嵌合因子viii多肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供包含VWF的D’結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段、包含所述VWF片段和異源部分的嵌合蛋白或包含所述VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白及其使用方法。包含本發(fā)明的VWF片段的多肽鏈結(jié)合包含F(xiàn)VIII蛋白的多肽鏈或與之締合，并且包含所述VWF片段的所述多肽鏈可阻止或抑制內(nèi)源性VWF與所述FVIII蛋白的結(jié)合。通過阻止或抑制作為FVIII的半衰期限制因子的內(nèi)源性VWF與所述FVIII的結(jié)合，所述VWF片段可誘導(dǎo)所述FVIII蛋白的半衰期延長(zhǎng)。本發(fā)明還包括核苷酸、載體、宿主細(xì)胞、使用所述VWF片段或所述嵌合蛋白的方法。
【專利說明】嵌合因子VlII多肽及其用途
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 凝血是血液形成凝塊的復(fù)雜過程。它是止血即阻止受損血管的失血的重要部分， 其中受損血管壁被含血小板和血纖維蛋白的凝塊覆蓋，以終止流血并開始修復(fù)受損血管。 凝血障礙可導(dǎo)致出血（溢血）或阻塞性凝血（血栓形成）的風(fēng)險(xiǎn)增加。
[0003] 凝血幾乎在血管損傷破壞血管的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯后的瞬間開始。血液暴露于蛋白質(zhì) 例如組織因子引發(fā)了血小板和血漿蛋白凝血因子血纖維蛋白原的變化。血小板立即在損 傷部位形成血塞；這稱為初期止血。二期止血與此同時(shí)進(jìn)行：血漿中稱為凝血因子或凝固 因子的蛋白質(zhì)在復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中響應(yīng)，形成增強(qiáng)血小板栓的血纖維蛋白鏈。非限制性凝 血因子包括但不限于：因子I(血纖維蛋白原）、因子II(凝血酶原）、組織因子、因子V(促 凝血球蛋白原、不穩(wěn)定因子）、因子VII(穩(wěn)定因子、前轉(zhuǎn)變素）、因子VIII(抗血友病因子 A)、因子IX(抗血友病因子B或克雷司馬斯因子（Christmasfactor))、因子X(斯圖亞特 因子（Stuart-Prowerfactor))、因子XI(血楽促凝血酶原激酶先質(zhì)）、因子XII(接觸因 子（Hagemanfactor))、因子XIII(血纖維蛋白穩(wěn)定因子）、VWF、前激肽釋放酶（弗萊徹因 子（Flectcherfactor))、高分子量激肽原（HMWK)(菲茨杰拉德因子）、纖連蛋白、抗凝血酶 III、肝素輔因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、血纖維蛋白溶酶原、α2-抗血纖維蛋白溶酶、組 織血纖維蛋白溶酶原激活物（tPA)、尿激酶、血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑-I(PAIl)和 血纖維蛋白溶酶原激活物抑制劑-2 (PAI2)。
[0004] 甲型血友病是編碼凝血因子VIII(FVIII)的基因缺陷導(dǎo)致的出血性病癥，并且在 10, 000 例出生男性中有 1-2 例受其影響。Graw等，Nat.Rev.Genet. 6(6) :488-501 (2005)。 受甲型血友病影響的患者可通過輸注純化的或重組產(chǎn)生的FVIII治療。然而，所有市 售FVIII產(chǎn)品已知具有約8-12小時(shí)的半衰期，因此需要頻繁向患者靜脈內(nèi)施用。參見 WeinerΜ.A.和Cairo,M.S.，PediatricHematologySecrets,Lee,M.T. , 12.Disorders ofCoagulation,ElsevierHealthSciences, 2001 ;Lillicrap,D.Thromb.Res. 122 增干丨J 4:S2-8(2008)。此外，為延長(zhǎng)FVIII半衰期已嘗試過多種方法。例如，在開發(fā)中延長(zhǎng)凝血 因子半衰期的方法包括聚乙二醇化、糖聚乙二醇化以及與白蛋白綴合作用。參見Dumont 等，Blood. 119(13) :3024-3030(2012年1月13日在線發(fā)表）。然而，不考慮所用的蛋白質(zhì)工 程，目前正在開發(fā)的長(zhǎng)效FVIII產(chǎn)品具有提高的半衰期，但據(jù)報(bào)道半衰期有限一在臨床前 動(dòng)物模型中僅提高約1.5至2倍。出處同上。在人類中顯示出一致的結(jié)果，例如，據(jù)報(bào)道在甲 型血友病患者中與ADVATE京相比，rFVIIIFc提高半衰期最多約1.7倍。出處同上。因此， 盡管提高量很小，半衰期增加可表明存在其它T1/2限制因素。參見Liu，T.等，2007ISTH會(huì) 議，摘要 #P-M-035 ;Henrik,A.等，2011ISTH會(huì)議，摘要#P=M0-181 ;Liu,T.等，2011ISTH 會(huì)議，摘要#P-WE-131。
[0005] 血漿血管性血友病因子（VWF)具有大約12小時(shí)（在9至15小時(shí)的范圍內(nèi)）的半 衰期。http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm(最近訪 問2011年10月22日）。VWF半衰期可受到多種因素的影響：糖基化模式、ADAMTS-13(具 有血小板反應(yīng)蛋白基序-13的解聚素和金屬蛋白酶）以及VWF中的各種突變。
[0006] 在血漿中，95-98 %的FVIII在具有全長(zhǎng)VWF的緊密非共價(jià)復(fù)合物中循 環(huán)。該復(fù)合物的形成對(duì)于在體內(nèi)維持適當(dāng)?shù)腇VIII血楽水平是重要的。Lenting 等，Blood. 92 (11) : 3983-96 (1998);Lenting等，J.Thromb.Haemost. 5 (7) : 1353-60 (2007)。 全長(zhǎng)野生型FVIII主要以具有重鏈（MW200kd)和輕鏈（MW73kd)的異源二聚體存在。當(dāng) FVIII由于重鏈第372和740位和輕鏈第1689位的蛋白水解而活化時(shí)，結(jié)合到FVIII的 VWF從活化的FVIII移除?；罨腇VIII連同活化的因子IX、鈣和磷脂（"因子X酶復(fù)合物 (tenasecomplex)"）一起參與因子X的活化，從而生成大量凝血酶。凝血酶繼而切割血纖 維蛋白原，形成可溶性血纖維蛋白單體，所述可溶性血纖維蛋白單體然后自發(fā)聚合形成可 溶性血纖維蛋白聚合物。凝血酶還活化因子XIII，其連同鈣一起用于交聯(lián)并且穩(wěn)定可溶性 血纖維蛋白聚合物，形成交聯(lián)（不溶性）血纖維蛋白?；罨腇VIII通過蛋白水解從循環(huán) 迅速清除。
[0007] 由于頻繁給藥以及給藥方案造成的不便，仍需要開發(fā)不需要頻繁施用的FVIII產(chǎn) 品，即半衰期長(zhǎng)于1. 5至2倍半衰期限制的FVIII產(chǎn)品。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明涉及包含因子VIII("FVIII")蛋白和輔助部分（"AM")的嵌合蛋白，其中所 述輔助部分抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白。所述FVIII蛋白和所述輔助部分 通過共價(jià)鍵彼此連接，以阻止在內(nèi)源性VWF存在下所述輔助部分的解離。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述共價(jià)鍵是肽鍵、二硫鍵或連接基（Iinker)，其強(qiáng)度足以阻止在內(nèi)源性VWF存在下所 述輔助部分從所述FVIII蛋白解離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述輔助部分阻止所述FVIII蛋 白通過VWF清除途徑被清除。在其它實(shí)施方案中，所述輔助部分通過屏蔽或阻斷所述FVIII 蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白。例如，VWF結(jié)合位點(diǎn) 位于所述FVIII蛋白的所述A3結(jié)構(gòu)域或所述C2結(jié)構(gòu)域或所述A3結(jié)構(gòu)域和所述C2結(jié)構(gòu)域 二者。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包括包含通過共價(jià)鍵彼此連接的FVIII蛋白和 輔助部分的構(gòu)建體，其中所述嵌合蛋白不包括引起所述FVIII蛋白的半衰期限制的FVIII半衰期限制因子，如全長(zhǎng)VWF蛋白或成熟VWF蛋白。因此，在一些實(shí)施方案中，在內(nèi)源性VWF 存在下，所述嵌合蛋白的所述FVIII蛋白的所述半衰期可延長(zhǎng)超過所述FVIII蛋白的所述 半衰期限制。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，所述輔助部分具有至少一種VWF樣FVIII保護(hù)特性。所述VWF 樣FVIII保護(hù)特性的實(shí)例包括但不限于：保護(hù)所述FVIII蛋白不被一種或多種蛋白酶切割、 保護(hù)所述FVIII蛋白不被活化、穩(wěn)定所述FVIII蛋白的所述重鏈和/或所述輕鏈或防止所 述FVIII蛋白被一種或多種清除劑受體清除。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述輔助部分包括多肽、 非多肽部分或它們二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述輔助部分可以是包含長(zhǎng)度為至少約40 個(gè)、至少約50個(gè)、至少約60個(gè)、至少約70個(gè)、至少約80個(gè)、至少約90個(gè)、至少約100個(gè)、至 少約110個(gè)、至少約120個(gè)、至少約130個(gè)、至少約140個(gè)、至少約150個(gè)、至少約200個(gè)、至 少約250個(gè)、至少約300個(gè)、至少約350個(gè)、至少約400個(gè)、至少約450個(gè)、至少約500個(gè)、至 少約550個(gè)、至少約600個(gè)、至少約650個(gè)、至少約700個(gè)、至少約750個(gè)、至少約800個(gè)、至 少約850個(gè)、至少約900個(gè)、至少約950個(gè)或至少約1000個(gè)氨基酸的氨基酸序列的多肽。在 某些實(shí)施方案中，所述輔助部分包括VWF片段、免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片 段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的任何組合。在其它實(shí) 施方案中，所述輔助部分是包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或 它們的任何組合的非多肽部分。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，所述輔助部分包括包含VWF的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片 段，其中所述VWF片段通過除所述FVIII蛋白和所述輔助部分（VWF片段）之間的所述共價(jià) 鍵之外的非共價(jià)鍵與所述FVIII蛋白締合。在一個(gè)實(shí)例中，所述VWF片段是單體。在另一 個(gè)實(shí)例中，所述VWF片段包括彼此之間一個(gè)或多個(gè)連接的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)VWF 片段。
[0013] 在一個(gè)方面，所述嵌合蛋白包含輔助部分如VWF片段和至少一個(gè)異源部分（Hl)以 及所述輔助部分如VWF片段和所述異源部分（Hl)之間任選的連接基。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述異源部分（Hl)可包括延長(zhǎng)所述FVIII蛋白的所述半衰期的部分，如選自由以下組成的 組的多肽：免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP 序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以及它們的任何組合；或選自自由以下組成的組的非多肽部分： 聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合。在一個(gè)實(shí)施 方案中，所述異源部分（Hl)包括第一Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源部分（Hl)包 括包含至少約50個(gè)氨基酸、至少約100個(gè)氨基酸、至少約150個(gè)氨基酸、至少約200個(gè)氨基 酸、至少約250個(gè)氨基酸、至少約300個(gè)氨基酸、至少約350個(gè)氨基酸、至少約400個(gè)氨基酸、 至少約450個(gè)氨基酸、至少約500個(gè)氨基酸、至少約550個(gè)氨基酸、至少約600個(gè)氨基酸、至 少約650個(gè)氨基酸、至少約700個(gè)氨基酸、至少約750個(gè)氨基酸、至少約800個(gè)氨基酸、至少 約850個(gè)氨基酸、至少約900個(gè)氨基酸、至少約950個(gè)氨基酸或至少約1000個(gè)氨基酸的氨 基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含所述輔助部分如VWF片段和所述異源部 分（Hl)之間的連接基，所述連接基是可切割的連接基。
[0014] 在另一個(gè)方面，所述嵌合蛋白中的所述FVIII蛋白包含F(xiàn)VIII和至少一個(gè)異源部 分（H2)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源部分（H2)能夠延長(zhǎng)所述FVIII蛋白的所述半衰期， 如選自由免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序 列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以及它們的任何組合組成的組的多肽或包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液 酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合的非多肽部分。在具體實(shí)施方案中，所 述異源部分（H2)包括第二Fc區(qū)。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽 鏈包含所述VWF片段、第一異源部分和連接基，所述第二多肽鏈包含所述FVIII蛋白和第二 異源部分，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈通過共價(jià)鍵彼此連接。在一個(gè)實(shí)例中，所 述第一異源部分和所述第二異源部分通過所述共價(jià)鍵，如二硫鍵、肽鍵或連接基彼此連接， 其中所述共價(jià)鍵防止體內(nèi)所述第一多肽鏈中的所述VWF片段被內(nèi)源性VWF替換。在一些實(shí) 施方案中，所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間的所述連接基是可切割的連接基。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，連接至所述VWF片段的所述第一異源部分（Hl)和連接至所述 FVIII蛋白的所述第二異源部分（H2)通過連接基，如scFc連接基連接，所述連接基是可加 工的連接基。
[0017] 在其它實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白中的所述FVIII蛋白還包含第三異源部分 (H3)、第四異源部分（H4)、第五異源部分（H5)、第六異源部分（H6)或它們的任何組合。在一 個(gè)實(shí)施方案中，所述第三異源部分（H3)、所述第四異源部分（H4)、所述第五異源部分（H5)、 所述第六異源部分（H6)中的一者或多者能夠延長(zhǎng)所述FVIII蛋白的所述半衰期。在另一 個(gè)實(shí)施方案中，所述第三異源部分（H3)、所述第四異源部分（H4)、所述第五異源部分（H5) 和所述第六異源部分（H6)連接至FVIII的所述C末端或N末端或插入FVIII的兩個(gè)氨基 酸之間。在其它實(shí)施方案中，所述第三異源部分（H3)、所述第四異源部分（H4)、所述第五異 源部分（H5)或所述第六異源部分（H6)中的一者或多者包括包含至少約50個(gè)氨基酸、至少 約100個(gè)氨基酸、至少約150個(gè)氨基酸、至少約200個(gè)氨基酸、至少約250個(gè)氨基酸、至少約 300個(gè)氨基酸、至少約350個(gè)氨基酸、至少約400個(gè)氨基酸、至少約450個(gè)氨基酸、至少約500 個(gè)氨基酸、至少約550個(gè)氨基酸、至少約600個(gè)氨基酸、至少約650個(gè)氨基酸、至少約700個(gè) 氨基酸、至少約750個(gè)氨基酸、至少約800個(gè)氨基酸、至少約850個(gè)氨基酸、至少約900個(gè)氨 基酸、至少約950個(gè)氨基酸或至少約1000個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間的所述連接基或所 述VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基還包含位于所述連接基的所述N-末端 區(qū)的第一切割位點(diǎn)（Pl)、位于所述連接基的所述C-末端區(qū)的第二切割位點(diǎn)（P2)或它們二 者。在其它實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白和所述輔助部分之間的所述連接基、所述FVIII蛋 白和所述第二異源部分之間的所述連接基以及所述VWF片段和所述第一異源部分之間的 所述連接基中的一者或多者具有約1至約2000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
[0019] 在其它實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白包含F(xiàn)VIII蛋白和輔助部分，它們通過所述 FVIII蛋白和所述輔助部分之間的連接基連接，其中所述連接基還包含分選酶識(shí)別基序，如 所述序列LPXTG(SEQIDNO: 106)。
[0020] 本發(fā)明涉及血管性血友病因子（vonWillebrandFactor,VWF)片段，所述血管性 血友病因子片段包含VWF的所述D'結(jié)構(gòu)域和所述D3結(jié)構(gòu)域，其中所述VWF片段結(jié)合因子 VIII(FVIII)并且抑制內(nèi)源性VWF與FVIII蛋白結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的所述 VWF片段不是SEQIDNO: 2的第764至1274位氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，無(wú)所述VWF片 段的所述FVIII蛋白具有相當(dāng)于野生型FVIII的半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述FVIII 蛋白是包含F(xiàn)VIII和能夠延長(zhǎng)FVIII的半衰期的異源部分的融合蛋白。所述異源部分可以 是多肽、非多肽部分或它們二者。所述異源多肽部分可選自由以下組成的組：免疫球蛋白恒 定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段 以及它們的任何組合。在其它實(shí)施方案中，所述異源部分是免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分，如 Fc區(qū)。在其它實(shí)施方案中，所述非多肽部分選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、聚唾液 酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合。在某些實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白 包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包含F(xiàn)VIII和第一Fc區(qū)，并且所述第 二多肽鏈包含無(wú)FVIII的第二Fc區(qū)。
[0021] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VWF片段延長(zhǎng)FVIII的半衰期。所述D'結(jié)構(gòu)域的所述 氨基酸序列與SEQIDNO:2的第764至866位氨基酸可具有至少90%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%的同一性。另外，所述D3結(jié)構(gòu)域的所述氨基酸序列與SEQIDNO:2的第 867至1240位氨基酸可具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在 某些實(shí)施方案中，所述VWF片段包含在對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2的第1099位殘基、第1142位殘 基或它們二者的殘基處的至少一個(gè)氨基酸取代。在具體實(shí)施方案中，VWF片段包含、基本上 由或由SEQIDNO: 2的第764至1240位氨基酸組成。所述VWF片段還可包含VWF的所述Dl結(jié)構(gòu)域、所述D2結(jié)構(gòu)域或所述Dl和D2結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述VWF片段還包 含選自由以下組成的組的VWF結(jié)構(gòu)域：所述Al結(jié)構(gòu)域、所述A2結(jié)構(gòu)域、所述A3結(jié)構(gòu)域、所 述D4結(jié)構(gòu)域、所述Bl結(jié)構(gòu)域、所述B2結(jié)構(gòu)域、所述B3結(jié)構(gòu)域、所述Cl結(jié)構(gòu)域、所述C2結(jié) 構(gòu)域、所述CK結(jié)構(gòu)域、它們的一個(gè)或多個(gè)片段以及它們的任何組合。在其它實(shí)施方案中，所 述VWF片段是聚乙二醇化的、糖基化的、羥乙基淀粉化的（hesylated)或聚唾液酸化的。
[0022] 本發(fā)明還涉及包含本文所述的VWF片段、異源部分以及所述VWF片段和所述異源 部分之間的任選的連接基的嵌合蛋白。所述異源部分可以是多肽、非多肽部分或它們二者。 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源多肽部分選自由以下組成的組：免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、 白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以及它們的任何 組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源非多肽部分選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、 聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合。在具體實(shí)施方案中，所述異源 部分是第一Fc區(qū)。所述嵌合蛋白還可包含第二Fc區(qū)，其中所述第二Fc區(qū)連接至所述第一 Fc區(qū)或與所述第一Fc區(qū)締合，或連接至所述VWF片段或與所述VWF片段締合。
[0023] 在一個(gè)方面，本發(fā)明的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：
[0024] (aa)V_L1_H1_L2_H2,
[0025] (bb)H2-L2-Hl-Ll-V,
[0026] (cc)H1_L1_V_L2_H2,和
[0027] (dd)H2_L2_V_L1_H1,
[0028] 其中V是本文所述的一個(gè)或多個(gè)VWF片段，
[0029]Ll和L2中的每個(gè)是任選的連接基；
[0030] Hl是第一異源部分；
[0031] (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸；并且
[0032] H2是任選的第二異源部分。
[0033] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Hl是第一異源部分，如本領(lǐng)域已知的半衰期延長(zhǎng)分子。在一個(gè) 實(shí)施方案中，所述第一異源部分是多肽。所述第一異源多肽部分選自由以下組成的組：免疫 球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白 或其片段以及它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，Hl是選自由以下組成的組的非多肽 部分：聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合。H2是 任選的第二異源部分，如本領(lǐng)域已知的半衰期延長(zhǎng)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二異源 部分可選自由以下組成的組：免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部 分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以及它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H2 是選自由以下組成的組的非多肽部分：聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍 生物以及它們的任何組合。在某些實(shí)施方案中，Hl是第一Fc區(qū)，并且H2是第二Fc區(qū)。所 述第一Fc區(qū)和所述第二Fc區(qū)可以是相同的或不同的，并且可以通過連接基或共價(jià)鍵如二 硫鍵彼此連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二Fc區(qū)連接至因子VIII蛋白或與因子VIII 蛋白締合。任選地，可存在作為半衰期延長(zhǎng)因子的第三異源部分H3,其連接至所述VWF片 段、所述第一異源部分或所述第二異源部分。所述第三異源部分的非限制性實(shí)例可包括多 肽或非多肽部分或它們二者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第三異源多肽部分可選自由以下組 成的組：免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序 列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H2是選自由以下組成的 組的非多肽部分：聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何 組合。在一些實(shí)施方案中，H3通過可切割的連接基如凝血酶可切割連接基連接至所述VWF 片段或所述第一或所述第二異源部分。所述連接基的非限制性實(shí)例在本文別處有所公開。
