專利名稱：：一種抗輻射中藥發(fā)酵液的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥加工及生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及中藥黃芪、三七、緑茶的發(fā)酵エ藝，及通過這種方法得到的發(fā)酵產(chǎn)物的抗輻射作用。
背景技術(shù)：
：黃芪總黃酮是黃芪的主要有效成分之一，多達(dá)30余種，其抗輻射作用效果明顯。楊映雪等研究了黃芪總黃酮對輻射損傷小鼠的防護(hù)研究，結(jié)果表明黃芪總黃酮抗輻射效果明顯，受照小鼠存活率明顯提高，外周血WBC、PLT及脾臟的損傷作用顯著降低[1]。胥正敏等以人正常骨髄間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對象，用6tlCoY射線進(jìn)行照射，結(jié)果表明黃芪總黃酮能夠?qū)θ苏９求l間充質(zhì)干細(xì)胞起到輻射防護(hù)作用[2]。皂苷廣泛存在于許多中藥，而三七中總皂苷含量較大，并且近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷具有較強(qiáng)的抗輻射作用。為了探討三七總皂苷的抗輻射療效，陳錫文等進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示三七總皂苷能明顯提高受照小鼠的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和骨髄有核細(xì)胞數(shù)，且小鼠胸腺、脾臟指數(shù)顯著升高，碳粒廓清指數(shù)増加M。鄒丹等發(fā)現(xiàn)三七總皂苷能明顯提高受照小鼠的外周血WBC、Hb、BMC總數(shù)及CFU-S和CFU-GM集落產(chǎn)率，得出了結(jié)論三七皂苷可以起到增強(qiáng)骨髄造血機(jī)能，達(dá)到對輻射后小鼠骨髄抑制的對抗作用[4]。茶多酚是茶葉中最具價(jià)值的功效成分，有分布廣含量高的特點(diǎn)，主要包括兒茶素、花色素、黃酮及黃酮醇、酚酸及縮酚酸類化合物氣近年來，眾多學(xué)者對茶多酚的醫(yī)療利保健功效進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)茶多酚具有清除自由基、抗衰老等多種活性，并且證實(shí)了其具有明顯的抗輻射作用[6’7]。曹明富通過實(shí)驗(yàn)研究了茶多酚對受6tlCoY照射小鼠的損傷防護(hù)，結(jié)果顯示，茶多酚能夠提高受照小鼠的免疫器官指數(shù)、血像、CFU-S及粒細(xì)胞MI，并且使骨髄PEC的細(xì)胞微核率受到抑制，說明了茶多酚對輻射損傷具有一定的防護(hù)治療作用[8]。我國是中藥的發(fā)源地，資源極其豐富，經(jīng)過千年傳承已擁有十分系統(tǒng)的理論，但是再近些年來對中藥的現(xiàn)代化研究進(jìn)展比較緩慢，導(dǎo)致了中藥的發(fā)展受到限制，使中藥至今還不能被世界完全接受。利用微生物對中藥進(jìn)行發(fā)酵處理是中藥現(xiàn)代化研究史上的ー個重要創(chuàng)新，為中藥的開發(fā)開辟了一條新途徑?，F(xiàn)代中藥發(fā)酵制藥技術(shù)是在繼承傳統(tǒng)中藥發(fā)酵炮制法的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代生物工程技術(shù)方法包括發(fā)酵技術(shù)等，定向改變中藥的性能，或根據(jù)中藥之間的特性有目的有針對性進(jìn)行組合，利用単一菌種，或用混合菌種定向發(fā)酵。通過微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶系對中藥底物進(jìn)行氧化、還原化、酷化、羥基化、甲基化等多種化學(xué)反應(yīng)[9]。經(jīng)過發(fā)酵后能夠給中藥帶來很多有益處，首先是對中藥中有效成分產(chǎn)生影響。微生物在代謝過程中分泌出纖維素酶、蛋白酶、木質(zhì)素酶等多種酶類，降低了中藥中有效成分浸出的傳質(zhì)阻力，使其更充分的被提取M。另外，因微生物發(fā)酵是在常溫常壓下進(jìn)行，條件溫和，避免了中藥活性成分遭到破壞，并且通過ー些特殊酶的作用還可以對中藥中的某些成分進(jìn)行修飾、轉(zhuǎn)化，降解生物大分子從而實(shí)現(xiàn)提高中藥藥效或產(chǎn)生新藥效的目的參考文獻(xiàn)[I]楊映雪，陳建業(yè)，費(fèi)中海，等.黃芪總黃酮對輻射損傷小鼠的防護(hù)作用研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(4):504507.[2]胥正敏，陳建業(yè)，李賢富，等.黃芪總黃酮對人正常骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的抗輻射損傷作用[J]·中藥藥理與臨床，2011，27(3)3941.