本發(fā)明涉及根皮素在制備治療雞壞死性腸炎藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種厭氧性革蘭氏陽性芽孢桿菌，廣泛存在于自然界的土壤、水體、食物、人畜糞便、家畜飼料及動(dòng)物腸道中，是人和動(dòng)物的正常腸道菌群，屬條件致病菌。目前根據(jù)其分泌的外毒素不同，將其分為a-e共個(gè)5血清型，家禽主要感染a型及c型產(chǎn)氣莢膜梭菌，尤以a型為主。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染家禽后，主要引起壞死性腸炎，其癥狀表現(xiàn)為雞只精神委靡、羽毛松亂、食欲減少或廢絕，排血便，生產(chǎn)性能嚴(yán)重下降。病變主要集中在小腸部位，表現(xiàn)為腸壁變薄，有局灶性或成片的腸粘膜壞死脫落。據(jù)有關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，全球家禽行業(yè)因壞死性腸炎造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)六十億美元，嚴(yán)重危害了家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道內(nèi)的粘附定植主要是通過其四型菌毛(typeivpili，tfp)介導(dǎo)的。tfp是一種存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的一種運(yùn)動(dòng)器官，tfp使得產(chǎn)氣莢膜梭菌具有在其自然生境和軟硬瓊脂等半固體的介質(zhì)表面運(yùn)動(dòng)的能力，這種特殊的運(yùn)動(dòng)方式被稱作滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)(glidingmotility)。據(jù)研究表明，包括產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道的粘附定植、滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)、生物被膜的形成等細(xì)菌功能都與tfp具有一定的聯(lián)系。通過抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌tfp的功能，能夠干擾細(xì)菌在腸道內(nèi)的粘附定植，從而達(dá)到抗產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的目的。

通過在飼料中添加抗生素是預(yù)防并治療家禽感染壞死性腸炎的主要手段，然而，由于抗生素大量使用所致的細(xì)菌耐藥性問題及抗生素殘留問題對公眾健康造成了嚴(yán)重威脅，因此，開發(fā)安全有效的抗生素替代物正日益成為研究的熱點(diǎn)。天然化合物具有毒性較低、來源豐富、安全范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是篩選抗生素替代物的重要資源。根皮素是自然界中一種較為稀有的二氫查爾酮類化合物，主要存在于蘋果的根、莖、葉及果實(shí)中。目前的研究表明，根皮素具有很強(qiáng)的抗氧化作用，同時(shí)也是一種新開發(fā)的天然皮膚美白劑。近年來，根皮素在醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)及食品工業(yè)中得到了廣泛關(guān)注。但是，截至目前國內(nèi)外尚無根皮素用于治療產(chǎn)氣莢膜梭菌所致雞壞死性腸炎的相關(guān)研究。本發(fā)明研究表明了根皮素對產(chǎn)氣莢膜梭菌所致的雞壞死性腸炎具有良好的治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根皮素的分子結(jié)構(gòu)見附圖1。

本發(fā)明通過產(chǎn)氣莢膜梭菌滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)、生物被膜形成抑制試驗(yàn)以及雛雞壞死性腸炎模型試驗(yàn)證根皮素對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染所致的雞壞死性腸炎具有保護(hù)作用。

附圖說明

圖1是根皮素分子結(jié)構(gòu)圖

圖2是滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)圖

圖3是生物被膜形成抑制試驗(yàn)圖

圖4是腸道病變評分試驗(yàn)圖

具體實(shí)施方式

滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)

產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株atcc13124于液體bhi培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)12h，之后取300μl該培養(yǎng)物繼續(xù)培養(yǎng)于液體bhi中，37℃厭氧培養(yǎng)5h。取1ml培養(yǎng)物，10000g離心棄上清，菌體重懸于500μlbhi液體培養(yǎng)基中，使之二倍濃縮。之后取5μl濃縮的菌液分別滴加于預(yù)先制備并于37℃烘箱干燥1h的含4μg/ml、16μg/ml根皮素的0.7％bhia的平板上，37℃厭氧培養(yǎng)48h，采集圖像(附圖2)。結(jié)果表明，4μg/ml及16μg/ml根皮素均能顯著抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌在bhia上的滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)，且16μg/ml根皮素作用效果更為明顯。

生物被膜形成抑制試驗(yàn)

