本發(fā)明屬于細胞生物學和醫(yī)藥領域，具體而言，本發(fā)明涉及莪術醇的新用途。本發(fā)明還涉及相應的藥物組合物及其應用方法。
背景技術：
腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數(shù)相當龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55%。
良性腫瘤對機體的影響較小，主要表現(xiàn)為局部壓迫和阻塞癥狀。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長較快，浸潤破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而對機體影響嚴重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現(xiàn)嚴重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。
中醫(yī)認為，癌癥的起因首先是人體內(nèi)陰陽平衡，組織細胞在不同的致癌因素長期作用下，細胞突變而引起的。其實癌組織也是人體的一部分，只有在人本陰陽平衡失調(diào)，五行生克乘侮發(fā)生變化的前提下，人體的免疫監(jiān)控系統(tǒng)才會對其失去監(jiān)控，任其發(fā)展。中草藥能夠以調(diào)理氣血、調(diào)整陰陽平衡、維持正常生命體征而保命；以培補正氣、產(chǎn)生抗體，清理"毒源"而治本。因而，中草藥提取物成為治療腫瘤一個重要方向。
是姜科植物莪術的提取物，傳統(tǒng)的從蓬莪術、溫郁金中提取莪術醇的方法,基本上是用甲醇或水提取，然后進行蒸汽蒸餾，再經(jīng)乙酸乙酯或者無水乙醇重結(jié)晶得到莪術醇[hiroshih，kanjim，yojiros，etal.structureofcurcumol.[j].chempharmbull，1965，13（12）：1484，許洪霞，鄭淑忱，左士賢，等.溫莪術抗腫瘤有效成分的研究-莪術醇和莪術二酮的分離和鑒定[j].中草藥通訊，1979，10（10）：11.]，得到的產(chǎn)率和純度較低，需經(jīng)硅膠柱分離等后續(xù)純化。
最近，莪術醇結(jié)晶制備工藝有所改進。孟昭珂等直接對莪術油進行真空分餾，得到的餾分不經(jīng)硅膠柱分離而直接重結(jié)晶制備莪術醇，收率可達30％，純度可達96％[孟昭珂，付美珍.莪術醇的提取工藝[p].中國專利：cn-1704417，2005-12-07.]。王鎏祥等用超臨界萃取聯(lián)用溶脹結(jié)晶法從莪術飲片中提取到含量高于90％的細粉末狀莪術醇晶體[王鎏祥，張朝暉，馬朝陽.莪術醇超臨界結(jié)晶的研究[j].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2007，28（3）：81.]。王婷等建立了以莪術油為原料，減壓蒸餾提取莪術醇的新方法[王婷，李鐵福，林紹強，等.莪術醇的分離鑒定及含量測定[j].中華中醫(yī)藥學刊，2008，26（5）：1018.]。
基因芯片技術研究發(fā)現(xiàn)，莪術醇可降低肝星狀細胞轉(zhuǎn)化生長因子β1、細胞色素p450a表達，提示其具有抗肝纖維化的潛能[江遠，李澤松，江福生，等.莪術醇對肝星狀細胞-t6細胞基因表達的影響[j].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2005，13（3）：144.]。在激素加腎上腺素制作的大鼠血瘀模型中，莪術醇顯示出一定的抗血栓作用[唐澤耀，宗成國，林原.莪術醇的活血化瘀活性實驗研究[j].中藥藥理與臨床，2003，19（5）：15.]。此外，莪術醇還具有較明顯的抗生育作用，用于作餌劑，降低雌鼠繁殖率和平均胎仔數(shù)，以防控農(nóng)田鼠害[馬金寶，張丹華，莊文君，等.莪術醇餌劑防治農(nóng)田害鼠示范[j].中國植保導刊，2007，27（1）：34.王庭林，張慧娣，趙日良，等.抗生育劑莪術醇對區(qū)域性害鼠的控制效應研究[j].山西農(nóng)業(yè)科學，2007，35（9）：53]。
莪術醇是中藥單體，生物利用度高、性質(zhì)比較穩(wěn)定,具有臨床使用價值。隨著人們對其的化學和生物學研究的深入,其分子作用機制將逐步明確,這將進一步推動此類化合物的化學結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關系研究,并有助于提高莪術的藥用價值。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供莪術醇的新的藥物用途。
本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤藥物增敏劑。
一方面，本發(fā)明提供了莪術醇在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。其中，莪術醇的英文全稱為curcumol，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
莪術醇可以作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物組合物，所述的抗腫瘤藥物組合物的有效成分是抗腫瘤藥物和莪術醇。