[0034] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本文所述的VWF片段、FVIII蛋白以及所述VWF片 段和所述FVIII蛋白之間的任選的連接基的嵌合蛋白。所述VWF片段與所述FVIII蛋白結(jié) 合。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含本文所述的VWF片段，其連接至異源部分。所述異源 部分可以是延長(zhǎng)所述蛋白質(zhì)的所述半衰期的部分，所述異源部分包括多肽、非多肽部分或 它們二者。此類異源多肽部分的實(shí)例包括，如免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片 段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、其任何衍生物或變體或它們的任何組合。非多肽 部分的實(shí)例包括，如聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何 組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源部分是連接至所述VWF片段的第一Fc區(qū)。在其它實(shí) 施方案中，所述嵌合蛋白還包含連接至所述FVIII蛋白的第二Fc區(qū)。所述VWF片段或所述 FVIII蛋白可通過連接基分別連接至所述第一Fc區(qū)或所述第二Fc區(qū)。在其它實(shí)施方案中， 嵌合蛋白包含連接至第一異源部分如第一Fc區(qū)的本文所述的VWF片段，以及連接至第二異 源部分如第二Fc區(qū)的FVIII蛋白，其中所述VWF片段還通過連接基或通過共價(jià)鍵連接至所 述第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）或所述FVIII蛋白，或所述第一異源部分（如，F(xiàn)c區(qū)）還 通過連接基或通過共價(jià)鍵連接至所述FVIII蛋白或所述第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）。 在一些實(shí)施方案中，所述嵌合蛋白的所述FVIII具有部分B-結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中， 具有部分B-結(jié)構(gòu)域的所述FVIII蛋白是FVIII198(SEQIDNO: 105)。在其它實(shí)施方案中， 所述嵌合蛋白還包含分選酶識(shí)別基序。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，作為本發(fā)明的結(jié)果，與無(wú)所述VWF片段的FVIII蛋白或野生型 FVIII相比，所述FVIII蛋白的所述半衰期延長(zhǎng)。所述FVIII蛋白的所述半衰期比無(wú)所述 VWF片段的FVIII蛋白的所述半衰期長(zhǎng)至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3 倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10 倍、至少約11倍或至少約12倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的所述半衰期比野生型FVIII 的所述半衰期長(zhǎng)約1. 5倍至約20倍、約1. 5倍至約15倍或約1. 5倍至約10倍。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，與野生型FVIII或無(wú)所述VWF片段的FVIII蛋白相比，所述FVIII的所述半衰 期延長(zhǎng)約2倍至約10倍、約2倍至約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約 6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4倍、約2倍至約3倍、約2. 5倍至約10倍、約2. 5倍至 約9倍、約2. 5倍至約8倍、約2. 5倍至約7倍、約2. 5倍至約6倍、約2. 5倍至約5倍、約 2. 5倍至約4倍、約2. 5倍至約3倍、約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、 約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約 5倍至約7倍或約6倍至約8倍。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的所述半衰期為至少約17小 時(shí)、至少約18小時(shí)、至少約19小時(shí)、至少約20小時(shí)、至少約21小時(shí)、至少約22小時(shí)、至少 約23小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約25小時(shí)、至少約26小時(shí)、至少約27小時(shí)、至少約28小 時(shí)、至少約29小時(shí)、至少約30小時(shí)、至少約31小時(shí)、至少約32小時(shí)、至少約33小時(shí)、至少 約34小時(shí)、至少約35小時(shí)、至少約36小時(shí)、至少約48小時(shí)、至少約60小時(shí)、至少約72小 時(shí)、至少約84小時(shí)、至少約96小時(shí)或至少約108小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的所述 半衰期為約15小時(shí)至約兩周、約16小時(shí)至約一周、約17小時(shí)至約一周、約18小時(shí)至約一 周、約19小時(shí)至約一周、約20小時(shí)至約一周、約21小時(shí)至約一周、約22小時(shí)至約一周、約 23小時(shí)至約一周、約24小時(shí)至約一周、約36小時(shí)至約一周、約48小時(shí)至約一周、約60小時(shí) 至約一周、約24小時(shí)至約六天、約24小時(shí)至約五天、約24小時(shí)至約四天、約24小時(shí)至約三 天或約24小時(shí)至約兩天。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)受試者的所述FVIII蛋白的所述平均半衰期為約15小 時(shí)、約16小時(shí)、約17小時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23 小時(shí)、約24小時(shí)（1天）、約25小時(shí)、約26小時(shí)、約27小時(shí)、約28小時(shí)、約29小時(shí)、約30小 時(shí)、約31小時(shí)、約32小時(shí)、約33小時(shí)、約34小時(shí)、約35小時(shí)、約36小時(shí)、約40小時(shí)、約44 小時(shí)、約48小時(shí)（2天）、約54小時(shí)、約60小時(shí)、約72小時(shí)（3天）、約84小時(shí)、約96小時(shí) (4天）、約108小時(shí)、約120小時(shí)（5天）、約六天、約七天（一周）、約八天、約九天、約10天、 約11天、約12天、約13天或約14天。
[0037] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：
[0038] (a)V_L1_H1_L3_C_L2_H2,
[0039] (b)H2_L2_C_L3_H1_L1_V,
[0040](c)C_L2_H2_L3_V_L1_H1，
[0041 ] (d)H1_L1_V_L3 _H2_L2_C,
[0042] (e)H1_L1_V_L3_C_L2_H2,
[0043] (f)H2-L2-C-L3-V-L1-H1,
[0044] (g)V-L1-H1-L3-H2-L2-C,
[0045] (h)C-L2-H2-L3-H1-L1-V,
[0046] (i)H2-L3-Hl-Ll-V-L2-C,
[0047] (j)C-L2-V-Ll-Hl-L3-H2,
[0048] (k)V_L2_C_L1_H1_L3_H2,和
[0049] (I)H2_L3_H1_L1_C_L2_V,
[0050] 其中V是本文所述的VWF片段；
[0051]LI或L2中的每個(gè)是任選的連接基，如凝血酶可切割連接基；
[0052]L3是任選的連接基，如scFc連接基，如可加工的連接基；
[0053]Hl或H2中的每個(gè)是任選的異源部分；并且
[0054]C是FVIII蛋白；并且
[0055] (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0056] 在其它方面，本發(fā)明的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：
[0057] (m)V-Ll-Hl:H2-L2-C,
[0058] (n)V-Ll-Hl:C-L2-H2,
[0059] (o)Hl-Ll-V:H2-L2-C,
[0060] (ρ)Hl-Ll-V:C-L2-H2,
[0061] (q) V: C-Ll-Hl :Η2,
[0062] (r) V: Hl-Ll-C :H2，
[0063] (s)H2:Hl-Ll-C:V，
[0064] (t)C:V-Ll_Hl:H2,和
[0065] (u)C:Hl-Ll-V:H2，
[0066] 其中V是本文所述的VWF片段；
[0067]LI或L2中的每個(gè)是任選的連接基，如凝血酶可切割連接基；
[0068] Hl或H2中的每個(gè)是任選的異源部分；并且
[0069]C是FVIII蛋白；
[0070](_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸；并且
[0071](:)是Hl和H2之間、V和C之間以及V和Hl和C和H2之間的化學(xué)或物理締合。 (:)表示化學(xué)締合，如至少一個(gè)非肽鍵。在某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)締合即（:）是共價(jià)鍵。 在一些實(shí)施方案中，Hl和H2之間的所述締合是共價(jià)鍵，如二硫鍵。在其它實(shí)施方案中，所述 化學(xué)締合即（:）是非共價(jià)相互作用，如離子相互作用、疏水相互作用、親水相互作用、范德 華相互作用、氫鍵。在某些實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白和所述VWF片段之間的所述締合是 非共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）是非肽共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）是肽鍵。在一 個(gè)實(shí)施方案中，Hl是第一異源部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一異源部分能夠延長(zhǎng)所述 FVIII活性的半衰期。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一異源部分是多肽、非多肽部分或它們 二者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一異源多肽部分可選自由以下組成的組：免疫球蛋白恒定 區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以 及它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述非多肽部分選自：聚乙二醇（PEG)、聚唾液 酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它們的任何組合。在一些實(shí)施方案中，H2是第二異源 部分。所述第二異源部分也可以是本領(lǐng)域已知的半衰期延長(zhǎng)因子（half-lifeextender), 并且可以是多肽、非多肽部分或它們二者的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第二異源部分 選自由以下組成的組：免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS 序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段以及它們的任何組合。在某些實(shí)施方案中，所述非多肽 部分選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物以及它 們的任何組合。在具體實(shí)施方案中，Hl是第一Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，H2是第二Fc區(qū)。 任選地，可存在半衰期延長(zhǎng)因子第三異源部分H3。H3可通過任選的連接基，如可切割的連 接基，如凝血酶可切割連接基連接至V、C、Hl或H2中的一者或多者。所述第三異源部分的 非限制性實(shí)例可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、聚乙二醇（PEG)、PAS 序列和羥乙基淀粉（HES)或其衍生物。
[0072] 在某些實(shí)施方案中，用于使式（a)至（U)的所述VWF片段、所述FVIII蛋白、所述 第一異源部分和/或所述第二異源部分彼此連接的一個(gè)或多個(gè)所述連接基是可切割的連 接基。用于所述嵌合蛋白的一個(gè)或多個(gè)所述切割位點(diǎn)可被選自由以下組成的組的蛋白酶切 害Ij:因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶）、彈 性蛋白酶-2、粒酶_B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選酶△、麗?-12、麗?-13、麗?-17和麗?-20。 在其它實(shí)施方案中，用于式（a)至（1)的一個(gè)或多個(gè)連接基（如，L3)包括可加工的連接基。 所述可加工的連接基可在分泌時(shí)被胞內(nèi)酶切割。所述可加工的連接基可包含位于所述連接 基的所述N-末端區(qū)的第一切割位點(diǎn)（Pl)、位于所述連接基的所述C-末端區(qū)的第二切割位 點(diǎn)（P2)或它們二者。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)用于本發(fā)明的所述連接基具有至少約1至2000個(gè) 氨基酸的長(zhǎng)度。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)用于本發(fā)明的所述連接基具有至少約20、 35、42、48、73、98、144、288、324、576或864個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。在具體實(shí)施方案中，一個(gè)或多 個(gè)所述連接基包含gly/ser肽。所述gly/ser肽可以是（Gly4Ser)3* (Gly4Ser)4。
[0074] 在其它方面，嵌合蛋白中的FVIII蛋白是功能性因子VIII蛋白。所述FVIII蛋白 可包含一個(gè)或多個(gè)其選自由以下組成的組的FVIII結(jié)構(gòu)域：所述Al結(jié)構(gòu)域、所述A2結(jié)構(gòu) 域、所述B結(jié)構(gòu)域、所述A3結(jié)構(gòu)域、所述Cl結(jié)構(gòu)域、所述C2結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)其片段以 及它們的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白包含所述B結(jié)構(gòu)域或其部分。在 另一個(gè)實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白是SQB結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。在其它實(shí)施方案中，所 述FVIII蛋白包含單鏈FVIII。在其它實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白包含F(xiàn)VIII的重鏈和 因子VIII的輕鏈，其中所述重鏈和所述輕鏈通過金屬鍵彼此締合。在某些實(shí)施方案中，所 述FVIII蛋白具有對(duì)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP)的低親合力或不與低密度脂蛋白受 體相關(guān)蛋白（LRP)結(jié)合。例如，用于本發(fā)明的FVIII蛋白可包含降低對(duì)LRP的所述親合力 或消除與所述LRP的結(jié)合的至少一個(gè)氨基酸取代。所述至少一個(gè)氨基酸取代的非限制性實(shí) 例位于與全長(zhǎng)成熟FVIII的第471位殘基、第484位殘基、第487位殘基、第490位殘基、第 497位殘基、第2092位殘基、第2093位殘基或兩個(gè)或更多個(gè)其組合對(duì)應(yīng)的殘基處。在一些 實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白中的所述FVIII蛋白包含至少一個(gè)氨基酸取代，其使得所 述FVIII蛋白比無(wú)所述取代的FVIII蛋白更穩(wěn)定。在其它實(shí)施方案中，所述FVIII蛋白包 含所述A2結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸取代和所述A3結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)氨基酸取代，其 中所述A2結(jié)構(gòu)域和所述A3結(jié)構(gòu)域通過共價(jià)鍵彼此締合。所述A2結(jié)構(gòu)域中的所述氨基酸 取代的非限制性實(shí)例位于與全長(zhǎng)成熟FVIII的第662或664位殘基對(duì)應(yīng)的殘基處。此外， 所述A3結(jié)構(gòu)域中的所述氨基酸取代的非限制性實(shí)例位于與全長(zhǎng)成熟的聚唾液酸化FVIII 的第1826或1828位殘基對(duì)應(yīng)的殘基處。
[0075] 在另外的方面，本發(fā)明提供編碼本文所述的VWF片段或本文所述的嵌合蛋白的多 核苷酸，或一組包含第一核苷酸鏈和第二核苷酸鏈的多核苷酸，其中所述第一核苷酸鏈編 碼所述VWF片段，并且所述第二核苷酸鏈編碼所述第二Fc區(qū)或所述嵌合蛋白的所述凝血因 子或其片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸組還包含第三多核苷酸鏈，其編碼屬于所述 枯草桿菌蛋白酶樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族的前蛋白轉(zhuǎn)化酶。所述前蛋白轉(zhuǎn)化酶的非限制性實(shí)例 包括前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin3型（PACE或PCSK3)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌 蛋白酶/kexin5型（PCSK5或PC5)、前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin7型（PCSK7或 PC7)或酵母Kex2。在其它方面，本發(fā)明包括包含所述多核苷酸或所述多核苷酸組和一個(gè) 或多個(gè)可操作地連接至所述多核苷酸或所述多核苷酸組的啟動(dòng)子的載體，或一組包括第一 載體和第二載體的載體，其中所述第一載體編碼所述多核苷酸組的所述第一多核苷酸鏈， 并且所述第二載體編碼所述多核苷酸組的所述第二多核苷酸鏈。所述載體組還可包含第三 載體，其包含編碼PC5或PC7的第三多核苷酸鏈。在一些實(shí)施方案中，所述載體還包含PACE。 在一些實(shí)施方案中，PACE切割所述VWF片段的所述D1D2結(jié)構(gòu)域。
[0076] 在一些方面，本發(fā)明涉及包含所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸、所述 多核苷酸組、所述載體或所述載體組以及可藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可延 長(zhǎng)因子VIII的半衰期。在其它方面，本發(fā)明包括包含所述多核苷酸、所述多核苷酸組、所述 載體或所述載體組的宿主細(xì)胞。
[0077]在其它方面，本發(fā)明涉及包含F(xiàn)VIII蛋白、輔助部分和任選的連接基的嵌合蛋白， 其中所述輔助部分抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白，并且具有至少一種VWF樣 FVIII保護(hù)特性。所述VWF樣FVIII保護(hù)特性包括保護(hù)所述FVIII蛋白不被一種或多種蛋 白酶切割，保護(hù)所述FVIII蛋白不被活化，穩(wěn)定所述FVIII蛋白的所述重鏈和/或所述輕鏈 或防止所述FVIII蛋白被一種或多種清除劑受體清除。
[0078]所述嵌合蛋白中的所述輔助部分可通過屏蔽或阻斷所述FVIII蛋白上的VWF結(jié)合 位點(diǎn)抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述VWF結(jié)合位點(diǎn) 位于所述FVIII蛋白的所述A3結(jié)構(gòu)域或所述C2結(jié)構(gòu)域或所述FVIII蛋白的A3結(jié)構(gòu)域和 C2結(jié)構(gòu)域二者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述VWF結(jié)合位點(diǎn)是與SEQIDNO: 16的第1669至 1689位和第2303至2332位氨基酸對(duì)應(yīng)的所述氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述輔助 部分是多肽、非多肽部分或它們二者。用作所述輔助部分的所述多肽可包含長(zhǎng)度為至少40 個(gè)、50 個(gè)、60 個(gè)、70 個(gè)、80 個(gè)、90 個(gè)、100 個(gè)、110 個(gè)、120 個(gè)、130 個(gè)、140 個(gè)、150 個(gè)、200 個(gè)、250 個(gè)、300 個(gè)、350 個(gè)、400 個(gè)、450 個(gè)、500 個(gè)、550 個(gè)、600 個(gè)、650 個(gè)、700 個(gè)、750 個(gè)、800 個(gè)、850 個(gè)、900個(gè)、950個(gè)或1000個(gè)氨基酸的氨基酸序列。例如，用作輔助部分的所述多肽可選自由 以下組成的組=VWF片段、免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、 PAS序列、HAP序列、其它半衰期延長(zhǎng)技術(shù)以及它們的任何組合。用作輔助部分的所述非多 肽部分可選自由以下組成的組：聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)或其衍生物 以及它們的任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述輔助部分是本文描述的所述VWF片段。所 述輔助部分和所述FVIII蛋白可例如通過連接基連接或彼此締合。所述連接基可包括可切 割的連接基，如凝血酶可切割連接基。
[0079] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供阻止或抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF結(jié)合的方法，所述 方法包括將有效量的所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或所述多核苷酸組加入 到包含F(xiàn)VIII蛋白或編碼所述FVIII蛋白的多核苷酸的細(xì)胞，其中所述VWF片段結(jié)合所述 FVIII蛋白。在另一個(gè)方面，本發(fā)明包括阻止或抑制所述FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF結(jié)合的 方法，所述方法包括將有效量的所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或所述多核苷酸組加入到需 要其的受試者，其中所述VWF片段結(jié)合所述FVIII蛋白，并且從而阻止或抑制所述FVIII蛋 白的結(jié)合。在一些方面，本發(fā)明包括延長(zhǎng)或增加FVIII蛋白的半衰期的方法，其中所述方法 包括將有效量的所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或所述多核苷酸組加入到包 含F(xiàn)VIII蛋白或編碼所述FVIII蛋白的多核苷酸的細(xì)胞或加入到需要其的受試者，其中所 述VWF片段結(jié)合所述FVIII蛋白。在其它方面，本發(fā)明涉及阻止或抑制FVIII蛋白從細(xì)胞 清除的方法，其中所述方法包括將有效量的所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或 所述多核苷酸組加入到包含F(xiàn)VIII蛋白或編碼所述FVIII蛋白的多核苷酸的細(xì)胞或加入到 需要其的受試者，其中所述VWF片段結(jié)合所述FVIII蛋白。
[0080] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及治療需要其的受試者的出血性疾病或病癥的方法，所 述方法包括施用有效量的所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或所述多核苷酸組， 其中所述出血性疾病或病癥選自由以下組成的組：出血性凝血障礙、關(guān)節(jié)出血癥、肌肉出 血、口腔出血、溢血、溢血進(jìn)入肌肉、口腔溢血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)溢血、腹腔內(nèi) 溢血、胸腔溢血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血以及髂腰肌鞘出 血。在其它實(shí)施方案中，所述治療是預(yù)防性的或按需的。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及治 療需要其的受試者的與2N型血管性血友病相關(guān)的疾病或病癥的方法，所述方法包括施用 有效量的所述VWF片段、所述嵌合蛋白、所述多核苷酸或所述多核苷酸組，其中所述疾病或 病癥得以治療。
[0081] 附圖簡(jiǎn)述
[0082] 圖1A-F.VWF蛋白的示意圖。圖IA示出了包含SEQIDNO: 73的第1至276位氨 基酸（SEQIDNO: 2的第764至1039位氨基酸）的兩個(gè)VWF片段。VWF-001在不存在VWF 的前/原肽序列的情況下合成，而VWF-009在存在前/原肽序列（Dl和D2結(jié)構(gòu)域）的情況 下合成。VWF-009的前肽在合成期間被切割，并且VWF-009包含具有D'和D3結(jié)構(gòu)域序列 的原肽。圖IB示出了包含SEQIDNO: 73的第1至477位氨基酸（SEQIDNO: 2的第764 至1240位氨基酸）的三個(gè)VWF片段。VWF-002在不存在前/原肽序列的情況下合成。除 D'D3結(jié)構(gòu)域之外，VWF-010還包含D1D2結(jié)構(gòu)域。除在SEQIDNO:72的第336和379位 殘基處取代半胱氨酸的丙氨酸殘基之外，VWF-013還包含D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域。圖IC示出了 包含D'D3結(jié)構(gòu)域和Al結(jié)構(gòu)域的一部分的兩個(gè)VWF片段。VWF-003具有SEQIDNO: 2的 第764至1274位氨基酸。除D'D3結(jié)構(gòu)域之外，VWF-011還包含D1D2結(jié)構(gòu)域。圖ID示出 了兩個(gè)構(gòu)建體VWF-004和VWF-012。VWF-004包含D'D3結(jié)構(gòu)域和Al結(jié)構(gòu)域的完整序列。 VWF-012包含D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域和Al結(jié)構(gòu)域的完整序列。圖IE示出了三個(gè)構(gòu)建體。VWF-006 包含D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域和VWF的CK結(jié)構(gòu)域（半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)域）。VWF-008是全長(zhǎng)VWF。 VWF-031 (VWF-Fc)示出了包含通過可切割的連接基連接至單Fc區(qū)的D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域的構(gòu) 建體。VWF-053是D1D2結(jié)構(gòu)域。圖IF示出了包含原肽（Dl和D2結(jié)構(gòu)域）和成熟亞基（D'、 03、六1、六2、六3、04、81-3、(：1-2結(jié)構(gòu)域）的全長(zhǎng)署卩蛋白。署卩蛋白為約2501^^蛋白質(zhì)，并 且通過二硫鍵形成多聚體（>20MDa)。在非共價(jià)復(fù)合物中VWF蛋白與FVIII(95-98% )締合， 然后通過保護(hù)FVIII不被蛋白酶切割/活化，穩(wěn)定重鏈和輕鏈以及阻止FVIII被清除劑受 體清除來延長(zhǎng)FVIII的半衰期。VWF蛋白還可通過VWF受體清除FVIII-VWF復(fù)合物以及阻 止胞飲和rFVIIIFc循環(huán)來限制FVIII的半衰期。
[0083] 圖2.VWF:FVIII異源二聚體構(gòu)建體的實(shí)例的示意圖。左邊構(gòu)建體示出了具有全長(zhǎng) WF的D'D3結(jié)構(gòu)域（SEQIDNO: 73的第1-477位氨基酸）并且包含SEQIDNO: 72的第336 和379位殘基處的丙氨酸取代的VWF片段。嵌合蛋白構(gòu)建體（FVIII064/065)包含通過連 接基連接至第一Fc區(qū)的VWF片段的C-末端，并且FVIII連接至第二Fc區(qū)，其中第二Fc區(qū) 還通過連接基連接至VWF片段的N-末端（如，式C-H1-L1-V-L2-H2,其中V為VWF片段，C 為FVIII，Hl和H2為Fc區(qū)，并且Ll和L2為可切割的連接基）。圖2b中的構(gòu)建體是在細(xì) 胞內(nèi)加工的VWF:FVIII異源二聚體構(gòu)建體，其中第二Fc和VWF片段的N-末端之間的連接 基被切割。FVIII-064包含VWF的D'D3結(jié)構(gòu)域（具有C336A和C379取代的SEQIDN0:73 的第1至477位氨基酸）。FVIII-065包含VWF的D'D3結(jié)構(gòu)域（SEQIDN0:73的第1至 276位氨基酸）。FVIII-136包含通過可被胞內(nèi)蛋白酶加工的連接基連接至D'D3片段-Fc 的FVIIIFc。當(dāng)FVIII-136表達(dá)時(shí)，酶切割第二Fc(融合至FVIII-LC)和VWFD'D3片段 (融合至第一Fe)之間的連接基，而融合至（或連接至）FVIII-LC的Fc區(qū)與融合至（或連 接至）VWF片段的第一Fe形成共價(jià)鍵（如，二硫鍵）。FVIII-148是具有D'D3片段的單鏈 FVIIIFc(通過將R1645A/R1648A突變引入FVIII基因而形成的單鏈FVIII)。
[0084] 圖3.包含VWF和Fe之間的可變連接基實(shí)例的VWF:FVIII異源二聚體構(gòu)建體實(shí)例 的示意圖。構(gòu)建體（FVIII-064、FVIII-159、FVIII-160、FVIII-178 和FVIII-179)具有如式 C-H1-L1-V-L2-H2表示的通用結(jié)構(gòu)，但包含不同連接基或氨基酸取代的實(shí)例。所示構(gòu)建體包 含相同的VWF片段，該片段為VWF的D'和D3結(jié)構(gòu)域（即，具有氨基酸取代C336A和C379A 的SEQIDNO: 73的第1至477位氨基酸）。構(gòu)建體FVIII64具有VWF片段和Fe(即，H2) 之間的凝血酶可切割連接基（即，L2)，該連接基具有20個(gè)氨基酸。構(gòu)建體FVIII159具 有VWF片段和Fe(S卩，H2)之間的凝血酶可切割連接基（即，L2)，該連接基具有35個(gè)氨基 酸。構(gòu)建體FVIII160具有VWF片段和Fe(即，H2)之間的凝血酶可切割連接基（即，L2)， 該連接基具有48個(gè)氨基酸。構(gòu)建體FVIII-180、FVIII-181和FVIII-182分別為包含F(xiàn)VIII Cl結(jié)構(gòu)域中的K2092A突變、FVIIICl結(jié)構(gòu)域中的K2093A突變以及FVIIICl結(jié)構(gòu)域中的 K2092A/K2093A突變的FVIII-160的衍生物。構(gòu)建體FVIII178具有VWF片段和Fe(即， H2)之間的凝血酶可切割連接基（即，L2)，該連接基具有73個(gè)氨基酸。構(gòu)建體FVIII179 具有VWF片段和Fe(S卩，H2)之間的凝血酶可切割連接基（S卩，L2)，該連接基具有98個(gè)氨 基酸。
