專利名稱：經(jīng)過修飾的因子ix多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及經(jīng)過修飾的因子IX多肽，例如，展現(xiàn)升高的比活性的因子IX多肽和聚合物綴合的因子IX多肽。本申請還涉及用于生成經(jīng)過修飾的因子IX多肽及其綴合物 (conjugate)的方法，及使用經(jīng)過修飾的因子IX多肽，例如，治療罹患血友病B的患者的方法。
背景技術(shù)：
血友病B影響1/34，500名男性，而且是由編碼凝固因子IX(FIX)的基因中導(dǎo)致血液中FIX蛋白低或檢測不到的各種遺傳缺陷引起的(Kurachi, et al.，Hematol. Oncol. Clin. North Am. 6 :991-997,1992 ；Lillicrap, Haemophilia 4:350-357,1998)。FIX 水平不足導(dǎo)致凝固缺陷和源自出血失控的癥狀。血友病B通過靜脈內(nèi)輸注血漿衍生的或重組的FIX蛋白來有效治療，或是停止已經(jīng)開始的出血或是防止出血發(fā)生(預(yù)防)(Dargaud， et al. ,Expert Opin. Biol. Ther. 7 :651-663 ；Giangrande,Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005) ο有效預(yù)防要求維持最低FIX谷水平為正常水平的約(Giangrande, Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524，2005)。由于天然 FIX (血漿衍生的或重組的)的半衰期是大約18至M小時(shí)，F(xiàn)IX水平在推注后3至4天內(nèi)下降至不到正常水平的1%，這就必須平均每三天重復(fù)注射以實(shí)現(xiàn)有效預(yù)防(Giangrande，Expert Opin. Pharmacother. 6 1517-1524, 2005) 0這樣頻繁的靜脈內(nèi)注射對患者成問題，而且對實(shí)現(xiàn)有效預(yù)防成障礙 (Petrini, Haemophilia 13Suppl 2 16-22，2007)，尤其在孩子中。比活性升高的 FIX 蛋白具有延長保護(hù)持續(xù)時(shí)間的潛力，因此具有顯著的醫(yī)學(xué)好處。發(fā)明概述本申請?zhí)峁〧IX多肽(也稱作經(jīng)過修飾的FIX多肽，F(xiàn)IX突變蛋白，或FIX變體)， 其包含經(jīng)過修飾以改善FIX比活性的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，引入了一或多處氨基酸替代。在一些實(shí)施方案中，該多肽具有凝固活性。在一些實(shí)施方案中，該經(jīng)過修飾的 FIX多肽可包含氨基酸殘基85，86，87，338，和410處的至少一處替代。該經(jīng)過修飾的FIX多肽可通過引入一或多處氨基酸替代，例如，用任何氨基酸替代來生成。例示性實(shí)施方案包括如下的FIX多肽，其包含一或多處替代諸如，但不限于(a)D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ； V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ； T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ； R338W ；E410N ；E410Q ；(b) D85W 和 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；
(C) D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ； D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A,和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ；D85F, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ； D85H, V86A，和 T87M ；(d) D85W, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ；D85I，V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ； D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K, 和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87V,和 R338A ；D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M,和 R338A ；(e) D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87I，R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A, 和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意組合。本發(fā)明還提供FIX多肽綴合物，其包含經(jīng)過修飾以改善FIX比活性的氨基酸序列和共價(jià)附著至該FIX多肽的一或多個(gè)聚合物模塊。在一些實(shí)施方案中，該聚合物模塊共價(jià)附著至該FIX多肽上的糖模塊，其中該糖模塊在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)期間天然附著至該肽。本申請還提供藥物制備物，其包含經(jīng)過修飾的FIX多肽和藥學(xué)可接受載體。本申請還提供用于治療血友病B的方法，其包括對有所需要的受試者施用治療有效量的本文所述藥物制備物。本申請還提供編碼經(jīng)過修飾的多肽的DNA序列，以及經(jīng)過該DNA序列轉(zhuǎn)染的真核宿主細(xì)胞。本申請還提供用于生產(chǎn)經(jīng)過修飾的FIX多肽的方法，其包括(i)通過引入一或多處氨基酸替代修飾該多肽的氨基酸序列；(ii)在，例如，哺乳動物細(xì)胞系中表達(dá)該多肽；并 (iii)純化該多肽。本申請還提供綴合物，其包含a)包含通過引入一或多處氨基酸替代經(jīng)過修飾的氨基酸序列的因子IX多肽，其中至少一處氨基酸替代位于殘基338 ；b)附著至所述一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的一或多糖模塊；和c)共價(jià)附著至一或多個(gè)糖模塊的一或多個(gè)聚合物模塊。本申請還提供用于改善聚合物模塊對多肽的綴合的方法，其包括a)提供具有一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的多肽，其中該糖基化位點(diǎn)包含一或多個(gè)唾液酸；b)氧化所述多肽的所述唾液酸；c)提供催化劑；并d)將包含氨基-氧官能團(tuán)的聚合物模塊共價(jià)附著至所述氧化后的唾液酸。附圖簡述

圖1描繪一幅圖，顯示正常大鼠中g(shù)lycoPEG化FIX-R338A，F(xiàn)IX_R338A和重組野生型FIX的劑量標(biāo)準(zhǔn)化藥動學(xué)概況。圖2描繪一幅圖，顯示血友病B小鼠中g(shù)lycoPEG化FIX-R338A, FIX-R338A和rFIX 的藥動學(xué)概況。圖3描繪一幅圖，顯示靜脈內(nèi)注射rFIX，F(xiàn)IX-R338A或glycoPEG化FIX-R338A后血友病B小鼠的血漿中的FIX活性。圖4顯示一項(xiàng)通過SDS-PAGE對有和無催化劑的情況中PEG化反應(yīng)的時(shí)間過程分析。發(fā)明詳述本發(fā)明提供包括一或多處氨基酸替代的FIX多肽。例如，經(jīng)過修飾的FIX多肽可包含氨基酸殘基85，86，87，338，和410處的至少一處替代。經(jīng)過修飾的FIX多肽可具有升高的比活性，這會提供，例如，血友病B患者中延長的針對出血的保護(hù)時(shí)間。經(jīng)過修飾的FIX 多肽會以比當(dāng)前可用的野生型FIX蛋白療法可能的次數(shù)少的FIX注射使血友病B患者能夠?qū)崿F(xiàn)針對出血的保護(hù)?；罨蟮囊蜃覸II (FVII)通過與因?qū)ρ鼙诘膿p害而暴露的組織因子(TF)形成復(fù)合物來啟動正常止血過程。該復(fù)合物隨后活化FIX;活性形式稱作FIXa。FIX的活化肽通過因子XIa(FXIa)或組織因子(TF)/因子VIIa復(fù)合物在兩個(gè)位點(diǎn)處的蛋白水解切割被切除以生成催化活性分子，因子1 (FIXa)。FMa和因子VIIIa (FVIIIa)將FX轉(zhuǎn)變成因子 Xa (FXa)，其繼而將凝血酶原轉(zhuǎn)變成凝血酶。凝血酶然后將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，導(dǎo)致纖維蛋白凝塊形成。野生型FIX具有眾多翻譯后修飾，已經(jīng)提出其中一些在體內(nèi)藥動學(xué)概況中發(fā)揮作用。一旦生成，F(xiàn)IX應(yīng)保留酶活性并與FVIII，F(xiàn)XI，和FX相互作用以成為血友病B的有效治療。引入替代氨基酸不應(yīng)擾亂這些相互作用和功能。本申請部分地提供對FIX的修飾，其有可能導(dǎo)致升高的比活性及最低限度的功能擾亂。通過以較低的蛋白質(zhì)水平賦予功效，增強(qiáng)FIX比活性的改變可補(bǔ)償凝固活性的潛在損失而且還潛在延長經(jīng)過修飾的分子的功效。
經(jīng)過修飾的FIX多肽本發(fā)明提供包含一或多處氨基酸替代的FIX多肽，就是，經(jīng)過修飾的FIX多肽。如本文中使用的，“因子IX”指FIX蛋白，其是內(nèi)在凝固途徑的一個(gè)成員且對于血液凝固是必須的。要理解，此定義包括天然以及重組形式的FIX蛋白。除非另有規(guī)定或指明，如本文中使用的，F(xiàn)IX意指在其在凝固中的正常作用中的任何功能性人FIX蛋白分子，包括其任何片段、類似物、變體、和衍生物。術(shù)語“片段”，“衍生物”，“類似物”，“突變蛋白”，和“變體”在涉及本申請的多肽時(shí)意指該多肽保留實(shí)質(zhì)性相同生物學(xué)功能或活性的片段，衍生物，類似物， 突變蛋白，和變體。FIX多肽的非限制性例子包括FIX，F(xiàn)IXa,和FIX具有FIX活性的截短形式。任何前述維持至少一定程度FIX活性的生物學(xué)活性片段，刪除變體，替代變體，或添加變體也可充當(dāng)FIX多肽。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)IX多肽可包含與SEQ ID NO 1至少約70，80，90，或 95%相同的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽是生物學(xué)活性的。生物學(xué)活性可，例如，通過本文所述凝固測定法來測定。經(jīng)過修飾的FIX多肽可含有保守氨基酸替代。保守替代在本領(lǐng)域中認(rèn)定為用一種氨基酸替代具有相似特性的另一種氨基酸，而且包括，例如，丙氨酸變成絲氨酸；精氨酸變成賴氨酸；天冬酰胺變成谷氨酰胺或組氨酸；天冬氨酸變成谷氨酸；半胱氨酸變成絲氨酸； 谷氨酰胺變成天冬酰胺；谷氨酸變成天冬氨酸；甘氨酸變成脯氨酸；組氨酸變成天冬酰胺或谷氨酰胺；異亮氨酸變成亮氨酸或纈氨酸；亮氨酸變成纈氨酸或異亮氨酸；賴氨酸變成精氨酸；甲硫氨酸變成亮氨酸或異亮氨酸；苯丙氨酸變成酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；絲氨酸變成蘇氨酸；蘇氨酸變成絲氨酸；色氨酸變成酪氨酸；酪氨酸變成色氨酸或苯丙氨酸；和纈氨酸變成異亮氨酸或亮氨酸。在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO :1的FIX多肽包含1-30， 1-20，或1-10處保守氨基酸替代。特定氨基酸的單字母縮寫，其對應(yīng)氨基酸，和三字母縮寫如下A，丙氨酸(Ala)； C，半胱氨酸(Cys) ；D，天冬氨酸(Asp) ；E，谷氨酸(Glu) ；F，苯丙氨酸(Phe) ；G，甘氨酸 (Gly) ；H，組氨酸(His) ；I，異亮氨酸(Ile) ；K，賴氨酸(Lys) ；L，亮氨酸(Leu) ；M,甲硫氨酸(Met) ；N，天冬酰胺(Asn) ；P，脯氨酸(Pro) ；Q，谷氨酰胺(Gln) ；R，精氨酸(Arg) ；S，絲氨酸(Ser) ；T，蘇氨酸(Thr) ；V，纈氨酸(Val) ；W，色氨酸(Trp) ；Y，酪氨酸(Tyr)；和正亮氨酸 (Nle)。