[3]陳錫文，管敏強(qiáng).三七總皂甙對小鼠抗輻射損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2005，25(6):559560.[4]鄒丹，喬海靈，全宏勛，等.三七皂甙對輻射所致小鼠骨髄抑制的對抗作用[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2000，20(6):413415.[5]楊賢強(qiáng)，王岳飛，陳留記，等.茶多酚化學(xué)[M].上海上海科學(xué)技術(shù)出版社，2003，I7，12，109125.[6]KatiyarSK,ElmetsCA.Greenteapolyphenolicantioxidantsandskinphotoprotection[J].IntJOncol,2001,18(6):13071313.[7]吳亮宇，林金科.茶多酚抗輻射研究進(jìn)展[J]·茶葉，2011，37(4):213217.[8]曹明富.茶多酚對小鼠輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)[J].茶葉科學(xué)，1998，18⑵139144.[9]欽傳光，李世杰，丁焰，等.發(fā)酵工程在醫(yī)藥研究和生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].湖北エ學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，15(I):6770.[10]葛喜珍.發(fā)酵在中藥研究中的應(yīng)用[J]·時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):386387.[11]阮曉東，張惠文，蔡穎慧，等.微生物在中藥生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].中草藥，2009,40(1):149-152.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明依據(jù)現(xiàn)代科技研究成果，選用黃芪、三七、緑茶作為實(shí)驗(yàn)原料，其主要功效成分依次為黃酮、皂苷和茶多酚。以上述三種有效成分能夠在發(fā)酵液中充分浸出為目的，篩選食藥真菌對中藥生物轉(zhuǎn)化的最佳組合并對其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。運(yùn)用正交試驗(yàn)的方法對發(fā)酵產(chǎn)物組方，測定較優(yōu)組方抗輻射作用的生理生化指標(biāo)。具體技術(shù)內(nèi)容如下I以中藥黃芪為發(fā)酵底物，利用食藥真菌靈芝對其進(jìn)行發(fā)酵，并考察不同時(shí)間發(fā)酵液中總黃酮含量的變化情況，確定食藥真菌靈芝發(fā)酵黃芪到第8天時(shí)，發(fā)酵液中總黃酮含量最高，為2.305mg/go并且通過單因素和正交試驗(yàn)，以發(fā)酵液中總黃酮含量為指標(biāo)，對食藥真菌靈芝發(fā)酵黃芪的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基為可溶性淀粉2g/100mL，硝酸鉀0.4g/100mL，磷酸ニ氫鉀0.lg/100mL，硫酸鎂0.lg/100mL，最佳發(fā)酵條件為接種量10%，黃芪添加量8g/100mL，溫度33°C，初始pH值5.5。最后采用優(yōu)化后エ藝進(jìn)行驗(yàn)證得出發(fā)酵液中總黃酮含量為2.411mg/g。2以中藥三七為發(fā)酵底物，利用食藥真菌豬苓對其進(jìn)行發(fā)酵，并考察不同時(shí)間發(fā)酵液中總皂苷含量的變化情況，確定了食藥真菌豬苓發(fā)酵三七到第8天時(shí)，發(fā)酵液中總皂苷含量最高，為69.063mg/go并且通過單因素和正交試驗(yàn)，以發(fā)酵液中總皂苷含量為指標(biāo)，對食藥真菌豬苓發(fā)酵三七的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基為可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸ニ氫鉀O.3g/100mL，硫酸鎂O.lg/100mL，最佳發(fā)酵條件為接種量10%，三七添加量5g/100mL，溫度25°C，初始pH值7。最后采用優(yōu)化后エ藝進(jìn)行驗(yàn)證得出發(fā)酵液中總皂苷含量為72.329mg/g。3以中藥綠茶為發(fā)酵底物，利用食藥真菌香菇對其進(jìn)行發(fā)酵，并考察不同時(shí)間發(fā)酵液中茶多酚含量的變化情況，確定了食藥真菌香菇發(fā)酵三七到第6天吋，發(fā)酵液中茶多酚含量最高，為166.889mg/g。