[0085] 圖4 :FVIII-VWF構(gòu)建體的實(shí)例的示意圖，其中VWF是VWF的D1D2D'D3片段，連接 基是包含切割位點(diǎn)如凝血酶切割位點(diǎn)的可變長(zhǎng)度連接基，SCFVIII是包含R1645A/R1648A 取代的單鏈FVIII，H是異源部分，如免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、綴合聚乙二醇（PEG)和 /或PEG的部分、白蛋白或白蛋白片段、白蛋白結(jié)合部分、HAP序列、聚唾液酸化和/或聚唾 液酸部分、羥乙基淀粉（HES)和/或HES部分或PAS序列等，HCFVIII是FVIII的重鏈，LC FVIII是FVIII的輕鏈，并且Fe是免疫球蛋白恒定區(qū)的Fe區(qū)。圖4A具有式VWF-連接基-SC ?￥111。圖48具有式￥1?-連接基-!1-連接基-50?￥111。連接基（￥1?和!1之間的第一連 接基和H和SCFVIII之間的第二連接基）可以是相同的或不同的。圖4C具有式VWF-連 接基-SCFVIII-連接基-H。連接基（VWF和SCFVIII之間的第一連接基和SCFVIII和H 之間的第二連接基）可以是相同的或不同的。圖4D具有式VWF-連接基-HCFVIII-H-連 接基-LCFVIII。連接基（VWF和HCFVIII之間的第一連接基和H和LCFVIII之間的第 二連接基）可以是相同的或不同的。圖4E具有式HCFVIII-H-LCFVIII-連接基-第一 Fe-連接基-VWF-連接基-第二Fc。連接基（LCFVIII和第一Fe之間的第一連接基、第一 Fe和VWF之間的第二連接基和VWF和第二Fe之間的第三連接基）可以是相同的或不同的。 連接基可以是可切割的連接基。例如，第一Fe和VWF之間的連接基可以是包含在連接基的 N-末端和/或C-末端的切割位點(diǎn)的可切割的連接基。第一Fe和第二Fe可以是相同的或 不同的。圖4F具有式HCFVIII-H-LCFVIII-連接基-第一Fe-連接基-VWF-連接基-第 二Fc。連接基（LCFVIII和第一Fe之間的第一連接基、第一Fe和VWF之間的第二連接基 和VWF和第二Fe之間的第三連接基）可以是相同的或不同的。一個(gè)或多個(gè)連接基可以是 可切割的連接基。例如，第一Fe和VWF之間的連接基可以是包含在連接基的N-末端和/ 或C-末端的切割位點(diǎn)的可切割的連接基。第一Fe和第二Fe可以是相同的或不同的。圖 4G具有式SCFVIII-連接基-Fe-連接基-VWF-H-連接基-Fe。圖4H具有式聚乙二醇化或 羥乙基淀粉化SCFVIII-連接基-Fe-連接基-VWF-H-連接基-Fe。連接基（SCFVIII和第 一Fe之間的第一連接基、第一Fe和VWF之間的第二連接基以及H和第二Fe之間的第三連 接基）可以是相同的或不同的。一個(gè)或多個(gè)連接基可以是可切割的連接基。例如，第一Fe 和VWF之間的連接基可以是包含在連接基的N-末端和/或C-末端的切割位點(diǎn)的可切割的 連接基。第一Fc和第二Fc可以是相同的或不同的。
[0086] 圖5.FVIII-VWF異源二聚體共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的示意圖。構(gòu)建體FVIII-155包含連接至 Fc區(qū)的全長(zhǎng)FVIII序列（丙氨酸殘基取代第1645和1648位的精氨酸殘基）。VWF-031包 含D1D2D'D3片段（丙氨酸殘基取代第336和379位的半胱氨酸殘基），其連接至具有48 凝血酶可切割連接基的另一個(gè)Fc區(qū)。在細(xì)胞內(nèi)加工后，構(gòu)建體FVII1-155生成融合至一個(gè) Fc片段的全長(zhǎng)單鏈FVIII(SCFVIII)，構(gòu)建體VWF-031生成連接至另一個(gè)Fc片段的477個(gè) 氨基酸的D'D3片段。兩個(gè)共價(jià)鍵可在連接至SCFVIII或D'D3片段的Fc片段之間形成， 這繼而允許FVIII和D'D3的共價(jià)締合，這是所需最終產(chǎn)物的主要特征。
[0087]圖 6 是VWF-009(D1D2D'D31-276aaX6HIS)的非還原和還原SDSPAGE，其顯示出 VWF-009以單體存在。未加工意指VVF-009具有原肽（D1D2結(jié)構(gòu)域）。
[0088] 圖 7 是VWF-002(D，D31-477aaX6his)或VWF-010(D1D2D，D31-477aaX6his)的 非還原和還原SDSPAGE，其顯示出VWF-002以單體存在，且VWF-OlO以二聚體存在。
[0089] 圖8示出了圖2(b)中示出的FVIII-VWF異源二聚體的凝血酶消化。第1泳道示出 分子量標(biāo)準(zhǔn)。第2泳道是無(wú)凝血酶的rFVIII-Fc。第3泳道是有凝血酶的rFVIII-Fc。第5 泳道是FVIIIFc-VWF。第6泳道示出了FVIIIFc-VWF和凝血酶。Al表示FVIII的Al結(jié)構(gòu) 域，A2表示FVIII的A2結(jié)構(gòu)域，并且Λa3LC表示FVIII的輕鏈。
[0090] 圖9A-B示出了通過FVIII顯色測(cè)定法測(cè)量的FVIII活性。圖9A示出了HemA小 鼠中rFVIII和rFVIIIFc的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。圖9B示出了FVIII/VWF雙敲除（DKO)小鼠 中rFVIII和rFVIIIFc的PK曲線。Y軸示出FVIII活性，單位為mIU/mL，X軸示出時(shí)間。
[0091] 圖10A-B示出了D' D3片段對(duì)FVIII的保護(hù)，其通過質(zhì)粒注射48小時(shí)后mFVIII 血漿水平（mIU/mL)和VWF表達(dá)水平（nM/mL)示出。用于示出FVIII保護(hù)的VWF片段為 VWF-001 (276aa，單體）、VWF-009 (276aa，單體）、VWF-002 (477aa，單體）、VWF-010 (477aa， 二聚體）、VWF-003(511aa，單體）、VWF-011(511aa，二聚體）、VWF-004(716aa，單體）、 VWF-012 (716aa，二聚體）、VWF-006 和VWF-008。
[0092] 圖11示出了共施用D'D3片段時(shí)FVIII-VWFDKO小鼠中rBDD-FVIII的藥代動(dòng)力學(xué) 曲線。圖IlA示出了rBDD-FVIII和VWF-002 或rBDD-FVIII和VWF-010共施用或rBDD-FVIII 單獨(dú)施用后FVIII/VWFDKO小鼠中通過FVIII顯色測(cè)定測(cè)量的FVIII活性（mIU/mL)。圖 IlB示出了施用后VWF-002和VWF-010的血漿水平（ng/mL)。X軸表示時(shí)間，單位為小時(shí)。
[0093] 圖12示出了表達(dá)VWFD'D3的小鼠中rFVIIIFc的藥代動(dòng)力學(xué)曲線。圖12A示 出了編碼D'D3結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒DNA的高壓注射（hydrodynamicinjection,HDI)(第-5天）、 rFVIIIFc的靜脈內(nèi)給藥（第0天）和PK樣品收集（第0天-第3天）的時(shí)間軸。圖12B 示出了通過FVIII顯色測(cè)定測(cè)量的D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域（477aa)HDI(圓形）的FVIII/VWFDKO 小鼠中和具有半胱氨酸取代的D1D2D'D3結(jié)構(gòu)域（477aa)(矩形）的FVIII/VWFDKO小鼠中 rFVIIIFc注入后血漿FVIII活性（mIU/mL)。無(wú)D'D3結(jié)構(gòu)域HDI的對(duì)照小鼠中FVIII活性 以三角形示出。圖IOC示出了D1D2D'D3二聚體或D1D2D'D3單體DNA構(gòu)建體的HDI施用 后D'D3血漿水平（ng/mL)。X軸表示時(shí)間，單位為小時(shí)。
[0094] 圖13示出了FVIII/VWFDKO小鼠中通過HDI的D'D3-Fc連接基選擇。將不同長(zhǎng) 度連接基（20aa(FVIII-064)、35aa(FVIII-159)或 48aa(FVIII-160))插入D'D3 結(jié)構(gòu)域和 Fe區(qū)之間。FVIII/VWFDKO小鼠中HDI后的FVIII活性（mlU/ml)通過FVIII顯色測(cè)定測(cè) 量。
[0095] 圖14示出了FVIII/VWFDKO小鼠中單鏈FVIIIFc/D'D3異源二聚體的HDI。力口 工（雙鏈）沖￥11正。-0'03(口5￥^卩￥111-136)和單鏈迚￥11正。-0'03(口5￥^卩￥111-148)的 FVIII活性在HDI24小時(shí)和48小時(shí)后測(cè)量。
[0096] 圖15示出了通過Octet測(cè)定測(cè)量的FVIII-155/VWF-031異源二聚體與固定化 hWF的結(jié)合親合力。FVIIIFc、FVIII和IgG也用作對(duì)照。X-軸顯示時(shí)間，單位為秒，并且 y-軸顯示結(jié)合，單位為納米（nm)。
[0097] 圖 16 示出了FVIII/VWF缺陷（FVIII/VWFDK0)小鼠中FVIII-155/VWF-031 的藥 代動(dòng)力學(xué)。X-軸表示時(shí)間，單位為小時(shí)，并且y-軸表示相對(duì)于輸入的FVIIi回收率，單位 為0/〇。
[0098] 圖17 :VWF片段構(gòu)建體實(shí)例的示意圖，其中VWF是VWF的D1D2D'D3片段；連接基 是包含切割位點(diǎn)如凝血酶切割位點(diǎn)的可變長(zhǎng)度連接基；H是異源部分，如免疫球蛋白恒定 區(qū)或其部分、綴合聚乙二醇（PEG)的部分和/或PEG、白蛋白或白蛋白片段、白蛋白結(jié)合部 分、HAP序列、聚唾液酸化部分和/或聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)部分和/或HES或PAS 序列等；并且Fe是免疫球蛋白的Fe區(qū)。圖17A具有式D1D2-D'部分D3-H-部分D3-連接 基-Fc。圖17B具有式D1D2-部分D'-H-部分D'D3-連接基-Fc。圖17C具有式D1D2-聚 乙二醇化或羥乙基淀粉化D'D3-連接基-Fc。連接基可任選地被切割。
[0099] 圖18 :A)示出了HemA(菱形）和DKO(正方形）血漿二者中FVIIIFc隨時(shí)間推移 喪失FVIII活性。FVIII活性通過顯色測(cè)定測(cè)量。X-軸顯示時(shí)間，單位為小時(shí)，y-軸顯示 相對(duì)活性。B)示出了FVIII活性由于重鏈（HC)的解離或降解而喪失。左圖示出了使用綿 羊抗-FVIII多克隆抗體在Bio-rad4-15%凝膠中進(jìn)行的免疫沉淀測(cè)定。凝膠為還原的， 并且通過Bio-rad系統(tǒng)成像。第1泳道示出Bio-rad未染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2泳道示出 FVIIIFc和PBS;第3泳道示出FVIIIFc和DKO血漿；第5泳道示出單獨(dú)的綿羊抗-FVIII 多克隆抗體。右圖示出了使用FVIII抗重鏈抗體（GMA012)進(jìn)行的凝膠蛋白質(zhì)印跡分析。 第1泳道示出Bio-rad未染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2泳道示出FVIIIFc和PBS;第3泳道示出 FVIIIFc和DKO血漿；第4泳道示出單獨(dú)的綿羊抗-FVIII多克隆抗體。
[0100] 圖19示出了通過顯色測(cè)定測(cè)量的DKO小鼠血漿（左圖）和HemA小鼠血漿（右 圖）中野生型FVIIIFc(圓形）、scFVIIIFc(單鏈FVIII)(實(shí)心三角形）或FVIII:VWF異 源二聚體（如，F(xiàn)VIII155/VWF31)(空心三角形）隨時(shí)間變化的FVIII活性。Y軸示出了相 對(duì)FVIII活性。野生型FVIIIFc包含F(xiàn)VIII的雙鏈（S卩，非共價(jià)結(jié)合的FVIII重鏈和FVIII 輕鏈），從而具有三條鏈，即FVIII重鏈、融合至Fe的FVIII輕鏈以及單獨(dú)Fc。ScFVIIIFc 包含F(xiàn)VIII單鏈，并且從而具有兩條鏈，一條具有融合至Fe的單鏈FVIII，另一條具有單獨(dú) ?(3。？￥111:￥1?異源二聚體（如^￥111155/^1?031)包含融合至？(：的單鏈？￥111和融合至 Fe的VWF片段（D'D3)。
[0101] 圖20示出了通過不同濃度的PC5或PACE(弗林蛋白酶）進(jìn)行的由VWF片段（如， VWF-031(DlD2D'D3Fc))的D1D2結(jié)構(gòu)域的加工。D1D2加工在還原條件的Bio-rad4-15% 凝膠上通過Bio-rad成像儀示出。第1泳道示出單獨(dú)VWF031 ;第2泳道示出單獨(dú)PC5 ;第3 泳道示出單獨(dú)PACE;第4泳道示出2. 5%的VWF031和PC5 ;第5泳道示出5%的VWF031和 PC5 ;第6泳道示出7. 5%的VWF031和PC5 ;第7泳道示出10%的VWF031和PC5 ;第8泳道 示出2. 5%的VWF031和PACE;第9泳道示出5%的VWF031和PACE;第10泳道示出7. 5% 的VWF031 ;并且第11泳道示出10%的VWF031和PACE。
[0102] 圖21 :A)示出了通過ForteBiooctet儀器進(jìn)行的FVIII:VWF異源二聚體（如， FVIII-155/VWF-031)的結(jié)合測(cè)定。對(duì)于該測(cè)定，全長(zhǎng)VWF使用APS傳感器捕集。FVIIIFc 和FVIII與全長(zhǎng)VWF的結(jié)合在左下左圖示出。未結(jié)合的FVinY1680(不具有對(duì)VWF的親 合力的突變體）和FVIII:VWF異源二聚體（FVIII155/VWF031)在右下圖示出。B)示出了 FVIII:VWF異源二聚體（如，F(xiàn)VIII-155/VWF-031)的另一個(gè)結(jié)合測(cè)定。在該測(cè)定中，構(gòu)建 體（VWF031構(gòu)建體、FVIII-155/VWF031或FVIII)固定在蛋白G傳感器上。測(cè)量構(gòu)建體與 FVIII的結(jié)合。
[0103] 圖22示出了通過表面等離子共振實(shí)驗(yàn)測(cè)量的VWFD' D3結(jié)構(gòu)域與FVIII分子的結(jié) 合親合力。VWF031構(gòu)建體（100RU)通過1000RU抗人IgG捕集。B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII以 1:1擬合以單周期動(dòng)力學(xué)模式施加?？倲?shù)為4。
[0104] 圖23示出了當(dāng)施用于FVIII/VWFDKO小鼠時(shí)，F(xiàn)VIIIFc/VWF異源二聚體構(gòu)建體中 不同連接基長(zhǎng)度對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的影響。三個(gè)不同的連接基（48aa、73aa或98aa)，即VWF031、 VWF035和VWF036插入D' D3和Fe之間。歸一化為5分鐘值（％ )的FVIII活性在Y-軸中 示出。
[0105] 圖24示出了VWF片段與FVIII的分選酶連接實(shí)例。A)示出了兩個(gè)連接構(gòu)建體， (I)C-末端融合至分選酶識(shí)別基序（如，LPXTG)的VWF片段以及（2)N-末端具有甘氨酸（η) 的FVIII。在與分選酶反應(yīng)后，VWF片段和分選酶識(shí)別基序連接至FVIII的N-末端。Β)示 出了兩個(gè)連接構(gòu)建體，（1)其C-末端融合至分選酶識(shí)別基序的FVIII以及（2)其N-末端 具有甘氨酸（η)的VWF片段。在與分選酶反應(yīng)后，F(xiàn)VIII和分選酶識(shí)別基序在VWF片段的 N-末端融合至VWF片段。C)示出了兩個(gè)連接構(gòu)建體，（1)通過可變長(zhǎng)度連接基融合至分選 酶識(shí)別基序的VWF片段以及（2)其N-末端融合至甘氨酸（η)的FVIII。在與分選酶反應(yīng) 后，通過連接基融合至分選酶識(shí)別基序的VWF連接至FVIII的N-末端。D)示出了兩個(gè)連 接構(gòu)建體，（1)通過可變長(zhǎng)度連接基融合至分選酶識(shí)別基序的FVIII以及（2)其N-末端融 合至甘氨酸（η)的VWF。在與分選酶反應(yīng)后，通過連接基融合至分選酶識(shí)別基序的FVIII 連接至VWF片段的N-末端。Ε)示出了包含通過可變長(zhǎng)度連接基融合至分選酶識(shí)別基序的 VWF片段的連接構(gòu)建體，所述分選酶識(shí)別基序還融合至蛋白酶切割位點(diǎn)（如，凝血酶切割位 點(diǎn)），該位點(diǎn)通過可變長(zhǎng)度連接基融合至Fc。
[0106] 圖25示出了FVIII155和FVIII198的比較示意圖。FVIII155編碼單鏈FVIIIFc 蛋白。FVII1198是包含部分B-結(jié)構(gòu)域的單鏈FVIIIFc分子-226N6。226表示FVIIIB-結(jié) 構(gòu)域的N-末端226個(gè)氨基酸，并且N6表示B-結(jié)構(gòu)域中的六個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。
[0107] 圖26A)示出了測(cè)量DKO血漿中FVIII155和FVIII198隨時(shí)間變化的相對(duì)活性的 穩(wěn)定性測(cè)定。如圖所示，部分B-結(jié)構(gòu)域存在于FVII1198中增加了單鏈FVIIIFc相對(duì)于 FVIII155 的穩(wěn)定性；B)示出了DKO小鼠中FVIII198、FVIII155 和雙鏈（dcFVIIIFc)的半 衰期比較。如圖所示，與雙鏈FVIII相比，單鏈FVIII(FVIII155)半衰期增加1.5倍。具有 266N6B-結(jié)構(gòu)域的單鏈FVIII(FVIII198)半衰期也增加1. 5倍。曲線圖示出了FVIII回收 率對(duì)5分鐘值（％)隨時(shí)間的變化。
[0108] 發(fā)明詳述 [0109] 定義
[0110] 值得注意的是，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"或"一種"實(shí)體是指該實(shí)體的一者或多者；例如，"核苷 酸序列"應(yīng)理解為表示一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列。因此，術(shù)語(yǔ)"一個(gè)"（或"一種"）、"一個(gè)或 多個(gè)"和"至少一個(gè)"在本文中可互換使用。
[0111] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"或"核苷酸"旨在涵蓋單個(gè)核酸以及多個(gè)核酸，并且指分離的核 酸分子或構(gòu)建體，如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸包含 常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵（如，酰胺鍵，例如可見于肽核酸（PNA)中）。術(shù)語(yǔ)"核酸"是指 任何一種或多種存在于多核苷酸中的核酸片段，如DNA或RNA片段。所謂"分離的"核酸或 多核苷酸意指從其天然環(huán)境移除的核酸分子、DNA或RNA。例如，出于本發(fā)明的目的，包含于 載體中的編碼因子VIII多肽的重組多核苷酸被認(rèn)為是分離的。分離的多核苷酸的另外實(shí) 例包括保持在異源宿主細(xì)胞中或從溶液中的其它多核苷酸純化（部分或基本上）的重組多 核苷酸。分尚的RNA分子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分 離的多核苷酸或核酸還包括此類合成產(chǎn)生的分子。此外，多核苷酸或核酸可包括調(diào)控元件， 例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
[0112] 如本文所用，"編碼區(qū)"或"編碼序列"是由可翻譯為氨基酸的密碼子組成的多核苷 酸的一部分。雖然"終止密碼子"（TAG、TGA或TAA)通常不翻譯為氨基酸，但其可視為編碼 區(qū)的部分，但任何側(cè)翼序列，例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等不是編碼 區(qū)的部分。編碼區(qū)的邊界通常通過編碼所得多肽的氨基末端的處于5'末端的起始密碼子， 和編碼所得多肽的羧基末端的處于3'末端的翻譯終止密碼子確定。本發(fā)明的兩個(gè)或更多 個(gè)編碼區(qū)可存在于單個(gè)多核苷酸構(gòu)建體中，如單個(gè)載體上，或單獨(dú)的多核苷酸構(gòu)建體中，如 單獨(dú)的（不同的）載體上。然后，它遵循單個(gè)載體可以僅包含單個(gè)編碼區(qū)，或包含兩個(gè)或更 多個(gè)編碼區(qū)，如單個(gè)載體可獨(dú)立地編碼結(jié)合結(jié)構(gòu)域-A和結(jié)合結(jié)構(gòu)域-B，如下所述。此外，本 發(fā)明的載體、多核苷酸或核酸可編碼融合或未融合至編碼本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核酸的異 源編碼區(qū)。異源編碼區(qū)包括不限于特化元件或基序，例如分泌信號(hào)肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。
[0113] 哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌的某些蛋白質(zhì)與分泌信號(hào)肽締合，一旦延長(zhǎng)的蛋白質(zhì)鏈開始跨 過糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出，所述信號(hào)肽即從成熟蛋白質(zhì)切割。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，信號(hào) 肽通常融合至多肽的N-末端，并且從完整的或"全長(zhǎng)"多肽切割，以產(chǎn)生分泌或"成熟"形 式的多肽。在某些實(shí)施方案中，使用天然信號(hào)肽，如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號(hào)肽，或保持 指導(dǎo)與其可操作地締合的多肽分泌的能力的該序列功能衍生物?；蛘?，可使用異源哺乳動(dòng) 物信號(hào)肽，如人組織血纖維蛋白溶酶原激活物（TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶信號(hào)肽，或其功 能衍生物。
[0114] 術(shù)語(yǔ)"下游"是指位于參考核苷酸序列的3'端的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中， 下游核苷酸序列涉及沿著轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄的 起始位點(diǎn)下游。
[0115] 術(shù)語(yǔ)"上游"是指位于參考核苷酸序列的5'端的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中， 上游核苷酸序列涉及位于編碼區(qū)的5'側(cè)或轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)的序列。例如，大多數(shù)啟動(dòng)子位于 轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)上游。
[0116] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"調(diào)控區(qū)"是指位于編碼區(qū)的上游（5'非編碼序列）內(nèi)，或下游 (3'非編碼序列）的核苷酸序列，并且其影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工、穩(wěn)定性或締合編碼區(qū)的翻譯。 調(diào)控區(qū)可包括啟動(dòng)子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識(shí)別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)子 結(jié)合位點(diǎn)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。如果預(yù)期編碼區(qū)在真核細(xì)胞中表達(dá)，則多腺苷酸化信號(hào)和轉(zhuǎn)錄終 止序列將通常位于編碼序列的3'端。
[0117] 編碼基因產(chǎn)物如多肽的多核苷酸可包括可操作地與一個(gè)或多個(gè)編碼區(qū)締合的啟 動(dòng)子和/或其它轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件。在可操作締合中，基因產(chǎn)物如多肽的編碼區(qū)與一個(gè) 或多個(gè)調(diào)控區(qū)締合，這樣將基因產(chǎn)物的表達(dá)置于調(diào)控區(qū)的影響或控制下。例如，如果啟動(dòng)子 功能的誘導(dǎo)引起編碼基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄，該基因產(chǎn)物由編碼區(qū)編碼，并且如果啟動(dòng)子 和編碼區(qū)之間的連接的性質(zhì)不干擾啟動(dòng)子指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力，或干擾DNA模板被轉(zhuǎn) 錄的能力，則編碼區(qū)和啟動(dòng)子是"可操作地締合的"。除啟動(dòng)子之外的其它轉(zhuǎn)錄控制元件， 例如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)也可操作地與編碼區(qū)締合，以指導(dǎo)基因產(chǎn)物表 達(dá)。
[0118] 多個(gè)轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于在脊椎動(dòng)物細(xì)胞發(fā) 揮功能的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如但不限于來自巨細(xì)胞病毒（與內(nèi)含子-A結(jié)合的立即早期啟動(dòng) 子）、猿猴病毒40(早期啟動(dòng)子）和逆轉(zhuǎn)錄病毒（例如勞氏肉瘤病毒）的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子片 段。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來源于脊椎動(dòng)物基因，例如肌動(dòng)蛋白、熱休克蛋白、牛生長(zhǎng)激素和 兔β-球蛋白的那些，以及能夠控制真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其它序列。另外的合適轉(zhuǎn)錄控 制區(qū)包括組織特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（如，干擾素或白介素誘 導(dǎo)的啟動(dòng)子）。
[0119] 相似地，多種翻譯控制元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于核 糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始和終止密碼子，以及來源于小RNA病毒的元件（特別是內(nèi)部核糖體 進(jìn)入位點(diǎn)或IRES，也稱為CITE序列）。
[0120] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"是指多核苷酸產(chǎn)生基因產(chǎn)物，例如RNA或多肽的過程。其 包括但不限于多核苷酸轉(zhuǎn)錄為信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、小干 擾RNA(SiRNA)或任何其它RNA產(chǎn)物，以及mRNA翻譯為多肽。表達(dá)生成"基因產(chǎn)物"。如本 文所用，基因產(chǎn)物可為核酸，如基因轉(zhuǎn)錄生成的信使RNA，或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。本文所述 的基因產(chǎn)物還包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾，如多腺苷酸化或剪接的核酸，或具有翻譯后修飾，如甲 基化、糖基化、添加脂質(zhì)、與其它蛋白亞基締合或蛋白酶切割的多肽。
[0121] "載體"是指用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞的任何媒介物。載體可以是另 一個(gè)核酸片段可與其連接，以便形成連接片段的復(fù)制的復(fù)制子。"復(fù)制子"是指作為體內(nèi)自 主復(fù)制單元起作用，即能夠在其自身控制下復(fù)制的任何遺傳元件（如，質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、 染色體、病毒）。術(shù)語(yǔ)"載體"包括用于在體外、離體或在體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病 毒媒介物二者。大量載體是本領(lǐng)域已知和使用的，包括例如質(zhì)粒、修飾的真核病毒或修飾的 細(xì)菌病毒。多核苷酸插入合適的載體可通過將適當(dāng)?shù)亩嗪塑账崞芜B接至所選擇的具有互 補(bǔ)粘性末端的載體實(shí)現(xiàn)。
