修飾的因子vii多肽及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了修飾的因子VII多肽及其應用。這種修飾的FVII多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽是活性改變的那些多肽，通常具有改變的促凝血活性，包括促凝血活性增加。因此，這種修飾的多肽是治療劑。
【專利說明】修飾的因子Vl I多肽及其應用
[0001]本申請是申請日為2008年4月11日的申請?zhí)枮?00880016982.6標題為“修飾的因子VII多肽及其應用”的申請的分案申請。
[0002]相關申請
[0003]要求2007 年 4 月 13 日提交的題為 “MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES ANDUSES THEREOF”的美國臨時申請N0.60/923，512的優(yōu)先權(quán)，該臨時申請的 申請人:為EdwinMadison, Christopher Thanos, Sandra Waugh Ruggles 和 Snaun Coughlin。
[0004]本申請涉及對應的美國申請N0.12/082, 662，題為“MODIFIED FACTOR VIIPOLYPEPTIDES AND USES THEREOF，，， 申請人:為 Edwin Madison, Christopher Thanos, SandraWaugh Ruggles和Shaun Coughlin,也要求美國臨時申請N0.60/923, 512的優(yōu)先權(quán)。
[0005]在允許的情況下，上述申請的每ー個的主題都全文包含在內(nèi)作為參考。
發(fā)明領域
[0006]本發(fā)明提供了修飾的治療性蛋白質(zhì)。本發(fā)明特別提供了修飾的因子VII多肽及其應用，所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。
[0007]發(fā)明背景
[0008]止血是使出血停止的一個復雜的生理學過程。血小板、血漿蛋白、血管和內(nèi)皮細胞是這個過程的三個成分，每個成分在組織損傷后的緊接事件中起重要作用，并且在正常情況下使血凝塊快速形成。關鍵的是凝血級聯(lián)反應，這是一系列蛋白酶解事件，其中某些血漿蛋白(或者凝血因子)在“級聯(lián)”中相繼被另一先被活化的凝血因子激活，導致凝血酶的迅速形成。隨后在這個級聯(lián)中產(chǎn) 生的大量凝血酶使纖維蛋白原裂解為血凝塊形成所需的纖維蛋白肽。
[0009]凝血因子作為無活性的單鏈酶原循環(huán)，在一或多個部位被活化而產(chǎn)生雙鏈活性形式的蛋白質(zhì)。因子VII(FVII)是維生素K依賴性血漿蛋白，最初在血液中以酶原形式循環(huán)。FVII酶原在單一位置Arg152-1le153被蛋白酶解，產(chǎn)生由一個ニ硫鍵連接的雙鏈蛋白酶(FVIIa)。FVIIa結(jié)合其輔因子-組織因子(TF)-形成復合物，其中FVIIa可有效地使因子X(FX)活化為FXa，從而起始導致纖維蛋白形成和止血的一系列事件。
[0010]雖然在大多數(shù)情況中實現(xiàn)正常止血，但是該過程中的缺陷可以導致出血性疾病，其中血凝塊形成的時間延長。這種疾病可以是先天或者后天的。例如，血友病A和B是遺傳性疾病，特征分別在于因子VIII (FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治療是血友病A和B的傳統(tǒng)治療方法，包括靜脈內(nèi)給予從人血漿中制備的或者作為重組蛋白質(zhì)的FVIII或者FIX。然而在許多情況中，患者產(chǎn)生注入的蛋白質(zhì)的抗體(也稱作抑制劑)，其降低治療
效カ或者使治療無效。已經(jīng)許可重組FVIIa (Novoseveii+11)用于治療具有FVI11或FIX抑
制劑的血友病A或者B患者，且還用于終止與外傷和/或手術相關的出血事件或者防止出血。重組FVIIa也被許可用于治療先天性FVII缺陷的患者，并越來越多地用于適應癥外使用(off-label use)，如治療與非血友病患者中先天性或者獲得性出血疾病、外傷和手術相關的出血。[0011 ] 重組FVIIa促進血凝塊形成的應用突出了其治療治療劑的越來越重要的特點。FVIIa治療明顯未滿足臨床需要。例如，給予臨床試驗數(shù)據(jù)，需要在6小時或更多的時間平均3劑的FVIIa以處理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa變體以減少這些需求。因此，本發(fā)明的ー個目的是提供修飾的FVII多肽，其被修飾為具有改良的治療性質(zhì)。
[0012]發(fā)明概述
[0013]本發(fā)明提供了修飾的因子VII (FVII)多肽。本發(fā)明特別提供了呈現(xiàn)促凝血活性的修飾的FVII多肽。該FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比在ー級序列中被修飾，且可包括氨基酸插入、缺失和置換。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽包括這樣的多肽，其呈現(xiàn)出對于組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抑制作用抗性增加、對于抗凝血酶-1II (AT-1II)的抑制作用抗性增加、Zn2+結(jié)合力降低、藥動學性質(zhì)改良如半衰期延長、在有和/或無TF的條件下催化活性増加，和/或與活化的血小板的結(jié)合增強。所述修飾的FVII多肽可含有本文提供的修飾的任何組合，由此與未修飾的FVII多肽相比一或多個活性或者性質(zhì)被改變。典型地，修飾的FVII多肽保留促凝血活性。本發(fā)明還提供了編碼/表達修飾的FVII多肽的核酸分子、載體和細胞。本發(fā)明還提供了藥物組合物、制品、試劑盒和治療方法。FVII多肽包括等位基因和種變體以及具有影響其它活性和/或性質(zhì)的修飾的多肽和其它變體。本發(fā)明還包括包含本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽的活性片段。舉例FVII多肽是包含所示氨基酸序列的那些多肽以及與其具有 60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的變體。