所述的抗腫瘤藥物是細胞周期特異性藥物或者細胞周期非特異性藥物。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
本發(fā)明還提供了一種抑制體外腫瘤細胞生長增殖的方法，即在腫瘤細胞的培養(yǎng)基中加入莪術醇和抗腫瘤藥物。
其中，加入莪術醇的終濃度為1-10μmol/l。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或者胰腺癌。
實施上述方法時，先加入莪術醇，然后加入抗腫瘤藥物。也可以同時加入莪術醇和抗腫瘤藥物。
本發(fā)明提供了莪術醇的新用途，即其在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應用。莪術醇是天然產(chǎn)物，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的作用，可以作為腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑；莪術醇還具有增加腫瘤多藥耐藥細胞對抗腫瘤藥物敏感性的作用，可以作為化療增敏劑使用。本發(fā)明中的小分子化合物莪術醇作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分進行開發(fā)，抑瘤效果明顯，綠色環(huán)保，將為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
附圖說明
圖1為莪術醇的結(jié)構(gòu)。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物，所述的抗腫瘤藥物的活性成分是莪術醇。所述的腫瘤可以是肝癌細胞、胃癌細胞、宮頸癌細胞或者血癌細胞。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學合成的方法。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與莪術醇發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中ph通常約為5-8，較佳地ph約為6-8，ph值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括（但并不限于）：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的莪術醇為例，可以將其與合適的藥學上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發(fā)明的莪術醇可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的莪術醇還可與其他治療劑一起使用。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
實驗方法：
1.細胞復蘇
1)從液氮罐中取出凍存管，直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。
2)從37℃水浴中取出凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并加入10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，棄上清，再重復用培養(yǎng)液洗一次。
3)用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至一定濃度時進行傳代。mcf-7細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基中，kb和kb/vcr細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸鈉的mem培養(yǎng)基中，mcf-7/adr細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、0.01mg/ml胰島素和1mm丙酮酸鈉的mem培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中含100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
2.細胞傳代培養(yǎng)
每天觀察細胞生長的情況，當細胞在培養(yǎng)瓶中長至約90%匯合時傳代，約每隔2-4天傳代一次。一瓶傳代成三瓶，或一個25cm2傳代于一個75cm2的培養(yǎng)瓶中。方法：
1)用1×磷酸緩沖液洗滌細胞一次。
2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培養(yǎng)箱中數(shù)分鐘。用手拍打細胞培養(yǎng)瓶，使細胞分離。
3)用含10-15%的gibico胎牛血清的合適培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細胞分裝于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
懸浮細胞傳代時，直接收集于離心管中離心，棄舊培養(yǎng)基。一般一瓶傳代成三瓶的比例分裝于新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3.細胞凍存
