專利名稱：一種雞壞死性腸炎(a型)滅活疫苗制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞壞死性腸炎(A型)滅活疫苗制備方法。屬于獸用生物制品制造領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞壞死性腸炎又稱為梭狀芽孢桿菌腸炎(Clostridial enteritis),菌群失衡癥(dysbacteriosis)或小腸細(xì)菌生長過度癥(SIB0)。是由產(chǎn)氣莢膜梭菌(ClostridiumperfringenS)A型或C型引起的一種疾病，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生α毒素，C型產(chǎn)生α和β毒素，這兩種毒素是引起壞死性腸炎的主要毒素。病死禽以肝腫大、腸道出血和腸黏膜有麩皮樣壞死灶為特征，正常雞群的發(fā)病率為I. 3% 37. 3%，無特定病原雞群的發(fā)病率可高達(dá)62% (王澤華，李燦恒.雞壞死性腸炎的診斷與防治，中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2002，19 (14)35-36)。目前國內(nèi)尚沒有針對雞壞死性腸炎的疫苗，治療該病主要采用抗生素。國內(nèi)A型梭菌類疫苗生產(chǎn)采用的是厭氣肉肝湯和肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基其主要成分牛肉和肝等，受動物品種、年齡、新鮮及消化程度的影響較大，造成培養(yǎng)基質(zhì)量不穩(wěn)定、批次間離散度大且制作過程繁瑣，進(jìn)而影響疫苗的質(zhì)量，特別是疫苗的均一性。大規(guī)模發(fā)酵用合成培養(yǎng)基按照產(chǎn)氣莢膜梭菌營養(yǎng)代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)，添加了促進(jìn)菌體增殖、提高保護(hù)性抗原含量的生長因子，具有產(chǎn)毒量高、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。合成培養(yǎng)基是細(xì)菌疫苗質(zhì)量好壞的關(guān)鍵因素，有鑒于此，本發(fā)明旨在設(shè)計(jì)一種適合A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株生長、產(chǎn)毒量高、成分相對確定、易于在線檢測、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整的合成培養(yǎng)基，制備A型產(chǎn)氣莢膜梭菌滅活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株種子液按培養(yǎng)基總量的1% 2%接種于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉為主要原材料的液體合成培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)/或靜置培養(yǎng)6h,培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)3000r/min離心30min,去除菌體,分別用8Ku截留分子量的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，經(jīng)O. 6%的甲醛溶液滅活脫毒完全后，加入終濃度20%的氫氧化鋁膠配制成疫苗。本發(fā)明詳細(xì)描述I.疫苗生產(chǎn)用菌種(I)來源產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株菌種，原C57_1，F(xiàn)21A，強(qiáng)毒株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。(2)菌種特性毒力肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)物上清靜脈注射，O. 05ml致死小白鼠；0. I I. Oml致
死家兔。免疫原性2. Oml濃縮鋁膠苗免疫家兔可產(chǎn)生75% 100%保護(hù)。
2培養(yǎng)基采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的合成培養(yǎng)基(I)配方(W/V)如下:蛋白胨L 5g,酵母粉O. 5g,氯化鈉O. 25g,磷酸氫二鉀O. 45g,葡萄糖O. 5g,氯化鐵O. OOOlg,半胱氨酸鹽酸鹽O. 05g, VcO. OOlg,去離子水加至IOOml。(2)合成培養(yǎng)基配制方法按配方稱取各成分溶于去離子水中，用2mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至8. O 8. 5。116°C高壓滅菌 30min。(3)合成培養(yǎng)基檢驗(yàn)、
I)性狀溶液澄清透明、呈棕色。2)無菌檢驗(yàn)按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，以下稱《中國獸藥典》)規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。3) pH 值應(yīng)為 8. O 8. 5。4)生長試驗(yàn)⑴種子液制備將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌CVCC37株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)凍干菌種用Iml普通肉湯(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)稀釋后，接種于IOml肉肝胃酶消化湯中，置37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，同時(shí)分別接種普通肉湯、普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯和石蕊牛奶各2管，每管O. 2ml，培養(yǎng)48小時(shí)，純粹檢驗(yàn)合格后作為一級種子。在2 8°C保存，使用期不得超過15日。取一級種子O. Iml接種IOml肉肝胃酶消化湯，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，純粹檢查合格后作為二級種子。