本發(fā)明涉及軟紫草在制備治療乙型病毒性肝炎的藥物中的臨床新用途，屬于制藥
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)自上個世紀六十年代發(fā)現(xiàn)以來，一直在全球范圍內(nèi)困擾著人類，雖然許多國家己經(jīng)廣泛推行免疫計劃，但據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)報告，在全球60億人口中，1/2的人生活在hbv高流行區(qū)，約20億人被證明有hbv感染，3~4億人為hbv慢性感染，其中25%~40%最終將死于肝硬化和肝癌。在全球前10位疾病死因中，乙型病毒性肝炎占第7位，每年因乙型病毒性肝炎死亡者約為75萬例(http://www.who.lnt/csr/disease/hepatitis/)。與世界上的其他國家相比，我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，有60%的人群感染過乙型病毒性肝炎病毒，其中乙型病毒性肝炎病毒攜帶者已超過1.2億，約占總?cè)丝诘?0%，慢性乙型病毒性肝炎病人約3000萬例，每年有30萬人死于乙型病毒性肝炎病毒引起的肝病或相關疾病，而每年乙型病毒性肝炎新發(fā)病人數(shù)約有50萬，每四個傳染病人中就有一位乙型病毒性肝炎病人(張緒清&顧長海，2001)，因此開展對病毒性乙型肝炎的基礎及應用研究已成為重中之重。慢性乙型肝炎屬祖國醫(yī)學黃疽、脅痛、嘔吐、痞證等證的范疇。其病變部位多在肝膽脾胃，多為感受時邪疫毒，郁阻中焦，脾胃運化失常；或飲食不節(jié)，嗜酒過度，損傷脾胃，濕熱郁阻肝膽；或情志所傷，惱怒傷肝等引發(fā)。雖然慢性乙型肝炎的病因病理變化多樣，但氣虛血疲證是其常見、多發(fā)的臨床發(fā)病類型。脾胃乃后天之本，氣血生化之源，病久或失治則脾胃受損，中氣虛弱，脾之運化功能失職，中焦氣機斡旋失常，脈絡郁滯；脾氣虛，無力運化水谷精微濡潤四肢則肢倦乏力；脾胃虛，腐熟水谷無權(quán)則食欲不振，胃氣上逆則惡心嘔吐。氣為血帥，氣行血行，肝藏血、主疏泄，膽為中正之官，儲存和疏泄膽汁，肝膽相互協(xié)調(diào)。若脾氣虛不能統(tǒng)血、肝氣虛調(diào)節(jié)血行無力則血行不暢，血疲肝膽，膽汁不循常道而外溢，導致皮膚、鞏膜黃染。此為本虛標實之證，治當補益中氣，使脾胃健運，氣血生化有源，正氣充足，血運有力，血脈暢通；活血以化疲助行血之力，涼血以散其郁熱，肝膽血疲消除則膽汁可循常道而黃自去。因此，治療宜以益氣升清，活血化疲為主。西醫(yī)認為，慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)病機制主要是由于急性病毒性肝炎患者體內(nèi)的病毒長期未能被清除和機體自身免疫功能障礙。研究證實，慢性乙型病毒性肝炎的發(fā)病機理與肝細胞膜成分的自身免疫反應有關(guldottietal.,1999)，自身免疫是t細胞調(diào)節(jié)下的體液免疫失常，主要表現(xiàn)為抗肝細胞膜成分抗體的出現(xiàn)，這些抗體可直接損傷肝細胞亦可介導抗體依賴性淋巴細胞毒導致肝細胞損傷，并加重病變肝臟的損傷，慢性乙型活動性肝炎的肝細胞損害和炎癥反應是由于免疫細胞對肝組織反應的結(jié)果，其中以細胞毒性t細胞破壞有病毒肝細胞最為重要。細胞毒性t細胞在清除肝細胞內(nèi)的hbv時發(fā)揮重要作用，它能識別表面有病毒抗的肝細胞，在巨嗜細胞的協(xié)同作用下攻擊肝細胞并使其破壞，同時殺滅細胞內(nèi)hbv(websteretal.,2000)。但目前臨床上尚無能確切有效地完全清除乙型病毒性肝炎病毒的特效藥物。我國中草藥資源豐富，在防治乙型肝炎方面積累了大量的經(jīng)驗，也顯現(xiàn)出了中藥資源優(yōu)勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：1.本發(fā)明的目的在于提供一種治療乙型病毒性肝炎的藥物制劑及其制備方法。2.本發(fā)明的治療乙型病毒性肝炎的中藥材，主要由中藥原料軟紫草制成。3.上述本發(fā)明的中藥材,還進一步包括加入藥用輔料制成制劑形式,所述制劑選自為散劑、片劑、顆粒劑、膠囊劑、微囊劑、丸劑、滴丸、軟膠囊、口服液、糖漿劑、分散片等任一藥劑學范疇上合理劑型；所用的輔料選自常規(guī)的溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑、粘合劑、潤滑劑、濕潤劑、增稠劑、增溶劑。4.