專(zhuān)利名稱(chēng)：因子vii融合多肽的制作方法
因子Vl I融合多肽本發(fā)明涉及具有延長(zhǎng)半衰期的凝血因子VII (FVII)融合多肽，其中所述FVII多肽可被激活或者呈活化型。FVII是由肝臟產(chǎn)生的糖蛋白。FVII的活化型叫做FVIIa，在凝血中具有重要的作用。凝血過(guò)程是由于若干胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶之間的級(jí)聯(lián)相互作用實(shí)現(xiàn)的。這些酶中的大多數(shù)被合成為無(wú)活性的前體酶原，在限制性蛋白水解期間酶原經(jīng)過(guò)切割產(chǎn)生其活化型。具體而言，F(xiàn)VII被激活為FVIIa，F(xiàn)VIIa結(jié)合組織因子，其為在某些細(xì)胞的膜上組成型表達(dá)的脂蛋白。已知包括FXa和FIXa在內(nèi)的某些蛋白酶引起FVII激活為FVIIa。FVII 的激活涉及通過(guò)蛋白酶剪切Arg (152)和Ile (153)之間的肽鍵將單鏈的FVII轉(zhuǎn)化為雙鏈活化型(FVIIa)。Ile (153)和Asp (343)之間鹽橋的形成驅(qū)使從酶原樣到活化型的FVIIa轉(zhuǎn)化。當(dāng)血管遭到破壞時(shí)，組織因子暴露于血液和循環(huán)中的FVIIa。隨后已結(jié)合的組織因子與FVIIa分別使因子IX (FIX)和因子X(jué) (FX)激活，形成FIXa和FXa。血友病患者很少有或沒(méi)有功能性凝血因子VIII或因子IX，并且一些患者產(chǎn)生了針對(duì)給予的因子的中和抗體，需要用旁路藥劑(bypassing agent)諸如因子Vila進(jìn)行治療。盡管由于因子FVIIa的半衰期較短，利用因子VIIa進(jìn)行預(yù)防在目前很麻煩并且昂貴，但是治療血友病的最佳方式仍是預(yù)防性的。為了將因子VIIa的血漿濃度在要求時(shí)間期間內(nèi)保持高于閾值水平，需要重復(fù)給藥。開(kāi)發(fā)了經(jīng)修飾的FVII多肽，試圖解決半衰期短的問(wèn)題。例如，W02006/018204中闡述通過(guò)在FVII多肽序列的140到152氨基酸之間插入來(lái)自FX或者FIX的激活肽來(lái)進(jìn)行修飾的FVII多肽。然而，在W02006/018204中闡述的該修飾多肽不能被激活為FVIIa。因此，仍然需要用于在保留FVII被激活為FVIIa的能力的同時(shí)增加FVII和FVIIa的半衰期的方法。本發(fā)明人確證通過(guò)將來(lái)自FX或者來(lái)自FIX的活化肽序列加到FVII多肽的某個(gè)位置，產(chǎn)生了可被激活為FVIIa的融合FVII多肽，其中未激活的FVII多肽和活化FVII多肽(FVIIa)均具有延長(zhǎng)的半衰期。本發(fā)明第一方面涉及包含F(xiàn)VII或FVIIa多肽或其同源物和FX或FIX活化肽或其同源物的多肽，其中FX或FIX活化肽在FVII或FVIIa多肽的C-末端融合。FVII/FVIIa多肽和FX/FIX活化肽的同源物是生物學(xué)活性同源物。FVII/FVIIa多肽同源物和活化肽同源物的“生物學(xué)活性”在以下定義。本文所用術(shù)語(yǔ)“FVII多肽”，指未激活的成熟FVII多肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“FVIIa多肽”，指FVII多肽的活化型，即FVII多肽在Argl52-Ilel53處的單個(gè)肽鍵斷裂導(dǎo)致通過(guò)二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈的形成。因此，F(xiàn)VIIa多肽與FVII多肽具有相同的序列，但是FVIIa多肽由兩條多肽鏈而不是一條鏈形成?？蓪⒈景l(fā)明的FVII或FVIIa多肽截短，然后在截短的多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“截短的FVII或FVIIa多肽”，包括這樣的FVII或FVIIa多肽，其不包含在野生型或同源FVII或FVIIa多肽的C末端的起始1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明截短的FVII或FVIIa多肽具有生物學(xué)活性。亦可延長(zhǎng)本發(fā)明FVII或FVIIa多肽，然后在延長(zhǎng)多肽的C-末端融合FX或FIX活化肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“延長(zhǎng)的FVII或FVIIa多肽”，包括這樣的FVII或者FVIIa多肽，其另外包含在野生型或同源的FVII或FVIIa多肽的C-末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明延長(zhǎng)的FVII或FVIIa多肽具有生物學(xué)活性。本發(fā)明FVII和FVIIa融合多肽分別與野生型FVII多肽和/或野生型FVIIa多肽相比具有延長(zhǎng)的半衰期?！癋IX活化肽”或“FX活化肽”，指當(dāng)成熟的FIX或FX多肽分別從其無(wú)活性型(酶 原)轉(zhuǎn)化為其活性型時(shí)自成熟肽釋放的肽?？蓪IX和FX活化肽截短。術(shù)語(yǔ)“截短的FIX肽”和“截短的FX肽”分別包括這樣的FIX肽或FX肽，其不包含在野生型或同源FIX或FX活化肽的C-末端和/或N-末端存在的起始1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸殘基。截短的FIX或FX活化肽具有生物學(xué)活性。亦可延長(zhǎng)本發(fā)明FX或FIX活化肽。本文所用術(shù)語(yǔ)“延長(zhǎng)的FX或FIX活化肽”包括這樣的FX或FIX活化肽，其包含在野生型或同源活化肽的N-末端和/或C-末端的另外1、2、3、4、5、6或更多個(gè)氨基酸殘基。延長(zhǎng)的FVII或FVIIa多肽具有生物學(xué)活性。野生型FVII多肽和野生型FVIIa多肽的序列如SEQ ID NO: I所示。該序列代表無(wú)前導(dǎo)序列的成熟FVII或FVIIa多肽。SEQ ID NO: I中的三字母表示“GLA”意即4_羧基谷氨酸U -羧基谷氨酸)。野生型FIX活化肽的序列在SEQ ID NO: 2中闡述。野生型FX活化肽的序列在SEQID NO:3中闡述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及這樣的多肽，其包含SEQ ID NO: I所述的氨基酸序列的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個(gè)到 397、398、399、400、401、402、403、404、405或406個(gè)殘基或其同源物，所述活化肽包含SEQ ID N0:2所述氨基酸序列的第1、2、3、4、5或6個(gè)到30、21、32、33、34或35個(gè)殘基或其同源物，或SEQ ID NO: 3所述氨基酸序列的第