[0122] 載體可被工程化以編碼選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因，所述選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因提供 摻入載體的細(xì)胞的選擇或識(shí)別。選擇性標(biāo)記或報(bào)告基因的表達(dá)允許識(shí)別和/或選擇宿主 細(xì)胞，該宿主細(xì)胞摻入并且表達(dá)包含于載體的其它編碼區(qū)。本領(lǐng)域已知和使用的選擇性標(biāo) 記基因的實(shí)例包括：提供對(duì)氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨膦除 草劑、磺酰胺等抗性的基因；以及用作表型標(biāo)記的基因，即花色素苷調(diào)控基因、異戊烯基轉(zhuǎn) 移酶基因等。本領(lǐng)域已知和使用的報(bào)告基因的實(shí)例包括：熒光素酶（Luc)、綠色熒光蛋白 (GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)、-半乳糖苷酶（LacZ)、-葡糖醛酸酶（Gus)等。選擇性標(biāo) 記也可視為報(bào)告基因。
[0123] 術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"是指通常攜帶不作為細(xì)胞的中央代謝部分的基因，并且通常為環(huán)狀雙 鏈DNA分子形式的染色體外元件。此類元件可為自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或 核苷酸序列、任何來源的線性、環(huán)狀或超螺旋的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其中多個(gè)核苷酸序 列連接或重組為能夠?qū)⑺x擇基因產(chǎn)物的啟動(dòng)子片段和DNA序列以及適當(dāng)?shù)?'未翻譯序 列引入細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。
[0124] 可使用的真核病毒載體包括但不限于：腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒 載體、痘病毒如牛痘病毒載體、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì) 體、帶電荷脂質(zhì)（細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑（cyt〇feCtin))、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。
[0125] "克隆載體"是指"復(fù)制子"，它是連續(xù)復(fù)制的單位長(zhǎng)度核酸，并且包含復(fù)制起點(diǎn)，例 如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，另一個(gè)核酸片段可連接到其上，以便導(dǎo)致連接片段的復(fù)制。某些克 隆載體能夠在一種細(xì)胞類型，如細(xì)菌中復(fù)制，并且在另一種細(xì)胞類型，如真核細(xì)胞中表達(dá)。 克隆載體通常包含可用于選擇包含載體的細(xì)胞一個(gè)或多個(gè)序列和/或用于插入所關(guān)注的 核酸序列的一個(gè)或多個(gè)多克隆位點(diǎn)。
[0126] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指設(shè)計(jì)為使得插入的核酸序列在插入宿主細(xì)胞后表達(dá)的載體。 插入的核酸序列設(shè)置為與調(diào)控區(qū)可操作締合，如上所述。
[0127] 載體通過本領(lǐng)域已知的方法，如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡 聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染（溶酶體融合）、使用基因槍或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引入宿主細(xì) 胞。
[0128] 如本文所用，"培養(yǎng)"意指在允許細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂或保持細(xì)胞活動(dòng)狀態(tài)的體外條件 下溫育細(xì)胞。如本文所用，"培養(yǎng)的細(xì)胞"意指體外繁殖的細(xì)胞。
[0129] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"多肽"旨在涵蓋單個(gè)"多肽"以及多個(gè)"多肽"，并且是指由通過 酰胺鍵（也稱為肽鍵）線性連接的單體（氨基酸）構(gòu)成的分子。術(shù)語(yǔ)"多肽"是指兩個(gè)或 更多個(gè)氨基酸的任何一條或多條鏈，并且不是指具體長(zhǎng)度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡 肽、"蛋白質(zhì)"、"氨基酸鏈"或用于指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的任何其它術(shù)語(yǔ)， 包括在"多肽"的定義內(nèi)，并且術(shù)語(yǔ)"多肽"可用于代替任何這些術(shù)語(yǔ)，或可與任何這些術(shù)語(yǔ) 互換。術(shù)語(yǔ)"多肽"還意指多肽的表達(dá)后修飾產(chǎn)物，所述表達(dá)后修飾包括但不限于糖基化、 乙酰化、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)/封端基團(tuán)的衍生化、蛋白酶裂解或通過非天然存 在的氨基酸的修飾。多肽可衍生自天然生物來源或重組制備技術(shù)，但不必從指定的核酸序 列翻譯。它可以任何方式生成，包括化學(xué)合成。
[0130] "分離的"多肽或片段、變體、或其衍生物是指不處于其天然環(huán)境的多肽。不需要具 體水平的純化。例如，分離的多肽可以僅僅從其天然或自然環(huán)境移除。出于本發(fā)明的目的， 在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白質(zhì)被視為分離的，通過任何合適的技術(shù)分離、 分級(jí)或部分或基本上純化的天然或重組多肽也一樣。
[0131] 本發(fā)明還包括多肽的片段或變體，以及它們的任何組合。當(dāng)涉及本發(fā)明的多肽結(jié) 合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子時(shí)，術(shù)語(yǔ)"片段"或"變體"包括保持參考多肽的至少一些特性（如， 對(duì)FcRn結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fe變體的FcRn結(jié)合親合力、對(duì)FVIII變體的凝血活性或VWF片段的FVIII結(jié)合活性）的任何多肽。除本文別處討論的具體抗體片段之外，多肽片段還包括蛋白 酶水解片段，以及缺失片段，但不包括天然存在的全長(zhǎng)多肽（或成熟多肽）。本發(fā)明的多肽 結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子的變體包括上述片段，以及具有由于氨基酸取代、缺失或插入而改 變的氨基酸序列的多肽。變體可以是天然或非天然存在的。非天然存在的變體可使用本領(lǐng) 域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。
[0132] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)一個(gè)或多個(gè)"VWF片段"意指與FVIII相互作用并且保持全長(zhǎng) VWF通常提供給FVIII的至少一種或多種特性的任何VWF片段，所述特性如防止FVIIIa的 過早活化，防止過早蛋白水解，防止可導(dǎo)致過早清除的與磷脂膜的締合，防止與可結(jié)合裸露 FVIII而非VWF結(jié)合FVIII的FVIII清除受體的結(jié)合，和/或穩(wěn)定FVIII重鏈和輕鏈相互 作用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"VWF片段"不包括全長(zhǎng)或成熟VWF蛋白。在具體實(shí)施方案中，如本 文所用，"VWF片段"包含VWF蛋白的D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，但不包括VWF蛋白的Al結(jié)構(gòu) 域、A2結(jié)構(gòu)域、A3結(jié)構(gòu)域、D4結(jié)構(gòu)域、Bl結(jié)構(gòu)域、B2結(jié)構(gòu)域、B3結(jié)構(gòu)域、Cl結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu) 域和CK結(jié)構(gòu)域。
[0133] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"半衰期限制因子"或"FVIII半衰期限制因子"表示防止FVIII 蛋白的半衰期長(zhǎng)于野生型FVIIl(如，ADVATE?.或MEAGTO? )的L5倍或2倍的因 子。例如，全長(zhǎng)或成熟VWF可通過誘導(dǎo)FVIII和VWF復(fù)合物通過一條或多條VWF清除通路 從系統(tǒng)清除而充當(dāng)FVIII半衰期限制因子。在一個(gè)實(shí)例中，內(nèi)源性VWF是FVIII半衰期限 制因子。在另一個(gè)實(shí)例中，非共價(jià)結(jié)合至FVIII蛋白的全長(zhǎng)重組VWF分子是FVIII半衰期 限制因子。
[0134] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源性VWF"表示天然存在于血漿中的VWF分子。內(nèi)源性VWF分 子可以是多聚體，但可以是單體或二聚體。血漿中的內(nèi)源性VWF結(jié)合至FVIII，并且與FVIII 形成非共價(jià)復(fù)合物。
[0135] "保守氨基酸取代"是其中氨基酸殘基被具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的取代。 具有類似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中有所定義，包括堿性側(cè)鏈（如，賴氨酸、精氨 酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈（如，天冬氨酸、谷氨酸）、不帶電極性側(cè)鏈（如，甘氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側(cè)鏈（如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、 異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、支鏈側(cè)鏈（如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮 氨酸）和芳基側(cè)鏈（如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，如果多肽中的氨基酸被 來自相同側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸替代，則取代被視為保守的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基 酸鏈可被側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成不同、結(jié)構(gòu)類似的鏈保守替代。
[0136] 如本領(lǐng)域已知，兩個(gè)多肽之間的"序列同一性"通過比較一個(gè)多肽的氨基酸 序列與第二個(gè)多肽的序列確定。在本文中討論時(shí)，任何特定多肽是否與另一條多肽具 有至少約 50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或 100% 同一性可使用 本領(lǐng)域已知的方法和計(jì)算機(jī)程序/軟件確定，例如但不限于BESTFIT程序（Wisconsin SequenceAnalysisPackage，Version8forUnix，GeneticsComputerGroup，University ResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711)。BESTFIT使用Smithand Waterman，AdvancesinAppliedMathematics2:482_489 (1981)的局部同源性算法查找兩 個(gè)序列之間的最佳同源性片段。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明使用BESTFIT或任何其它序列比對(duì)程序確定 特定序列是否與參考序列具有例如95%同一性時(shí)，參數(shù)的設(shè)置毫無(wú)疑問使得同一性的百分 比針對(duì)參考多肽序列全長(zhǎng)計(jì)算，并且允許參考序列中氨基酸總數(shù)的最多5%的同源性空位。
[0137] 如本文所用，VWF序列或FVIII蛋白序列中的"對(duì)應(yīng)氨基酸"或"等同氨基酸"通過 比對(duì)識(shí)別以使第一VWF或FVIII序列和第二VWF或FVIII序列之間的同一性或相似性最大 化。用于識(shí)別第二VWF或FVIII序列中的等同氨基酸的數(shù)量基于用于識(shí)別第一VWF或FVIII 序列中的對(duì)應(yīng)氨基酸的數(shù)量。
[0138] "融合"或"嵌合"蛋白包含連接至第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，其在自然狀 態(tài)下不會(huì)天然連接。通常存在于單獨(dú)蛋白質(zhì)中的氨基酸序列可集合于融合多肽中，或通常 存在于相同蛋白質(zhì)中的氨基酸序列在融合多肽中可置于新排列，如本發(fā)明的因子VIII結(jié) 構(gòu)域與免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的融合。例如，通過化學(xué)合成或通過創(chuàng)建和翻譯其中肽區(qū)以所 需關(guān)系編碼的多核苷酸來創(chuàng)建融合蛋白。嵌合蛋白還可包含通過共價(jià)非肽鍵或非共價(jià)鍵與 第一氨基酸序列締合的第二氨基酸序列。
[0139] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"半衰期"是指特定多肽在體內(nèi)的生物半衰期。半衰期可通過施 用給受試者的量的一半從動(dòng)物中的循環(huán)和/或其它組織清除所需的時(shí)間來表示。當(dāng)給定多 肽的清除曲線構(gòu)建為時(shí)間的函數(shù)時(shí)，曲線通常具有快速α-相和較長(zhǎng)β-相兩相。α-相 通常表示所施用的Fc多肽在血管內(nèi)腔和血管外間隙之間的平衡，并且部分通過多肽的大 小確定。β-相通常表示血管內(nèi)腔中多肽的分解代謝。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII和包含 FVIII的嵌合蛋白是單相的，并且因此不具有α-相，而只有單個(gè)β-相。因此，在某些實(shí)施 方案中，如本文所用，術(shù)語(yǔ)半衰期是指β-相中多肽的半衰期。人抗體在人體中的典型β 相半衰期為21天。
[0140] 應(yīng)用于多核苷酸或多肽的術(shù)語(yǔ)"異源"意指多核苷酸或多肽來源于與其進(jìn)行比較 的實(shí)體不同的實(shí)體。因此，連接至VWF片段的異源多肽意指連接至VWF片段的多肽鏈，并且 不是VWF片段的天然存在部分。例如，異源多核苷酸或抗原可來源于不同的物種、個(gè)體的不 同細(xì)胞類型或不同個(gè)體的相同或不同類型細(xì)胞。
[0141] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"連接"是指分別共價(jià)或非共價(jià)連接至第二氨基酸序列或核苷酸 序列的第一氨基酸序列或核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)"共價(jià)連接"或"共價(jià)鍵合"是指共價(jià)鍵，如二 硫鍵、肽鍵，或連接在一起的兩個(gè)部分之間的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，如連接基。第一氨基酸或 核苷酸序列可直接連接第二氨基酸或核苷酸序列或與其并置，或者插入序列可將第一序列 共價(jià)連接至第二序列。術(shù)語(yǔ)"連接"不僅意指第一氨基酸序列C-末端或N-末端融合至第 二氨基酸序列，而且包括整個(gè)第一氨基酸序列（或第二氨基酸序列）插入第二氨基酸序列 (或分別地第一氨基酸序列）中的任何兩個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一氨基酸序列可 通過肽鍵或連接基連接至第二氨基酸序列。第一核苷酸序列可通過磷酸二酯鍵或連接基連 接至第二核苷酸序列。連接基可以是肽或多肽（對(duì)于多肽鏈）或核苷酸或核苷酸鏈（對(duì)于 核苷酸鏈）或任何化學(xué)部分（對(duì)于多肽和多核苷酸鏈二者）。共價(jià)鍵合有時(shí)以（_)或連字 符表示。
[0142] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"與…締合"指第一氨基酸鏈和第二氨基酸鏈之間形成的共價(jià)或 非共價(jià)鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)"與…締合"意指共價(jià)非肽鍵或非共價(jià)鍵。在一些實(shí)施 方案中，該締合以冒號(hào)即（:）表示。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其意指除肽鍵之外的共價(jià)鍵。在 其它實(shí)施方案中，如本文所用，術(shù)語(yǔ)"共價(jià)締合"意指兩個(gè)部分之間通過共價(jià)鍵，如二硫鍵、 肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸（如，連接基）締合。例如，氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫鍵或 與第二半胱氨酸殘基上的巰基橋接的巰基。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CHl和CL區(qū)通 過二硫鍵締合，并且兩條重鏈通過兩個(gè)二硫鍵在對(duì)應(yīng)于使用Kabat編號(hào)系統(tǒng)的第239和242 位（第226或229位，EU編號(hào)系統(tǒng)）的位置結(jié)合。共價(jià)鍵的實(shí)例包括但不限于：肽鍵、金屬 鍵、氫鍵、二硫鍵、σ鍵、Ji鍵、δ鍵、糖苷鍵、抓氫鍵（agnosticbond)、彎鍵、偶極鍵、Ji主 鏈、雙鍵、三鍵、四鍵、五鍵、六鍵、綴合作用、超綴合作用、芳香作用、哈普托數(shù)（hapticity) 或反鍵。非共價(jià)鍵的非限制性實(shí)例包括離子鍵（如，陽(yáng)離子-η鍵或鹽鍵）、金屬鍵、氫鍵 (如，二氫鍵、二氫配合（dihydrogencomplex)、低能障氫鍵或?qū)ΨQ氫鍵）、范德華力、色散 力（Londondispersionforce)、機(jī)械結(jié)合、鹵鍵、親金作用、嵌入、堆疊、熵力或化學(xué)極性。
[0143] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"單體-二聚體雜合物"是指包含通過二硫鍵彼此締合的第一多 肽鏈和第二多肽鏈的嵌合蛋白，其中第一鏈包含凝血因子，如因子VIII和Fc區(qū)，并且第二 鏈包含、基本上由或由無(wú)凝血因子的Fc區(qū)組成。因此，單體-二聚體雜合構(gòu)建體是包含只 具有一個(gè)凝血因子的單體方面和具有兩個(gè)Fc區(qū)的二聚體方面的雜合物。
[0144] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"切割位點(diǎn)"或"酶切割位點(diǎn)"是指酶識(shí)別的位點(diǎn)。某些酶切 割位點(diǎn)包含細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽具有由在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)期間活化 的酶切割的酶切割位點(diǎn)，使得此類位點(diǎn)的切割在凝血形成部位進(jìn)行。此類示例性位點(diǎn)包 括例如由凝血酶、因子XIa或因子Xa識(shí)別的那些位點(diǎn)。示例性FXIa切割位點(diǎn)包括例如 TQSFNDFTR(SEQIDN0:47)和SVSQTSKLTR(SEQIDN0:48)。示例性凝血酶切割位點(diǎn)包 括例如DFLAEGGGVR(SEQIDN0:49)、TTKIKPR(SEQIDN0:50)、LVPRG(SEQIDN0:55)和 ALRPR(SEQIDNO:51的第I至5位氨基酸）。其它酶切割位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的。
[0145] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"加工位點(diǎn)"或"細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)"是指作為在多肽翻譯后發(fā)揮 功能的酶的靶標(biāo)的多肽中的一種類型的酶切割位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，此類酶在從高爾 基腔至反面高爾基隔室的轉(zhuǎn)運(yùn)期間發(fā)揮功能。細(xì)胞內(nèi)加工酶在蛋白質(zhì)從細(xì)胞分泌之前切割 多肽。此類加工位點(diǎn)的實(shí)例包括例如由PACE/弗林蛋白酶（其中PACE是成對(duì)堿性氨基酸 裂解酶的縮寫）家族內(nèi)切肽酶靶向的那些。這些酶定位于高爾基體膜，并且切割序列基序 Arg-[任何殘基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端側(cè)的蛋白質(zhì)。如本文所用，"弗林蛋白酶"家 族酶包括例如PCSKl(也稱為PCl/Pc3)、PCSK2 (也稱為PC2)、PCSK3 (也稱為弗林蛋白酶或 PACE)、PCSK4 (也稱為PC4)、PCSK5 (也稱為PC5 或PC6)、PCSK6 (也稱為PACE4)或PCSK7 (也 稱為PC7/LPC、PC8或SPC7)。其它加工位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的。
[0146] 術(shù)語(yǔ)"弗林蛋白酶"是指對(duì)應(yīng)于ECNo. 3.4. 21. 75的酶。弗林蛋白酶是枯草桿菌 蛋白酶樣前蛋白轉(zhuǎn)化酶，其也稱為PACE(成對(duì)堿性氨基酸裂解酶）。弗林蛋白酶缺失了失活 前體蛋白的部分以將它們轉(zhuǎn)化為生物活性蛋白。在其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)期間，原肽通過高爾基體 中的弗林蛋白酶從成熟VWF分子切割。
[0147] 在包括超過一個(gè)加工或切割位點(diǎn)的構(gòu)建體中，應(yīng)當(dāng)理解此類位點(diǎn)可以是相同的或 不同的。
[0148] 如本文所用，止血病癥意指特征在于由于形成血纖維蛋白凝塊的能力受損或無(wú) 能，具有自發(fā)或作為創(chuàng)傷結(jié)果的溢血趨勢(shì)的基因遺傳或獲得的病癥。此類疾病的實(shí)例包 括血友病。三種主要形式是甲型血友?。ㄒ蜃覸III缺失）、乙型血友病（因子IX缺失 或"克雷司馬疾病"）和丙型血友病（因子XI缺失，輕度出血趨勢(shì)）。其它止血病癥包括 例如血管性血友病、因子XI缺失（PTA缺失）、因子XII缺失、血纖維蛋白原、凝血酶原、因 子V、因子VII、因子X或因子XIII缺失或結(jié)構(gòu)異常、GPIb缺陷或缺失的巨血小板綜合征 (Bernard-Soulier)。VWF的受體GPIb可為缺陷的，并導(dǎo)致初期凝塊形成（初期止血）缺 乏和出血趨勢(shì)增加，以及格-尼二氏血小板無(wú)力癥（thrombastheniaofGlanzmanand Naegeli)(Glanzmannthrombasthenia)。在肝功能衰竭（急性和慢性形式）中，肝臟產(chǎn)生 的凝血因子不足；這可增加出血風(fēng)險(xiǎn)。
[0149] 本發(fā)明的嵌合分子可預(yù)防地使用。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防性治療"是指在出血發(fā) 作之前施用分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，需要一般止血?jiǎng)┑氖茉囌哒诮?jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷外科 手術(shù)。本發(fā)明的嵌合蛋白可在手術(shù)之前或之后作為預(yù)防即施用。本發(fā)明的嵌合蛋白可在外 科手術(shù)期間或之后施用以控制急性出血發(fā)作。外科手術(shù)可包括但不限于肝臟移植、肝臟切 除、牙科手術(shù)或干細(xì)胞移植。
[0150] 本發(fā)明的嵌合蛋白還用于按需（也稱為"發(fā)病期"）治療。術(shù)語(yǔ)"按需治療"或"發(fā) 病期治療"是指響應(yīng)出血發(fā)作的癥狀或在可引起出血的活動(dòng)之前施用嵌合分子。在一個(gè)方 面，當(dāng)出血開始時(shí)，例如受傷后，或當(dāng)預(yù)期要出血時(shí)，例如在外科手術(shù)之前，可給予受試者按 需（發(fā)病期）治療。在另一個(gè)方面，在增加出血風(fēng)險(xiǎn)的活動(dòng)，例如接觸運(yùn)動(dòng)之前可給予按需 治療。
[0151] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"急性出血"是指與根本原因無(wú)關(guān)的出血發(fā)作。例如，受試者可 具有創(chuàng)傷、尿毒癥、遺傳性出血疾?。ㄈ?，因子VII缺失）、血小板疾病或由于凝血因子抗體 的發(fā)展而產(chǎn)生的抗性。
[0152] 如本文所用，治療是指例如疾病或病癥的嚴(yán)重性減少；病程的持續(xù)時(shí)間減少；與 疾病或病癥相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)癥狀改善；為患有疾病或病癥的受試者提供有益效果，而不 必治愈疾病或病癥，或與疾病或病癥相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)癥狀的預(yù)防。在一個(gè)實(shí)施方案中，術(shù) 語(yǔ)"治療"意指通過施用本發(fā)明的嵌合蛋白或VWF片段保持受試者中至少約lIU/dL、2IU/ dL、3IU/dL、4IU/dL、5IU/dL、6IU/dL、7IU/dL、8IU/dL、9IU/dL、10IU/dL、llIU/dL、12IU/dL、 13IU/dL、14IU/dL、15IU/dL、16IU/dL、17IU/dL、18IU/dL、19IU/dL或 20IU/dL的FVIII谷底 水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療意指保持約1和約20IU/dL、約2和約20IU/dL、約3和約 20IU/dL、約 4 和約 20IU/dL、約 5 和約 20IU/dL、約 6 和約 20IU/dL、約 7 和約 20IU/dL、約 8 和約20IU/dL、約9和約20IU/dL或約10和約20IU/dL之間的FVIII谷底水平。疾病或病 癥的治療也可包括保持受試者中FVIII活性相當(dāng)于非血友病受試者中FVIII活性的至少約 1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%U0%>11%>12%U3%U4%U5%U6%U7%, 18%、19%或20%的水平。治療所需的最小谷底水平可通過一種或多種已知方法測(cè)量，并且 可為每個(gè)人調(diào)整（增加或減少）。
[0153] 嵌合蛋白
[0154] 本發(fā)明涉及通過阻止或抑制FVIII半衰期限制因子（如內(nèi)源性VWF)在體內(nèi)與 FVIII蛋白締合而延長(zhǎng)因子VIII蛋白的半衰期。內(nèi)源性VWF與非共價(jià)復(fù)合物中約95%至 約98%的FVIII締合。結(jié)合至FVIII蛋白的內(nèi)源性VWF已知以各種方式保護(hù)FVIII。例如， 全長(zhǎng)VWF(作為具有約250kDa的多聚體）可保護(hù)FVIII不被蛋白酶切割和FVIII活化，穩(wěn) 定FVIII重鏈和/或輕鏈以及防止FVIII被清除劑受體清除。然而，同時(shí)，內(nèi)源性VWF通過 阻止胞飲以及通過VWF清除途徑從系統(tǒng)清除FVIII-VWF復(fù)合物限制FVIII半衰期。據(jù)信， 如實(shí)例中所示，內(nèi)源性VWF是半衰期限制因子，其防止融合至半衰期延長(zhǎng)因子的FVIII蛋白 的半衰期長(zhǎng)于野生型FVIII的約兩倍。因此，本發(fā)明使用輔助部分阻止或抑制內(nèi)源性VWF 和FVIII蛋白之間的相互作用，從而阻止FVIII蛋白被通過VWF清除途徑清除和/或誘導(dǎo) 胞飲。在一個(gè)實(shí)施方案中，輔助部分能夠阻止或抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF結(jié)合，并且具 有至少一種VWF樣FVIII保護(hù)特性。此外，輔助部分通過阻止或抑制與內(nèi)源性VWF的相互 作用減少FVIII從系統(tǒng)清除。本發(fā)明的輔助部分結(jié)合或締合（如，通過非共價(jià)鍵合）FVIII 蛋白和/或物理或化學(xué)阻斷FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)。因此，與野生型FVIII或不與 輔助部分締合的FVIII相比，與輔助部分締合的FVIII蛋白通過一個(gè)或多個(gè)VWF清除受體 更緩慢地從循環(huán)清除。