產(chǎn)氣莢膜梭菌于液體bhi中37℃厭氧培養(yǎng)12h，離心棄上清，用滅菌pbs洗滌一次，之后用tsb液體培養(yǎng)基重懸并調(diào)整至od600nm＝0.1，取400μl調(diào)整后的細(xì)菌培養(yǎng)物，加至24孔板中，24孔板外圍用滅菌pbs封板以防止液體蒸發(fā)。之后與細(xì)菌培養(yǎng)物內(nèi)分別加入0.4μl濃度為8mg/ml或32mg/ml的根皮素，使得24孔板內(nèi)根皮素的終濃度分別為8μg/ml及32μg/ml，另設(shè)立加入0.4μl過濾滅菌的dmso(不加入根皮素)的陽性對照組以及400μl液體tsb培養(yǎng)基的陰性對照組，24孔板置于30℃厭氧培養(yǎng)5d。之后輕輕吸棄上清，滅菌pbs洗滌24孔板內(nèi)固著的生物被膜兩次，室溫干燥30min，加入過濾滅菌的1％結(jié)晶紫400μl，室溫孵育30min，吸棄結(jié)晶紫，再次用滅菌pbs洗滌兩次。向每孔中加入400μl的33％乙酸溶解結(jié)晶紫，吹打混勻后取300μl分別加入96孔板的3個(gè)獨(dú)立孔中，每孔100μl，于酶標(biāo)儀570nm測定吸光值，計(jì)算生物被膜形成的抑制率。結(jié)果表明，根皮素能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌生物被膜的形成(附圖3)。

雛雞壞死性腸炎模型試驗(yàn)的治療學(xué)研究

雛雞壞死性腸炎模型

取20日齡的雄性愛拔益加(arboracre)肉仔雞經(jīng)口給予0.1ml(5×10⁸cfus)重懸于滅菌pbs的產(chǎn)氣莢膜梭菌atcc13124培養(yǎng)物，次日(21日齡)再次給予相同菌量的菌液以攻菌，建立雛雞壞死性腸炎模型，健康組雞只經(jīng)口給予0.1ml滅菌pbs作為對照。

腸道病變評分試驗(yàn)

雛雞經(jīng)口攻菌感染前8h(20日齡)按雞只體重經(jīng)口給予50mg/kg的根皮素(溶解于滅菌pbs)，每12h給藥一次。另設(shè)立不給藥治療的陽性對照組及不攻菌感染的健康對照組，陽性對照組與健康對照組雞只同樣稱重并按體重經(jīng)口給予相應(yīng)體積的滅菌pbs。上述三組每組10只雞，治療組共給藥治療5天(治療至24日齡)。25日齡頸椎脫臼處死全部雞只，剖檢，取十二指腸至空腸，肉眼觀察腸道病理變化，根據(jù)腸道損傷程度進(jìn)行腸道損傷評分(附圖4)。腸道損傷評分采用0-6分制：0分(沒有明顯損傷)、1分(腸壁變薄、變脆)、2分(出現(xiàn)1-5個(gè)壞死灶)、3分(出現(xiàn)6-15個(gè)壞死灶)、4分(出現(xiàn)16個(gè)或16個(gè)以上壞死灶)、5分(出現(xiàn)2-3cm長的片狀壞死)、6分(出現(xiàn)大片的彌漫性壞死)。結(jié)果表明，經(jīng)根皮素治療后，顯著降低壞死性腸炎雞只腸道的病理變化程度，說明根皮素對產(chǎn)氣莢膜梭菌所致的雞壞死性腸炎具有良好的保護(hù)作用。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及根皮素在制備治療雞壞死性腸炎藥物中的應(yīng)用，并通過產(chǎn)氣莢膜梭菌滑動(dòng)運(yùn)動(dòng)抑制試驗(yàn)、生物被膜形成抑制試驗(yàn)以及雛雞壞死性腸炎模型試驗(yàn)證根皮素對產(chǎn)氣莢膜梭菌感染所致的雞壞死性腸炎具有保護(hù)作用。由于傳統(tǒng)抗生素的濫用和細(xì)菌耐藥性的不斷加強(qiáng)，根皮素具有治愈率高，無耐藥性及藥物殘留的特點(diǎn)，因此根皮素用于治療雞壞死性腸炎可以增加使用藥物的選擇性,對開發(fā)新藥和有著重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧旭明;劉水;王建鋒;周永林;王婷婷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.05.05
技術(shù)公布日：2017.07.07