[0014]本發(fā)明的因子VII(FVII)多肽與未修飾的FVII多肽相比在ー級序列中被修飾，所述修飾可包括氨基酸插入、缺失和置換。本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽包括這樣的FVII多肽，其呈現(xiàn)出對于TFPI的抑制作用抗性增加，對于AT-1II的抑制作用抗性增加，Zn2+結(jié)合力下降，藥動學性質(zhì)改良，如半衰期延長，在有和/或無(組織因子)TF條件下催化活性增カロ，和/或與活化的血小板結(jié)合增強。所述修飾的FVII多肽可含有本發(fā)明提供的修飾的任意組合，從而與未修飾的FVII多肽相比該多肽的一或多種活性或者性質(zhì)被改變。所述FVII多肽可包括改變性質(zhì)和/或活性的其它修飾。典型地，所述修飾的FVII多肽保留促凝血活性。本發(fā)明還提供了編碼/表達修飾的FVII多肽的核酸分子、載體和細胞。本發(fā)明也提供了藥物組合物、制品、試劑盒和治療方法。
[0015]特別地，本發(fā)明提供的修飾的因子VII (FVII)多肽的等位基因和種變體或者其活性片段或者其它變體。本發(fā)明提供了 FVII多肽，包括其等位基因變體和種變體或者其活性片段，其在對應具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197或者K199位置或者在FVII多肽包括其等位基因變體和種變體、活性片段的對應殘基具有修飾，本發(fā)明還提供了針對其它活性或者性質(zhì)修飾的其它FVII多肽。所述FVII多肽在對應含有SEQ IDNO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197或K199的位置或者在FVII多肽的對應位置含有至少ー個修飾。所述修飾是選自如下的疏水性或者酸性氨基酸的插入和/或置換:Val (V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Tyr(Y)、Cys(C)、Asp(D)和 Glu(E)。當提供活性片段時，該活性片段包含這種修飾。例如，本發(fā)明提供了這樣修飾的因子VII (FVII)多肽、其等位基因和種變體或者其活性片`段或其它變體，其也包含選自如下的置換:D196F、D196W、D196L、D1961、D196Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E 和 K197Y。[0016]此外，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽在其另一位置可含有進ー步的修飾，包括氨基酸置換、插入和缺失。在一些實例中，所述進ー步修飾是在對應選自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置的氨基酸置換，其中第一個修飾和第二個修飾位于不同的氨基酸。這些修飾可包括但不限于:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D 和 K341Q。其它舉例的氨基酸插入修飾例如但不限于是如下任意插入:G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。其它舉例的修飾的FVII多肽包括如下修飾:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q 或 K197E/K199E/K341Q。[0017]本發(fā)明還提供了這樣修飾的FVII多肽，包括其等位基因和種變體或者其活性片段或其它變體，其也可含有對應具有SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽或者FVII多肽對應位置中如下任一或多個氨基酸修飾:D196R、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E、G237W、G2371、G237V、R290M、R290V、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、 G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。此外，這些修飾的FVII多肽可含有在另一位置的進ー步的修飾，包括氨基酸置換、插入或者缺失。在一些實例中，所述進ー步修飾可以是在對應D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置的氨基酸置換，其中所述進ー步修飾與第一個修飾在不同位置。例如，所述修飾的FVII多肽可另外含有選自如下的氨基酸置換:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和K341Q。舉例的這種修飾的FVII多肽是包含選自如下修飾的那些多肽:D196R/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q和 K196V/K197E。