1、2、3、4、5或6個(gè)到47、48、49、50、51或52個(gè)殘基或其同源物。因此，本發(fā)明包括以下多肽序列，其為以SEQ ID N0:1的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 位殘基中的任一個(gè)開(kāi)始并以 SEQ ID NO: I 的第 397、398、399、400、401、402、403、404 或405位殘基中的任一個(gè)結(jié)束的多肽序列，其在C末端與活化肽融合，所述活化肽以SEQ IDN0:2的第1、2、3、4、5或6位殘基中的任一個(gè)開(kāi)始并以SEQ ID NO:2的第30、31、32、33、34或35位殘基中的任一個(gè)結(jié)束或以SEQ ID N0:3的第1、2、3、4、5或6位殘基中的任一個(gè)開(kāi)始并以SEQ ID N0:3的第47、48、49、50、51或52位殘基中的任一個(gè)結(jié)束。本文術(shù)語(yǔ)“多肽”概括性地指通過(guò)肽鍵連接在一起的多個(gè)氨基酸殘基。它與肽、寡肽、寡聚物或蛋白質(zhì)可互換使用并意思相同，并包括糖蛋白及其衍生物。術(shù)語(yǔ)“多肽”還意欲包括同源物，其中所述同源物與參考蛋白保持相同(或更高)的生物學(xué)活性。在本發(fā)明中，F(xiàn)VII或FVIIa多肽的同源物與在SEQ ID NO: I中所述的野生型FVII或FVIIa多肽具有相同或更高生物學(xué)活性。在本文中，術(shù)語(yǔ)同源物包括變體。
野生型FVIIa的生物學(xué)活性是該多肽將其底物FX轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚訤Xa的能力。當(dāng)本發(fā)明多肽是FVII多肽時(shí)，在可測(cè)定其生物學(xué)活性之前必須首先將其激活為FVIIa。FVIIa多肽的生物學(xué)活性可用如下的“體外蛋白水解測(cè)定”來(lái)確定
在含有0.1 M NaCl、5 mM CaCl2和I mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100微升50 mMHepes (pH 7.4)中，將因子Vila (10 nM)和因子X(jué) (0.8 U M)于微滴板中孵育15分鐘。然后通過(guò)加入含有0. I M NaCl、20 mM EDTA和I mg/ml牛血清白蛋白的50微升50 mM Hepes(pH 7. 4)來(lái)終止FX切割。通過(guò)加入終濃度為0. 5 mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺(S-2765，Chromogenix，瑞典)來(lái)測(cè)量產(chǎn)生的FXa的量。在SpectraMax (TM) 340讀板儀(Molecular Devices, USA)中連續(xù)測(cè)量其在405 nm處的吸光度。將在10分鐘期間顯 現(xiàn)的吸光度減去不含F(xiàn)VIIa的空白孔的吸光度后，用于計(jì)算同源FVIIa和野生型因子FVIIa(如SEQ ID NO: I中所述)的蛋白水解活性的比率
比率=(A405 nm因子VIIa同源物)/(A405 nm SEQ ID NO: I中所述的因子VIIa多肽)在本測(cè)試中，將高于0.8 (任選包括約為或高于1、1. 25和1.5)的比率定義為本發(fā)明生物活性多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的FVII或FVIIa多肽延伸至與SEQ ID NO: I中定義的野生型FVII或FVIIa多肽具有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，所述序列可與SEQ ID NO: I中的野生型FVII或FVIIa多肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。眾所周知，氨基酸水平的同源性一般是就氨基酸的相似性或同一性而言?？赏ㄟ^(guò)目測(cè)和數(shù)學(xué)計(jì)算來(lái)測(cè)定序列同源性百分比。用可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)軟件例如BLAST或ALIGEN，可以以多種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)用于測(cè)定氨基酸序列同一性百分比目的的比對(duì)。例如，可用XBLAST程序來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索，以獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的合適的參數(shù)，包括在所比較的序列全長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大比對(duì)所需的任何算法。本發(fā)明FVIIa多肽的同源物與SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物學(xué)活性。一旦FVII多肽被激活為FVIIa多肽，則本發(fā)明FVII多肽的同源物與SEQ ID NO: I的野生型FVIIa多肽具有相同或更高的生物學(xué)活性。本發(fā)明變體多肽包括在US2006/0166915、W002/077218、US2003/0100075、US2003/0130191 和 W02004/029090 中公開(kāi)的所有變體多肽序列，這些公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)弓I用全部并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明FIX或FX活化肽延伸至分別與SEQ ID N0:2或N0:3中的野生型FIX或FX活化肽有至少80%同源性的氨基酸序列。在另外的實(shí)施方案中，所述序列與所述野生型FIX或FX活化肽氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 4% 或 99. 5% 的同源性 / 同一性。在本發(fā)明背景下FIX或FX活化肽的生物活性，是提高本發(fā)明融合多肽的血漿半衰期高于添加活化肽之前FVII或FVIIa多肽血漿半衰期的能力。融合蛋白半衰期比添加活化肽之前的FVII或FVIIa多肽半衰期長(zhǎng)大約或超過(guò)5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、100%或 200%。術(shù)語(yǔ)血楽；“半衰期”是指使對(duì)于特定蛋白而言,僅剩余初始蛋白庫(kù)(protein pool)的50%所花的時(shí)間。半衰期可通過(guò)ELISA測(cè)量。