(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，以下稱《規(guī)程》)。⑵菌液培養(yǎng)及判定將種子液按1%接種200ml液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶，37°C靜置培養(yǎng)6小時(shí)，同時(shí)設(shè)I個(gè)不接種陰性對照。分別取樣3000r/min離心30min，取上清按現(xiàn)行《規(guī)程》進(jìn)行毒力測定。毒力應(yīng)達(dá)到50MLD/ml，且陰性對照應(yīng)無菌生長。5)貯藏與有效期液體培養(yǎng)基應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，高壓滅菌后放置室溫即刻使用。3疫苗制造(I)種子液制備將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)凍干菌種用Iml肉肝胃酶消化湯(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供)稀釋后，接種于IOml肉肝胃酶消化湯中，置37°C培養(yǎng)18 24小時(shí)，同時(shí)分別接種普通肉湯、普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯和石蕊牛奶各2管，每管O. 2ml，培養(yǎng)48小時(shí)，純粹檢驗(yàn)合格后作為一級種子。在2 8°C保存，使用期不得超過15日。取一級種子O. Iml接種IOml肉肝胃酶消化湯，37°C培養(yǎng)6小時(shí)，純粹檢查合格后作為二級種子(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二〇〇〇年版.化學(xué)工業(yè)出版社，2001，以下稱《規(guī)程》)。(2)疫苗制造將種子液按培養(yǎng)基總量的1%接種于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉為主要原材料的液體合成培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)/或靜置培養(yǎng)6小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后菌液3000r/min離心30min,取上清經(jīng)8Ku截留分子量的超濾濃縮系統(tǒng)濃縮后，立即加入O. 6%的甲醛溶液滅活脫毒4 6日，滅活脫毒完全后加入終濃度20%的氫氧化鋁膠和O. 006%硫柳汞制成滅活疫
苗。 (3)成品檢驗(yàn)物理性狀本品靜置后，上層為黃褐色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后成均勻混懸液。無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附注進(jìn)行，無應(yīng)菌生長。安全檢驗(yàn)皮下接種14日齡的肉雞10只，每只2ml，觀察10日，不應(yīng)出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部或全身反應(yīng)。效力檢驗(yàn)皮下注射14日齡的肉雞5只，每只0.5ml，14日后，連同條件相同的對照肉雞5只，各靜脈注射O. 2ml (含1MLD) A型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，觀察5日，免疫組至少4/5保護(hù)，空白對照組5/5死亡。甲醛、硫柳汞含量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，制品中甲醛殘留含量應(yīng)不超過O. 5%，硫柳汞殘留含量應(yīng)小于O. 01%。本發(fā)明涉及微生物的信息本發(fā)明涉及的A型產(chǎn)氣莢梭菌菌株，菌號分別為CVCC37、CVCC52、CVCC2027、CVCC2030、CVCC2014，均來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物保藏管理中心(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物保藏管理中心編著.中國獸醫(yī)菌種目錄第二版.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002, p41、p43、p44、p45、p44)。本發(fā)明的積極意義目前國內(nèi)尚無雞壞死性腸炎滅活疫苗，而其他A型產(chǎn)氣莢膜梭菌類疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化湯或厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基其主要成分牛肉和肝等，受動物品種、年齡、新鮮及消化程度的影響較大，造成培養(yǎng)基質(zhì)量不穩(wěn)定、批次間離散度大且制作過程繁瑣，進(jìn)而影響疫苗的質(zhì)量，特別是疫苗的均一性。而本發(fā)明所提供的合成培養(yǎng)基，克服了以上的缺陷，是進(jìn)行細(xì)菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)的發(fā)展趨勢，具有操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為高品質(zhì)的雞壞死性腸炎滅活疫苗生產(chǎn)提供了有力的保障。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IA型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株(原C57-1株)合成培養(yǎng)基的研究通過靜置培養(yǎng)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株篩選出該合成培養(yǎng)基配方,對該合成培養(yǎng)基的配制條件和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并與肉肝胃膜消化湯的產(chǎn)毒性能進(jìn)行比較，結(jié)果該配方37°C靜置培養(yǎng)6小時(shí)產(chǎn)毒性能達(dá)到50 100MLD/ml，產(chǎn)毒能力達(dá)到或超過肉肝胃膜消化湯。對該合成培養(yǎng)基的適應(yīng)性進(jìn)行研究，結(jié)果該合成培養(yǎng)基只適用于CVCC37株的培養(yǎng)。I 材料I. I培養(yǎng)基原材料胰酪蛋白胨(批號VM732731-644)，購自MERCK公司；酵母浸粉(批號911948)購自O(shè)XOID公司；磷酸氫二鉀、葡萄糖、氯化鐵、半胱氨酸鹽酸鹽、亮氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、VB1, Vki, Vc,甲硫氨酸均為分析純化學(xué)試劑，購自北京化學(xué)試劑公司。I. 2肉肝胃膜消化湯肉湯(批號為0130、0227、0307、0115、0119、0205)，A型試管使用規(guī)格25ml、三角瓶使用規(guī)格500ml，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所培養(yǎng)基組提供。