[0018]在一些情況中，修飾的因子VII (FVII)多肽、包括其等位基因和種變體或者其活性片段或者其它變體，可包含F(xiàn)VII多肽中兩或多個修飾，其中至少兩個氨基酸修飾對應具有或包含SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽如下修飾或者FVII多肽中對應殘基的修飾:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。所述多肽可包含多于兩個的修飾，例如2、3、4、5、6或者7個修飾。
[0019]舉例的這些多肽是這樣的FVII多肽，其包含選自如下的修飾:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q 和 K197E/G237V/M298Q。[0020]上述任何修飾的FVII多肽均可呈現(xiàn)出與未修飾的FVII多肽比對于組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抗性增加。在一些實例中，所述修飾的FVII多肽的TFPI抗性是至少大約或是 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高。此外，這些修飾的FVII多肽也可以含有實現(xiàn)磷脂結(jié)合的異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其足夠部分。
[0021]本發(fā)明還提供了這樣修飾的FVII多肽，其含有實現(xiàn)磷脂結(jié)合的異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其足夠部分，如 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的異源Gla結(jié)構(gòu)域。上述任何及所有修飾的FVII多肽也可包含Gla交換(swap)，包括本文舉例和描述的Gla交換。
[0022]異源Gla結(jié)構(gòu)域可選自因子IX(FIX)、因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨鈣素、基質(zhì)Gla蛋白、生長阻滯特異蛋白(Growth-arrest-specific protein)6 (Gas6)或者Z蛋白的Gla結(jié)構(gòu)域。在一些實例中，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽中的異源Gla結(jié)構(gòu)域具有SEQ ID NO: 110-118、120和121所示任一氨基酸序列或者其足夠部分以實現(xiàn)磷脂結(jié)合。對FVII多肽的修飾可以通過除去天然FVII Gla結(jié)構(gòu)域的所有或者鄰近部分而實現(xiàn)，這可包括具有或者包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中1_45位氨基酸或者FVII多肽中對應殘基，并且用異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其足夠部分置換以實現(xiàn)磷脂結(jié)合，例如増加磷脂結(jié)合。這種修飾可導致修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比呈現(xiàn)出磷脂結(jié)合力增強。例如，所述修飾的FVII多肽可呈現(xiàn)出磷脂結(jié)合力增強至少大約或者增強1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更高。
[0023]所述修飾的FVII多肽的全部或者鄰近部分的天然FVII Gla結(jié)構(gòu)域被除去，并用異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其足夠部分置換以實現(xiàn)磷脂結(jié)合。舉例的這種多肽是這樣的多肽，其中天然FVII Gla結(jié)構(gòu)域包含具有或包含SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列的FVII多肽中1_45位氨基酸或者FVII多肽中對應殘基。Gla修飾包括但不限于Gla Swap FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S 和 Gla Swap 凝血酶。
[0024]通過交換，修飾的FVII多肽可呈現(xiàn)出磷脂結(jié)合力增強。這種磷脂結(jié)合增強可以是增強至少大約或者增強 0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500% 或更聞。
[0025]含有異源Gla結(jié)構(gòu)域的修飾的FVII多肽在某些位置可含有進ー步修飾，導致或者呈現(xiàn)出與未修飾的FVII多肽相比對于組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抗性增加。舉例的這種修飾是在具有或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置或者FVII多肽對應殘基中的一或多個氨基酸修飾。特別地，這種修飾可包括選自如下的一或多個氨基酸修飾:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、 D196K197insY、 D196K197insW、 D196K197insA、 D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA 和 K197I198insS。例如，含有異源 Gla 結(jié)構(gòu)域的修飾的FVII多肽也可含有氨基酸置換和/或氨基酸插入，例如但不限于:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E 以及 D196R/K197M/K199E/R290E。