本發(fā)明FVII或FVIIa多肽或FIX或FX肽的同源物可為(i)其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代的多肽，且所述取代的氨基酸殘基可由或可不由遺傳密碼編碼；或(ii)其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基包括取代基的多肽。優(yōu)選具有以上定義的多肽氨基酸序列的同源物，其中若干個(gè)例如5-10、1-5、1_3、
2、1或沒(méi)有氨基酸殘基以任意組合被取代、缺失或添加。其中尤其優(yōu)選沉默取代、缺失和添加，其不改變本發(fā)明蛋白的性質(zhì)和活性。在這方面還尤其優(yōu)選保守取代。因此，氨基酸甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(含有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸)經(jīng)常可以彼此取代。其中可能的取代優(yōu)選用甘氨酸和丙氨酸來(lái)相互取代(因?yàn)樗鼈冇邢鄬?duì)短的側(cè)鏈)和用纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸相互取代(因?yàn)樗鼈冇休^大的疏水脂肪族側(cè)鏈)?？山?jīng)常彼此取代的其它氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(含有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)；賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸(含有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬氨酸和谷氨酸(含有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；天冬酰胺和谷氨酰胺(含有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；半胱氨酸和甲硫 氨酸(含有含硫側(cè)鏈的氨基酸)。這種類(lèi)型的取代通常被稱(chēng)為“保守”或“半保守”氨基酸取代。亦可相對(duì)于用于以上提及的融合多肽的氨基酸序列進(jìn)行氨基酸缺失。因此，例如，對(duì)多肽的活性沒(méi)有實(shí)質(zhì)影響或至少不會(huì)消除所述活性的氨基酸可缺失。所述缺失可為有利的，因?yàn)榭山档投嚯牡娜L(zhǎng)和分子量但同時(shí)保持活性。這可使特定目的所需的多肽的量降低一例如可降低劑量水平。亦可相對(duì)于以上融合多肽的序列來(lái)進(jìn)行氨基酸插入。可實(shí)施插入以改變本發(fā)明的物質(zhì)的性質(zhì)(例如有助于鑒定、純化或表達(dá)，其如以上關(guān)于融合多肽所解釋的)?？捎萌魏芜m當(dāng)?shù)募夹g(shù)例如通過(guò)用定向誘變來(lái)使相對(duì)于以上a)中所給的序列發(fā)生
氨基酸變化。應(yīng)該了解，可用天然存在的或非天然存在的氨基酸來(lái)進(jìn)行本發(fā)明范圍內(nèi)的氨基酸取代或插入。不管使用的是天然還是合成的氨基酸，優(yōu)選只存在L-氨基酸。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，本發(fā)明FVII或FVIIa多肽延伸至相對(duì)于SEQ ID NO: I的氨基酸序列包含一個(gè)或更多個(gè)取代的同源物，其中所述取代為用選自以下位置的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: I氨基酸位置的第172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370 或 373 位。本文所用術(shù)語(yǔ)“任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸”是指與SEQ ID NO: I中氨基酸不同的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸。這包括但不限于可由多核苷酸編碼的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，不同的氨基酸呈天然的L-型，可由多核苷酸編碼，具體實(shí)例是L-半胱氨酸(Cys)。在以下實(shí)施方案中，表述“至少”是指僅指定的氨基酸被取代，或除分子中一個(gè)或更多個(gè)其它氨基酸發(fā)生變化外，還有特定氨基酸被取代。在以下實(shí)施方案中，關(guān)于SEQ ID NO: I的氨基酸取代如下字母代表在SEQ IDNO: I位置中天然存在的氨基酸，后面的數(shù)字代表在SEQ ID NO: I中的位置。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少G237被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少T238被選自Ala、Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少T239被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少Q(mào)286被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。
