本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及羅漢果皂苷元的新用途。本發(fā)明還涉及相應(yīng)的藥物組合物及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個(gè)細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導(dǎo)致其克隆性異常增生而形成的異常病變。我國的腫瘤病例數(shù)相當(dāng)龐大，有資料顯示占全世界病例數(shù)的55％。
良性腫瘤對機(jī)體的影響較小，主要表現(xiàn)為局部壓迫和阻塞癥狀。惡性腫瘤由于分化不成熟、生長較快，浸潤破壞器官的結(jié)構(gòu)和功能，并可發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而對機(jī)體影響嚴(yán)重。惡性腫瘤除可引起與上述良性腫瘤相似的局部壓迫和阻塞癥狀外，還可有發(fā)熱、頑固性疼痛，晚期可出現(xiàn)嚴(yán)重消瘦、乏力、貧血和全身衰竭的狀態(tài)。
中醫(yī)認(rèn)為，癌癥的起因首先是人體內(nèi)陰陽平衡，組織細(xì)胞在不同的致癌因素長期作用下，細(xì)胞突變而引起的。其實(shí)癌組織也是人體的一部分，只有在人本陰陽平衡失調(diào)，五行生克乘侮發(fā)生變化的前提下，人體的免疫監(jiān)控系統(tǒng)才會(huì)對其失去監(jiān)控，任其發(fā)展。中草藥能夠以調(diào)理氣血、調(diào)整陰陽平衡、維持正常生命體征而保命；以培補(bǔ)正氣、產(chǎn)生抗體，清理"毒源"而治本。因而，中草藥提取物成為治療腫瘤一個(gè)重要方向。
羅漢果皂苷元是天然產(chǎn)物，生物利用度高、性質(zhì)比較穩(wěn)定,具有臨床使用價(jià)值。隨著人們對其的化學(xué)和生物學(xué)研究的深入,其分子作用機(jī)制將逐步明確,這將進(jìn)一步推動(dòng)此類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供式Ⅰ結(jié)構(gòu)的羅漢果皂苷元的新的藥物用途。
本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤藥物增敏劑。
一方面，本發(fā)明提供了羅漢果皂苷元在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應(yīng)用。其中，羅漢果皂苷元的結(jié)構(gòu)如式1所示。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌或胰腺癌。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
羅漢果皂苷元可以作為腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。
另一方面，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物組合物，所述的抗腫瘤藥物組合物的有效成分是抗腫瘤藥物和羅漢果皂苷元。
所述的抗腫瘤藥物是細(xì)胞周期特異性藥物或者細(xì)胞周期非特異性藥物。
所述的抗腫瘤藥物是長春新堿、柔紅霉素、紫杉醇或者5-氟尿嘧啶。
本發(fā)明還提供了一種抑制體外腫瘤細(xì)胞生長增殖的方法，即在腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入羅漢果皂苷元和抗腫瘤藥物。
其中，加入羅漢果皂苷元的終濃度為1-10μmol/L。
所述的腫瘤包括口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、宮頸癌或者胰腺癌。
實(shí)施上述方法時(shí)，先加入羅漢果皂苷元，然后加入抗腫瘤藥物。也可以同時(shí)加入羅漢果皂苷元和抗腫瘤藥物。
本發(fā)明提供了羅漢果皂苷元的新用途，即其在制備抗腫瘤藥物增敏劑中的應(yīng)用。羅漢果皂苷元是天然產(chǎn)物，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用，可以作為腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑；羅漢果皂苷元還具有增加腫瘤多藥耐藥細(xì)胞對抗腫瘤藥 物敏感性的作用，可以作為化療增敏劑使用。本發(fā)明中的小分子化合物羅漢果皂苷元作為新的抗腫瘤藥物或者其輔助成分進(jìn)行開發(fā)，抑瘤效果明顯，綠色環(huán)保，將為治療和治愈腫瘤提供了一種新的途徑和手段。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供了一種抗腫瘤藥物，所述的抗腫瘤藥物的活性成分是羅漢果皂苷元。所述的腫瘤可以是肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞或者血癌細(xì)胞。
本發(fā)明的小分子化合物可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。例如，采用人工化學(xué)合成的方法。
利用本發(fā)明小分子化合物，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與羅漢果皂苷元發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明及其抑制劑、拮抗劑等，在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的羅漢果皂苷元為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的羅漢果皂苷元可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的羅漢果皂苷元還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
實(shí)驗(yàn)方法：
1.細(xì)胞復(fù)蘇
1)從液氮罐中取出凍存管，直接投入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融 化。
2)從37℃水浴中取出凍存管，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并加入10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，棄上清，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次。
3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)至一定濃度時(shí)進(jìn)行傳代。PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10％Gibico胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中；K562、HGC、QGY、MCF-7、PC-3等細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，SK-hep1、HeLa、HepG2、等細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。
2.細(xì)胞傳代培養(yǎng)
每天觀察細(xì)胞生長的情況，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中長至約90％匯合時(shí)傳代，約每隔2-4天傳代一次。一瓶傳代成三瓶，或一個(gè)25cm2傳代于一個(gè)75cm2的培養(yǎng)瓶中。方法：