經(jīng)過修飾的FIX多肽還可糖基化。多肽的糖基化通常是N-連接的或0-連接的。 N-連接指碳水化合物模塊(moiety)附著至天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列Asn-X-Ser和 Asn-X-Thr，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸，是碳水化合物模塊酶促附著至Asn側(cè)鏈的識別序列。如此，多肽中這些三肽序列任一的存在產(chǎn)生潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)。一種例示性N-連接糖基化位點(diǎn)可表述如下Xl-Asn-X2-X3-X4 ；其中Xl任選是Asp，Val, Glu, Gly, 或Ile ；X2是除Pro外的任何氨基酸；X3是Ser或Thr ；且X4任選是Val, Glu, Gly，Gln,或 IIe。N-連接糖基化位點(diǎn)添加至FIX多肽通過改變氨基酸序列，使得一或多個(gè)上文所述三肽序列得到引入來實(shí)現(xiàn)。0-連接糖基化指糖N-乙?；肴樘前罚肴樘?，或木糖之一附著至羥基氨基酸， 最常見附著至絲氨酸或蘇氨酸，盡管附著至5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸也是可能的。 0-連接糖基化位點(diǎn)添加至FIX多肽可通過改變氨基酸序列，使得一或多個(gè)Ser或Thr殘基得到引入來實(shí)現(xiàn)。糖基化位點(diǎn)可，例如，通過刪除一或多個(gè)氨基酸殘基，一或多個(gè)內(nèi)源FIX氨基酸殘基用另一氨基酸替代，或添加一或多個(gè)氨基酸殘基來引入。氨基酸殘基的添加可以在天然 FIX分子的兩個(gè)已有氨基酸殘基之間或在N-或C-末端。所用氨基酸替代術(shù)語學(xué)如下。第一個(gè)字母代表人FIX的一個(gè)位置處天然存在的氨基酸殘基。后面的數(shù)字代表成熟人FIX氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中的位置。第二個(gè)字母代表替代(替換/置換/取代)天然氨基酸的不同氨基酸。例如，V86A表示SEQ ID NO=I 位置86處的Val殘基用Ala殘基替換。本文中所用FIX殘基編號系統(tǒng)指天然人FIX蛋白的，其中殘基1代表成熟FIX多肽在切除信號序列和前肽(prop印tide) 二者之后的第一個(gè)氨基酸。天然或野生型FIX指 SEQ ID NO 1所示全長成熟人FIX分子。可能想要與對照多肽比較具有一或多處氨基酸替代的經(jīng)過修飾的FIX多肽的特性。比較的特性包括，例如，溶解度，活性，血漿半衰期，和結(jié)合特性。為比較選擇最適宜的對照多肽在本領(lǐng)域技術(shù)人員的見識之內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，對照多肽可以除一或多處氨基酸替代外與經(jīng)過修飾的多肽相同。例示性多肽包括野生型FIX多肽和包含一或多處活化替代，諸如R338A和/或V86A的FIX多肽。本發(fā)明的一個(gè)方面提供經(jīng)過修飾的FIX多肽，其具有與對照多肽相比升高的比活性?？赡芟胍鰪?qiáng)的比活性來降低實(shí)現(xiàn)治療效果所需給藥頻率。因而，在某些實(shí)施方案中， FIX 多肽具有相對于對照蛋白升高約 20，30，40，60，80，100，150，200，300，400，500，600， 700，800，900，或 1000% 的比活性。如本文中將多肽藥物施用于患者的語境中使用的，術(shù)語“半衰期”定義為患者中藥物的血漿濃度降低一半所需時(shí)間。用于藥動學(xué)分析和測定半衰期和體內(nèi)穩(wěn)定性的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是熟悉的。詳情可見于Kenneth，et al.，Chemical Stability of Pharmaceuticals :A Handbook for Pharmacists 禾口 Peters, et al. , Pharmacokinetc analysis :A Practical Approach(1996)。還可參考"Pharmacokinetics，，，M Gibaldi&D Perron, published by Marcel Dekker，2nd Rev. edition(1982)，其記載藥動學(xué)參數(shù)諸如 t-α和t-β半衰期和曲線下面積(AUC)。經(jīng)過修飾的FIX多肽的活性可描述為絕對值，諸如以單位計(jì)，或相對于對照多肽的活性的百分比。FIX比活性可定義為在凝固級聯(lián)中發(fā)揮功能，經(jīng)與活化后的血小板上的 FVIIIa相互作用誘導(dǎo)FXa形成，或支持血液凝塊形成的能力?；钚钥稍隗w外通過諸如凝塊分析等技術(shù)，如記載于，例如，McCarthy, et al.，(Thromb. Haemost. 87 :824-830,2002), 和本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其它技術(shù)來評估?；钚砸部稍隗w內(nèi)使用數(shù)種動物系之一來評估， 所述動物系故意以血友病B的遺傳突變育種，使得自此類系生成的動物FIX缺陷的。此類系可得自多種來源諸如，但不限于，Division ofLaboratories and Research, New York Department of Public Health, Albany, N. Y.禾口 Department of Pathology, University ofNorth Carolina, Chapel Hill，N. C。這兩種來源，例如，提供罹患犬血友病B的犬。或者,FIX 缺陷小鼠也是可得的(Sabatino，et al. ,Blood 104 :2767-2774,2005) 為了測試 FIX活性，將測試多肽注射入患病動物，做一小切口并與健康對照比較出血時(shí)間。人野生型FIX具有200個(gè)單位每mg左右的比活性。FIX的一個(gè)單位定義為1毫升正常(合并的)人血漿中存在的FIX的量(對應(yīng)于100%的FIX水平)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽可具有至少約200個(gè)單位，300個(gè)單位，400個(gè)單位，500個(gè)單位，或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽可具有至少約500 個(gè)單位，600個(gè)單位，700個(gè)單位，750個(gè)單位或更多每mg FIX多肽的比活性。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)IX的比活性可使用APTT或活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間測定法(記載于，例如， Proctor, et al.，Am. J. Clin. Pathol. 36 :212,1961)來測量。當(dāng)在細(xì)胞，諸如肝或腎細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，F(xiàn)IX多肽可由細(xì)胞機(jī)制合成，經(jīng)歷翻譯后修飾，并然后由細(xì)胞分泌入胞外環(huán)境。自細(xì)胞分泌的FIX多肽的量因此依賴于蛋白質(zhì)翻譯和胞外分泌這兩種過程。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽可以相對于對照蛋白質(zhì)分泌的量降低不超過約10，20，30，40，50，60，70，或80 %量分泌。例如，經(jīng)過修飾的FIX多肽可以相對于對照FIX多肽降低不超過約80%的量分泌，如果經(jīng)過修飾的多肽以與對照相比至少約20%的量分泌的話。FIX多肽分泌的量可，例如，通過使用任何公知方法測定胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)水平來測量。用于蛋白質(zhì)定量的傳統(tǒng)方法包括2-D凝膠電泳，質(zhì)譜術(shù)，和抗體結(jié)合。用于測定生物學(xué)樣品中蛋白質(zhì)水平的例示性方法包括基于抗體的技術(shù)，諸如免疫印跡(Western印跡)，免疫組織學(xué)測定法，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，或放射免疫測定法 (RIA)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽以相對于對照蛋白質(zhì)與FVIII，F(xiàn)XI，或FX 中至少一種的相互作用降低不超過約40，50，60，70，或80%的水平與FVIII，F(xiàn)XI，或FX中至少一種相互作用。例如，經(jīng)過修飾的FIX多肽可以相對于對照FIX多肽降低不超過約80% 的水平與FVIII，F(xiàn)XI，或FX中至少一種相互作用，如果經(jīng)過修飾的多肽以與對照相比至少約20%的水平與FVIII，F(xiàn)XI，或FX中至少一種相互作用的話。FIX對凝固級聯(lián)其它成員的結(jié)合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法來測定，包括例如，Chang，et al. , (J.Biol. Chem. 273 :12089-12094,1998)中記載的方法。本申請部分提供包含一或多處氨基酸替代的FIX多肽。在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽:D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ； D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ；V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ； V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ；T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ； R338M ；R338S ；R338T ；R338V ；R338W ；E410N ；E410Q ；或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽D85W和T87R ； D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ； D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；或其任意組合在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽D85W，V86A， 和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I，V86A,和 T87R ； D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87I ；D85I，V86A,和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87R ；D85G, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ； D85F, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87V ；D85M, V86A,和 T87I ；D85H, V86A,和 T87M ；或其任意組合在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽D85W，V86A， T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W，和 R338A ；D85R, V86A, T85R, 和 R338A ；D85I, V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ；D85I, V86A, T87M,和 R338A ；D85F, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87V,和 R338A ；D85R, V86A, T87K,和 R338A ； D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87W，和 R338A ；D85H, V86A, T87K，和 R338A ；D85F, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87V, 和 R338A ；D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M，和 R338A ；或其任意組合。