本發(fā)明中將中藥材用于治療乙型病毒性肝炎，是以水、乙醇或二氧化碳為溶媒提取的中藥材提取物，制備成適用于臨床上使用的藥物。5.優(yōu)選的，以水為溶媒提取中藥材提取物包括以下步驟：將中藥材切制成0.02～2cm段，稱取60～110g，用6～10倍量水將藥材浸潤30～120min，煎煮1～3次，每次1～3小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為65～75℃、真空度為0.08～0.1mpa的條件下減壓干燥，即得。6.更優(yōu)選的，以水為溶媒提取中藥材提取物包括以下步驟：將中藥材切制成1cm段，稱取80g，用8倍量水將藥材浸潤30min，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為70℃、真空度為0.1mpa的條件下減壓干燥，即得。7.制劑中，采取辯證與辨病相結(jié)合，根據(jù)中醫(yī)整體觀念及辯證論治的特點，針對急、慢性肝炎，病毒性肝炎的中醫(yī)學病機—黃疸、肋痛、肝瘟、積聚進行選藥組方而成，方中軟紫草有清熱解毒，保肝利膽之功效。8.為了確保本發(fā)明的效果，發(fā)明人進行了一系列的實驗來選擇本發(fā)明提供的中藥材提取物的提取工藝，保證科學、合理、可行；同時為了驗證中藥材在治療乙型病毒性肝炎及其并發(fā)癥方面的作用效果，申請人進行了一系列試驗研究，具體如下：實驗例1提取溶媒的選擇及提取方法的粗選取中藥材的粗粉80克，按下表1中的方案進行試驗，試驗結(jié)果如表2所示：表1不同提取方案方案一煎煮提取2次，每次2小時，加水量每次為10倍藥材量方案二回流提取2次，每次2小時，加5%乙醇量為10倍藥材量方案三回流提取2次，每次2小時，加40%乙醇量為10倍藥材量方案四回流提取2次，每次2小時，加80%乙醇量為10倍藥材量方案五回流提取2次，每次2小時，加95%乙醇量為10倍藥材量方案六超臨界co2結(jié)合質(zhì)量比為5%的乙醇作夾帶劑，壓力30mpa、萃取溫度50℃、靜態(tài)浸泡時間3h，動態(tài)萃取3h；方案七超臨界co2結(jié)合質(zhì)量比為40%的乙醇作夾帶劑，壓力30mpa、萃取溫度50℃、靜態(tài)浸泡時間3h，動態(tài)萃取3h；方案八超臨界co2結(jié)合質(zhì)量比為75%的乙醇作夾帶劑，壓力30mpa、萃取溫度50℃、靜態(tài)浸泡時間3h，動態(tài)萃取3h；方案九超臨界co2結(jié)合質(zhì)量比為95%的乙醇作夾帶劑，壓力30mpa、萃取溫度50℃、靜態(tài)浸泡時間3h，動態(tài)萃取3h；表2不同提取溶劑對出膏率的影響由表2可知：中藥材以水和二氧化碳為溶媒進行提取，提取物的出膏率最高，從節(jié)約成本考慮，選擇水作為最佳提取溶媒，提取方式選擇煎煮提取。實驗例2中藥材水提工藝考察一、藥材的炮制長度對出膏率的影響稱取中藥材80g，用10倍量水將藥材浸潤30分鐘，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，進行出膏率測定，結(jié)果見表3：表3藥材炮制長度對出膏率的影響由上表3可知：藥材粗粉的出膏率最高，但是由于藥材粗粉提取后藥液難于濾過，實驗時雖然可用機械的方法榨干藥渣，但并不適用于大工業(yè)生產(chǎn)；而且切制成1.0cm段的藥材的出膏率與藥材粗粉的出膏率相近，故以切制成1.0cm段進行提取為佳。二、浸泡時間對出膏率的影響藥材吸水率測定：將中藥材炮制成1.0cm段，稱取80g，加水至浸泡藥材完全，過夜，測定其吸水率，結(jié)果見表4：表4浸泡過夜藥材吸水率測定稱取80g炮制成1.0cm段的中藥材，用10倍量水將藥材浸潤不同時間，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，測定出膏率，結(jié)果見表5：表5藥材不同浸泡時間由上表5可知：不同的浸泡時間，對藥材的出膏率影響不大，從節(jié)約時間和成本考慮，以浸潤30分鐘為佳。三、不同加水量、煎煮時間和提取次數(shù)對出膏率的影響在藥材炮制長度和浸泡時間確定之后，根據(jù)預實驗，選定對影響出膏率的主要因素：煎煮時間、提取次數(shù)和加水量，采用正交實驗的方法，以三因素的三個不同水平來進行考察各環(huán)節(jié)對出膏率的影響，從而選取最佳工藝。