I. 3 菌種產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37 株、CVCC52 株、CVCC2027 株、CVCC2030 株、CVCC2014 株，O. 3ml/支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。I. 4 動物小鼠ICR系，30 35日齡、體重16 20g，SPF級，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所實(shí)驗(yàn)動物組采購并提供。2方法與結(jié)果2. I基礎(chǔ)配方篩選從不同組合配方中，通過培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株，進(jìn)行產(chǎn)毒效果比較，篩選基礎(chǔ)配方。 稱取氯化鈉2. 5g、磷酸氫二鉀4. 5g，溶于IOOOml去離子水中，用2mol/L的氫氧化鈉調(diào)PH值為8. O 8. 5。將蛋白胨與酵母粉按不同比例(W/V)設(shè)計(jì)成9個(gè)配方，標(biāo)記為I 9(具體比例及編號結(jié)果見表1)，用上述緩沖液分別定容至100ml，116°C滅菌30分鐘，同時(shí)設(shè)立肉肝胃酶消化湯對照。按1%加入種子液，37°C靜置培養(yǎng)6小時(shí)，取培養(yǎng)好的菌液3000r/min離心30min,取上清測毒。結(jié)果見下表I。表I 9組基礎(chǔ)配方產(chǎn)毒性能測毒結(jié)果
賴.i
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酵付玢 O. 1% 0.1 ().1 (1.2. 0.25 0.25S, 0.5 O. , 0.5%__
. 17 20 20 20 20 25 20 25 17 50 OIUVinI )___________*將毒素用明膠緩沖液適當(dāng)稀釋，將稀釋液O. 2ml靜脈接種2只小鼠，24小時(shí)內(nèi)，使小鼠2/2全部死亡的最高稀釋倍數(shù)乘以5，即為每ml毒素的最小致死量(MLD)數(shù)。以下同。從表I中配方6和配方8產(chǎn)毒性能較高，較接近肉肝胃酶消化湯。2. 2生長因子的篩選選取產(chǎn)毒性能接近肉肝胃酶消化湯的2組基礎(chǔ)配方，制成液體培養(yǎng)基，116°C滅菌30分鐘，待其降至室溫，分裝到滅菌的A型試管中。在A型試管中分別加入經(jīng)O. 22 μ m過濾除菌的葡萄糖、氯化鐵、半胱氨酸鹽酸鹽、亮氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、VB1, Vki, V。、甲硫氨酸等生長因子(W/V比例見表2)，同時(shí)設(shè)立肉肝胃酶消化湯對照。按1%加入種子液，37°C靜置培養(yǎng)6小時(shí)，取培養(yǎng)好的菌液3000r/min離心30min，取上清測毒。結(jié)果見下表2。表2培養(yǎng)基生長因子篩選試驗(yàn)測毒結(jié)果(MLD/ml)
權(quán)利要求
1.一種雞壞死性腸炎(A型)滅活疫苗制備方法，其特征在于將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC37株種子液按培養(yǎng)基總量的1% 2%接種于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉為主要原材料的液體合成培養(yǎng)基中，37°C厭氧發(fā)酵培養(yǎng)/或靜置培養(yǎng)6小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后經(jīng)3000r/min離心30min，去除菌體，分別用8Ku截留分子量的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行超濾濃縮，經(jīng)0.6%的甲醛溶液滅活脫毒完全后，加入終濃度20%的氫氧化鋁膠配制成疫苗。
2.如權(quán)利要求I所述的雞壞死性腸炎(A型)滅活疫苗及其生產(chǎn)方法，其特征是其中所使用合成培養(yǎng)基的配方(W/V)是蛋白胨I. 5g，酵母粉0. 5g，氯化鈉0. 25g，磷酸氫二鉀0. 45g,葡萄糖0. 5g,氯化鐵0. OOOlg,半胱氨酸鹽酸鹽0. 05g, VcO. OOlg,去離子水加至IOOml。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用合成培養(yǎng)基生產(chǎn)雞壞死性腸炎(A型)滅活疫苗的方法。目前國內(nèi)尚沒有針對雞壞死性腸炎的滅活疫苗，而針對其他動物的梭菌疾病滅活疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基其主要成分牛肉和肝等，受動物品種、年齡、新鮮及消化程度的影響較大，造成培養(yǎng)基質(zhì)量不穩(wěn)定、批次間離散度大且制作過程繁瑣，進(jìn)而影響疫苗的質(zhì)量，特別是疫苗的均一性。而本發(fā)明所提供的合成培養(yǎng)基，克服了以上的缺陷，是進(jìn)行細(xì)菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)的發(fā)展趨勢，具有操作簡便、質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，為高品質(zhì)的雞壞死性腸炎(A型)滅活疫苗生產(chǎn)提供了有力的保障。
文檔編號C12N1/20GK102698259SQ20121019287
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者孫曄, 朱良全, 李聰研, 田冬青, 蔣玉文 申請人:北京中海生物科技有限公司