在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽D85W，V86A， T87R, R338A,禾口 E410N ；D85F, V86A, T87I, R338A,禾口 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A，和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A, 和 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A, 和 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A, 和 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意組合。在一些實(shí)施方案中，提供包含選自下組的一或多處替代的FIX多肽(a)D85F ；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ；D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ； V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ；V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ； T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ；R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ； R338W ；E410N ；E410Q ；(b) D85W 和 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ；D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ； D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 和 T87K ；D85H 和 T87W ；D85H 和 T87K ；D85F 和 T87K ；D85H 和 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；(c) D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A,和 T87W ；D85R, V86A,和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ；D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A,和 T87K ；D85S，V86A，和 T87R ；D85Y, V86A,和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A，和 T87K ；D85F, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ； D85H, V86A,和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；(d) D85W, V86A, T87R,和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ；D85I，V86A, T87R,和 R338A ；D85Y, V86A, T87F,和 R338A ； D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87R，和 R338A ；D85G, V86A, T87K, 和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H,V86A,T87V,^P R338A ；D85M，V86A，T87I，和 R338A ；D85H，V86A，T87M，和 R338A ；(e) D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87I，R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A，禾口 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A, 和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，禾口 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A，禾口 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A, 和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A, 和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87M, R338A,和 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A, 和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A, 和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A, 和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A，和 E410Q ；D85H, V86A, T87V, R338A，和 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410Q ；及其任意組合。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供具有升高的比活性的FIX多肽。在一些實(shí)施方案中，多肽可具有至少約 200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100，1200，1400，1600，1800， 2000，4000，6000，8000，或更多單位每mg多肽的比活性。比活性可如先前所述測定，諸如， 例如，使用APTT測定法。這些多肽可用作治療劑，特別是在罹患血友病B的患者中。這些多肽可包含別的替代或修飾，諸如本文所述糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明的一個(gè)方面提供經(jīng)過修飾的因子IX多肽，其包含下述氨基酸序列YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD
QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86X87CNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPffQ
VVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNS YVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLX338STKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQ⑶SGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKX410KTKLT(SEQ ID NO:2)；其中)(85選自 D，F(xiàn)，G，H，I，M，N，R，S，W，和 Y ；其中X86 選自 A，D，E，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，和 V ；其中)(87選自卩，1，1(，1，1 ，1^，和1;其中Xm8 選自 A，F(xiàn)，I，L，M，R，S，T，V，和 W;其中X410 選自 E，N，和 Q。引入至少一處氨基酸替代是至少一個(gè)X位置處的替代的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的多肽另外包含約1-30，1-20，或1-10個(gè)連續(xù)氨基酸變化且維持FIX活性。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的多肽與SEQ ID NO :1至少約80，85，90，95，或99%相同(同一性)且維持FIX活性。經(jīng)過修飾的FIX多Jft的生成氨基酸序列改變可通過多種技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，諸如，例如，通過以位點(diǎn)特異性誘變修飾對應(yīng)核酸序列。用于位點(diǎn)特異性誘變的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的且記載于，例如，Zoller, et al.，(DNA3 :479-488,1984)或 Horton, et al.，(Gene 77 :61-68,1989，pp. 61-68)。如此， 使用FIX的核苷酸和氨基酸序列，可進(jìn)入選定的改變。類似地，使用特異性引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備DNA構(gòu)建物的規(guī)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見，例如，PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。編碼FIX多肽的核酸構(gòu)建物也可通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備，例如， Beaucage, et al.，(Gene Amplif. Anal. 3 :1-26,1983)記載的亞磷酰胺法。依照亞磷酰胺法，合成寡核苷酸(例如，在自動DNA合成儀中)，純化，退火，連接，并在合適載體中克隆。 編碼FIX多肽的DNA序列也可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)使用特異性引物來制備，例如，記載于美國專利 No. 4，683，202 ；或 Saiki，et al.，(Science 239 :487-491,1988)。另外，核酸構(gòu)建物可以是合成起源和基因組起源的混合，合成起源和cDNA起源的混合，或基因組起源和cDNA 起源的混合，通過依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)連接與完整核酸構(gòu)建物的各個(gè)部分對應(yīng)的合成，基因組，或 cDNA起源的片段來制備(在恰當(dāng)時(shí))。編碼FIX多肽的DNA序列可使用重組DNA規(guī)程插入重組載體中。載體的選擇常常會依賴于載體要導(dǎo)入的宿主。載體可以是自主復(fù)制載體或整合載體。自主復(fù)制載體作為染色體外實(shí)體存在，而且它的復(fù)制不依賴染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒。整合載體指整合入宿主細(xì)胞基因組中的載體，而且與它所整合的染色體一起復(fù)制。載體可以是表達(dá)載體，其中編碼經(jīng)過修飾的FIX的DNA序列與DNA的轉(zhuǎn)錄，翻譯， 或加工所需別的區(qū)段，諸如啟動子，終止子，和聚腺苷酸化位點(diǎn)可操作連接。