在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少L287被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少L288被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少D289被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少R290被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少A292被選自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少T293被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少A294被選自Gly、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少L295被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少L297被選自Gly、Ala、Val、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少V299被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少M(fèi)327被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少K341被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或V IIa多肽為同源物，其中至少S363被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少W364被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少G365被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少Q(mào)366被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少Q(mào)366被選自Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、His、Lys> Arg、Cys> Thr 或 Ser 的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少V172被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少N173被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少A175被選自Gly、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少Q(mào)176被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少L177被選自Gly、Ala、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少D196被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少K197被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少1198被選自Gly、Ala、Leu、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少K199被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Arg、Cys> Ser> Val 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少N200被選自 Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少N203被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少V235被選自Gly、Ala、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少N240被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少D319被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少S320被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe> Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少P321被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys、Arg、Cys> Ser 或Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少G367被選自Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少T370被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、His、Lys> Arg、Cys 或 Ser的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少H373被選自Gly、Ala、Val、Leu、lie、Phe、Met、Trp> Tyr> Asp、Asn、Glu、Gin、Lys> Arg、Cys> Ser 或 Thr的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少i) L287被選自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被選自Thr或Ser的氨基酸取代，和iii) M298被Lys取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少i) L287被選自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被選自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被選自lie、Leu、Thr或Val的氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少i) L287被選自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被選自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) V185被選自Asp或Glu的氨基酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為同源物，其中至少i) L287被 選自Thr或Ser的氨基酸取代，ii) A294被選自Thr或Ser的氨基酸取代，iii) M298被Lys取代，和iv) E296被選自lie、Leu、Thr或Val的氨基酸取代，和v) V158被選自Asp或Glu的氨基酸取代。關(guān)于SEQ ID NO: I,以下闡述的用于氨基酸取代的術(shù)語(yǔ)如下