并且通過單因素和正交試驗(yàn)，以發(fā)酵液中茶多酚含量為指標(biāo)，對食藥真菌香菇發(fā)酵緑茶的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳培養(yǎng)基為葡萄糖4g/100mL，酵母膏O.2g/100mL，磷酸ニ氫鉀O.3g/100mL，硫酸鎂O.lg/100mL，最佳發(fā)酵條件為接種量8%，中藥添加量8g/100mL，溫度25°C，初始pH值7。最后采用優(yōu)化后エ藝進(jìn)行驗(yàn)證得出發(fā)酵液中茶多酚含量為170.749mg/g。4以照射后第3、10天的外周血中白細(xì)胞數(shù)作為評價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)法對黃芪、三七、緑茶的發(fā)酵物進(jìn)行劑量配比組方，優(yōu)選出最佳組方為組方7，即三七發(fā)酵液O.4g/kg·(!,黃苗發(fā)酵液3.8g/kg·(!,綠茶發(fā)酵液2.25g/kg*d;組方2,即三七發(fā)酵液O.8g/kg*d,黃芪發(fā)酵液2.5g/kg·d，綠茶發(fā)酵液2.25g/kg·d。5對受輻射小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)，免疫器官指數(shù)，內(nèi)源性脾集落形成単位(CFU-S)，骨髓有核細(xì)胞(BMC)數(shù)，骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率(PCE)五項(xiàng)指標(biāo)測定，結(jié)果顯示，組方2和組方7均具有一定抗輻射作用。目前中藥抗輻射作用研究日漸增多，但是效果顯著得到開發(fā)的較少。本發(fā)明采用微生物發(fā)酵的方法，目的在于提高藥效，獲得ー劑具有良好抗輻射作用效果的組方，為以中藥為原材料的抗輻射產(chǎn)品研究開辟了一條新思路，同時(shí)在黃芪、三七及緑茶的進(jìn)ー步應(yīng)用研究上提供了理論基礎(chǔ)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一黃芪發(fā)酵液的制備以中藥黃芪為發(fā)酵底物，利用食藥真菌靈芝對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉2g/100mL，硝酸鉀O.4g/100mL,磷酸ニ氫鉀O.Ig/1OOmL,硫酸鎂O.Ig/1OOmL,最佳發(fā)酵條件為接種量10%，黃芪添加量8g/100mL，溫度33°C，初始pH值5.5，培養(yǎng)時(shí)間為8-10d，得黃芪發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及藥品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。實(shí)施例ニ三七發(fā)酵液的制備以中藥黃芪為發(fā)酵底物，利用食藥真菌豬苓對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸ニ氫鉀O.3g/100mL，硫酸鎂O.lg/100mL，最佳發(fā)酵條件為接種量10%，三七添加量5g/100mL，溫度25°C，初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間為8_10d，得三七發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及藥品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。實(shí)施例三緑茶發(fā)酵液的制備以中藥綠茶為發(fā)酵底物，利用食藥真菌香菇對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖4g/100mL，酵母膏0.2g/100mL,磷酸ニ氫鉀0.3g/100mL,硫酸鎂0.Ig/1OOmL,最佳發(fā)酵條件為接種量8%，中藥添加量8g/100mL，溫度25°C，初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間為6_8d，得綠茶發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及藥品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。實(shí)施例四正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選中藥發(fā)酵物的抗輻射組方實(shí)驗(yàn)動物健康的雌性昆明小鼠，18_22g，清潔級。輻照條件采用synergy醫(yī)用直線加速器對小鼠進(jìn)行一次性全身照射，照射劑量3Gy,劑量率O.5Gy/min,照射時(shí)間6min,革巴心距離100cm。正交設(shè)計(jì)分組用L9(33)三因素三水平正交表進(jìn)行試驗(yàn)分組，因素水平表見表1，其中因素A為黃芪發(fā)酵液，因素B為三七發(fā)酵液，因素C為綠茶發(fā)酵液，以每千克小鼠每天灌服發(fā)酵液中所含原始生藥材量表示各因素的水平劑量。