一般地，表達(dá)載體可衍生自質(zhì)粒或病毒DNA，或者可含有二者的元件。術(shù)語“可操作連接”指示各區(qū)段的排列使得它們協(xié)調(diào)發(fā)揮功能以實(shí)現(xiàn)它們的預(yù)定目的，例如，轉(zhuǎn)錄在啟動子中啟動并穿過編碼多肽的DNA序列前進(jìn)。表達(dá)FIX多肽中使用的表達(dá)載體可包含能夠指導(dǎo)克隆的基因或cDNA轉(zhuǎn)錄的啟動子。啟動子可以是在選定的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，而且可以衍生自編碼對宿主細(xì)胞而言同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適合于在哺乳動物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼FIX多肽的DNA轉(zhuǎn)錄的啟動子的例子是，例如， SV40 啟動子(Subramani, et al.，Mol. Cell Biol. 1 :854-864,1981)，MT-I (金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter, et al.，Science 222 :809-814,1983), CMV 啟動子(Boshart, et al.，Cell 41 :521_530，1985)，或腺病毒 2 主要晚期啟動子(Kaufman et al.，，Mol. Cell Biol,2 :1304-1319,1982)。編碼FIX多肽的DNA序列也可，在必要時(shí)，可操作連接合適的終止子，諸如人生長激素終止子(Palmiter，et al.，Science 222 :809-814,1983)或 TPIl(Alber et al.， J. Mol. Appl. Gen. 1 :419-434,1982)或 ADH3(McKnight, et al.，EMBO J. 4 :2093-2099, 1985)終止子。表達(dá)載體也可含有位于插入位點(diǎn)下游的聚腺苷酸化信號。聚腺苷酸化信號包括來自SV40的早期或晚期聚腺苷酸化信號，來自腺病毒5ΕΛ區(qū)的聚腺苷酸化信號，人生長激素基因終止子(DeNoto，et al.，Nucl. Acids Res. 9 :3719_3730，1981)，或來自人 FIX 基因的聚腺苷酸化信號。表達(dá)載體也可包括增強(qiáng)子序列，諸如SV40增強(qiáng)子。為了引導(dǎo)本發(fā)明的FIX多肽入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可使用天然FIX分泌信號序列?；蛘?，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱作前導(dǎo)序列，前原序列，或前序列)。 分泌信號序列可以正確的讀碼框連接編碼FIX類似物的DNA序列。分泌信號序列通常位于編碼肽的DNA序列的5’。例示性信號序列包括，例如，MPIF-I信號序列和司腺鈣蛋白信號序列。用于連接編碼FIX多肽的DNA序列，啟動子，和任選的終止子和/或分泌信號序列及將它們插入含有復(fù)制必需信息的合適載體中的規(guī)程，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參見， 例如，Sambrook et al. , Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,1989)。轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞和表達(dá)導(dǎo)入細(xì)胞中的DNA序列的方法記載于，例如，Kaufman, et al. , (J. Mol. Biol. 159 :601-621,1982) ；Southern, et al. , (J. Mol. Appl. Genet. 1 327-341,1982) ；Loyter, et al.，(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 :422-426,1982) ；Wigler, et al. , (Cell 14:725-731,1978) ；Corsaro, et al. , (Somatic Cell Genetics 7: 603-616,1981),Graham,et al. ， (Virology 52 :456-467,1973)；禾口Neumann，et al. ， (ΕΜΒ0 J. 1 :841-845,1982)?？寺〉腄NA序列可通過，例如，脂轉(zhuǎn)染，DEAE-右旋糖酐介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，顯微注射，原生質(zhì)體融合，磷酸鈣沉淀，逆轉(zhuǎn)錄病毒投遞，電穿孔，聲穿孔，激光輻照，磁轉(zhuǎn)染， 天然轉(zhuǎn)化，和生物射彈轉(zhuǎn)化導(dǎo)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中(參見，例如，Mehier-Humbert, et al.，Adv. Drug Deliv. Rev. 57 =733-753, 2005) 為了鑒定和選擇表達(dá)外源 DNA 的細(xì)胞，一般將賦予可選擇表型的基因(選擇標(biāo)志)與感興趣基因或cDNA—起導(dǎo)入細(xì)胞中。選擇標(biāo)志包括，例如，賦予對藥物諸如新霉素，嘌呤霉素，潮霉素，和甲氨蝶呤的抗性的基因。選擇標(biāo)志可以是可擴(kuò)增的選擇標(biāo)志，其允許標(biāo)志和外源DNA在序列相連接時(shí)擴(kuò)增。例示性可擴(kuò)增選擇標(biāo)志包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和腺苷脫氨酶。選擇合適的選擇標(biāo)志在本領(lǐng)域技術(shù)人員的見識之內(nèi)(參見，例如，美國專利No. 5，238，820)。在細(xì)胞經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染之后，在適宜的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞以表達(dá)感興趣基因。如本文中使用的，術(shù)語“適宜的生長培養(yǎng)基”意指含有營養(yǎng)物和細(xì)胞生長和活性FIX多肽表達(dá)所需其它成分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基一般包括，例如，碳源，氮源，必需氨基酸，必需糖，維生素，鹽，磷脂，蛋白質(zhì)，和生長因子，而且在維生素K依賴性蛋白質(zhì)諸如FIX的情況中，還可提供維生素K。然后應(yīng)用藥物選擇來選擇以穩(wěn)定方式表達(dá)選擇標(biāo)志的細(xì)胞的生長。對于經(jīng)可擴(kuò)增選擇標(biāo)志轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可提高藥物濃度以選擇克隆的序列的拷貝數(shù)的增多，由此提高表達(dá)水平。然后對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的克隆篩選FIX多肽的表達(dá)。本發(fā)明中使用的哺乳動物細(xì)胞系的例子是C0S-1(ATCC CRL 1650)，幼倉鼠腎 (BHK)，HKBll 細(xì)胞(Cho, et al.，J. Biomed. Sci，9 :631_638，2002)，和 HEK-293 (ATCC CRL 1573 ；Graham, et al.，J. Gen. Virol. 36 =59-72,1977)細(xì)胞系。另外，多種其它細(xì)胞系可用于本發(fā)明之內(nèi)，包括大鼠H印I (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1600)，大鼠H印II (大鼠肝瘤；ATCC CRL 1548)，TCMK-I(ATCC CCL 139)，H印-G2(ATCC HB 8065)，NCTC 1469(ATCC CCL 9. 1)， CHO-Kl (ATCC CCL 61)，和 CH0-DUKX 細(xì)胞(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4220,1980)。FIX多肽可以自細(xì)胞培養(yǎng)液回收，而且然后可以通過本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程來純化，包括，但不限于，層析(例如，離子交換，親和，疏水，層析聚焦，和大小排阻)，電泳規(guī)程(例如，制備性等電聚焦(IEF)，差異溶解性(例如，硫酸銨沉淀))，提取(參見，例如， Protein Purification， Janson and Lars Ryden, editors， VCH Publishers， New York， 1989)，或其各種組合。在一個(gè)例示性實(shí)施方案中，多肽可以通過抗FIX抗體柱上的親和層析來純化。別的純化可以通過常規(guī)化學(xué)純化手段來實(shí)現(xiàn)，諸如高效液相層析。其它純化方法是本領(lǐng)域已知的，而且可以應(yīng)用于經(jīng)過修飾的FIX多肽的純化(參見，例如，Scopes, R.， Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. ,1982)。一般地，“純化的”應(yīng)當(dāng)指已經(jīng)進(jìn)行過分級以清除各種其它成分，而且基本上保留其表達(dá)的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或肽組合物。在使用術(shù)語“實(shí)質(zhì)性純化的”(substantially purified)的情況中，這種表述應(yīng)當(dāng)指如下的組合物，其中蛋白質(zhì)或肽構(gòu)成該組合物的主要成分，諸如占該組合物中蛋白質(zhì)的約50 %，約60 %，約70 %，約80 %，約90 %，約95 %，約 99%，或更多。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道用于定量多肽純化程度的多種方法。這些包括，例如，測定活性級分的比活性，或通過SDS/PAGE分析來評估級分內(nèi)多肽的量。用于評估級分純度的一種例示性方法是計(jì)算級分的比活性，將該活性與初始提取物的比活性比較，并如此計(jì)算純度， 本文中通過“純化倍數(shù)”來評估。用于代表活性量的實(shí)際單位，當(dāng)然，會依賴于特定測定技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，在組織培養(yǎng)細(xì)胞中重組表達(dá)FIX多肽，而且糖基化是宿主細(xì)胞，諸如哺乳動物細(xì)胞的正常翻譯后細(xì)胞功能的結(jié)果。在其它情況中，細(xì)胞經(jīng)過遺傳工程改造以表達(dá)酶和期望多肽的組合，使得細(xì)胞內(nèi)發(fā)生期望糖模塊添加至表達(dá)的多肽?；蛘?，糖基化可經(jīng)由化學(xué)或酶促修飾來實(shí)現(xiàn)(參見，例如，Lee, et al.，J. Biol. Chem. 264 13848-13855,1989)。本領(lǐng)域建議了多種方法來定制多肽的糖基化樣式(參見，例如， WO 99/22764 ；W098/58964 ；WO 99/54342 ；美國公開 No. 2008/0050772 ；和美國專利 No. 5，047，335)。聚合物綴合