1)用1×磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞一次。
2)加入2-3ml胰酶消化液消化，置于37℃培養(yǎng)箱中數(shù)分鐘。用手拍打細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分離。
3)用含10-15％的Gibico胎牛血清的合適培養(yǎng)基終止胰酶消化。將細(xì)胞分裝于新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。
懸浮細(xì)胞傳代時(shí)，直接收集于離心管中離心，棄舊培養(yǎng)基。一般一瓶傳代成三瓶的比例分裝于新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
3.細(xì)胞凍存
1)取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細(xì)胞胰蛋白酶消化，收集于離心管中并計(jì)數(shù)，離心。
2)棄除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配置好的凍存培養(yǎng)液(含10％DMSO，40％DMEM和50％Gibico胎牛血清)，凍存液中細(xì)胞的最終濃度為0.5-1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中，每管加1-1.5ml。
3)將凍存管放入凍存盒置-80℃速凍，5小時(shí)后移入液氮罐中保存。
4.實(shí)驗(yàn)材料
藥物準(zhǔn)備：
羅漢果皂苷元溶于DMSO(二甲基亞砜),配制成100mM或50mM的母液備用。其結(jié)構(gòu)如式1所示。
維拉帕米(VPL)、長春新堿(VCR)和阿霉素(ADR)購自羅氏化學(xué)公司，純度都大于99％。
細(xì)胞來源:
人口腔癌細(xì)胞株KB及其耐藥細(xì)胞株KB/VCR由中科院藥物所提供，人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7及其耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR，人結(jié)腸癌HCT-8及其耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR均購自南京凱基生物公司。
試劑盒:
CCK-8試劑盒購自同仁公司。
CCK-8實(shí)驗(yàn)
KB和KB/VCR細(xì)胞以及MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞都按照3500/孔的密度接種到96孔板中，24h后不同濃度的ADR，VCR，羅漢果皂苷元以及VCR和羅漢果皂苷元一起用含10％胎牛血清的α-MEM配好后被加到各個(gè)孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入90μL不含血清的培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑。37℃反應(yīng)2h后，酶標(biāo)儀讀取450nm波長的吸光值(OD450)。通過計(jì)算得到用藥組相對于對照組的細(xì)胞增殖比率?？瞻捉M為不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基，對照組為加入與藥物同體積的DMSO，細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)組OD450-空白組OD450)/(對照組OD450-空白組OD450)。通過IC50值再計(jì)算耐藥倍數(shù)(Resistance Fold，RF)。
RF＝耐藥細(xì)胞株的IC50值/親本細(xì)胞株的IC50值。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
所有耐藥細(xì)胞系在生長抑制實(shí)驗(yàn)之前在無藥物培養(yǎng)基中生長3天。每個(gè)數(shù)值是3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IC50以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。VCR，長春新堿； ADR，柔紅霉素；RF，耐藥倍數(shù)。
實(shí)施例1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
KB/VCR和MCF-7/ADR是兩種常用的多藥耐藥細(xì)胞株，在本實(shí)施例中，這兩種細(xì)胞也表現(xiàn)出多藥耐藥的特性。如表1所示，KB/VCR細(xì)胞相對于KB細(xì)胞對VCR和ADR的耐藥倍數(shù)分別為81.9倍和94.4倍，而MCF-7/ADR細(xì)胞跟MCF-7細(xì)胞相比對VCR和ADR的耐藥倍數(shù)分別是38.1倍和20.9倍，顯示實(shí)驗(yàn)所用耐藥細(xì)胞具有多藥耐藥性，且MDR活性類似于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。
羅漢果皂苷元對親本細(xì)胞株KB和MCF-7的半數(shù)抑制濃度IC50分別為121μΜ和105μΜ，對耐藥細(xì)胞株KB/VCR和MCF-7/ADR的IC50也都大于100μΜ，多藥耐藥細(xì)胞株KB/VCR和MCF-7/ADR沒有表現(xiàn)出對化合物羅漢果皂苷元的交叉耐藥，說明羅漢果皂苷元可以逃脫耐藥細(xì)胞的多藥耐藥性。羅漢果皂苷元在10μΜ以下的濃度下，對細(xì)胞生長無明顯的抑制，高于100μΜ的濃度下會(huì)抑制細(xì)胞的增殖。
結(jié)論：羅漢果皂苷元能夠克服耐藥細(xì)胞株的耐藥性，耐藥細(xì)胞株對羅漢果皂苷元的敏感性基本相同。
實(shí)施例2：CCK-8方法檢測羅漢果皂苷元對腫瘤細(xì)胞多藥耐藥活性的逆轉(zhuǎn)作用
KB/VCR,MCF-7/ADR和HCT-8/VCR細(xì)胞按照3500/孔的密度接種到96孔板 中，24h后不同濃度的VCR，以及不同濃度的VCR和羅漢果皂苷元一起用含10％胎牛血清的α-MEM配好后被加到各個(gè)孔中。培養(yǎng)48h后，棄去培養(yǎng)液，同實(shí)施實(shí)例1中方法，用CCK-8試劑盒測耐藥細(xì)胞株及其親本細(xì)胞對VCR和VCR+羅漢果皂苷元的活性，繪成曲線。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
KB/VCR細(xì)胞對VCR的耐藥倍數(shù)為81.9倍，MCF-7/ADR對ADR的耐藥倍數(shù)為20.9倍。當(dāng)加入10μM的羅漢果皂苷元后，使KB/VCR細(xì)胞對VCR的敏感性增加了1.61倍，而ADR對耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR的敏感性增加了2.17倍。羅漢果皂苷元能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。而這種效應(yīng)在親本細(xì)胞中表現(xiàn)并不明顯。
結(jié)論：
羅漢果皂苷元可以逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞KB/VCR和MCF-7/ADR的耐藥性，可以作為抗腫瘤藥物的增敏劑，或者與抗腫瘤藥物制成藥物組合物。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。