第一個(gè)字母代表在SEQ ID NO: I位置中天然存在的氨基酸。后面的數(shù)字代表在SEQ IDN0:1中的位置。第二個(gè)字母代表取代天然氨基酸的不同的氨基酸。實(shí)例為K197A-FVII，其中SEQ ID NO: I中197位置的賴(lài)氨酸被丙氨酸取代。在本發(fā)明又一實(shí)施方案中，因子VII或VIIa多肽為選自以下的多肽
￥ 151<0;12^71-\21148^￡2%1 ^12 K-FVIIA; V15KD^.28TT/\294S^E296-V/M2l K-F￥]iA:
￥ 158D；L2 T/A294S^296L;M29KK-FVIIA; V15fSD;12K T/A294S/E296T^I298K-FVlIA: Vl5KDL2^7T^A294Tl;2%i-;M29SIC-FVilA; V15XD1. 2K T^A294T ￠296 V/M2 WK^F V i I A;
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V15UD±2$lSfA294E,:E2l)M ^lltWK-FVIIA; V15KD/L 287S/A294S E296V %1298K-F Vl IA;
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V15S E;L2H T/A2 MT/E2%I, ^I29KK-F V11 A; V15KE:1 28 T^2 T；II296T/M2* K-F VIIA:\a5KE/L2l< S'V%294S1i29fti/M9KK4--VIIA; VI5KE/L2 S/A2y4S^E2%V;M2sIXIC-FViiA;
V15KE/i.2K S/A294S^E2961^/M 29HK-FV I! A; V 15HE/1^K7SA294S/B296T/M29HK.FV 11 A;
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權(quán)利要求
1.一種多肽，所述多肽包含因子VII (FVII)或因子Vila (FVIIa)多肽或其同源物和因子X(jué) (FX)或因子IX (FIX)活化肽或其同源物，其中所述FX或FIX活化肽在所述FVII或FVIIa多肽的C末端融合。
2.權(quán)利要求I的多肽，其中所述FVII或FVIIa多肽包含SEQID NO: I所述氨基酸序列或其同源物的第 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 到 397、398、399、400、401、402、403、404、405 或406位殘基，并且所述活化肽包含SEQ ID NO:2所述氨基酸序列或其同源物的第1、2、3、4、5或6到30、31、32、33、34或35位殘基或SEQ ID NO:3所述氨基酸序列或其同源物的第I、2、3、4、5 或 6 到 47、48、49、50、51 或 52 位殘基。
3.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的多肽，其中所述FVII或FVIIa多肽相對(duì)于SEQID NO: I的氨基酸序列包含一個(gè)或更多個(gè)取代，其中所述取代是被選自對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:l的氨基酸位置的第 172、173、175、176、177、196、197、198、199、200、203、235、237、238、239、240、 286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、297、299、319、320、321、327、341、363、364、365、366、367、370或373位的任何一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的取代。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的多肽，其中所述多肽為分離多肽和/或?yàn)橹亟M多肽。
5.—種核酸序列，其編碼權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽。
6.—種載體,其包含權(quán)利要求5的核酸。
7.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求5的核酸或權(quán)利要求6的載體。
8.—種產(chǎn)生FVII多肽的方法，所述方法包括在促進(jìn)所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中回收所表達(dá)的多肽。
9.權(quán)利要求8的方法，所述方法還包括純化所表達(dá)的多肽的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述純化步驟包括激活所述FVII多肽。
11.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽。
12.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求11的藥物組合物，其用于藥物。
13.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽在制備用于治療凝血缺陷的藥物中的用途。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述凝血缺陷是A型血友病出型血友??；因子X(jué)I缺陷和因子VII缺陷；包括手術(shù)或其它組織損傷出血在內(nèi)的過(guò)量出血或不必要的出血；或因血小板功能缺陷、血小板減少癥或血管性血友病而導(dǎo)致的出血。
15.一種治療與凝血缺陷相關(guān)病況的方法，所述方法包括給予受試者權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的多肽或權(quán)利要求11的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有延長(zhǎng)的半衰期的因子VII(FVII)融合多肽，其中所述FVII多肽可被激活或處于活化型。
文檔編號(hào)C12N15/62GK102753575SQ201180007544
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者E.珀森 申請(qǐng)人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司