經(jīng)過修飾的FIX多肽可進(jìn)一步包含一或多個(gè)聚合物綴合位點(diǎn)，其可用于附著聚合物模塊。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)IX多肽可綴合至生物相容的聚合物?？蛇x擇生物相容的聚合物來提供期望的藥動學(xué)改善。例如，可選擇聚合物的身份、大小、和結(jié)構(gòu)以改善具有FIX活性的多肽的循環(huán)半衰期或降低多肽的抗原性且沒有不可接受的活性降低。經(jīng)過修飾的FIX多肽可包括一或多個(gè)糖模塊，其天然地在哺乳動物中在 exoression期間附著至該肽。在一些實(shí)施方案中，糖模塊可充當(dāng)用于附著聚合物模塊的綴合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，聚合物模塊可使用各種接頭或連接化學(xué)附著至糖模塊。例如， 聚合物模塊可通過腙連接或氨基-氧連接綴合至糖模塊。在本發(fā)明中有用的聚合物的例子包括但不限于聚(烯二醇)(poly(alkylene glycols))諸如聚乙二醇(PEG)，聚(丙二醇)(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等等， 聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羥基烴基甲基丙烯酰胺)， 聚(羥基烴基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚(α-羥基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚P惡唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)，聚唾液酸，羥乙基淀粉(HEQ，聚氧化乙烯，烴基-聚氧化乙烯，二聚氧化乙烯，聚氧化烯的共聚物或嵌段共聚物，聚(乙二醇-共-丙二醇)，聚(Ν-2-(羥基丙基)甲基丙烯酰胺)，和右旋糖酐(poly(propylene glycol) ( "PPG"), copolymers of ethylene glycol and propylene glycol and the like, poly(oxyethylated polyol)， poly (olefinic alcohol)，poly (vinylpyrroIidone)，poly (hydroxyalkylmethacrylamide )，poly (hydroxyalkylmethacrylate), poly (saccharides), poly (alpha-hydroxy acid), poly (vinyl alcohol)，polyphosphazene,polyoxazoline,poly (N-acryIoylmorpholine)， polysialic acid,hydroxyethyl starch(HES),polyethylene oxide,alkyl-polyethylene oxides, bispolyethylene oxides, co-polymers or block co-polymers of polyalkyene oxides, poly(ethylene glycol-co-propylene glycol), poly (N-2- (hydroxyproply) methyacrylamide)，and dextran) 0聚合物不限于特定結(jié)構(gòu)，而且可以是線性的(例如，烴氧基PEG或雙功能PEG)，或非線性的諸如分支的，分叉的，多臂的(例如，附著至多元醇核心的PEG)，和樹狀的。此外， 聚合物的內(nèi)部結(jié)構(gòu)可以以任意數(shù)目的不同樣式組織，而且可以選自下組均聚物，交替共聚物，隨機(jī)共聚物，嵌段共聚物，交替三聚物，隨機(jī)三聚物，和嵌段三聚物。PEG和其它水溶性聚合物(S卩，聚合試劑)可以用適合偶聯(lián)至FIX多肽上期望位點(diǎn)的合適活化基團(tuán)來活化。如此，聚合試劑會擁有用于與FIX多肽反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)。代表性聚合試劑和用于將這些聚合物綴合至活性模塊的方法是本領(lǐng)域已知，而且進(jìn)一步記載于 Zalipsky,et al. ,("Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols)for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry :Biotechnical and Biomedical Applications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)), 及 Zalipsky(Adv. Drug Rev. 16 :157-182,1995)。聚合物的重量平均分子量可以為約100道爾頓至約150，000道爾頓。例示性范圍，然而，包括大于約5，000道爾頓至約100，000道爾頓的范圍中的，約6，000道爾頓至約90，000道爾頓的范圍中的，約10，000道爾頓至約85，000道爾頓的范圍中的，大于約 10，000道爾頓至約85，000道爾頓的范圍中的，約20，000道爾頓至約85，000道爾頓的范圍中的，約53，000道爾頓至約85，000道爾頓的范圍中的，約25，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍中的，約29，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍中的，約35，000道爾頓至約 120，000道爾頓的范圍中的，和約40，000道爾頓至約120，000道爾頓的范圍中的重量平均
分子量。生物相容聚合物的例示性重量平均分子量包括約100道爾頓，約200道爾頓，約 300道爾頓，約400道爾頓，約500道爾頓，約600道爾頓，約700道爾頓，約750道爾頓，約 800道爾頓，約900道爾頓，約1，000道爾頓，約1，500道爾頓，約2，000道爾頓，約2，200道爾頓，約2，500道爾頓，約3，000道爾頓，約4，000道爾頓，約4，400道爾頓，約4，500道爾頓，約5，000道爾頓，約5，500道爾頓，約6，000道爾頓，約7，000道爾頓，約7，500道爾頓， 約8，000道爾頓，約9，000道爾頓，約10,000道爾頓，約11,000道爾頓，約12,000道爾頓， 約13,000道爾頓，約14，000道爾頓，約15,000道爾頓，約20,000道爾頓，約22，500道爾頓，約25，000道爾頓，約30，000道爾頓，約35，000道爾頓，約40，000道爾頓，約45，000道爾頓，約50，000道爾頓，約55，000道爾頓，約60，000道爾頓，約65，000道爾頓，約70，000 道爾頓，和約75，000道爾頓。也可使用具有任何前述總分子量的前述分支型式的生物相容聚合物(例如，由兩個(gè)20，000道爾頓聚合物構(gòu)成的分支40，000道爾頓聚合物)。在一些實(shí)施方案中，聚合物是PEG。PEG是公知的，水溶性聚合物，其是商品化的或可以依照本領(lǐng)域公知方法通過乙二醇的開環(huán)聚合來制備(Sandler and Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161)。術(shù)語"PEG，，廣義用于涵蓋任何聚乙二醇分子，不管大小或PEG末端處的修飾，而且可以以下式表示=X-O(CH2CH2O) P1CH2CH2OH,其中η是20至2300且X是H或末端修飾，例如，C^4烴基。PEG可含有別的化學(xué)基團(tuán)，其是結(jié)合反應(yīng)必需的，其源自該分子的化學(xué)合成，或起該分子各部分的最佳距離的間隔物的作用。另外，此類PEG可以由連接到一起的一或多個(gè)PEG側(cè)鏈組成。具有超過一個(gè) PEG鏈的PEG稱作多臂或分支PEG。分支PEG可，例如，通過將聚氧化乙烯添加至各種多元醇包括甘油，季戊四醇，和山梨醇來制備。例如，四臂分支PEG可以自季戊四醇和氧化乙烯制備。分支PEG的例子記載于，例如，歐洲已公布申請No. 473084A和美國專利No. 5，932，462。 一種形式的PEG包括經(jīng)賴氨酸的伯氨基連接的兩個(gè)PEG側(cè)鏈(PEG2) (Monfardini, et al.， Bioconjugate Chem. 6 :62-69,1995)。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物可以是末端加帽聚合物，就是，具有至少一個(gè)用相對惰性基團(tuán)，諸如低級Ch6烴氧基，盡管也可使用羥基加帽的末端的聚合物。當(dāng)聚合物是PEG時(shí)， 例如，可使用甲氧基-PEG (通常稱作mPEG)，其是PEG的一種線性形式，其中聚合物的一個(gè)末端具有甲氧基(一OCH3)，而另一個(gè)末端是羥基或可任選化學(xué)修飾的其它官能團(tuán)。多臂或分支PEG分子，諸如美國專利No. 5，932，462中記載的那些，也可用作PEG 聚合物。另外，PEG可包含分叉PEG(參見，例如，PCT公開號W01999/45964，披露了能夠用于本發(fā)明的一或多個(gè)實(shí)施方案的多種分叉PEG結(jié)構(gòu))。將Z官能團(tuán)連接至分支碳原子的原子鏈充當(dāng)系鏈基團(tuán)，而且可以包含，例如，烴基鏈，醚鏈，酯鏈，酰胺鏈，及其組合。PEG聚合物也可含有沿著PEG的長度而非在PEG鏈的末端共價(jià)附著的懸掛PEG分子，其具有反應(yīng)性基團(tuán)，諸如羧基。懸掛的反應(yīng)性基團(tuán)可直接或經(jīng)由間隔物模塊，諸如亞烴基附著至PEG。為了實(shí)現(xiàn)聚合物分子對多肽的共價(jià)附著，聚合物分子的羥基端基必須以活化后的形式提供，就是，反應(yīng)性官能團(tuán)(其例子包括伯氨基，酰胼(HZ)，硫醇基，琥珀酸酯(SUC)，琥珀酰亞氨基琥珀酸酯(SS)，琥珀酰亞氨基琥珀酰胺(SSA)，琥珀酰亞氨基丙酸酯(SPA)，琥珀酰亞氨基丁酸酯(SBA)，琥珀酰亞氨基羧甲酯(SCM)，苯并三唑碳酸酯(BTC)，N-羥基琥珀酰亞胺(MB)，醛，硝基苯基碳酸酯(NPC)，和tresylate (TRES))。適當(dāng)活化的聚合物分子是商品化的，例如，NOF，Japan ；Nektar Therapeutics, Inc. ，Huntsville, Ala. ；PoIyMASC Pharmaceuticals pic, UK ；或 SunBio Corporation, Anyang City, South Korea?；蛘撸酆衔锓肿涌赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來活化(參見，例如，WO 90/13540)。適合于在本發(fā)明中使用的活化后的線性或分支聚合物分子的具體例子是商品化的，例如，NOF, Japan ； Nektar Therapeutics, Inc.，Huntsville，Ala?；罨蟮腜EG聚合物的具體例子包括下述線性 PEG NHS-PEG, SPA-PEG,SSPA-PEG,SBA-PEG,SS-PEG,SSA-PEG, SC-PEG,SG-PEG, SCM-PEG, NOR-PEG， BTC-PEG， EPOX-PEG, NC0-PEG， NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG， TRES-PEG, VS-PEG, OPSS-PEG, 10D0-PEG,和 MAL-PEG，和分支 PEG，諸如 PEG2-NHS，PEG2-MAL，和，例如，美國專利 No. 5，932，462和美國專利No. 5，643，575中披露的那些，通過述及將二者收入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合物具有硫氫基反應(yīng)性模塊，其可與FIX多肽上的游離半胱氨酸反應(yīng)以形成共價(jià)連接。此類硫氫基反應(yīng)性模塊包括硫醇，triflate，tresylate，氮丙啶，環(huán)氧乙烷，S-吡啶基，或馬來酰亞胺模塊。另外，下述出版物，通過述及收入本文，披露了有用的聚合物分子和/或PEG化化學(xué)美國專利No. 6，113,906 ；7, 199，223 ；5，824，778 ； 5，476，653 ；4，902，502 ；5，281，698 ；5，122，614 ；5，219，564 ；5，736，625 ；5，473，034 ； 5,516,673 ；5,629, 384 ；5,382, 657 ；WO 97/32607 ；WO 92/16555 ；WO 94/04193 ；WO 94/14758 ；WO 94/17039 ；WO 94/18247 ；WO 94/28024 ；WO 95/00162 ；WO 95/11924 ； W095/13090 ；WO 95/33490 ；WO 96/00080 ；WO 97/18832 ；WO 98/41562 ；WO 98/48837 ； WO 99/32134；WO 99/32139 ；WO 99/32140 ；WO 96/40791 ；WO 98/32466 ；WO 95/06058 ； WO 97/03106 ；WO 96/21469 ；WO 95/13312 ；WO 98/05363 ；WO 96/41813 ；WO 96/07670 ； EP809996 ；EP921131 ；EP605963 ；EP510356 ；EP400472 ；EP183503 ；EP154316 ；EP229108 ； EP402378 ；和 EP439508。