另設(shè)ー組輻照模型對照組，各試驗(yàn)組分別于照射前連續(xù)灌服20天，每天一次，模型對照組以等量蒸餾水代替，對各組均以同一輻照條件進(jìn)行一次性全身照射，照射后仍繼續(xù)灌服。表I試驗(yàn)分組因素水平表i'able丄l'hetableofthegroupingfactorofexperiment權(quán)利要求1.一種黃芪發(fā)酵液，其特征是以中藥黃芪為發(fā)酵底物，利用食約真菌靈芝對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉2g/100mL，硝酸鉀O.4g/100mL，磷酸二氫鉀O.lg/100mL,硫酸鎂O.lg/100mL,最佳發(fā)酵條件為接種量10%，黃芪添加量8g/100mL，溫度33°C，初始pH值5.5，培養(yǎng)時(shí)間為.8-10d，得黃芪發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及藥品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。2.一種三七發(fā)酵液，其特征是以中藥黃芪為發(fā)酵底物，利用食藥真菌豬苓對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為可溶性淀粉3g/100mL，蛋白胨O.2g/100mL，磷酸二氫鉀O.3g/100mL,硫酸鎂O.Ig/1OOmL,最佳發(fā)酵條件為接種量10%，三七添加量5g/100mL，溫度25°C，初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間為8-.10d，得三七發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及約品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。3.—種綠茶發(fā)酵液，其特征是以中藥綠茶為發(fā)酵底物，利用食藥真菌香菇對其進(jìn)行發(fā)酵，采用發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖4g/100mL，酵母膏O.2g/100mL，磷酸二氫鉀O.3g/100mL，硫酸鎂O.lg/100mL,最佳發(fā)酵條件為接種量8%，中藥添加量8g/100mL，溫度25°C，初始pH值7，培養(yǎng)時(shí)間為6-8d，得綠茶發(fā)酵液，經(jīng)3500r/min離心15min，該上清液即可直接作為食品、保健品及藥品使用，或者用于制備食品、保健品及藥品的原料。4.一種中藥發(fā)酵液，其特征是將權(quán)利要求I至3所述方法制備的三種中藥發(fā)酵液進(jìn)行劑量配比組方，該組方具有一定抗輻射作用，可以在制備抗輻射藥品、食品及保健品中應(yīng)用。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的中藥發(fā)酵液，其特征在于該發(fā)酵液可以單獨(dú)或與其它藥物配伍或加入藥學(xué)上可以接受的輔料，制備成軟膠囊、硬膠囊、滴丸、片劑、分散片、顆粒劑、注射液、口服液、栓劑，經(jīng)口服、皮膚、粘膜、直腸方式應(yīng)用。6.本發(fā)明是采用搖瓶的方法進(jìn)行的，如進(jìn)行放大生產(chǎn)，可根據(jù)本發(fā)明的基本原理采用各種生物反應(yīng)器、發(fā)酵罐等方式進(jìn)行發(fā)酵處理，另外除本發(fā)明中所用食藥真菌靈芝、豬苓、香菇外，也可是其它大型食藥真菌如平菇、黑木耳、金針菇等，這是本領(lǐng)域的研究人員所能理解的。全文摘要本發(fā)明提供一種抗輻射中藥發(fā)酵液的制備方法，涉及中藥加工及生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是中藥黃芪、三七、綠茶的發(fā)酵方法。本發(fā)明以食藥真菌作為發(fā)酵的出發(fā)菌種，分別對三種中藥進(jìn)行發(fā)酵，并將此法所得三種發(fā)酵液進(jìn)行劑量配比組合。動物實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明中中藥發(fā)酵液具有明顯抗輻射作用。本發(fā)明的特點(diǎn)是中藥發(fā)酵液即可直接作為食(飲)品、保健品及藥品使用，或者用于制備食(飲)品、保健品及藥品的原料，在預(yù)防和治療輻射損傷方面具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。文檔編號A23L1/29GK102688280SQ20121019294公開日2012年9月26日申請日期2012年6月13日優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日發(fā)明者姜云,孫旸,王莘,董浩,陳述申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)