其中因素水平如表6所示：表6綜合評價實驗水平采用l9(34)正交表進行試驗，稱取80炮制成1.0cm段的中藥材，按表6中的因素和水平條件進行，藥材浸泡時間均為30分鐘，提取后，提取液濾過，濾液濃縮，進行出膏率測定，結(jié)果如表7所示：表7正交表實驗結(jié)果由表7可知：各因素影響的順序為a>b>軟紫草，最佳提取工藝為a2b2c2，即：炮制成1.0cm段的中藥材提取2次，第一次加8倍量水浸泡30分鐘，煎煮2小時，第二次加8倍量水煎煮2小時。實驗例3提取方案驗證根據(jù)優(yōu)選出的試驗條件，稱取10000g炮制成1.0cm段的中藥材，提取2次，第一次加8倍量水浸泡30分鐘，煎煮2小時，第二次加8倍量水煎煮2小時，提取后，提取液濾過，濾液濃縮，減壓干燥（溫度為65～75℃，真空度為0.08～0.1mpa）進行出膏率測定，結(jié)果如表8所示：表8提取方案驗證由上表8可見，優(yōu)選出的試驗條件用來提取中藥材是合理、可行的。上述實驗例中所述出膏率測定的具體方法為：取濃縮至相對密度1.20～1.30（測定溫度60℃）的清膏，轉(zhuǎn)移至1000ml的容量瓶中并定容，搖勻，精密量取20ml分別置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，殘渣于105℃干燥3小時，取出，置干燥器中放置30分鐘，稱重，計算；超臨界二氧化碳萃取的提取物水浴揮干，置于105℃下干燥至恒重，稱重，計算?！揪唧w實施方式】藥效學試驗及本發(fā)明中藥制劑提取物的制備本發(fā)明不受下述實施例的限制,可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實際情況來確定具體的實施方式?！揪唧w實施方式】本發(fā)明中藥制劑的提取物藥效學試驗1材料1.1實驗動物廣州麻鴨，購自廣州石井潮陽孵化場。實驗時體質(zhì)量為90～105。藥物及試劑本發(fā)明中藥材（批號：20150103）;拉米夫定:葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn);地高辛dna標記與檢測試劑盒，roche公司產(chǎn)品;hbsagelisa檢測試劑盒，購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;alt、ast試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。方法2.1造模與給藥取健康1日齡廣州麻鴨，經(jīng)腹腔接種0.2mldhbv-dna陽性病毒血清，接種1w后，分別于頸外靜脈取血，用地高辛標記的dhbv-dna探針經(jīng)斑點雜交檢測篩選出感染陽性鴨，飼養(yǎng)至3周齡作為模型動物。將dhbv感染陽性的廣州麻鴨隨機分為5組，即模型對照組、拉米夫定組及本發(fā)明提取物低、中及高劑量組，每組12只。模型組灌服生理鹽水，拉米夫定組按劑量50mg/kg灌服拉米夫定，本發(fā)明提取物低、中、高劑量組分別按劑量6.5、13.0、26.0mg/kg灌服本發(fā)明提取物。1次/d，連續(xù)28d。指標檢測于給藥前、給藥后7、14、28d、停藥后7d，分別自頸外靜脈取血，分離血清，采用斑點雜交法，用地高辛標記的dhbv-dna探針將給藥前后的血清進行檢測，以與探針同源的質(zhì)粒dna倍比稀釋后點樣于硝酸纖維薄膜上雜交顯示的斑點顏色深淺為標準，用掃描儀進行膜片掃描并進行斑點定量分析，并按公式volume=intensity×mm2計算斑點值volume，以反映血清dhbv-dna滴度水平;采用elisa法通過酶標儀讀取光密度d(λ)值檢測血清hbsag水平;對給藥28d與停藥后7d的血清，同時按照試劑盒進行alt和ast活性的檢測。此外，于停藥后第7天分別處死各組動物，取肝組織置于10%甲醛溶液中固定，石蠟切片后用he染色，進行病理檢查。統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用的統(tǒng)計軟件為spss16.0，組間比較采用one-wayanova統(tǒng)計處理。結(jié)果3.1本發(fā)明中藥材提取物對鴨血清中dhbv-dna滴度的影響結(jié)果如表1所示，于給藥后第7天開始，拉米夫定組動物血清中dhbv-dna滴度與模型對照組比較，顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，但在停藥后第7天，血清中dhbv-dna滴度的水平有所升高。給藥后第28d及停藥后第7天，本發(fā)明中藥材提取物低劑量組動物血清中dhbv-dna滴度與模型組比較均差異顯著(p＜0.05或p＜0.01);于給藥后第7天開始，本發(fā)明中藥材提取物中、高劑量組動物血清dh-bv-dna滴度與模型組比較均差異顯著(p＜0.05或p＜0.01)，且在停藥后第7天，血清中dhbv-dna滴度的水平未見升高。