對于半胱氨酸殘基的PEG化，可以在PEG化之前用還原劑，諸如二硫蘇糖醇 (DDT)處理多肽。隨后可以通過任何便利方法，諸如通過脫鹽來清除還原劑。PEG對半胱氨酸殘基的綴合通常在PH 6-9的合適緩沖液中于4°C至25°C變化的溫度發(fā)生長至約16小時(shí)的時(shí)段。用于偶聯(lián)至半胱氨酸殘基的活化后的PEG聚合物的例子包括， 例如，下述線性和分支PEG 乙烯基砜-PEG (PEG-VS)，諸如乙烯基砜-mPEG (mPEG-VS)； 正吡啶基-二硫化物-PEG (PEG-OPSS)，諸如正吡啶基-二硫化物-mPEG (MPEG-0PSS)； 和馬來酰亞胺-PEG (PEG-MAL)，諸如馬來酰亞胺-mPEG (mPEG-MAL)和分支馬來酰亞胺-mPEG2(mPEG2-MAL)。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有一或多個(gè)引入的聚合物綴合位點(diǎn)的FIX多肽可在細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞在含有半胱氨酸的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，半胱氨酸通過形成二硫鍵對該多肽的半胱氨酸殘基“加帽”。為了將聚合物綴合物添加至FIX多肽，半胱氨酸帽可通過溫和還原以釋放該帽來消除，然后添加半胱氨酸特異性聚合物試劑。本申請還提供用于制備聚合物綴合的FIX多肽的方法，包括將聚合物綴合位點(diǎn)， 就是，半胱氨酸殘基引入編碼FIX多肽的核苷酸序列；表達(dá)該突變核苷酸序列以生成包含引入的聚合物綴合位點(diǎn)的多肽；純化該多肽；使該多肽與已經(jīng)活化以與多肽在還原的半胱氨酸殘基處反應(yīng)的生物相容聚合物反應(yīng)，使得綴合物形成；并純化該綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于FIX多肽突變蛋白的定點(diǎn)PEG化的方法，包括(a)表達(dá)包含引入的聚合物綴合位點(diǎn)，就是，在FIX多肽的暴露表面上引入的半胱氨酸殘基的FIX多肽，其中該半胱氨酸是加帽的；(b)使該FIX多肽與還原劑在溫和還原該引入的半胱氨酸并釋放該帽的條件下接觸；(c)自該FIX多肽消除該帽和該還原劑；并(d)在消除該還原劑后至少約 5，15，或30分鐘之后，在使得PEG化FIX多肽生成的條件下用包含硫氫基偶聯(lián)模塊的PEG 處理該FIX多肽。PEG的硫氫基偶聯(lián)模塊選自下組硫醇，triflathtresylate，氮丙啶，環(huán)氧乙烷，S-吡啶基，和馬來酰亞胺模塊。下文描述一種生成PEG化FIX多肽的例示性方法。將約1 μ M純化的包含引入的非天然半胱氨酸殘基的FIX多肽用還原劑諸如0. 7mM Tris (2-羧乙基)膦(TCEP)或0. 07mM 二硫蘇糖醇(DTT)于4°C溫和還原30分鐘以釋放“帽”。通過大小排阻層析(SEC)法諸如穿過旋轉(zhuǎn)柱運(yùn)行樣品與“帽”一起清除還原劑以容許二硫化物再形成同時(shí)留下引入的半胱氨酸處于游離和還原狀態(tài)。清除還原劑之后至少30分鐘，將FIX多肽用至少10倍摩爾過量的大小范圍5至85kD的PEG-馬來酰亞胺于4°C處理至少1小時(shí)。FIX的聚合物綴合可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何方法來評估。例如，聚合物綴合FIX可通過還原性6% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠上的電泳來分析。電泳后，凝膠可以用考馬斯藍(lán)以鑒定所有蛋白質(zhì)或進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)Western印跡方案，以鑒定與未綴合FIX 多肽相比的條帶分子量位移。對PEG特異性的碘化鋇染色可用于確認(rèn)分子量有位移的條帶包含PEG化蛋白質(zhì)。聚合物綴合之前和之后的FIX多肽也可通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離 (MALDI)質(zhì)譜術(shù)來分析，以測定聚合物綴合的程度和效率。在一些實(shí)施方案中，聚合物綴合可發(fā)生于通過糖基化附著的一或多個(gè)糖模塊。此類聚合物綴合的方法是本領(lǐng)域已知的，而且記載于例如W094/05332，US2009/0081188和US 5，621，039，通過述及而收錄它們。在聚合物是PEG的情況中，它通常也稱作glycoPEG化。在一些實(shí)施方案中，通過US 5，621，039在提供的化學(xué)附著進(jìn)行的聚合物綴合可通過添加催化劑來改善。在一些實(shí)施方案中，催化劑是化學(xué)催化劑。例如，化學(xué)催化劑可以是苯胺，其可用于提高糖上的游離醛和氨基之間的反應(yīng)的效率。在其它實(shí)施方案中，其它合適的化學(xué)催化劑可以是苯胺衍生物諸如o-Cl-，p-Cl-，O-CH3O-, P-CH3O-,和p-CH3-苯胺。在一些實(shí)施方案中，聚合物綴合可發(fā)生于FIX中的天然發(fā)生糖基化位點(diǎn)。野生型因子IX具有兩個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，其含有因子IX的總唾液酸含量的約80%。這兩個(gè) N-連接位點(diǎn)(W57和N167)都位于活化肽內(nèi)，活化肽在凝固級聯(lián)的擴(kuò)展期間在兩個(gè)位點(diǎn) (R145-Alal46)和(R180-V181)處切割以生成催化活性FMa分子。在FIX中的天然發(fā)生糖基化位點(diǎn)處的聚合物綴合之外，可能想要在位于FIX蛋白的不同域中的備選位點(diǎn)處綴合聚合物。這可如下來實(shí)現(xiàn)，首先消除位置m57和m67處的天然發(fā)生N-連接糖基化位點(diǎn)，通過例如將附57變成A157和將附67變成A167進(jìn)行，其次在該分子中的別處引入新的功能性N-連接糖基化位點(diǎn)，例如在催化域或兩個(gè)EGF域之一中。 此類新的功能性N-連接糖基化位點(diǎn)先前披露于PCT US2009/040813。藥物組合物基于用于測定哺乳動物中上文鑒定的狀況的治療功效的公知測定法，及通過將這些結(jié)果與用于治療這些狀況的已知藥物的結(jié)果比較，可容易地為每種期望適應(yīng)證的治療確定本發(fā)明多肽的有效劑量。這些狀況之一的治療中要施用的活性組分的量可依據(jù)諸如采用的特定多肽和劑量單位，施用的模式，治療的時(shí)段，所治療患者的年齡和性別，及所治療狀況的性質(zhì)和程度等考量而廣泛變化。本申請部分提供包含本文所述具有一或多處氨基酸替代的FIX多肽的組合物。該組合物可適合于體內(nèi)施用，而且是沒有熱原的。該組合物還可包含藥學(xué)可接受載體。短語 “藥學(xué)或藥理學(xué)可接受”指當(dāng)施用于動物或人時(shí)不產(chǎn)生不利的，變應(yīng)性的，或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文中使用的，“藥學(xué)可接受載體”包括任何和所有溶劑，分散介質(zhì)，涂層，抗細(xì)菌和抗真菌劑，等張和吸收延遲劑，等等。此類介質(zhì)和藥劑對藥學(xué)活性物質(zhì)的使用是本領(lǐng)域公知的。也可將補(bǔ)充性活性組分摻入該組合物中。本發(fā)明的組合物包括經(jīng)典藥物制備物。依照本發(fā)明的這些組合物的施用可經(jīng)由任何常規(guī)路徑。藥物組合物可通過任何常規(guī)方法導(dǎo)入受試者中，例如，通過靜脈內(nèi)，皮內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，或經(jīng)皮投遞。治療可以由單劑或一段時(shí)間里的多劑組成?；钚曰衔锟芍苽涑捎坞x堿或藥理學(xué)可接受鹽在水中的溶液供施用。也可在液體聚乙二醇中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以防止微生物的生長。適合于注射使用的藥學(xué)形式包括無菌水溶液或分散體和用于臨場制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉劑。該形式應(yīng)當(dāng)是無菌的，而且流動性的程度應(yīng)當(dāng)容易進(jìn)行注射。 它在制造和貯存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，而且應(yīng)當(dāng)針對微生物，諸如細(xì)菌和真菌的污染作用進(jìn)行防腐。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有，例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇，等等)，蔗糖，L-組氨酸，聚山梨酯80，或其合適混合物。對微生物作用的預(yù)防可以由各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，山梨酸，硫柳萊， 等等產(chǎn)生?？勺⑸浣M合物可包括等張劑，例如，糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延遲吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的藥劑來產(chǎn)生。無菌可注射溶液可通過在根據(jù)需要具有上文所列各種其它組分的適宜溶劑中中摻入所需量的活性化合物(例如，F(xiàn)IX多肽)，接著過濾除菌來制備。一般地，分散體可通過將各種經(jīng)過滅菌的活性組合摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來自上文所列的所需其它組分的無菌媒介中來制備。在用于制備無菌可注射溶液的無菌粉劑的情況中，制備方法包括，例如，真空-干燥和冷凍-干燥技術(shù)，其自先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生活性組分加任何別的期望組分的粉末。組合物也可包括抗微生物劑以防止或阻止微生物生長。適合于本發(fā)明的抗微生物劑的非限制性例子包括苯扎氯銨，芐索氯銨，苯甲醇，西吡氯銨，氯丁醇，酚，苯乙醇，硝酸苯汞，硫柳汞，及其組合。組合物中也可以存在抗氧化劑?？寡趸瘎┛捎糜诜乐寡趸?，由此防止ζ制備物的變質(zhì)。適合于在本發(fā)明中使用的抗氧化劑包括，例如，抗壞血酸棕櫚酸酯，丁羥茴醚，丁羥甲苯，次磷酸，硫代甘油，沒食子酸丙酯，亞硫酸氫鈉，甲醛次硫酸鈉，偏亞硫酸氫鈉，及其組