1)取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞胰蛋白酶消化，收集于離心管中并計數(shù)，離心。
2)棄除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液(含10%dmso，40%dmem和50%gibico胎牛血清)，凍存液中細胞的最終濃度為0.5-1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中，每管加1-1.5ml。
3)將凍存管放入凍存盒置-80℃速凍，5小時后移入液氮罐中保存。
4.實驗材料
藥物準備：
莪術醇又名姜黃環(huán)奧醇，為無色針狀結(jié)晶，易溶于乙醚、氯仿，溶于乙醇，微溶于石油醚，幾乎不溶于水，在水中溶解度僅為0．3%。相應參數(shù)為：
m.wt:236.35formula:c15h24o2solubility:unknownpurity:>99%storage:at-20℃2yearscasno.:4871-97-0
莪術醇溶于dmso(二甲基亞砜),配制成100mm或50mm的母液備用。
長春新堿(vcr)和阿霉素(adr)購自羅氏化學公司，純度都大于99%。
細胞來源:
人口腔癌細胞株kb及其耐藥細胞株kb/vcr由中科院藥物所提供，人乳腺癌細胞株mcf-7及其耐藥細胞株mcf-7/adr購自南京凱基生物公司。
試劑盒:
cck-8試劑盒購自同仁公司。
cck-8實驗
kb和kb/vcr細胞以及mcf-7和mcf-7/adr細胞都按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的adr，vcr，莪術醇以及vcr和莪術醇一起用含10%胎牛血清的α-mem配好后被加到各個孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90μl不含血清的培養(yǎng)基和10μlcck-8試劑。37℃反應2h后，酶標儀讀取450nm波長的吸光值（od450）。通過計算得到用藥組相對于對照組的細胞增殖比率?？瞻捉M為不加細胞只加培養(yǎng)基，對照組為加入與藥物同體積的dmso，細胞存活率=（實驗組od450-空白組od450）/（對照組od450-空白組od450）。通過ic50值再計算耐藥倍數(shù)（resistancefold，rf）。
rf=耐藥細胞株的ic50值/親本細胞株的ic50值。每個濃度設3個重復孔，實驗重復3次。
所有耐藥細胞系在生長抑制實驗之前在無藥物培養(yǎng)基中生長3天。每個數(shù)值是3個獨立實驗結(jié)果，ic50以“均值±標準差”形式表示。vcr，長春新堿；adr，柔紅霉素；rf，耐藥倍數(shù)。
實施例1
實驗結(jié)果：
kb/vcr和mcf-7/adr是兩種常用的多藥耐藥細胞株，在本實施例中，這兩種細胞也表現(xiàn)出多藥耐藥的特性。如表1所示，kb/vcr細胞相對于kb細胞對vcr和adr的耐藥倍數(shù)分別為81.9倍和94.4倍，而mcf-7/adr細胞跟mcf-7細胞相比對vcr和adr的耐藥倍數(shù)分別是38.1倍和20.9倍，顯示實驗所用耐藥細胞具有多藥耐藥性，且mdr活性類似于文獻報道的結(jié)果。
莪術醇對親本細胞株kb和mcf-7的半數(shù)抑制濃度ic50分別為56.9μμ和62.7μμ，對耐藥細胞株kb/vcr和mcf-7/adr的ic50分別為133.0μμ和143.9μμ，兩者之間無顯著性差別，多藥耐藥細胞株kb/vcr和mcf-7/adr沒有表現(xiàn)出對化合物莪術醇的交叉耐藥，說明莪術醇可以逃脫耐藥細胞的多藥耐藥性。莪術醇在10μμ以下的濃度下，對細胞生長無明顯的抑制，高于100μμ的濃度下會抑制細胞的增殖。
結(jié)論：莪術醇能夠克服耐藥細胞株的耐藥性，耐藥細胞株對莪術醇的敏感性基本相同。
實施例2：cck-8方法檢測莪術醇對腫瘤細胞多藥耐藥活性的逆轉(zhuǎn)作用
kb/vcr,mcf-7/adr和hct-8/vcr細胞按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的vcr，以及不同濃度的vcr和莪術醇一起用含10%胎牛血清的α-mem配好后被加到各個孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，同實施實例1中方法，用cck-8試劑盒測耐藥細胞株及其親本細胞對vcr和vcr+莪術醇的活性，繪成曲線。每個濃度設3個重復孔，實驗重復3次。
實驗結(jié)果：
kb/vcr細胞對vcr的耐藥倍數(shù)為81.9倍，mcf-7/adr對adr的耐藥倍數(shù)為20.9倍。當加入10μm的莪術醇后，使kb/vcr細胞對vcr的敏感性增加不顯著，而adr對耐藥細胞mcf-7/adr的敏感性增加了5.43倍。莪術醇能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細胞對化療藥物的耐藥性。而這種效應在親本細胞中表現(xiàn)并不明顯。
結(jié)論：
莪術醇可以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細胞kb/vcr和mcf-7/adr的耐藥性，可以作為抗腫瘤藥物的增敏劑，或者與抗腫瘤藥物制成藥物組合物。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。