[0155] 本發(fā)明輔助部分的實(shí)例包括例如多肽或FVIII蛋白的化學(xué)或物理修飾、添加、缺 失或變型。用于本發(fā)明的輔助部分可包括多肽、非多肽部分或它們二者。作為輔助部分的 多肽的非限制性實(shí)例包括例如本文所述的VWF片段、免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、轉(zhuǎn)鐵蛋 白或其片段、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、HAP序列、PAS序列或它們的任何組合。非 多肽部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或 它們的任何組合。本發(fā)明使用的其它此類部分也是本領(lǐng)域已知的。
[0156] 在一個(gè)實(shí)施方案中，輔助部分通過共價(jià)或非共價(jià)鍵與FVIII蛋白締合（或連接）。 然而，在一些情況下，在內(nèi)源性VWF存在下，輔助部分和FVIII蛋白之間的物理封閉或化學(xué) 締合（如，非共價(jià)鍵合）的強(qiáng)度可能不足以提供包含F(xiàn)VIII蛋白和輔助部分的穩(wěn)定復(fù)合物。 例如，在內(nèi)源性VWF存在下，與FVIII蛋白形成無(wú)任何其它連接的非共價(jià)鍵的VWF片段可易 于在體內(nèi)從FVIII蛋白解離，從而用內(nèi)源性VWF替代VWF片段（如，重組VWF，S卩rVWF)。因 此，非共價(jià)結(jié)合內(nèi)源性VWF的FVIII蛋白可經(jīng)歷VWF清除途徑并從系統(tǒng)清除。為了阻止輔助 部分與FVIII蛋白解離，在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白和輔助部分之間的鍵合是共價(jià)鍵， 如肽鍵、一個(gè)或多個(gè)氨基酸或二硫鍵。在某些實(shí)施方案中，輔助部分和FVIII蛋白之間的締 合（即，鍵合）是肽鍵或FVIII蛋白和輔助部分之間的連接基（"FVIII/AM連接基"）。連 接基的非限制性實(shí)例在本文別處有所描述。在一些實(shí)施方案中，輔助部分是包含、基本上由 或由至少約10個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400個(gè)、500個(gè)、600個(gè)、700個(gè)、800個(gè)、900個(gè)、1000 個(gè)、1100 個(gè)、1200 個(gè)、1300 個(gè)、1400 個(gè)、1500 個(gè)、1600 個(gè)、1700 個(gè)、1800 個(gè)、1900 個(gè)、2000 個(gè)、 2500個(gè)、3000個(gè)或4000個(gè)氨基酸組成的多肽。在其它實(shí)施方案中，輔助部分是包含、基本 上由或由約100至約200個(gè)氨基酸、約200至約300個(gè)氨基酸、約300至約400個(gè)氨基酸、 約400至約500個(gè)氨基酸、約500至約600個(gè)氨基酸、約600至約700個(gè)氨基酸、約700至 約800個(gè)氨基酸、約800至約900個(gè)氨基酸或約900至約1000個(gè)氨基酸組成的多肽。在一 些實(shí)施方案中，與FVIII蛋白共價(jià)締合的輔助部分是本文別處所述的VWF片段。
[0157]在某些實(shí)施方案中，輔助部分化學(xué)（如，非共價(jià)）結(jié)合或物理阻斷FVIII蛋白上的 一個(gè)或多個(gè)VWF結(jié)合位點(diǎn)。FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)位于FVIII蛋白的A3結(jié)構(gòu)域或 C2結(jié)構(gòu)域內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)位于A3結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu) 域內(nèi)。例如，F(xiàn)VIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)可對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 16[全長(zhǎng)成熟FVIII]的第 1669至1689位和/或第2303至2332位氨基酸。
[0158] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含連接至輔助部分的FVIII蛋白，其中 輔助部分是VWF分子，如包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，但不包含VWF清除受體結(jié)合位點(diǎn)的 VWF片段，并且屏蔽或保護(hù)FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制或阻止FVIII蛋白與內(nèi) 源性VWF的相互作用。在某些實(shí)施方案中，輔助部分是VWF片段。用于本發(fā)明的VWF片段 包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域，仍為FVIII蛋白提供VWF樣特性的一個(gè)或多個(gè)優(yōu)勢(shì)，但VWF片 段不經(jīng)歷VWF清除途徑。FVIII蛋白和輔助部分可通過連接基（如，F(xiàn)VIII/AM連接基）共 價(jià)締合。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接基可以是可切割的連接基。連接基的非限制性實(shí)例在本 文別處有所公開。
[0159] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含F(xiàn)VIII蛋白和免疫球蛋白恒定區(qū)或其 部分（即，輔助部分），其中免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分屏蔽或保護(hù)FVIII蛋白上的VWF結(jié) 合位點(diǎn)，從而抑制或阻止FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用。在其它實(shí)施方案中，免疫球 蛋白恒定區(qū)或其部分是Fc區(qū)。
[0160] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及嵌合或融合蛋白或包含本文所公開的一個(gè)或多個(gè)VWF片 段的雜合物及其用途。嵌合或融合蛋白可融合或連接至一個(gè)或多個(gè)異源部分（本文有時(shí)以 H或Hl表示）。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源部分（Hl)是天然不與VWF片段一起存在和/或連 接至VWF片段的異源肽或異源多肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源部分（Hl)是非多肽部分， 如肽或多肽與非多肽部分的化學(xué)修飾或組合。在一些實(shí)施方案中，VWF片段通過連接基（本 文也稱為"VWF連接基"）連接或鍵合至異源部分（Hl)。在一個(gè)實(shí)施方案中，VWF連接基是 可切割的連接基。VWF片段和異源部分（Hl)之間的連接基的非限制性實(shí)例在本文別處有所 公開。
[0161] 在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的異源部分（Hl)改善了VWF片段的一種或多種藥 代動(dòng)力學(xué)特性，而不顯著影響VWF片段的生物學(xué)活性或功能（如，其與FVIII蛋白的結(jié)合 或締合）。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接至VWF片段的異源部分（Hl)可延長(zhǎng)VWF片段的半衰 期。異源多肽部分的非限制性實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋 白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的兩種或多種組合。異源非多肽 部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們 的任何組合。
[0162] 在一些實(shí)施方案中，異源部分（Hl)可用于通過共價(jià)鍵連接VWF片段和FVIII蛋 白?？商峁┕矁r(jià)鍵合的異源部分的實(shí)例包括但不限于包含鉸鏈區(qū)如Fc區(qū)或FcRn結(jié)合伴侶 的免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分。在具體實(shí)例中，F(xiàn)VIII蛋白連接至第一Fc區(qū)，并且VWF片 段連接至第二Fc區(qū)，其中第一Fc區(qū)和第二Fc區(qū)形成一個(gè)或多個(gè)二硫鍵。
[0163] 在一些實(shí)施方案中，異源部分（在本文中有時(shí)以"H"或"H1"表不）是免疫球蛋白 恒定區(qū)或其部分。免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分的非限制性實(shí)例可選自由以下組成的組=CHl 結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、CH4結(jié)構(gòu)域、鉸鏈結(jié)構(gòu)域以及它們的兩種或多種組合。在 一個(gè)實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分包含至少一個(gè)CHl結(jié)構(gòu)域、至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu) 域、至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域、至少一個(gè)CH4結(jié)構(gòu)域或其功能片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫 球蛋白恒定區(qū)或其部分包含至少一個(gè)鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分，以及至少一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其 部分（如，鉸鏈-CH2方向）。在其它實(shí)施方案中，免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域或其部分包含至少 一個(gè)CH2結(jié)構(gòu)域或其部分，以及至少一個(gè)CH3結(jié)構(gòu)域或其部分（如，CH2-CH3方向）。組合 的實(shí)例包括但不限于：CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域，它們也稱為Fc區(qū)（或Fc結(jié)構(gòu) 域），如第一Fc區(qū)。在其它實(shí)施方案中，異源部分（Hl)通過連接基連接至VWF片段。在某 些實(shí)施方案中，異源部分（HI)是本文別處所述的FcRn結(jié)合伴侶。在其它實(shí)施方案中，異源 部分（Hl)是鉸鏈區(qū)。
[0164] 在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白還包含第二（或另外的）異源部分（在本文中有時(shí) 以"H2"表示）。值得注意的是，第一異源部分（Hl)和第二異源部分（H2)可互換使用，并且 可以是相同的或不同的。第二異源部分（H2)可通過肽鍵、一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或通過連接 基（如，F(xiàn)VIII連接基（如果連接至FVIII))連接至FVIII蛋白或嵌合蛋白的別處。此類 構(gòu)建體有時(shí)可稱為FVIII/VWF異源二聚體。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源部分（H2)包含異源多 肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，異源部分（H2)包括非多肽部分。在其它實(shí)施方案中，異源部分 (H2)包括異源部分和非多肽部分的組合。第二異源部分（H2)可以是半衰期延長(zhǎng)因子。第 二異源多肽部分（H2)的非限制性實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、 白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的兩種或多種組合。異源非 多肽部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或 它們的任何組合。在某些實(shí)施方案中，第一異源部分（Hl)和第二異源部分是相同的或不同 的。第一異源部分（Hl)和第二異源部分（H2)的任一者或兩者可賦予嵌合蛋白中FVIII蛋 白的半衰期延長(zhǎng)，提供比非共價(jià)締合更強(qiáng)的連接，即通過嵌合蛋白中FVIII蛋白和VWF片段 或它們二者之間的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵。一旦融合或連接至第一異源部分（Hl)的VWF片段 通過阻止或抑制FVIII蛋白和內(nèi)源性VWF蛋白之間的相互作用移除半衰期上限，則融合至 異源部分的FVIII蛋白可發(fā)揮其全部潛力，并且可具有長(zhǎng)于野生型FVIII兩倍的半衰期。
[0165] 在某些實(shí)施方案中，連接至VWF片段的第一異源部分（如，第一Fc區(qū)）和連接至 FVIII蛋白的第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）彼此締合，使得該締合阻止VWF片段在體內(nèi)被 內(nèi)源性VWF替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二異源部分是第二Fc區(qū)，其中第二Fc區(qū)通過共價(jià) 鍵，如二硫鍵、肽鍵或連接基（一個(gè)或多個(gè)氨基酸）連接至第一異源部分，如第一Fc區(qū)或與 之締合。例如，在一個(gè)末端連接至FVIII蛋白的第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）還可連接 至第一異源部分（如，第一Fc區(qū)），所述第一異源部分通過連接基（如，scFc連接基）連接 至VWF片段，或通過共價(jià)或非共價(jià)鍵與第一異源部分締合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二異源 部分（如，第二Fc區(qū)）連接至VWF片段，所述VWF片段已連接至第一異源部分。在一些實(shí) 施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含VWF片段和第一 異源部分，所述第二多肽鏈包含F(xiàn)VIII蛋白和第二異源部分，其中第一多肽鏈和第二多肽 鏈締合，其中包含第一異源部分的第一多肽鏈和包含第二異源部分的第二多肽鏈之間的締 合是共價(jià)鍵，因此允許VWF片段和FVIII蛋白保持其彼此相互作用。同時(shí)，可與FVIII蛋白 形成非共價(jià)鍵的內(nèi)源性VWF不能替代包含VWF片段的共價(jià)連接多肽鏈。
[0166] 第一異源部分（Hl)和VWF片段（如，VWF連接基）之間的連接基可以是可切割的 連接基，如凝血酶可切割連接基?？汕懈畹倪B接基可被選自由以下組成的組的蛋白酶切割： 因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因子Xa、因子IIa(凝血酶）、彈性蛋 白酶-2、粒酶-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選酶A、MMP-12、MMP-13、MMP-17、MMP-20以及 它們的任何組合。在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化時(shí)，這些可切割的連接基允許切割VWF片段，并且從 FVIII蛋白解離，從而產(chǎn)生具有完全活性潛力的FVIII蛋白。
[0167] 在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白作為包含任何順序的VWF片段、可切割的連接基、第 一異源部分（Hl)、可加工的連接基、FVIII蛋白和第二異源部分（H2)的單多肽鏈產(chǎn)生。在 合成后，可加工的連接基可在分泌前被胞內(nèi)蛋白酶切割，從而產(chǎn)生上述兩條多肽鏈。在分泌 前的單鏈構(gòu)建體中，第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）可通過可加工的連接基連接至VWF片 段。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)連接基可包含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)。
[0168] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白還包含第三異源部分（本文有時(shí)以"H3"表 示）。第三異源部分（H3)可以是半衰期延長(zhǎng)因子。異源部分（H3)可包括異源多肽、非多 肽部分或二者的組合。第三異源部分（H3)的非限制性實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部 分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段、其任何衍生 物或變體或它們的兩種或多種組合。非多肽部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、聚 唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。連接至VWF片段的第一異源部分 (Hl)、連接至FVIII蛋白的第二異源部分（H2)和第三異源部分（H3)可以是相同的或不同 的。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一異源部分（Hl)與第二異源部分（H2)相同，但不同于第三異源 部分（H3)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第三異源部分（H3)融合或連接至嵌合蛋白的FVIII蛋白 或VWF片段。在一些實(shí)施方案中，第三異源部分插入FVIII蛋白的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中或 FVIII蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。
[0169] 在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中第一鏈包含通 過任選的連接基（如，F(xiàn)VIII連接基）連接至第一異源部分（Hl)如第一Fc區(qū)的FVIII蛋 白，并且第二鏈包含通過任選的連接基（如，VWF連接基）連接至第二異源部分（H2)如第 二Fc區(qū)的VWF片段。FVIII蛋白還可包含第三異源部分（H3)，如任何半衰期延長(zhǎng)部分，如 白蛋白，或FVIII重鏈和FVIII輕鏈之間的PAS序列（即，SEQIDNO: 16的第1648位氨基 酸殘基），從而作為單鏈FVIII蛋白?；蛘撸現(xiàn)VIII蛋白可以是雙鏈蛋白，即通過共價(jià)或非 共價(jià)鍵（如，金屬鍵）彼此締合的FVIII重鏈和FVIII輕鏈，其中重鏈還連接至第三異源部 分（H3)，如非結(jié)構(gòu)半衰期延長(zhǎng)多肽、白蛋白或其片段或PAS序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌 合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中第一鏈包含通過任選的連接基（如，F(xiàn)VIII連接 基）連接至第一異源部分（Hl)如第一Fc區(qū)的FVIII蛋白，并且第二鏈包含連接至第三異 源部分（H3)如非結(jié)構(gòu)半衰期延長(zhǎng)多肽、白蛋白或PAS序列的VWF片段，其通過任選的連接 基連接至第二異源部分（H2)如第二Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第三異源部分（H3)(如，半 衰期延長(zhǎng)多肽）可連接至FVIII蛋白的C-末端或N-末端或插入FVIII蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域 之間或FVIII蛋白的結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)氨基酸之間。
[0170] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白還包含第四異源部分（本文有時(shí)以"H4"表 示）和/或第五異源部分（本文有時(shí)以"H5"表示）。第四或第五異源部分也可以是半衰期 延長(zhǎng)因子。第四異源部分和/或第五異源部分可與第三異源部分相同或不同。異源部分可 包括異源多肽、非多肽部分或二者的組合。第四或第五異源部分的非限制性實(shí)例包括免疫 球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白 或其片段、其任何衍生物或變體或它們的兩種或多種組合。非多肽部分的非限制性實(shí)例包 括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。第一異源部 分、第二異源部分、第三異源部分、第四異源部分和第五異源部分可以是相同的或不同的。 在一些實(shí)施方案中，第四異源部分（如，半衰期延長(zhǎng)多肽）可連接至FVIII蛋白的C-末端或 N-末端或插入FVIII蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間或FVIII蛋白的結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)氨基酸之間。 在其它實(shí)施方案中，第五異源部分（如，半衰期延長(zhǎng)多肽）也可連接至FVIII蛋白的C-末 端或N-末端或插入FVIII蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間或FVIII蛋白的結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)氨基酸 之間。
[0171] 在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含F(xiàn)VIII蛋白、VWF片段、第一異源部分、第二異源 部分、第三異源部分、第四異源部分和第五異源部分，其中第一異源部分和第二異源部分形 成包含F(xiàn)VIII蛋白的鏈和包含VWF片段的鏈之間的鍵（如，共價(jià)鍵），并且第三異源部分、第 四異源部分和第五異源部分是半衰期延長(zhǎng)因子，并且其中包含F(xiàn)VIII蛋白的鏈和包含VWF 片段的鏈之間的鍵強(qiáng)于FVIII和VWF片段之間的非共價(jià)相互作用，從而阻止內(nèi)源性VWF在 體內(nèi)、體外或離體與FVIII蛋白結(jié)合。
[0172] 在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含F(xiàn)VIII蛋白、VWF片段、第一異源部分、第二異源 部分、第三異源部分、第四異源部分、第五異源部分和第六異源部分（本文有時(shí)以"H6"表 示），其中第一異源部分和第二異源部分形成包含F(xiàn)VIII蛋白的鏈和包含VWF片段的鏈之 間的鍵，并且第三異源部分、第四異源部分、第五異源部分和第六異源部分是半衰期延長(zhǎng)因 子，并且其中包含F(xiàn)VIII蛋白的鏈和包含VWF片段的鏈之間的鍵強(qiáng)于FVIII和VWF片段之 間的相互作用，從而阻止內(nèi)源性VWF在體內(nèi)、體外或離體與FVIII蛋白結(jié)合。
[0173] 在一些實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：
[0174] (aa)V_L1_H1_L2_H2,
[0175] (bb)H2-L2-Hl-Ll-V,
[0176] (cc)H1_L1_V_L2_H2,和
[0177] (dd)H2_L2_V_L1_H1,
[0178] 其中V包含本文所述的VWF片段；
[0179]Ll和L2中的每個(gè)包含任選的連接基；并且
[0180]Hl包含第一異源部分；并且
[0181]H2包含任選的第二異源部分。第一異源部分和第二異源部分的任一者或兩者可以 是半衰期延長(zhǎng)部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，Hl包括多肽、非多肽部分或它們二者。用作Hl的 多肽可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP 序列、任何衍生物或變體或它們的任何組合。非多肽部分可包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、 和羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或變體或它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，H2包括多 肽、非多肽部分或它們二者。用作H2的多肽可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或 其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、任何衍生物或變體或它們的任何組合。非多 肽部分可包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或變體或它們的任 何組合。在某些實(shí)施方案中，式（aa)和（bb)中Hl和H2之間的連接基是可加工的連接基。 在其它實(shí)施方案中，式（aa)和（bb)中VWF片段和Hl之間的連接基是可切割的連接基，如 可被凝血酶切割的凝血酶可切割連接基。
[0182] 本文的式中多肽的方向從N-末端（左）至C-末端（右）列出。例如，式H-L-V 意指式NH2-H-L-V-C00H。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的式可包含兩個(gè)部分之間的另外序 列。例如，式V-L1-H1-L2-H2還可包含在V的N-末端、V和Ll之間、Ll和Hl之間、Hl或 L2之間、L2或H2之間或在H2的C-末端的序列，除非另外指明。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連 字符（_)表示肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0183] 在具體實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含、基本上由或由選自由以下組成的組的式 中的一者或多者組成：（al)V_H、（a2)H-V、（a3)V-L-H、（a4)H-L-V、（a5)V-Ll-Hl-H2、 (a6)H2-Hl-Ll-V、 （a7)V-Ll-Hl:H2、 （a8)H2:Hl-Ll-V、 （a9)V-Hl:H2、 （bl)H2:Hl-V、 (b2)V-Ll-Hl-L2-H2、 （b3)H2-L2-Hl-Ll-V、 （b4)Hl-V-H2、 （b5)Hl-Ll-V-L2-H2 和（b6) H2-L2-V-L1-H1，其中V包含本文所述的VWF片段中的一者或多者，L、L1或L2包含連接基， H或Hl包含第一異源部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一異源部分（Hl)可以是多肽、非多肽部 分或它們二者。異源多肽部分可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白 結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列或它們的任何組合。用作Hl的非多肽部分的非限制性實(shí)例包 括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。在另一個(gè)實(shí) 施方案中，H2包含第二異源部分。第二異源部分可以是多肽、非多肽部分或它們二者。異源 多肽部分可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、 HAP序列或它們的任何組合。用作Hl的非多肽部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、 聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。在某些實(shí)施方案中，第一異源部 分和第二異源部分之間的連接基是可加工的連接基。在其它實(shí)施方案中，VWF片段和第一 異源部分或第二異源部分之間的連接基是可切割的連接基，其包含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)， 如凝血酶可切割連接基。
[0184] 本發(fā)明的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：(aa)、（bb)、（cc)、（dd)、（al)、 (a2)、（a3)、（a4)、（a5)、（a6)、（a7)、（a8)、（a9)、（bl)、（b2)、（b3)、（b4)、（b5)和（b6)以及 FVIII蛋白，其共價(jià)連接至式中的VWF片段、第一異源部分（如，第一Fe區(qū)）、或第二異源部 分（如，第二Fe區(qū)）或與其共價(jià)締合。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白通過共價(jià)或非共價(jià) 鍵或通過連接基連接至VWF片段或與其締合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII蛋白可通過共 價(jià)或非共價(jià)鍵或通過連接基連接至第一異源部分或第二異源部分。