I=I O表面活性劑可作為賦形劑存在。例示性表面活性劑包括聚山梨酯諸如Tween -20(聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯)和Tween _80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)和 Pluronics諸如F68和F88 ( 二者均可購自BASF, Mount Olive, N. J.)；山梨聚糖酯；脂質(zhì)諸如磷脂諸如卵磷脂和其它磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，脂肪酸和脂肪酯；類固醇諸如膽固醇；和螯合劑諸如EDTA，鋅和其它此類合適陽離子。酸或堿可以作為賦形劑存在于組合物中。可使用的酸的非限制性例子包括氫氯酸，乙酸，磷酸，檸檬酸，蘋果酸，乳酸，甲酸，三氯乙酸，硝酸，高氯酸，磷酸，硫酸，富馬酸，及其組合。合適的堿的例子包括，但不限于，氫氧化鈉，乙酸鈉，氫氧化銨，氫氧化鉀，乙酸銨， 乙酸鉀，磷酸鈉，磷酸鉀，檸檬酸鈉，甲酸鈉，硫酸鈉，硫酸鉀，富馬酸鉀，及其組合。組合物中任何各種賦形劑的量可以隨賦形劑的活性和組合物的具體需要而變化。 典型地，任何各賦形劑的最佳量可以經(jīng)由例行實(shí)驗(yàn)來確定，就是，通過制備含有不同量的賦形劑(范圍從低到高)的組合物，檢查穩(wěn)定性和其它參數(shù)，然后確定獲得最佳性能且沒有顯著不良效應(yīng)的范圍。一般地，賦形劑可以以約至約99% (以重量計(jì))，約5%至約 98% (以重量計(jì))，約15至約95% (以賦形劑的重量計(jì))的量，以小于30% (以重量計(jì)) 的濃度存在于組合物中。這些前述制藥學(xué)賦形劑連同其它賦形劑記載于“Remington =The Science&Practice of Pharmacy，，，19ed·，Wi 11 iams&Wi 11 iams, (1995) ；"Physician ' s Desk Reference”，52ed.，Medical Economics，Montvale，N. J. (1998)；及 Kibbe，A. H.， Handbook of Pharmaceutical Excipients,3 Edition， American Pharmaceutical Association，Washington, D.C.，2000。在配制后，可以以與劑量配制劑相容的方式及以諸如治療有效量施用溶液?！爸委熡行Я俊痹诒疚闹杏糜谥冈谘髦谢蛟诎薪M織中提供期望水平的多肽需要的多肽量。精確量會取決于眾多因子，例如，具體的FIX多肽，治療性組合物的成分和物理特征，預(yù)定的患者群體，投遞的模式，患者個(gè)體考量，等等，而且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本文中提供的信息容易地確定?？梢砸远喾N劑量形式容易地施用配制劑，諸如可注射溶液，等等。對于例如水溶液中的胃腸外施用，溶液應(yīng)當(dāng)在必要時(shí)適當(dāng)緩沖，而且液體稀釋劑應(yīng)當(dāng)首先用足夠鹽水或葡萄糖使得其等張。這些特定水溶液尤其適合于靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下和腹膜內(nèi)施用。FIX的劑量通常表述成單位。一個(gè)單位的FIX每kg體重可將血漿水平升高0. OlU/ !!^，就是，丨^。其它方面健康的患者具有一個(gè)單位的FIX每ml血漿，就是，100%。血友病B 的溫和病例定義為FIX血漿濃度介于6-60%之間，中等病例介于1-5%之間，而嚴(yán)重病例， 其占血友病B病例的約一半，具有低于FIX。預(yù)防性處理或輕微出血的處理通常要求將 FIX水平提高至介于15-30%之間。中等出血的處理通常要求將水平提高至介于30-50% 之間，而嚴(yán)重外傷的處理可要求將水平提高至50至100%。提高患者的血液水平需要的總單位數(shù)可如下確定1.0U/kg χ體重(kg)x期望百分比升高(％正常)。胃腸外施用可用初始推注，接著連續(xù)輸注以維持藥物產(chǎn)品的治療循環(huán)水平來進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，可施用 15至150U/kg FIX多肽。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會容易地優(yōu)化有效劑量和施用方案，如通過優(yōu)良醫(yī)學(xué)實(shí)踐和患者個(gè)體的臨床狀況確定的。給藥頻率會取決于藥劑的藥動學(xué)參數(shù)和施用的路徑。可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)施用的路徑和期望的劑量來確定最佳藥物配制劑(參見，例如，Remington' s Pharmaceutical SciencesiMack Publishing Co. ,Easton,Pa. , 20thedition, 2000, Mii^ 及收入本文)。此類配制劑可影響物理狀態(tài)，穩(wěn)定性，體內(nèi)釋放速率，和施用的藥劑的體內(nèi)清除速率。根據(jù)施用的路徑，可根據(jù)體重，體表面積，或器官大小來計(jì)算合適的劑量。由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在無需過度實(shí)驗(yàn)的情況中，尤其是根據(jù)本文中公開的劑量信息和測定法，以及在動物或人臨床試驗(yàn)中觀察到的藥動學(xué)數(shù)據(jù)，例行進(jìn)行確定適宜治療劑量所必需的對計(jì)算的進(jìn)一步改進(jìn)。例示性給藥進(jìn)度表包括，但不限于，一天施用五次，一天四次，一天三次， 一天兩次，一天一次，一周三次，一周兩次，一周一次，一月兩次，一月一次，及其任意組合。適宜劑量可經(jīng)由使用用于測定血液凝固水平的已確立的測定法聯(lián)合相關(guān)劑量響應(yīng)數(shù)據(jù)來確定。最終劑量方案可以由主治醫(yī)師考慮改變藥物的作用的因素來確定，例如，藥物的比活性，損害的嚴(yán)重性，和患者的響應(yīng)性，患者的年齡，狀況，體重，性別和食譜，任何感染的嚴(yán)重性，施用的時(shí)間，和其它臨床因素。例示性用途本文所述組合物可用于治療與FIX的功能缺陷或FIX的缺陷諸如FIX體內(nèi)半衰期縮短，F(xiàn)IX結(jié)合特性改變，F(xiàn)IX的遺傳缺陷，和FIX血漿濃度降低有關(guān)的任何出血病癥。FIX 的遺傳缺陷包括，例如，編碼FIX的核苷酸序列中堿基的刪除，添加，和/或替代。在一個(gè)實(shí)施方案中，出血病癥可以是血友病B。此類出血病癥的癥狀包括，例如，嚴(yán)重鼻衄，口粘膜出血，關(guān)節(jié)積血，血腫，持續(xù)血尿，胃腸出血，腹膜后出血，舌/咽后出血，顱內(nèi)出血，和外傷相關(guān)出血。本發(fā)明的組合物可用于預(yù)防性應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)過修飾的FIX多肽可施用于對疾病狀態(tài)或損傷易感或以其它方式處于疾病狀態(tài)或損傷風(fēng)險(xiǎn)的受試者以增強(qiáng)受試者自身的凝固能力。這樣的量可定義為“預(yù)防有效劑量”。為預(yù)防而施用經(jīng)過修飾的FIX 多肽包括如下的情況，其中罹患血友病B的患者將要經(jīng)歷手術(shù)，并且在手術(shù)前1至4個(gè)小時(shí)之間施用該多肽。另外，該多肽適合于用作針對不受控制的出血的預(yù)防劑，任選在沒有罹患血友病的患者中。如此，例如，該多肽可在手術(shù)之前施用于處于不受控制的出血風(fēng)險(xiǎn)的患者ο本文所述多肽，材料，組合物，和方法旨在作為本發(fā)明的代表性實(shí)施例，而且會理解，本發(fā)明的方法不限于實(shí)施例的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到可以在所公開的多肽，材料，組合物和方法有變化的情況中實(shí)施本發(fā)明，而且認(rèn)為此類變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。呈現(xiàn)下述實(shí)施例以例示本文所述發(fā)明，但是不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例為了能更好地理解本發(fā)明，列出下述實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅為了例示的目的，而且不應(yīng)解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。通過述及完整收錄本文中提及的所有出版物。實(shí)施例1 人因子IXcDNA的克隆根據(jù)公開的cDNA序列(NM_000133)設(shè)計(jì)與人FIX cDNA編碼區(qū)5，和3，端處的庫列互補(bǔ)的一對 PCR 引物。5，引物(FIXF1 ；ATCATAAGCTTGCCACCATGCAGCGCGTGAACATG(SEQ ID NO 3)，F(xiàn)IX的起始密碼子以粗體顯示)含有FIX編碼區(qū)的頭18個(gè)核苷酸，包括共有Kozak 序列(標(biāo)有下劃線)后面的ATG起始密碼子和HindIII限制性位點(diǎn)。3，引物(FIXR3, ATC ATAAGCTTGATTAGTTAGTGAGAGGCCCTG) (SEQ ID NO 4)含有 FIX 序列中位于 FIX 編碼區(qū)末端 3’ 45個(gè)核苷酸的22個(gè)核苷酸，前面有HindIII位點(diǎn)。使用這些引物和高保真校正聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA)自正常人肝(Stratagene，San Diego, CA)擴(kuò)增 cDNA 第一條鏈導(dǎo)致人FIX cDNA預(yù)期大小(1464bp)的單一條帶。用HindIII消化之后，將PCR產(chǎn)物凝膠純化，然后克隆入質(zhì)粒pEAKflcmv的HindIII位點(diǎn)中。通過限制性消化來鑒定其中FIX cDNA 以相對于載體中的CMV啟動子正向取向插入的克隆。對數(shù)個(gè)克隆的插入物實(shí)施雙鏈DNA測序，而且衍生序列與FIX序列的比對證明了 cDNA編碼成熟蛋白的氨基酸148處為蘇氨酸的人FIX。將此質(zhì)粒命名為pEAKflcmv-FIX。實(shí)施例2 經(jīng)過修飾的因子IX多肽的生成為了改變?nèi)薋IX序列內(nèi)的各個(gè)氨基酸，使用Quickchange 引物設(shè)計(jì)程序 (Stratagene, San Diego, CA)設(shè)計(jì)一對引物。采用Quickchange II XL定點(diǎn)誘變試劑盒 (Mratagene，San Diego, CA)依照制造商的指令使用這些引物在pEAKf lcmv-FIX質(zhì)粒中生成突變。通過完整FIX編碼區(qū)的DNA測序來鑒定含有期望突變的克隆。用于創(chuàng)建突變的有義鏈寡核苷酸的序列顯示于表1。表 權(quán)利要求
1.一種因子IX多肽，其包含通過引入一或多處氨基酸替代經(jīng)過修飾的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含殘基86處的氨基酸替代。
3.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含選自氨基酸殘基85，86，和87的一或多處氨基酸替代。
4.權(quán)利要求1的多肽，其中所述多肽包含選自氨基酸殘基85，86，87，338，和410的一或多處氨基酸替代。
5.權(quán)利要求4的多肽，其中該一或多處氨基酸替代選自D85F；D85G ；D85H ；D85I ；D85M ； D85N ；D85R ；D85S ；D85W ；D85Y ；V86A ；V86D ；V86E ；V86G ；V86H ；V86I ；V86L ；V86M ；V86N ； V86P ；V86Q ；V86R ；V86S ；V86T ；T87F ；T87I ；T87K ；T87M ；T87R ；T87V ；T87W ；R338A ；R338F ； R338I ；R338L ；R338M ；R338S ；R338T ；R338V ；R338W ；E410N ；E410Q ；D85W 禾口 T87R ；D85F 和 T87I ；D85W 和 T87W ；D85R 和 T85R ；D85I 和 T87R ；D85Y 和 T87F ；D85I 和 T87M ；D85F 和 T87R ； D85F 和 T87V ；D85R 和 T87K ；D85H 和 T87I ；D85I 和 T87I ；D85Y 和 T87K ；D85S 和 T87R ；D85Y 和 T87R ；D85G 禾口 T87K ；D85H 禾口 T87W ；D85H 禾口 T87K ；D85F 禾口 T87K ；D85H 禾口 T87V ；D85M 和 T87I ；D85H 和 T87M ；R338A 和 E410N ；R338A 和 E410Q ；D85W, V86A,和 T87R ；D85F, V86A,和 T87I ；D85W, V86A，和 T87W ；D85R, V86A，和 T85R ；D85I, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A，和 T87F ； D85I, V86A，和 T87M ；D85F, V86A，和 T87R ；D85F, V86A，和 T87V ；D85R, V86A，和 T87K ；D85H, V86A，和 T87I ；D85I, V86A，和 T87I ；D85Y, V86A，和 T87K ；D85S, V86A，和 T87R ；D85Y, V86A, 和 T87R ；D85G, V86A,和 T87K ；D85H, V86A,和 T87W ；D85H, V86A,和 T87K ；D85F, V86A,和 T87K ；D85H, V86A，和 T87V ；D85M, V86A，和 T87I ；D85H, V86A，和 T87M ；D85W, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87I，和 R338A ；D85W, V86A, T87W,和 R338A ；D85R, V86A, T85R,和 R338A ； D85I, V86A, T87R，和 R338A ；D85Y, V86A, T87F，和 R338A ；D85I, V86A, T87M，和 R338A ；D85F, V86A, T87R，和 R338A ；D85F, V86A, T87V，和 R338A ；D85R, V86A, T87K，和 R338A ；D85H, V86A, T87I，和 R338A ；D85I, V86A, T87I，和 R338A ；D85Y, V86A, T87K，和 R338A ；D85S, V86A, T87R, 和 R338A ；D85Y, V86A, T87R,和 R338A ；D85G, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87W,和 R338A ；D85H, V86A, T87K,和 R338A ；D85F, V86A, T87K,和 R338A ；D85H, V86A, T87V,和 R338A ； D85M, V86A, T87I，和 R338A ；D85H, V86A, T87M,和 R338A ；D85W, V86A, T87R, R338A,和 E410N ； D85F, V86A, T87I, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87W, R338A，禾口 E410N ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410N ；D85I, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87F, R338A,和 E410N ； D85I, V86A, T87M, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87R, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85R, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87I, R338A,和 E410N ； D85I, V86A, T87I, R338A，和 E410N ；D85Y, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85Y, V86A, T87R, R338A,和 E410N ；D85G, V86A, T87K, R338A,和 E410N ； D85H, V86A, T87W, R338A，和 E410N ；D85H, V86A, T87K, R338A，和 E410N ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410N ；D85H, V86A, T87V, R338A,和 E410N ；D85M, V86A, T87I, R338A,和 E410N ； D85H, V86A, T87M, R338A，禾口 E410N ；D85W, V86A, T87R, R338A，禾口 E410Q ；D85F, V86A, T87I, R338A,和 E410Q ；D85W, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85R, V86A, T85R, R338A,和 E410Q ； D85I, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85Y, V86A, T87F, R338A，和 E410Q ；D85I, V86A, T87M, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87V, R338A,和 E410Q ； D85R, V86A, T87K, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85I, V86A, T87I,R338A,和 E410Q ；D85Y, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85S, V86A, T87R, R338A,和 E410Q ； D85Y, V86A, T87R, R338A，和 E410Q ；D85G, V86A, T87K, R338A，和 E410Q ；D85H, V86A, T87W, R338A,和 E410Q ；D85H, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ；D85F, V86A, T87K, R338A,和 E410Q ； D85H, V86A, T87V, R338A，禾口 E410Q ；D85M, V86A, T87I, R338A，禾口 E410Q ；D85H, V86A, T87M, R338A，和E410Q ；及其任意組合。
6.一種因子IX多肽，其包含氨基酸序列 YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGD QCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELX85X86X87CNIKNGRC EQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTR AETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPffQ VVLNGKVDAF CGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTE QKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNS YVTPICIADKEYTNiflkfgsgyvsgwgrvfhkgrsalvlqylrvplvdratclx338stkftiynNMFCAGFHEGGRDSCQ⑶SGGPHVTEVEGTSFLTGIISffGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKX410KTKLT (SEQ ID NO 2)；其中)(85 選自 D，F(xiàn)，G，H，I, Μ, N，R，S，W，和 Y;其中 X86 選自 A，D，E，G，H，I，L，M，N，P，Q，R，S，T，和 V ;其中 A7 選自 F，I, K, Μ, R，T，V，和 W;其中 X338 選自 A，F(xiàn)，I，L，M，R，S，T，V，和 W ;其中)C41Q選自E，N，*Q。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的多肽，其進(jìn)一步包含一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。
8.—種藥物制備物，其包含權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的因子IX多肽和藥學(xué)可接受載體。
9.一種治療血友病B的方法，其包括對有所需要的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求 8的藥物制備物。
10.一種DNA序列，其編碼權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)的多肽。
11.一種真核宿主細(xì)胞，其用依照權(quán)利要求10的DNA序列轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的方式容許該宿主細(xì)胞表達(dá)因子IX多肽。
12.一種用于生產(chǎn)因子IX多肽的方法，其包括(i)通過引入一或多處氨基酸替代修飾該多肽的氨基酸序列；(ii)在細(xì)胞系中表達(dá)該多肽；并(iii)純化該多肽。
13.權(quán)利要求7的多肽，其進(jìn)一步包含附著至所述一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的一或多個(gè)糖模塊。114.權(quán)利要求13的多肽，其中該一或多個(gè)糖模塊是唾液酸。
14.一種綴合物，其包含a)權(quán)利要求13或14的多肽，和b)共價(jià)附著至其的一或多個(gè)聚合物模塊。
15.權(quán)利要求14的綴合物，其中該一或多個(gè)聚合物模塊共價(jià)附著至一或多個(gè)糖模塊。
16.權(quán)利要求15的綴合物，其中該一或多聚合物模塊選自下組聚亞烷基二醇，聚(丙二醇)(“ppg”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等等，聚(乙氧基化多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羥基烴基甲基丙烯酰胺)，聚(羥基烴基甲基丙烯酸酯)，聚(糖)，聚 (0-羥基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚埸唑啉，聚(N-丙烯酰嗎啉)，聚唾液酸，羥乙基淀粉(HEQ，聚氧化乙烯，烴基-聚氧化乙烯，二聚氧化乙烯，聚氧化烯的共聚物或嵌段共聚物，聚(乙二醇-共-丙二醇)，聚(N-2_(羥基丙基)甲基丙烯酰胺)，和右旋糖酐。
17.該權(quán)利要求16的綴合物，其中該一或多個(gè)聚合物模塊是聚亞烷基二醇。
18.權(quán)利要求17的綴合物，其中該聚亞烷基二醇是聚乙二醇(PEG)。
19.一種綴合物，其包含a)因子IX多肽，其包含通過引入一或多處氨基酸替代經(jīng)過修飾的氨基酸序列，其中至少一處氨基酸替代位于殘基338 ；b)附著至所述一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的一或多個(gè)糖模塊；和c)共價(jià)附著至一或多個(gè)糖模塊的一或多個(gè)聚合物模塊。
20.權(quán)利要求19的綴合物，其中所述殘基338處的替代選自下組R338A，R338F， R338I, R338L, R338M, R338S, R338T, R338V，和 R338W。
21.權(quán)利要求19或20的綴合物，其中所述多肽進(jìn)一步包含選自氨基酸殘基157和167 的一或多處氨基酸替代。
22.權(quán)利要求21的綴合物，其中所述殘基157處的替代選自下組N157A和W57Q。
23.權(quán)利要求21的綴合物，其中所述殘基167處的替代選自下組N167A和W67Q。
24.一種用于改善聚合物模塊對多肽的綴合的方法，其包括a)提供具有一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)的多肽，其中該糖基化位點(diǎn)包含一或多個(gè)唾液酸；b)氧化所述多肽的所述唾液酸；c)提供催化劑；并d)將包含氨基-氧官能團(tuán)的聚合物模塊共價(jià)附著至所述氧化后的唾液酸；由此綴合速率得到提高。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述催化劑選自下組苯胺和苯胺衍生物諸如o-Cl-， ρ-Cl-, O-CH3O-, P-CH3O-,和 P-CH3-苯胺。
26.權(quán)利要求對的方法，其中所述綴合速率相對于沒有該催化劑的情況得到提高。
全文摘要
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的因子IX多肽諸如具有一或多處氨基酸替代的因子IX多肽。本發(fā)明還涉及用于生成經(jīng)過修飾的因子IX多肽的方法，及使用經(jīng)過修飾的因子IX多肽，例如，治療罹患血友病B的患者的方法。
文檔編號A61K38/36GK102573890SQ201080043135
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月31日
發(fā)明者A.布魯克斯, C.帕特爾, H.阿佩勒, U.格里贊, 王俊, 蔣曉喬 申請人:拜耳醫(yī)藥保健有限公司