[0026]在一些情況中，這種進一步修飾導致修飾的多肽與不含有修飾-即未修飾的FVII多肽相比對于TFPI的抗性增加。
[0027]上述任何修飾的FVII多肽，包括呈現(xiàn)出對于TFPI抗性增加或者磷脂結(jié)合力增強或者這些性質(zhì)的任意組合的多肽，可另外含有其它修飾，包括本領域所述的任何修飾。這種進ー步的氨基酸修飾可增加對抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性，增加與磷脂的結(jié)合和/或親和性，增加對于組織因子(TF)的親和性，增強內(nèi)在活性，改變多肽的構(gòu)象以改變酶原性，包括使構(gòu)象改變?yōu)楦呙冈瓨有螤罨蛘吒痪邆涿冈瓨有螤睿瑝埣拥鞍酌缚剐?，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，提高穩(wěn)定性，和/或促進化學基團連接。例如，本發(fā)明提供的修飾的FVII多肽可含有在具有或包`含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Q176、M298或者E296位置或者FVII多肽中對應殘基中的修飾。在一些實例中，修飾的FVII多肽可另外含有選自Q176A、M298Q、E296V和/或E296A的的氨基酸修飾。在其它實例中，修飾的FVII多肽除了 Gla交換和/或其它指定的修飾之外，可另外含有一或多個如下進ー步的氨基酸修飾:S278C/V302C、L279C/N301C、V280C/V301C、S281C/V299C、在第 4 位的酪氨酸插入、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A341、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N1451、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、
【權(quán)利要求】
1.修飾的因子VII(FVII)多肽，其包含異源Y-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)構(gòu)域或者其實現(xiàn)磷脂結(jié)合的足夠部分，其中: 所述修飾的FVII多肽具有促凝血劑活性； 所述異源Gla結(jié)構(gòu)域選自因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨鈣素、基質(zhì)Gla蛋白、生長停滯特異性蛋白6(Gas6)和Z蛋白中的Gla結(jié)構(gòu)域；以及 所述足夠部分是來自所述異源Gla結(jié)構(gòu)域的30個或更多個連續(xù)氨基酸，由此與具有天然Gla結(jié)構(gòu)域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂結(jié)合被改變。
2.修飾的FVII多肽，其包含異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其實現(xiàn)磷脂結(jié)合的足夠部分，其中: 所述異源Gla結(jié)構(gòu)域選自因子IX (FIX)、因子X (FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨鈣素、基質(zhì)Gla蛋白、生長停滯特異性蛋白6 (Gas6)和Z蛋白中的Gla結(jié)構(gòu)域； 所述修飾的FVII多肽具有促凝血劑活性； 所述足夠部分是來自所述異源Gla結(jié)構(gòu)域的30個或更多個連續(xù)氨基酸，由此與具有天然Gla結(jié)構(gòu)域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂結(jié)合被改變；以及 所述修飾的FVII多肽包含一或多個進ー步的氨基酸修飾，其中所述修飾選自:增加對抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性、增強對磷脂的結(jié)合和/或親和性、増加對組織因子(TF)的親和性、増加內(nèi)在活性、増加TF依賴性催化或者凝血活性、増加凝血活性、改變多肽構(gòu)象以改變酶原性、通過改變高活性與低活性FVIIa構(gòu)象之間的平衡使之有利于高活性構(gòu)象而增加催化或凝血活性、增加對蛋白酶的抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加穩(wěn)定性、和/或促進化學基團連接的插入、缺失和取代。
3.權(quán)利要求1的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO: 110-118、120和121任一項所示的氨基酸序列，或者其實現(xiàn)磷脂結(jié)合的足夠部分。
4.權(quán)利要求2的修飾的FVII多肽，其中所述異源Gla結(jié)構(gòu)域具有SEQID NO: 110-118、120和121任一項所示的氨基酸序列，或者其實現(xiàn)磷脂結(jié)合的足夠部分。
5.權(quán)利要求2的修飾的FVII多肽，其包含選自GlaSwap FIX,Gla Swap FX,Gla SwapProt C、Gla Swap Prot S、PGla Swap 凝血酶的修飾。
6.權(quán)利要求1的修飾的FVII多肽，其包含位于如下位置處的ー或多個進ー步的氨基酸修飾，所述位置選自具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的對應殘基。