[0185] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含共價(jià)連接至FVIII蛋白或與其共價(jià)締 合的本文所述VWF片段。例如，嵌合蛋白可包含VWF片段和FVIII蛋白，其中VWF片段和 FVIII蛋白通過共價(jià)非肽鍵、肽鍵、非共價(jià)鍵，或通過連接基如可切割的連接基結(jié)合。在具體 實(shí)施方案中，VWF片段和FVIII蛋白通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵結(jié)合或彼此相互作用。在另一 個(gè)具體實(shí)施方案中，VWF片段通過非共價(jià)鍵結(jié)合位于FVIII的A3結(jié)構(gòu)域、FVIII的C2結(jié)構(gòu) 域或FVIII的A3結(jié)構(gòu)域和C2結(jié)構(gòu)域二者的FVIII蛋白或與其相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，結(jié)合FVIII蛋白或與其相互作用的VWF片段連接或融合至第一異源部分。在其它實(shí) 施方案中，結(jié)合VWF片段或與其相互作用的FVIII蛋白還連接至第二異源部分。在一些實(shí) 施方案中，結(jié)合FVIII蛋白或與其相互作用的VWF片段還連接至第一異源部分，并且FVIII 蛋白還連接至第二異源部分。在某些實(shí)施方案中，包含VWF片段和第一異源部分的第一多 肽鏈以及包含F(xiàn)VIII蛋白和第二異源部分的第二多肽鏈彼此締合，使得締合不允許FVIII 蛋白與其它部分如內(nèi)源性VWF的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，締合是共價(jià)鍵，如二硫鍵。
[0186] 每個(gè)VWF片段或FVIII蛋白可通過連接基，如可切割的連接基，如凝血酶可切割連 接基結(jié)合或連接至第一和第二異源部分。VWF片段和第一異源部分之間的連接基在本文中 可以VWF連接基表示。FVIII蛋白和第二異源部分之間的連接基在本文中可以FVIII連接 基表示。或者，VWF片段或FVIII蛋白二者可通過連接基，如可切割的連接基，如凝血酶可 切割連接基結(jié)合或連接至第一和第二異源部分。在某些實(shí)施方案中，連接至VWF片段的第 一異源部分包括多肽、非多肽部分或它們二者。第一異源多肽部分的非限制性實(shí)例包括免 疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋 白或其片段或它們的兩種或多種組合。非多肽部分的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇（PEG)、聚 唾液酸、羥乙基淀粉（HES或HAES)、其衍生物或變體或它們的任何組合。在其它實(shí)施方案 中，連接至FVIII蛋白的第二異源部分包括多肽、非多肽部分或它們二者。第二異源部分的 非限制性實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序 列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的兩種或多種組合。非多肽部分的非限制性實(shí)例包 括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES或HAES)、其衍生物或變體或它們的任何組 合。在一些實(shí)施方案中，VWF片段使用分選酶介導(dǎo)的體外蛋白連接而連接至FVIII。在一些 實(shí)施方案中，使用分選酶識(shí)別基序。
[0187] 在一個(gè)實(shí)施方案中，第一異源部分是免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分。在具體實(shí)施方 案中，第一異源部分是第一Fc區(qū)。在一些實(shí)施方案中，第二異源部分是免疫球蛋白恒定區(qū) 或其部分。在具體實(shí)施方案中，第二異源部分是第二Fc區(qū)。在具體實(shí)施方案中，嵌合蛋白 包含本文所述的VWF片段和FVIII蛋白，其中VWF片段連接至免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分， 其為Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含本文所述的VWF片段和FVIII蛋白，其中 FVIII蛋白連接至免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分，其為Fc區(qū)。在其它實(shí)施方案中，嵌合蛋白 包含本文所述的VWF片段和FVIII蛋白，其中VWF片段連接至第一免疫球蛋白恒定區(qū)，其為 第一Fc區(qū)，并且FVIII蛋白連接至第二免疫球蛋白恒定區(qū)，其為第二Fc區(qū)，并且其中VWF 片段和FVIII蛋白通過非共價(jià)鍵彼此結(jié)合或相互作用，或第一Fc區(qū)或第二Fc區(qū)通過共價(jià) 鍵彼此締合。在其它實(shí)施方案中，連接至第一異源部分的VWF片段還通過連接基如可加工 的連接基連接至第二異源部分如第二Fc區(qū)。在一個(gè)方面，VWF片段通過連接基如VWF連接 基如可切割的連接基連接至第一異源部分。在另一個(gè)方面，F(xiàn)VIII蛋白通過連接基如FVIII 連接基如可切割的連接基連接至第二異源部分。異源部分的非限制性實(shí)例在本文別處有所 公開，如第[0165]-[0193]段的免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、第[0194]-[0198]段的白蛋白 片段或其變體、第[0293]段的HAP序列、第[0204]-[0205]段的轉(zhuǎn)鐵蛋白片段或其變體、第 [0206]-[0213]段的聚合物如聚乙二醇、第[0214]-[0219]段的HES或第[0220]段的PSA 以及第[0199]-[0202]段的PAS序列。
[0188] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含、基本上由或由選自由以下組成的組 的式組成：
[0189] (a)V_L1_H1_L3_C_L2_H2,
[0190] (b)H2-L2-C-L3-H1-L1-V,
[0191] (c)C_L2_H2_L3_V_L1_H1，
[0192] (d)H1_L1_V_L3_H2_L2_C,
[0193] (e)H1_L1_V_L3_C_L2_H2,
[0194] (g)H2-L2-C-L3-V-L1-H1,
[0195] (g)V-L1-H1-L3-H2-L2-C,
[0196] (g)C-L2-H2-L3-H1-L1-V,
[0197] (i)H2-L3-Hl-Ll-V-L2-C,
[0198] (j)C-L2-V-Ll-Hl-L3-H2,
[0199] (k)V_L2_C_L1_H1_L3_H2,和
[0200] (1)H2-L3-H1-L1-C-L2-V,
[0201] 其中V是本文所述的VWF片段；
[0202] Ll或L2中的每個(gè)是任選的連接基，如可切割的連接基，如凝血酶可切割連接基；
[0203] L3是任選的連接基，如可加工的連接基
[0204] Hl和H2中的每個(gè)是任選的異源部分；
[0205] C是FVIII蛋白；并且
[0206] (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0207] 在其它方面，本發(fā)明的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式：
[0208] (m)V-Ll-Hl:H2-L2-C，
[0209] (n)V-Ll-Hl:C-L2-H2 ;
[0210] (〇)Hl-Ll-V:H2-L2-C;
[0211] (ρ)Hl-Ll-V:C-L2-H2 ;
[0212] (q)V:C-Ll-Hl:Η2；
[0213] (r)V:Hl-Ll-C:Η2 ；
[0214] (s)Η2:Hl-Ll-C:V，
[0215] (t)C:V-Ll_Hl:H2,和
[0216] (u)C:Hl-Ll-V:H2。
[0217] 其中V是本文所述的VWF片段；
[0218] Ll或L2中的每個(gè)是任選的連接基，如凝血酶可切割連接基；
[0219] Hl或H2中的每個(gè)是任選的異源部分；
[0220] (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸；并且
[0221] C是FVIII蛋白；并且（:）是Hl和H2之間的化學(xué)或物理締合。
[0222] 在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)異源部分是半衰期延長(zhǎng)因子。半衰期延長(zhǎng)因子是 本領(lǐng)域已知的，并且此類半衰期延長(zhǎng)因子的非限制性實(shí)例包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部 分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段、其衍生物或 變體或它們的兩種或多種組合。非多肽部分可包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉 (HES)、其衍生物或它們的任何組合。
[0223] 在一個(gè)實(shí)施方案中，式（m)至（U)中的（:）表示化學(xué)締合，如至少一個(gè)非肽鍵。在 某些實(shí)施方案中，所述化學(xué)締合即（:）是共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，所述化學(xué)締合即（:） 是非共價(jià)相互作用，如離子相互作用、疏水相互作用、親水相互作用、范德華相互作用、氫 鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）是非肽共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）是肽鍵。在其它實(shí)施 方案中，式（m)至（u)中的（:）表示兩個(gè)序列之間的物理締合，其中第一序列的一部分靠近 第二序列，使得第一序列屏蔽或阻斷第二序列的一部分與另一部分的相互作用，并且還保 持該物理締合，而不允許第二序列與其它部分相互作用。
[0224]本文中包括的式（a)至（U)僅僅作為本發(fā)明構(gòu)建體的非限制性實(shí)例。式中多肽 的方向從N-末端（左）至C-末端（右）示出。例如，式V-L1-H1-L3-C-L2-H2意指式 NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-C00H。此外，（:）可以是兩條多肽鏈通過第一鏈的任何部分和第 二鏈的任何部分之間的共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵之間的締合或相互作用，除非另外指明。例如，式 V-Hl:H2-C具有兩條多肽鏈，第一鏈?zhǔn)荲-Hl，并且第二鏈?zhǔn)荂-H2,其中第一鏈中的V與第二 鏈中的C相互作用或締合和/或第一鏈中的Hl與第二鏈中的H2相互作用或締合。在一些 實(shí)施方案中，（:）意指共價(jià)非肽鍵或非共價(jià)鍵。
[0225] 在某些實(shí)施方案中，嵌合蛋白包含、基本上由或由選自由以下組成的組的式組 成：
[0226] (1)V:C, (2)H-V:C*C:V-H,
[0227] (3)V:C-H或H-C:V，（4)V-Hl:H2_C或H1-V:C_H2，
[0228] (5)V:C-H1:H2或H2:H1-C:V，（6)H2:H1_V:C或C:V_H1:H2，
[0229] (7)H-L-V:C*C:V-L_H，（8) V:C_L_H或H_L_C:V，
[0230] (9) V-C或C-V，（10) H-V-C或C-V-H，
[0231] (11)V-H-C*C-H_V，（12) V_C_H或H_C_V，
[0232] (13)V-H1-C-H2或H2-C-H1-V，（14)H1-V-C-H2或H2-C-V-H1，
[0233] (15)H1-V-H2-C或C-H2-V-H1，（16)V-H1-H2-C或C-H2-H1-V，
[0234] (17)V-L-C或C-L-V，（18)H-L-V-C或C-V-L-H，
[0235] (19)H-V-L-C或C-L-V-H，（20)V-L-H-C或C-H-L-V，
[0236] (21)V-H-L-C或C-L-H-V，（22)V-L-C-H或H-C-L-V，
[0237] (23)V-C-L-H或H-L-C-V，（24)H-L1-V-L2-C或C-L2-V-L1-H，
[0238] (25)V-L-Hl:H2-C或C-H2:Hl-L-V，
[0239] (26)V-Hl:H2-L-C或C-L-H2:H1-V，
[0240] (27)V:C-H1-H2或H2-H1-C:V，
[0241] (28)H2-H1_V:C或C:V-H1_H2，
[0242] (29)V:C-L-Hl:H2或H2:Hl-L-C:V，
[0243] (30)H2:Hl-L-V:C或C:V-L-Hl:H2，
[0244] (31)V-Ll-Hl:H2-L2-C或L-L2-H2:H1-L1-V，
[0245] (32)V:C-L-H1-H2或H2-H1-L-C:V，
[0246] (33)V:C-H1-L-H2或H2-L-H1-C:V，
[0247] (34)V:C-L1-H1-L2-H2或H2-L2-H1-L1-C:V，
[0248] (35)H2-H1_V:C或C:V-H1_H2，
[0249] (36)H2-H1-L_V:C或C:V-L-H1_H2，
[0250] (37)H2-L-H1-V:C或C:V-H1-L-H2，
[0251] (38)H2-L2-H1-L1-V:C或C:V-L1-H1-L2-H2，
[0252] (39)V-L1-H-L2-C或C-L2-H-L1-V，
[0253] (40)V-LI-C-L2-H或H-L2-C-LI-V，
[0254] (41)V-L-H1-C-H2或H2-C-H1-L-V，
[0255] (42)V-H1-C-L-H2或H2-L-C-H1-V，
[0256] (43)V-H1-L-C-H2或H2-C-L-H1-V，
[0257] (44)H1-L-V-C-H2或H2-C-V-L-H1，
[0258] (45)H1-V-L-C-H2或H2-C-L-V-H1，
[0259] (46)Hl-V-C-L-H或H-L-C-V-Hl，
[0260] (47)H1-L-V-H2-C或C-H2-V-L-H1，
[0261](48)H1-V-L-H2-C或C-H2-L-V-H1，
[0262](49)H1-V-H2-L-C或C-L-H2-V-H1，
[0263] (50)V-L-H1-H2-C或C-H2-H1-L-V，
[0264] (51)V-H1-L-H2-C或C-H2-L-H1-V，
[0265] (52)V-H1-H2-L-C或C-L-H2-H1-V，
[0266] (53)V-L1-H1-L2-C-H2 或H2-C-L2-H1-L1-V，
[0267] (54)V-L1-H1-C-L2-H2 或H2-L2-C-H1-L1-V，
[0268] (55)V-L1-H1-L2-C-L3-H2 或H2-L3-C-L2-H1-L1-V，
[0269] (56)V-H1-L1-C-L2-H2 或H2-L2-C-L1-H1-V，
[0270](57)H1-L1-V-L2-C-H2 或H2-C-L2-V-L1-H1，
[0271](58)H1-L1-V-C-L2-H2 或H2-L2-C-V-L1-H1，
[0272](59)H1-L1-V-L2-C-L3-H2 或H2-L3-C-L2-V-L1-H1，
[0273](60)H1-V-L1-C-L2-H2 或H2-L2-C-L1-V-H1，
[0274] (61)H1-L1-V-L2-H2-C或C-H2-L2-V-L1-H1，
[0275] (62)H1-L1-V-H2-L2-C或C-L2-H2-V-L1-H1，
[0276](63)H1-L1-V-L2-H2-L3-C或C-L3-H2-L2-V-L1-H1，
[0277] (64)H1-V-L1-H2-L2-C或C-L2-H2-L1-V-H1，
[0278] (65)V-L1-H1-L2-H2-C或C-H2-L2-H1-L1-V，
[0279] (66)V-L1-H1-H2-L2-C或C-L2-H2-H1-L1-V，
[0280] (67)V-L1-H1-L2-H2-L3-C或C-L3-H2-L2-H1-L1-V，以及
[0281] (68)V-H1-L1-H2-L2-C或C-L2-H2-L1-H1-V，
[0282]V是本文所述的VWF片段；
[0283]C是FVIII蛋白；
[0284] H或Hl是異源部分或第一異源部分；
[0285]H2是第二異源部分；第一和第二異源部分可以是相同的或不同的；
[0286]L、Ll或L2中的每個(gè)是任選的連接基；
[0287] (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸；并且
[0288](:)是化學(xué)或物理締合。每個(gè)連接基可以是相同的或不同的，并且每個(gè)可以是包 含一個(gè)或多個(gè)酶切割位點(diǎn)的可切割的連接基。異源部分可以是本領(lǐng)域已知的半衰期延長(zhǎng) 技術(shù)、多肽、非多肽部分或它們二者。多肽部分可包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋 白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、其任何衍生物或變體或它們的任何組 合（如，F(xiàn)c區(qū)）。非多肽部分可包括聚乙二醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍 生物或變體或它們的任何組合。H、Hl或H2中的每個(gè)可獨(dú)立地根據(jù)特性選擇，并且可以 是全部相同的，或每一個(gè)是不同的。異源部分的非限制性實(shí)例在本文別處有所公開，如第 [0126]-[0153]段的免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、第[0154]-[0157]段的白蛋白或其片段 或變體、第[0166]-[0173]段的聚合物如聚乙二醇以及第[0159]-[0162]段的PAS序列。本 文中包括式（1)至（68)僅僅作為本發(fā)明構(gòu)建體的非限制性實(shí)例。
[0289]在一個(gè)實(shí)施方案中，（:）表示化學(xué)締合，如至少一個(gè)非肽鍵。在某些實(shí)施方案中， 所述化學(xué)締合即（:）是共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，所述化學(xué)締合即（:）是非共價(jià)相互作 用，如離子相互作用、疏水相互作用、親水相互作用、范德華相互作用、氫鍵。在其它實(shí)施方 案中，（:）是非肽共價(jià)鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）是肽鍵。在其它實(shí)施方案中，（:）表示兩 個(gè)序列之間的物理締合，其中第一序列的一部分靠近第二序列，使得第一序列屏蔽或阻斷 第二序列的一部分與另一部分的相互作用，并且還保持該物理締合，而不允許第二序列與 其它部分相互作用。
[0290] 在一個(gè)實(shí)施方案中，連接至嵌合蛋白中的VWF片段的第一異源部分（H或Hl)是第 一Fc區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接至嵌合蛋白中的FVIII蛋白的第二異源部分（或H2) 是第二Fc區(qū)。
[0291] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，第一鏈包含、基本上由或 由編碼FVIII(如，單鏈FVIII)的氨基酸序列和第一異源部分（如，第一Fc區(qū)）組成，并且 第二鏈包含、基本上由或由編碼包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段的氨基酸序列、第 二異源部分（如，第二Fc區(qū)）以及VWF片段和第二Fc結(jié)構(gòu)域之間的連接基（如，VWF連接 基）組成。VWF片段和第二Fc結(jié)構(gòu)域之間的連接基可以是凝血酶可切割連接基。在一些實(shí) 施方案中，單鏈FVIII蛋白包含第三異源部分，如半衰期延長(zhǎng)因子，其連接至N-末端、C-末 端或FVIII序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
[0292] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含三條多肽鏈，其中第一鏈包含、基本上 由或由FVIII的重鏈組成，第二鏈包含、基本上由或由融合至第一異源部分（如，第一Fc 區(qū)）的FVIII的輕鏈組成，并且第三多肽鏈包含、基本上由或由包含D'結(jié)構(gòu)域和D3結(jié)構(gòu)域 的VWF片段、第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）和連接基組成。VWF片段和第二異源部分之間 的連接基可以是凝血酶可切割連接基。在一些實(shí)施方案中，重鏈FVIII連接至第三異源部 分，如半衰期延長(zhǎng)因子，其可連接至N-末端、C-末端或FVIII序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
[0293] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含兩條多肽鏈，第一鏈包含、基本上由或 由FVIII的重鏈組成，并且第二鏈包含、基本上由或由FVIII的輕鏈、第一異源部分（如，第 一Fc區(qū)）、第一連接基（如，包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)的蛋白酶切割位點(diǎn)）、VWF片 段、第二連接基（如，凝血酶可切割連接基）和第二異源部分（如，第二Fc區(qū)）組成，其中 FVIII的輕鏈連接至第一異源部分（如，第一Fc區(qū)），其還通過第一連接基（如，具有包含 一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)加工位點(diǎn)的蛋白酶切割位點(diǎn)的可加工的連接基）連接至VWF片段，并且 其中VWF片段通過第二連接基（如，凝血酶可切割連接基）連接至第二Fc區(qū)。在某些實(shí)施 方案中，第一連接基和第二連接基是相同的或不同的。
[0294] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含一條多肽鏈，其包含單鏈FVIII蛋白、 第一異源部分（如，第一Fc區(qū)）、第一連接基（如，凝血酶可切割連接基）、VWF片段、第二 連接基（如，凝血酶可切割連接基）和第二異源部分（如，第二Fc區(qū)），其中單鏈FVIII蛋 白連接至第一異源部分，所述第一異源部分還通過第一連接基連接至VWF片段，并且VWF片 段通過第二連接基連接至第二Fc區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一連接基是包含第一可切割位 點(diǎn)和第二可切割位點(diǎn)的可切割的連接基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第二連接基是包含一個(gè)或 兩個(gè)可切割位點(diǎn)的可切割的連接基。在具體實(shí)施方案中，第二連接基是凝血酶可切割連接 基。用于本發(fā)明的連接基可具有任何長(zhǎng)度，如至少10個(gè)、50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)、300個(gè)、400 個(gè)、500個(gè)、600個(gè)或700個(gè)氨基酸。例如，連接基可具有20個(gè)氨基酸、35個(gè)氨基酸、42個(gè)氨 基酸、73個(gè)氨基酸或98個(gè)氨基酸。
[0295] 在某些實(shí)施方案中，VWF片段通過肽鍵或連接基直接連接至FVIII蛋白。作為直接 或通過連接基連接VWF片段和FVIII蛋白的一種方式，可利用酶連接（如，分選酶）。例如， 分選酶是指通過識(shí)別和切割羧基末端分選信號(hào)來修飾表面蛋白的一組原核生物酶。對(duì)于分 選酶的大多數(shù)底物，識(shí)別信號(hào)由基序LPXTG(Leu-Pro-任何殘基-Thr-Gly(SEQIDNO: 106) 和高度疏水的跨膜序列以及堿性殘基簇例如精氨酸組成。切割在Thr和Gly之間進(jìn)行，其 中瞬間結(jié)合從連接伴侶的Thr殘基至活化位點(diǎn)Cys殘基進(jìn)行，然后是將蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合至 細(xì)胞壁的轉(zhuǎn)肽作用。在一些實(shí)施方案中，連接伴侶包含Gly(η)。
[0296] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過任選的連接基連接至分選酶識(shí)別基序的VWF片段可通過 分選酶融合至連接至Gly(η)的FVIII蛋白，其中η可以是任何整數(shù)。連接構(gòu)建體包含VWF 片段（構(gòu)建體的N-末端部分）和FVIII蛋白（構(gòu)建體的C-末端部分），其中分選酶識(shí)別基 序插入其間。示例性構(gòu)建體如圖24(A)中所示。另一個(gè)連接構(gòu)建體包含VWF片段（構(gòu)建體 的N-末端部分）、連接基、分選酶識(shí)別基序和FVIII蛋白（構(gòu)建體的C-末端部分）（如，圖 24(C))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過任選的連接基連接至分選酶識(shí)別基序的FVIII蛋白可 通過分選酶融合至連接至Gly(η)的VWF片段，其中η是任何整數(shù)。所得的連接構(gòu)建體包含 FVIII蛋白（構(gòu)建體的N-末端部分）和VWF片段（構(gòu)建體的C-末端部分），其中分選酶識(shí) 別基序插入其間。示例性構(gòu)建體如圖24(B)中所示。另一個(gè)所得的連接構(gòu)建體包含F(xiàn)VIII 蛋白（構(gòu)建體的N-末端部分）、連接基、分選酶識(shí)別基序和VWF片段（構(gòu)建體的C-末端部 分）（如，圖24 (D))。在其它實(shí)施方案中，通過第一任選的連接基連接至分選酶識(shí)別基序的 VWF片段可融合至異源部分，如免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分，如通過第二任選的連接基連接 至凝血酶切割位點(diǎn)的Fc區(qū)。所得的構(gòu)建體可包含VWF片段（Ν-末端部分）、第一連接基、分 選酶識(shí)別基序、蛋白酶切割位點(diǎn)、第二任選的連接基和異源部分（如，圖24(E))。在某些實(shí) 施方案中，該所得的構(gòu)建體是包含F(xiàn)VIII蛋白和第二異源部分，如免疫球蛋白恒定區(qū)或其 部分，如第二Fc區(qū)的嵌合蛋白的部分。在一個(gè)實(shí)例中，在另一個(gè)實(shí)例中，嵌合包含三條多肽 鏈，包含VWF片段、第一連接基、分選酶識(shí)別基序、蛋白酶切割位點(diǎn)、第二任選的連接基、第 一異源部分的第一鏈，包含F(xiàn)VIII蛋白的輕鏈和第二異源部分的第二鏈，以及包含F(xiàn)VIII蛋 白的重鏈的第三鏈。
[0297] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合蛋白包含VWF片段和FVIII蛋白，其中彼此共價(jià) 締合或彼此共價(jià)連接的VWF片段和FVIII蛋白具有的免疫原性小于無(wú)VWF片段的FVIII蛋 白。免疫原性減小包括但不限于體液免疫響應(yīng)減少，如中和抗體滴定度減小，或針對(duì)FVIII 的細(xì)胞介導(dǎo)免疫響應(yīng)，如生成各種細(xì)胞因子減少。
[0298] 在其它實(shí)施方案中，作為本發(fā)明的結(jié)果，與無(wú)VWF片段的FVIII蛋白或野生型 FVIII相比，F(xiàn)VIII蛋白（或嵌合蛋白）的半衰期延長(zhǎng)。FVIII蛋白的半衰期比無(wú)VWF片段 的FVIII蛋白的半衰期長(zhǎng)至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約4 倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11 倍或至少約12倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的半衰期比野生型FVIII的半衰期長(zhǎng)約1. 5 倍至約20倍、約1. 5倍至約15倍或約1. 5倍至約10倍。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型 FVIII或無(wú)VWF片段的FVIII蛋白相比，F(xiàn)VIII的半衰期延長(zhǎng)約2倍至約10倍、約2倍至 約9倍、約2倍至約8倍、約2倍至約7倍、約2倍至約6倍、約2倍至約5倍、約2倍至約4 倍、約2倍至約3倍、約2. 5倍至約10倍、約2. 5倍至約9倍、約2. 5倍至約8倍、約2. 5倍 至約7倍、約2. 5倍至約6倍、約2. 5倍至約5倍、約2. 5倍至約4倍、約2. 5倍至約3倍、 約3倍至約10倍、約3倍至約9倍、約3倍至約8倍、約3倍至約7倍、約3倍至約6倍、約 3倍至約5倍、約3倍至約4倍、約4倍至約6倍、約5倍至約7倍或約6倍至約8倍。在 其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的半衰期為至少約17小時(shí)、至少約18小時(shí)、至少約19小時(shí)、至少 約20小時(shí)、至少約21小時(shí)、至少約22小時(shí)、至少約23小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約25小 時(shí)、至少約26小時(shí)、至少約27小時(shí)、至少約28小時(shí)、至少約29小時(shí)、至少約30小時(shí)、至少 約31小時(shí)、至少約32小時(shí)、至少約33小時(shí)、至少約34小時(shí)、至少約35小時(shí)、至少約36小 時(shí)、至少約48小時(shí)、至少約60小時(shí)、至少約72小時(shí)、至少約84小時(shí)、至少約96小時(shí)或至少 約108小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，F(xiàn)VIII的半衰期為約15小時(shí)至約兩周、約16小時(shí)至約一 周、約17小時(shí)至約一周、約18小時(shí)至約一周、約19小時(shí)至約一周、約20小時(shí)至約一周、約 21小時(shí)至約一周、約22小時(shí)至約一周、約23小時(shí)至約一周、約24小時(shí)至約一周、約36小時(shí) 至約一周、約48小時(shí)至約一周、約60小時(shí)至約一周、約24小時(shí)至約六天、約24小時(shí)至約五 天、約24小時(shí)至約四天、約24小時(shí)至約三天或約24小時(shí)至約兩天。