表1本發(fā)明中藥材提取物對鴨血清中dhbv-dna滴度的影響(x±s，n=12)注:與模型組比較，*p<0.05，**p<0.013.2本發(fā)明提取物對鴨血清中hbsag的影響結(jié)果如表2所示，于給藥后第7天開始，拉米夫定組動物血清hbsag的d(λ)值與模型組比較差異顯著(p＜0.05或p＜0.01)，但在停藥后第7天，血清中hbsag的d(λ)值有所升高。給藥后第28天，本發(fā)明提取物低劑量組動物血清中hbsag的d(λ)值與模型組比較差異顯著(p＜0.05);于給藥后第1天開始，本發(fā)明提取物中、高劑量組動物血清中hbsag的d(λ)值與模型組比較差異顯著(p＜0.05或p＜0.01)，且在停藥后第7天，血清中hbsag的d(λ)值無明顯升高。表2本發(fā)明提取物對鴨血清中hbsag的影響(x±s，n=12)注:與模型組比較，*p<0.05，**p<0.013.3本發(fā)明提取物對鴨血清ast和alt的影響結(jié)果如表3所示，給藥后第28天及停藥后第7天，拉米夫定組動物血清ast和alt的活性較模型組顯著升高(p＜0.01)，但在停藥后第7天，血清ast和alt的活性與給藥后第28天相比，略有上升。在給藥后第28天及停藥后第7天，本發(fā)明提取物低、中、高劑量組動物血清ast和alt的活性均較模型組顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，且在停藥后第7天，血清ast和alt的活性未見明顯升高。表3本發(fā)明提取物對鴨血清ast、alt的影響(x±s，n=12)注:與模型組比較，*p<0.05，**p<0.013.4本發(fā)明提取物對肝組織病理變化的影響肝組織he染色結(jié)果顯示:模型組肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝索紊亂，肝細胞渾濁腫大、變性，部分組織匯管區(qū)小葉間隔有明顯炎癥細胞浸潤及肝細胞點狀或灶狀壞死現(xiàn)象;拉米夫定組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞形態(tài)未見明顯異常，未見明顯炎癥細胞浸潤及肝細胞壞死現(xiàn)象;本發(fā)明提取物高劑量組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝血竇清晰，細胞無渾濁腫大，未見明顯炎癥細胞浸潤及肝細胞壞死現(xiàn)象;本發(fā)明提取中劑量物組少量肝細胞輕度渾濁腫大，可見散在分布的少量點、灶狀壞死;本發(fā)明提取物低劑量組肝組織結(jié)構(gòu)有少部分不正常，并有少量的炎癥細胞浸潤及肝細胞點狀或灶狀壞死現(xiàn)象。討論鴨乙型肝炎病毒與人乙型肝炎病毒同屬嗜肝病毒科，在病毒復制及致病性等方面十分相似，故以dhbv感染的鴨作為研究dhbv致病機理和抗乙型肝炎病毒藥物評價的實驗動物模型已被國內(nèi)外學者公認。本研究采用鴨乙型肝炎模型，考察本發(fā)明提取物在體內(nèi)抗鴨乙型肝炎病毒的作用，結(jié)果表明:本發(fā)明提取物能顯著降低乙型肝炎模型鴨血清中dhbv-dna滴度、hbsag水平以及ast、alt活性，且在停藥后第7天，未見反跳現(xiàn)象;停藥后第7天時肝組織he染色結(jié)果亦顯示:本發(fā)明提取物能減少肝細胞的變性與壞死及炎癥細胞浸潤。提示本發(fā)明提取物具有顯著的抗鴨乙型肝炎病毒的作用。【具體實施方式】本發(fā)明中藥制劑提取物的制備本發(fā)明的實施例1：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取80g，用8倍量水將藥材浸潤30min，煎煮2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為70℃、真空度為0.1mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例2：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成0.5cm段，稱取90g，用7倍量水將藥材浸潤60min，煎煮2次，每次2.5小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為68℃、真空度為0.09mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例3：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成2cm段，稱取110g，用10倍量水將藥材浸潤120min，煎煮3次，每次3小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為75℃、真空度為0.1mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例4：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成0.02cm段，稱取80g，用6倍量水將藥材浸潤30min，煎煮1小時，濾過，濃縮，于溫度為65℃、真空度為0.08mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例5：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，加10倍藥材量的5%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為72℃、真空度為0.09mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例6：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，加10倍藥材量的40%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為72℃、真空度為0.09mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例7：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，加10倍藥材量的80%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為72℃、真空度為0.09mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例8：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，加10倍藥材量的95%乙醇回流提取2次，每次2小時，濾過，合并濾液，濃縮，于溫度為72℃、真空度為0.09mpa的條件下減壓干燥，即得。實施例9：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，co2超臨界提取，其中，以質(zhì)量比為5%的乙醇作夾帶劑，萃取壓力為30mpa，萃取溫度為50℃，靜態(tài)浸泡時間為3h，動態(tài)萃取3h，減壓干燥，即得。實施例10：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，co2超臨界提取，其中，以質(zhì)量比為40%的乙醇作夾帶劑，萃取壓力為30mpa，萃取溫度為50℃，靜態(tài)浸泡時間為3h，動態(tài)萃取3h，減壓干燥，即得。實施例11：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，二氧化碳超臨界提取，其中，以質(zhì)量比為75%的乙醇作夾帶劑，萃取壓力為30mpa，萃取溫度為50℃，靜態(tài)浸泡時間為3h，動態(tài)萃取3h，減壓干燥，即得。實施例12：本發(fā)明中藥材提取物的制備：將本發(fā)明中藥材切制成1cm段，稱取100g，co2超臨界提取，其中，以質(zhì)量比為95%的乙醇作夾帶劑，萃取壓力為30mpa，萃取溫度為50℃，靜態(tài)浸泡時間為3h，動態(tài)萃取3h，減壓干燥，即得。實施例13：取實施例1~4任一所得的本發(fā)明中藥材提取物，加入適量的常規(guī)輔料，混勻，烘干，滅菌，裝入硬膠囊，包裝，制成膠囊劑。。實施例14：取實施例5~8任一所得的本發(fā)明中藥材提取物，加適量的增溶劑，研磨，加入少量水稀釋，混勻，加入矯味劑和防腐劑，混勻，加水至規(guī)定量，過濾，混勻，分裝，滅菌，制成口服液。實施例15：取實施例9~12任一所得的本發(fā)明中藥材提取物，加適量的常規(guī)輔料，混勻，制成顆粒，干燥，壓片，制成片劑。實施例16：取實施例1~4任一所得的本發(fā)明中藥材提取物，加入適量常用輔料，成丸，干燥，制成丸劑。當前第1頁12