[0299] 在一些實(shí)施方案中，每個(gè)受試者的FVIII蛋白的平均半衰期為約15小時(shí)、約16小 時(shí)、約17小時(shí)、約18小時(shí)、約19小時(shí)、約20小時(shí)、約21小時(shí)、約22小時(shí)、約23小時(shí)、約24 小時(shí)（1天）、約25小時(shí)、約26小時(shí)、約27小時(shí)、約28小時(shí)、約29小時(shí)、約30小時(shí)、約31小 時(shí)、約32小時(shí)、約33小時(shí)、約34小時(shí)、約35小時(shí)、約36小時(shí)、約40小時(shí)、約44小時(shí)、約48 小時(shí)（2天）、約54小時(shí)、約60小時(shí)、約72小時(shí)（3天）、約84小時(shí)、約96小時(shí)（4天）、約 108小時(shí)、約120小時(shí)（5天）、約六天、約七天（一周）、約八天、約九天、約10天、約11天、 約12天、約13天或約14天。
[0300] 在某些實(shí)施方案中，與由FVIII或FVIII單體-二聚體雜合物組成的多肽相比，共 價(jià)連接至VWF片段的FVIII蛋白的半衰期在FVIII/VWF雙敲除（"DK0"）小鼠中可延長(zhǎng)。
[0301]A)血管性血友病因子（VWF)片段
[0302]VWF(也稱為F8VWF)是存在于血漿中的大多聚體糖蛋白，并且主要組成型地產(chǎn)生 于內(nèi)皮細(xì)胞（Weibel-Palade小體中）、巨核細(xì)胞（血小板的α顆粒）和內(nèi)皮下結(jié)締組織 中。堿性VWF單體是具有2813個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。每個(gè)單體包含多個(gè)具有特定功能的特 定結(jié)構(gòu)域，D'和D3結(jié)構(gòu)域（共同結(jié)合因子VIII)、Al結(jié)構(gòu)域（結(jié)合血小板GPIb-受體、肝 素和/或可能結(jié)合膠原）、A3結(jié)構(gòu)域（結(jié)合膠原）、C1結(jié)構(gòu)域（其中RGD結(jié)構(gòu)域在活化時(shí)結(jié) 合血小板整聯(lián)蛋白aIIbβ3)和蛋白質(zhì)C-末端的"半胱氨酸結(jié)"結(jié)構(gòu)域（VWF與血小板衍 生生長(zhǎng)因子（PDGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGFβ)和β-人絨毛膜促性腺素（βHCG)共有）。
[0303]人VWF的2813個(gè)單體氨基酸序列在Genbank中以登錄號(hào)_ΝΡ_000543. 2_報(bào)告。編 碼人VWF的核苷酸序列在Genbank中以登錄號(hào)_ΝΜ_000552. 3_報(bào)告。人VWF的核苷酸序列 指定為SEQ ID NO: 1。SEQ ID NO: 2是由SEQ ID NO: 1編碼的氨基酸序列。VWF的每個(gè)結(jié)構(gòu) 域在表1中列出。
[0304]表1
[0305]
【權(quán)利要求】
1. 一種包含通過共價(jià)鍵連接的因子VIII ("FVin")蛋白和輔助部分（AM)的嵌合蛋白， 其中所述輔助部分抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵在內(nèi)源性VWF存在下阻止所述輔 助部分從所述FVIII蛋白的解離。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵是肽鍵。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵是二硫鍵。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵是所述FVIII蛋白 和所述輔助部分之間的連接基。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分阻止所述FVIII 蛋白通過VWF清除途徑被清除。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分通過屏蔽或阻斷 所述FVIII蛋白上的VWF結(jié)合位點(diǎn)抑制或阻止內(nèi)源性VWF結(jié)合所述FVIII蛋白。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的嵌合蛋白，其中所述VWF結(jié)合位點(diǎn)位于所述FVIII蛋白的所 述A3結(jié)構(gòu)域或所述C2結(jié)構(gòu)域或所述A3結(jié)構(gòu)域和所述C2結(jié)構(gòu)域二者。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的嵌合蛋白，其中所述VWF結(jié)合位點(diǎn)是與SEQ ID NO: 16的第 1669至1689位和第2303至2332位氨基酸對(duì)應(yīng)的所述氨基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白不包含F(xiàn)VIII半 衰期限制因子。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII半衰期限制因子包括全長(zhǎng)VWF 蛋白或成熟VWF蛋白。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中在內(nèi)源性VWF存在下，所述 FVIII蛋白的所述半衰期可延長(zhǎng)超過所述FVIII蛋白的所述半衰期限制。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分具有至少一種 VWF樣FVIII保護(hù)特性。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的嵌合蛋白，其中所述VWF樣FVIII保護(hù)特性包括保護(hù)所述 FVIII蛋白不被一種或多種蛋白酶切割、保護(hù)所述FVIII蛋白不被活化、穩(wěn)定所述FVIII蛋 白的所述重鏈和/或所述輕鏈或防止所述FVIII蛋白被一種或多種清除劑受體清除。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分包括多肽、非多 肽部分或它們二者。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的嵌合蛋白，其中所述多肽包含長(zhǎng)度為至少約40個(gè)、至少約 50個(gè)、至少約60個(gè)、至少約70個(gè)、至少約80個(gè)、至少約90個(gè)、至少約100個(gè)、至少約110 個(gè)、至少約120個(gè)、至少約130個(gè)、至少約140個(gè)、至少約150個(gè)、至少約200個(gè)、至少約250 個(gè)、至少約300個(gè)、至少約350個(gè)、至少約400個(gè)、至少約450個(gè)、至少約500個(gè)、至少約550 個(gè)、至少約600個(gè)、至少約650個(gè)、至少約700個(gè)、至少約750個(gè)、至少約800個(gè)、至少約850 個(gè)、至少約900個(gè)、至少約950個(gè)或至少約1000個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分包括VWF片段、 免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵 蛋白或其片段或它們的任何組合。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的嵌合蛋白，其中所述非多肽部分包括聚乙二醇（PEG)、聚唾 液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的嵌合蛋白，其中所述輔助部分包括包含VWF的D'結(jié)構(gòu)域和 D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段，其中所述VWF片段通過除所述共價(jià)鍵之外的非共價(jià)鍵與所述FVIII 蛋白締合。
20. 根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求19所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段是單體。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19或權(quán)利要求20所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段包括彼此之間 一個(gè)或多個(gè)連接的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)VWF片段。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段包含至少一個(gè) 異源部分（H1)以及所述VWF片段和所述異源部分（H1)之間的任選的連接基。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合蛋白，其中連接至所述VWF片段的所述至少一個(gè)異源 部分（H1)包括多肽、非多肽部分或它們二者。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或權(quán)利要求23所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H1)包括延 長(zhǎng)所述FVIII蛋白的所述半衰期的部分。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H1)包括免疫球蛋白恒定區(qū) 或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它 們的任何組合。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述非多肽部分包括聚乙二醇（PEG)、聚唾 液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H1)包括第一 Fc區(qū)。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H1)包括包含至少約50個(gè) 氨基酸、至少約100個(gè)氨基酸、至少約150個(gè)氨基酸、至少約200個(gè)氨基酸、至少約250個(gè)氨 基酸、至少約300個(gè)氨基酸、至少約350個(gè)氨基酸、至少約400個(gè)氨基酸、至少約450個(gè)氨基 酸、至少約500個(gè)氨基酸、至少約550個(gè)氨基酸、至少約600個(gè)氨基酸、至少約650個(gè)氨基酸、 至少約700個(gè)氨基酸、至少約750個(gè)氨基酸、至少約800個(gè)氨基酸、至少約850個(gè)氨基酸、至 少約900個(gè)氨基酸、至少約950個(gè)氨基酸或至少約1000個(gè)氨基酸的氨基酸序列。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白包含所述VWF片段和所述異 源部分（H1)之間的連接基，所述連接基是可切割的連接基。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包含一個(gè)或多個(gè)可切 割位點(diǎn)。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29或權(quán)利要求30中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接 基能夠被選自由以下組成的組的蛋白酶切割：因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、 因子IXa、因子Xa、因子Ila(凝血酶）、彈性蛋白酶-2、粒酶-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分 選酶 A、MMP-12、MMP-13、MMP-17 和 MMP-20。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包含 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO:56)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29至32中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包 含一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)，所述切割位點(diǎn)包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：RRRR(SEQ ID NO:52), RKRRKR(SEQ ID NO:53), RRRRS(SEQ ID NO:54), TQSFNDFTR(SEQ ID NO:47), SVSQTSKLTR(SEQ ID N0:48)、DFLAEGGGVR(SEQ ID N0:49)、TTKIKPR(SEQ ID N0:50)、 LVPRG(SEQ ID N0:55),ALRPRVVGGA(SEQ ID NO:51).KLTRAET(SEQ ID NO:29).DFTRVVG(SEQ ID N0:30), TMTRIVGG(SEQ ID NO: 31), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 32), LQVRIVGG (SEQ ID NO:33), PLGRIVGG(SEQ ID NO:34), IEGRTVGG(SEQ ID NO:35), LTPRSLLV(SEQ ID NO:36), LGPVSGVP(SEQ ID NO: 37) , VAGDSLEE(SEQ ID NO:38) , GPAGLGGA(SEQ ID NO :39), GPAGLRGA(SEQ ID NO:40) , APLGLRLR(SEQ ID NO: 41) , PALPLVAQ(SEQ ID N0:42), ENLYFQG(SEQ ID N0:43)、DDDKIVGG(SEQ ID N0:44)、LEVLFQGP(SEQ ID N0:45)和 LPKTGSES(SEQ ID N0:46)。
34. 根據(jù)權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含F(xiàn)VIII 和至少一個(gè)異源部分（H2)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H2)能夠延長(zhǎng)所述FVIII蛋 白的所述半衰期。
36. 根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H2)包括多 肽、非多肽部分或它們二者。
37. 根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H2)包括免 疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋 白或其片段或它們的任何組合。
38. 根據(jù)權(quán)利要求34或權(quán)利要求35所述的嵌合蛋白，其中所述非多肽部分包括聚乙二 醇（PEG)、聚唾液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。
39. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的嵌合蛋白，其中所述異源部分（H2)包括第二Fc區(qū)。
40. 根據(jù)權(quán)利要求1至39中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含第一多肽鏈和 第二多肽鏈，所述第一多肽鏈包含所述VWF片段、第一異源部分和連接基，所述第二多肽鏈 包含所述FVIII蛋白和第二異源部分，其中所述第一多肽鏈和所述第二多肽鏈通過共價(jià)鍵 彼此連接。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的嵌合蛋白，其中所述第一異源部分和所述第二異源部分通 過所述共價(jià)鍵彼此連接，其中所述共價(jià)鍵防止體內(nèi)所述第一多肽鏈中的所述VWF片段被內(nèi) 源性VWF替換。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵是二硫鍵。
43. 根據(jù)權(quán)利要求34至42中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白通過連接基 連接至所述第二異源部分（H2)。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間 的所述連接基是可切割的連接基。
45. 根據(jù)權(quán)利要求34至44所述的嵌合蛋白，其中所述第一異源部分（H1)和所述第二 異源部分（H2)通過連接基連接。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的嵌合蛋白，其中所述連接基是scFc連接基。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的嵌合蛋白，其中所述scFc連接基是可加工的連接基。
48. 根據(jù)權(quán)利要求1至47所述的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式： (a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2, (b) H2-L2-C-L3-H1-L1-V, (c) C-L2-H2-L3-V-Ll-Hl, (d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C, (e) Hl-Ll-V-L3-C-L2-H2, (f) H2-L2-C-L3-V-L1-H1, (g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, (h) C-L2-H2-L3-H1-L1-V, (i) H2-L3-Hl-Ll-V-L2-C, (j) C-L2-V-Ll-Hl-L3-H2, (k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2,和 (l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V， 其中V包括包含VWF的所述D'結(jié)構(gòu)域和所述D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段； L1是任選的連接基； L2是任選的連接基； (a)至（f)中的L3是任選的連接基， (g)至⑴中的L3是任選的scFc連接基， H1和H2中的每個(gè)包括任選的異源部分； C包括FVIII蛋白；并且 (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
49. 根據(jù)權(quán)利要求1至47所述的嵌合蛋白包含選自由以下組成的組的式： (m) V-L1-H1:H2-L2-C, (n) V-L1-H1:C-L2-H2, (o) Hl-Ll-V:H2-L2-C, (p) Hl-Ll-V:C-L2-H2, (q) V:C-Ll-Hl:H2, (r) V:Hl-Ll-C:H2, (s) H2:Hl-Ll-C:V, (t) C:V-Ll-Hl:H2,和 (u) C:Hl-Ll-V:H2, 其中V是包含VWF的所述D'結(jié)構(gòu)域和所述D3結(jié)構(gòu)域的VWF片段； L1是任選的連接基； L2是任選的連接基； H1是第一異源部分； H2是第二異源部分； C是FVIII蛋白； (_)是肽鍵或一個(gè)或多個(gè)氨基酸；并且 (:)是所述H1和所述H2之間的共價(jià)鍵。
50. 根據(jù)權(quán)利要求48和權(quán)利要求49所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段和所述FVIII 蛋白通過除所述共價(jià)鍵、所述肽主鏈或所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸之外的非共價(jià)鍵彼此締合。
51. 根據(jù)權(quán)利要求48和權(quán)利要求49所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段抑制或阻止內(nèi) 源性VWF與所述FVIII蛋白的結(jié)合。
52. 根據(jù)權(quán)利要求49至51中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述HI和所述H2之間的所 述共價(jià)鍵是二硫鍵。
53. 根據(jù)權(quán)利要求48至52中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中H1包括多肽、非多肽部分或 它們二者。
54. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的嵌合蛋白，其中H1包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋 白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的任何組合。
55. 根據(jù)權(quán)利要求53或權(quán)利要求54所述的嵌合蛋白，其中H1包括第一 Fc區(qū)。
56. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的嵌合蛋白，其中所述非多肽部分包括聚乙二醇（PEG)、聚唾 液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。
57. 根據(jù)權(quán)利要求48至56中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中H2包括多肽、非多肽部分或 它們二者。
58. 根據(jù)權(quán)利要求57所述的嵌合蛋白，其中H2包括免疫球蛋白恒定區(qū)或其部分、白蛋 白或其片段、白蛋白結(jié)合部分、PAS序列、HAP序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白或其片段或它們的任何組合。
59. 根據(jù)權(quán)利要求48至58中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中H2包括第二Fc區(qū)。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的嵌合蛋白，其中所述非多肽部分包括聚乙二醇（PEG)、聚唾 液酸、羥乙基淀粉（HES)、其衍生物或它們的任何組合。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的嵌合蛋白，其中所述共價(jià)鍵是二硫鍵。
62. 根據(jù)權(quán)利要求1至61中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含第三異 源部分（H3)。
63. 根據(jù)權(quán)利要求1至62中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含第四異 源部分（H4)。
64. 根據(jù)權(quán)利要求1至63中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含第五異 源部分（H5)。
65. 根據(jù)權(quán)利要求1至64中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含第六異 源部分（H6)。
66. 根據(jù)權(quán)利要求61至65中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述第三異源部分（H3)、所 述第四異源部分（H4)、所述第五異源部分（H5)、所述第六異源部分（H6)中的一者或多者能 夠延長(zhǎng)所述FVIII蛋白的所述半衰期。
67. 根據(jù)權(quán)利要求1至66中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述第三異源部分（H3)、所 述第四異源部分（H4)、所述第五異源部分（H5)和所述第六異源部分（H6)連接至FVIII的 所述C末端或N末端或插入FVIII的兩個(gè)氨基酸之間。
68. 根據(jù)權(quán)利要求1至67中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述第三異源部分（H3)、所 述第四異源部分（H4)、所述第五異源部分（H5)或所述第六異源部分（H6)中的一者或多者 包括包含至少約50個(gè)氨基酸、至少約100個(gè)氨基酸、至少約150個(gè)氨基酸、至少約200個(gè)氨 基酸、至少約250個(gè)氨基酸、至少約300個(gè)氨基酸、至少約350個(gè)氨基酸、至少約400個(gè)氨基 酸、至少約450個(gè)氨基酸、至少約500個(gè)氨基酸、至少約550個(gè)氨基酸、至少約600個(gè)氨基酸、 至少約650個(gè)氨基酸、至少約700個(gè)氨基酸、至少約750個(gè)氨基酸、至少約800個(gè)氨基酸、至 少約850個(gè)氨基酸、至少約900個(gè)氨基酸、至少約950個(gè)氨基酸或至少約1000個(gè)氨基酸的 氨基酸序列。
69. 根據(jù)權(quán)利要求1至68中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII的所述半衰期比 野生型FVIII延長(zhǎng)至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約4倍、至 少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或 至少約12倍。
70. 根據(jù)權(quán)利要求1至69中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白的所述半衰 期為至少約10小時(shí)、至少約11小時(shí)、至少約12小時(shí)、至少約13小時(shí)、至少約14小時(shí)、至少 約15小時(shí)、至少約16小時(shí)、至少約17小時(shí)、至少約18小時(shí)、至少約19小時(shí)、至少約20小 時(shí)、至少約21小時(shí)、至少約22小時(shí)、至少約23小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約36小時(shí)、至少 約48小時(shí)、至少約60小時(shí)、至少約72小時(shí)、至少約84小時(shí)、至少約96小時(shí)或至少約108 小時(shí)。
71. 根據(jù)權(quán)利要求22至70中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述第二 異源部分之間的所述連接基或所述VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基還包 含位于所述連接基的所述N-末端區(qū)的第一切割位點(diǎn)（P1)、位于所述連接基的所述C-末端 區(qū)的第二切割位點(diǎn)（P2)或它們二者。
72. 根據(jù)權(quán)利要求22至71中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述第二 異源部分之間的所述連接基、所述VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基或它們 二者包含 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO:56)。
73. 根據(jù)權(quán)利要求22至71中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述第二 異源部分之間的所述連接基、所述VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基或它們 二者被選自由以下組成的組的蛋白酶切割：因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因 子IXa、因子Xa、因子Ila(凝血酶）、彈性蛋白酶-2、粒酶-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選 酶八、麗卩-12、麗?-13、麗?-17和麗卩-20。
74. 根據(jù)權(quán)利要求22至73中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述 第二異源部分之間的所述連接基、所述VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基 或它們二者包含選自由以下組成的組的氨基酸序列：RRRR(SEQ ID NO:52)、RKRRKR(SEQ ID NO:53)、RRRRS(SEQ ID NO:54)、TQSFNDFTR(SEQ ID NO:47)、SVSQTSKLTR(SEQ ID N0:48)、DFLAEGGGVR(SEQ ID N0:49)、TTKIKPR(SEQ ID N0:50)、LVPRG(SEQ ID NO:55)、 ALRPRVVGGA(SEQ ID NO: 51) , KLTRAET(SEQ ID NO: 29) , DFTRVVG(SEQ ID NO:30), TMTRIVGG(SEQ ID NO:31), SPFRSTGG(SEQ ID NO:32) , LQVRIVGG(SEQ ID NO:33), P LGRIVGG(SEQ ID NO: 34), IEGRTVGG (SEQ ID N0:35),LTP RSLLV(SEQ ID NO :36), LGPVSGVP(SEQ ID N0:37)、VAGD SLEE(SEQ ID N0:38)、GPAGLGGA(SEQ ID N0:39)、GPAGL RGA(SEQ ID N0:40)、APLGLRLR(SEQ ID N0:41)、PALPLV AQ(SEQ ID N0:42)、ENLYFQG(SEQ ID N0:43)、DDDKIVG G(SEQ ID N0:44)、LEVLFQGP(SEQ ID N0:45)和LPKTGSES(SEQ ID N0:46)。
75. 根據(jù)權(quán)利要求71至74中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述第一酶切割位點(diǎn)和所述 第二酶切割位點(diǎn)是相同的或不同的。
76. 根據(jù)權(quán)利要求5至75中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述輔助 部分之間的所述連接基、所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間的所述連接基以及所述 VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基中的一者或多者具有約1至約2000個(gè)氨基 酸的長(zhǎng)度。
77. 根據(jù)權(quán)利要求5至75中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述輔助 部分之間的所述連接基、所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間的所述連接基以及所述 VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基中的一者或多者具有至少約10個(gè)、20個(gè)、 30 個(gè)、40 個(gè)、50 個(gè)、60 個(gè)、70 個(gè)、80 個(gè)、90 個(gè)、100 個(gè)、110 個(gè)、120 個(gè)、130 個(gè)、140 個(gè)、150 個(gè)、 160 個(gè)、170 個(gè)、180 個(gè)、190 個(gè)、200 個(gè)、210 個(gè)、220 個(gè)、230 個(gè)、240 個(gè)、250 個(gè)、300 個(gè)、350 個(gè)、 400 個(gè)、450 個(gè)、500 個(gè)、550 個(gè)、600 個(gè)、650 個(gè)、700 個(gè)、750 個(gè)、800 個(gè)、850 個(gè)、900 個(gè)、950 個(gè)、 1000個(gè)、1200個(gè)、1400個(gè)、1600個(gè)、1800個(gè)或2000個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。
78. 根據(jù)權(quán)利要求5至77中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述輔助 部分之間的所述連接基、所述FVIII蛋白和所述第二異源部分之間的所述連接基以及所述 VWF片段和所述第一異源部分之間的所述連接基中的一者或多者包含gly/ser肽。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的嵌合蛋白，其中所述gly/ser肽具有式（Gly4Ser)n或 S(Gly4Ser)n，其中η為選自由以下組成的組的正整數(shù)：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80 或 100。
80. 根據(jù)權(quán)利要求79所述的嵌合蛋白，其中所述（Gly4Ser)n連接基是（Gly4Ser)3或 (Gly4Ser) 4〇
81. 根據(jù)權(quán)利要求5至80中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述輔助 部分之間的所述連接基是可切割的連接基。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包含一個(gè)或多個(gè)凝血 酶切割位點(diǎn)。
83. 根據(jù)權(quán)利要求81或權(quán)利要求82所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包含 TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK(SEQ ID NO:56)。
84. 根據(jù)權(quán)利要求81至83中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中可切割的連接基被選自由 以下組成的組的蛋白酶切割：因子XIa、因子Xlla、激肽釋放酶、因子Vila、因子IXa、因子 Xa、因子Ila(凝血酶）、彈性蛋白酶-2、粒酶-B、TEV、腸激酶、蛋白酶3C、分選酶A、MMP-12、 MMP-13、MMP-17 和 MMP-20。
85. 根據(jù)權(quán)利要求81至83中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述可切割的連接基包含選 自由以下組成的組的氨基酸序列：RRRR(SEQ ID NO:52)、RKRRKR(SEQ ID NO:53)、RRRRS(SEQ ID NO:54)、TQSFNDFTR(SEQ ID NO:47)、SVSQTSKLTR(SEQ ID N0:48)、DFLAEGGGVR(SEQ ID N0:49)、TTKIKPR(SEQ ID N0:50)、LVPRG(SEQ ID NO:55)、ALRPRVVGGA(SEQ ID NO:51)、KLTRAET(SEQ ID NO:29)、DFTRWG(SEQ ID N0:30)、TMTRIVGG(SEQ ID NO:31)、 SPFRSTGG(SEQ ID NO:32), LQVRIVGG(SEQ ID NO: 33) , PLGRIVGG(SEQ ID NO :34), IEGRTVGG(SEQ ID NO:35) , LTPRSLLV(SEQ ID NO:36) , LGPVSGVP(SEQ ID NO :37), VAGDSLEE(SEQ ID NO: 38) , GPAGLGGA(SEQ ID NO: 39) , GPAGLRGA(SEQ ID NO :40), APLGLRLR(SEQ ID NO: 41) , PALPLVAQ (SEQ ID NO: 42) , ENLYFQG (SEQ ID N0:43), DDDKIVGG(SEQ ID N0:44)、LEVLFQGP(SEQ ID N0:45)和 LPKTGSES(SEQ ID N0:46)。
86. 根據(jù)權(quán)利要求5至85中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白和所述輔助 部分之間的所述連接基還包含分選酶識(shí)別基序。
87. 根據(jù)權(quán)利要求86所述的嵌合蛋白，其中所述分選酶識(shí)別基序包含所述序列 LPXTG(SEQ ID NO:106)〇
88. 根據(jù)權(quán)利要求19至87中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段包含VWF的所 述D'結(jié)構(gòu)域和所述D3結(jié)構(gòu)域。
89. 根據(jù)權(quán)利要求88所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段抑制或阻止內(nèi)源性VWF與 FVIII蛋白的結(jié)合。
90. 根據(jù)權(quán)利要求88或權(quán)利要求89所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段的所述D'結(jié) 構(gòu)域的所述氨基酸序列與SEQ ID NO:2的第764至866位氨基酸具有至少90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 的同一性。
91. 根據(jù)權(quán)利要求88至90中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段的所述D3結(jié)構(gòu) 域的所述氨基酸序列與SEQ ID NO:2的第867至1240位氨基酸具有至少90%、95%、96%、 97%、98%、99% 或 100% 的同一性。
92. 根據(jù)權(quán)利要求88至91中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段包含在對(duì)應(yīng) 于SEQ ID NO: 2的第1099位殘基、第1142位殘基或第1099和1142位殘基二者的殘基處 的至少一個(gè)氨基酸取代。
93. 根據(jù)權(quán)利要求88至91中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋，其中在所述VWF片段的所述序列 中，除半胱氨酸之外的氨基酸被對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2的第1099位殘基、第1142位殘基或第 1099和1142位殘基二者的殘基取代。
94. 根據(jù)權(quán)利要求88至93中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段的所述序列包 含SEQ ID NO:2的第764至1240位氨基酸。
95. 根據(jù)權(quán)利要求88至94中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段還包含VWF的 所述D1結(jié)構(gòu)域、所述D2結(jié)構(gòu)域或所述D1和D2結(jié)構(gòu)域。
96. 根據(jù)權(quán)利要求88至95中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段還包含選自由 以下組成的組的VWF結(jié)構(gòu)域：所述A1結(jié)構(gòu)域、所述A2結(jié)構(gòu)域、所述A3結(jié)構(gòu)域、所述D4結(jié)構(gòu) 域、所述B1結(jié)構(gòu)域、所述B2結(jié)構(gòu)域、所述B3結(jié)構(gòu)域、所述C1結(jié)構(gòu)域、所述C2結(jié)構(gòu)域、所述 CK結(jié)構(gòu)域、它們的一個(gè)或多個(gè)片段以及它們的任何組合。
97. 根據(jù)權(quán)利要求88至95中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段基本上由或由 以下組成：（l)VWF的所述D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；（2)VWF的所述Dl、D'和D3結(jié)構(gòu)域或 其片段；（3) VWF的所述D2、D'和D3結(jié)構(gòu)域或其片段；（4) VWF的所述Dl、D2、D'和D3結(jié)構(gòu) 域或其片段；或（5)VWF的所述D1、D2、D'、D3和A1結(jié)構(gòu)域或其片段。
98. 根據(jù)權(quán)利要求88至97中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，還包含VWF的與其可操作地連接 的信號(hào)肽。
99. 根據(jù)權(quán)利要求19至98中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述VWF片段是聚乙二醇化 的、糖基化的、羥乙基淀粉化的或聚唾液酸化的。
100. 根據(jù)權(quán)利要求1至99中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含一個(gè)或 多個(gè)選自由以下組成的組的FVIII的結(jié)構(gòu)域：所述A1結(jié)構(gòu)域、所述A2結(jié)構(gòu)域、所述B結(jié)構(gòu) 域、所述A3結(jié)構(gòu)域、所述C1結(jié)構(gòu)域、所述C2結(jié)構(gòu)域、它們的一個(gè)或多個(gè)片段以及它們的任 何組合。
101. 根據(jù)權(quán)利要求1〇〇所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含所述A1結(jié)構(gòu)域、所 述A2結(jié)構(gòu)域、所述A3結(jié)構(gòu)域和所述C1結(jié)構(gòu)域以及所述任選的C2結(jié)構(gòu)域。
102. 根據(jù)權(quán)利要求100或101所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含所述B結(jié)構(gòu) 域或其部分。
103. 根據(jù)權(quán)利要求100至102中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其包含與SEQ ID NO: 16或 SEQ ID N0:18 具有至少 60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100% 的同一性的氨基酸序列。
104. 根據(jù)權(quán)利要求100至103中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白是SQ B 結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII。
105. 根據(jù)權(quán)利要求100至104中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包括單 鏈 FVIII。
106. 根據(jù)權(quán)利要求105所述的嵌合蛋白，其中所述單鏈FVIII包含在對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)成熟 因子VIII多肽（SEQ ID NO: 16)的第1648位殘基、第1645位殘基或它們二者或SQ BDD因 子VIII (SEQ ID NO: 18)的第754位殘基、第751位殘基或它們二者的殘基處的至少一個(gè)氨 基酸取代。
107. 根據(jù)權(quán)利要求106所述的嵌合蛋白，其中所述氨基酸取代是除精氨酸之外的氨基 酸。
108. 根據(jù)權(quán)利要求1至107中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中所述FVIII蛋白包含第一 鏈和第二鏈，所述第一鏈包括FVIII的重鏈，并且所述第二鏈包括因子VIII的輕鏈，其中所 述重鏈和所述輕鏈通過金屬鍵締合。
109. -種編碼根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的多核苷酸。
110. 根據(jù)權(quán)利要求110所述的多核苷酸，其還包含編碼PC5、PC7或弗林蛋白酶的另外 多核苷酸序列。
111. 根據(jù)權(quán)利要求109或權(quán)利要求110所述的多核苷酸，其還包含編碼VWF的D1結(jié)構(gòu) 域和D2結(jié)構(gòu)域的另外多核苷酸序列。
112. -種或多種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的多核苷酸和一 個(gè)或多個(gè)可操作地連接至所述多核苷酸或所述多核苷酸組的啟動(dòng)子。
113. 根據(jù)權(quán)利要求112所述的一種或多種載體，其還包括另外的載體，所述另外的載 體包含編碼PC5、PC7或弗林蛋白酶的第二多核苷酸鏈。
114. 根據(jù)權(quán)利要求112或權(quán)利要求113所述的一種或多種載體，其還包括另外的載體， 所述另外的載體包含編碼VWF的D1結(jié)構(gòu)域和D2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列。
115. -種宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或根據(jù) 權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體。
116. 根據(jù)權(quán)利要求115所述的宿主細(xì)胞，其包含編碼PC5、PC7或弗林蛋白酶的另外載 體。
117. 根據(jù)權(quán)利要求115或權(quán)利要求116所述的宿主細(xì)胞，其還包含另外的載體，所述另 外的載體包含編碼VWF的D1結(jié)構(gòu)域和D2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列。
118. 根據(jù)權(quán)利要求115或權(quán)利要求118所述的宿主細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
119. 根據(jù)權(quán)利要求118所述的宿主細(xì)胞，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞選自由以下組成的 組：HEK 293細(xì)胞、CH0細(xì)胞和BHK細(xì)胞。
120. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白、根據(jù)權(quán) 利要求109或權(quán)利要求111所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求112或權(quán)利要求114所述的載 體或根據(jù)權(quán)利要求115和權(quán)利要求118中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞以及可藥用載體。
121. 根據(jù)權(quán)利要求120中任一項(xiàng)所述的組合物，其中與無(wú)所述VWF片段的所述嵌合蛋 白的所述FVIII蛋白的所述半衰期相比，所述嵌合蛋白的所述FVIII蛋白的所述半衰期在 FVIII/VWF雙敲除（"DKO"）小鼠中延長(zhǎng)。
122. 根據(jù)權(quán)利要求120或權(quán)利要求121所述的組合物，其中所述FVIII的所述半衰期 比野生型FVIII延長(zhǎng)至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約4倍、至 少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、 至少約12倍、至少20倍、至少30倍或至少40倍。
123. 根據(jù)權(quán)利要求120或權(quán)利要求122所述的組合物，其中因子VIII的所述半衰期為 至少6小時(shí)、至少7小時(shí)、至少9小時(shí)、至少10小時(shí)、至少11小時(shí)、至少12小時(shí)、至少15小 時(shí)、至少約17小時(shí)、至少約18小時(shí)、至少約19小時(shí)、至少約20小時(shí)、至少約21小時(shí)、至少 約22小時(shí)、至少約23小時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約25小時(shí)、至少約26小時(shí)、至少約27小 時(shí)、至少約28小時(shí)、至少約29小時(shí)、至少約30小時(shí)、至少約31小時(shí)、至少約32小時(shí)、至少 約33小時(shí)、至少約34小時(shí)、至少約35小時(shí)、至少約36小時(shí)、至少約48小時(shí)、至少約60小 時(shí)、至少約72小時(shí)、至少約84小時(shí)、至少約96小時(shí)或至少約108小時(shí)。
124. 根據(jù)權(quán)利要求120至123中任一項(xiàng)所述的組合物，其通過選自由以下組成的組的 途徑施用：局部施用、眼內(nèi)施用、腸胃外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和口服。
125. 根據(jù)權(quán)利要求124所述的組合物，其中所述腸胃外施用為靜脈內(nèi)或皮下施用。
126. 根據(jù)權(quán)利要求120至125中任一項(xiàng)所述的組合物，其用于治療需要其的受試者的 出血性疾病或病狀。
127. 根據(jù)權(quán)利要求126所述的組合物，其中所述出血性疾病或病狀選自由以下組成的 組：出血性凝血障礙、關(guān)節(jié)出血癥、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢血進(jìn)入肌肉、口腔溢血、創(chuàng) 傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)溢血、腹腔內(nèi)溢血、胸腔溢血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后 間隙出血、腹膜后間隙出血、髂腰肌鞘出血以及它們的任何組合。
128. 根據(jù)權(quán)利要求126或權(quán)利要求127所述的組合物，其中所述受試者被安排經(jīng)歷外 科手術(shù)。
129. 根據(jù)權(quán)利要求126或權(quán)利要求127中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述治療是預(yù)防 性的或發(fā)作期的。
130. -種阻止或抑制FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用的方法，其包括向需要其的 受試者加入有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白、根據(jù)權(quán)利要求109 至111中任一項(xiàng)所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利 要求115至119中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求120至129中任一項(xiàng)所述的組合 物，其中所述VWF片段抑制或阻止所述FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用。
131. -種移除或減少FVIII蛋白的半衰期限制因子的方法，其中所述方法包括加入有 效量的根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白、根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng) 所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求115至119 中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求120至129中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述嵌 合蛋白或由所述多核苷酸、所述載體編碼的或由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述嵌合蛋白阻止或 抑制所述FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用。
132. -種延長(zhǎng)或增加 FVIII蛋白的所述半衰期的方法，其中所述方法包括加入有效量 的根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白、根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所 述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求115至119中 任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求120至129中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述嵌合 蛋白的所述VWF片段阻止或抑制所述FVIII蛋白與內(nèi)源性VWF的相互作用。
133. 根據(jù)權(quán)利要求132所述的方法，其中所述FVIII蛋白的所述半衰期比野生型 FVIII延長(zhǎng)至少約1. 5倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5 倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍或至少約 12倍。
134. 根據(jù)權(quán)利要求133所述的方法，其中因子VIII的所述半衰期為至少約17小時(shí)、至 少約18小時(shí)、至少約19小時(shí)、至少約20小時(shí)、至少約21小時(shí)、至少約22小時(shí)、至少約23小 時(shí)、至少約24小時(shí)、至少約26小時(shí)、至少約27小時(shí)、至少約28小時(shí)、至少約29小時(shí)、至少 約30小時(shí)、至少約31小時(shí)、至少約32小時(shí)、至少約33小時(shí)、至少約34小時(shí)、至少約35小 時(shí)、至少約36小時(shí)、至少約48小時(shí)、至少約60小時(shí)、至少約72小時(shí)、至少約84小時(shí)、至少 約96小時(shí)或至少約108小時(shí)。
135. -種治療需要其的受試者的出血性疾病或病狀的方法，其包括施用有效量的根據(jù) 權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白、根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的多 核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體、根據(jù)權(quán)利要求115至119中任一項(xiàng) 所述的宿主細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求120至129中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述出血性疾病 或病癥選自由以下組成的組：出血性凝血障礙、關(guān)節(jié)出血癥、肌肉出血、口腔出血、溢血、溢 血進(jìn)入肌肉、口腔溢血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)溢血、腹腔內(nèi)溢血、胸腔溢血、骨折、 中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血、髂腰肌鞘出血以及它們的任何組合。
136. 根據(jù)權(quán)利要求135所述的方法，其中所述治療是預(yù)防性的或按需的（發(fā)作期）。
137. 根據(jù)權(quán)利要求130至136中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述有效量為0. 1 μ g/kg至 500mg/kg。
138. 根據(jù)權(quán)利要求130至137中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合蛋白、所述多核苷 酸、所述宿主細(xì)胞或所述組合物通過選自由以下組成的組的途徑施用：局部施用、眼內(nèi)施 用、腸胃外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和口服。
139. 根據(jù)權(quán)利要求138所述的方法，其中所述腸胃外施用選自由以下組成的組：靜脈 內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用和真皮內(nèi)施用。
140. 根據(jù)權(quán)利要求130至139中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者是人。
141. 根據(jù)權(quán)利要求140所述的方法，其中所述受試者患有甲型血友病。
142. -種制備嵌合蛋白的方法，其包括用根據(jù)權(quán)利要求109至111中任一項(xiàng)所述的多 核苷酸、或根據(jù)權(quán)利要求112至114中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)染一種或多種宿主細(xì)胞，以及在 所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述VWF片段或所述嵌合蛋白。
143. 根據(jù)權(quán)利要求142所述的方法，其中所述載體還包含編碼加工酶的多核苷酸。
144. 根據(jù)權(quán)利要求143所述的方法，其中所述加工酶是PACE。
145. 根據(jù)權(quán)利要求144所述的方法，其中PACE切割所述VWF片段的所述D1D2結(jié)構(gòu)域。
146. 根據(jù)權(quán)利要求142和權(quán)利要求143所述的方法，其中還包括用表達(dá)VWF的D1結(jié)構(gòu) 域和D2結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列轉(zhuǎn)染一種或多種宿主細(xì)胞。
147. -種構(gòu)建根據(jù)權(quán)利要求1至108中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的方法，其包括在分選 酶存在下通過共價(jià)鍵將所述輔助部分與所述FVIII蛋白連接。
【文檔編號(hào)】A61K38/37GK104271150SQ201380013452
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2013年1月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月12日
【發(fā)明者】伊克塔·賽思·切布拉, 劉童瑤, 羅伯特·彼得斯, 江海燕 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克Ma公司