7.權(quán)利要求2的修飾的FVII多肽，其中: 修飾的FVII多肽含有進ー步的修飾，與未修飾的FVII多肽相比表現(xiàn)出對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抗性增強。
8.權(quán)利要求7的修飾的FVII多肽，其中所述進ー步修飾是位于如下位置處的ー或多個氨基酸修飾，所述位置選自具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的對應殘基。
9.權(quán)利要求8的修飾的FVII多肽，其中所述ー或多個氨基酸修飾選自對應于如下的置換:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、 G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和 K197I198insS。
10.權(quán)利要求9的修飾的FVII多肽，其中所述ー或多個氨基酸修飾選自對應于如下的置換:D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E 和 D196R/K197M/K199E/R290E。
11.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-10任ー項的修飾的FVII多肽的核苷酸序列。
12.載體，其包含權(quán)利要求11的核酸分子。
13.權(quán)利要求12的載體,其中所述載體是原核載體、病毒載體或者真核載體。
14.權(quán)利要求12或13的載體，其是哺乳動物載體。
15.權(quán)利要求13的載體，其中所述載體是選自腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨細胞病毒載體的病毒載體。
16.分離的細胞或培養(yǎng)的細 胞，其包含權(quán)利要求12-15任一項的載體或者權(quán)利要求11的核酸分子。
17.細胞，其包含權(quán)利要求12-15任一項的載體或者權(quán)利要求11的核酸分子，其中所述細胞是真核細胞。
18.權(quán)利要求17的細胞，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
19.權(quán)利要求18的細胞，其中所述哺乳動物細胞選自幼倉鼠腎細胞(BHK-21)、293細胞和CHO細胞。
20.權(quán)利要求17的細胞，其是酵母細胞。
21.權(quán)利要求20的細胞，其是畢赤酵母(Pichiasp.)細胞。
22.權(quán)利要求21的細胞，其是巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞。
23.藥物組合物，其在藥物可接受的載體中包含治療有效濃度或量的權(quán)利要求1-10任ー項的修飾的FVII多肽，或者權(quán)利要求11的核酸分子，或者權(quán)利要求12-15任一項的載體，或者權(quán)利要求17-20任ー項的細胞。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其被配制為用于局部、系統(tǒng)或者局域給予。
25.權(quán)利要求23或24的藥物組合物，其被配制為用于ロ服、經(jīng)鼻、肺、頰、透皮、皮下、十二指腸內(nèi)、腸道、胃腸外、靜脈內(nèi)或者肌內(nèi)給予。
26.權(quán)利要求23-25任一項的藥物組合物，其被配制為用于控制釋放。
27.權(quán)利要求23-25任一項的藥物組合物，其被配制為用于單ー劑量給予。
28.權(quán)利要求1-10任ー項的修飾的FVII多肽，用于治療選自如下的疾病或病癥:血液凝固病癥、血液病、出血性病癥、血友病、因子VII缺陷、出血病癥、手術出血或者外傷導致的出血。
29.權(quán)利要求23-27任一項的藥物組合物在制備治療疾病或病癥的藥物中的應用，所述疾病或病癥選自:血液凝固病癥、血液病、出血性病癥、血友病、因子VII缺陷、出血病癥、手術出血或者外傷導致的出血。
30.權(quán)利要求28的修飾的FVII多肽，其中所述疾病或病癥是是血友病A、血友病B或者血友病C。
31.權(quán)利要求28的修飾的FVII多肽，其中所述疾病或病癥是先天性或獲得性血友病。
32.權(quán)利要求28的修飾的FVII多肽，其中所述疾病或病癥是由于手術或外傷所致的出血并發(fā)癥所導致。
33.權(quán)利要求32的修飾的FVII多肽，其中出血表現(xiàn)為急性關節(jié)積血、慢性血友病性關節(jié)病、血腫、血尿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、胃腸道出血，或者腦出血。
34.權(quán)利要求32的修飾的FVII多肽，其中手術是心臟手術、血管成形術、肺手術、腹部手術、脊椎手術、腦手術、血管手術、口腔手術，或者器官移植術。
35.權(quán)利要求34的修飾的FVII多肽，其中手術是選自骨髓、心、肺、胰腺和肝的移植木。
36.修飾的因子VII(FVII)多肽，所述修飾的因子VII(FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因和種變體或者其活性片段中包含修飾，其中 所述修飾是在對應于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197和K199的一或多個位置或在FVII多肽的對應殘基的氨基酸置換；以及 所述修飾對應于選自如下的置換:D196F、D196W、D196L、D1961、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D 和 K199E,由此 所述修飾的FVII多肽與未修飾的FVII多肽相比表現(xiàn)出對組織因子途徑抑制劑(TFPI)的抗性增強、對ATIII 抑制的抗性增強和/或凝血活性增強。
37.權(quán)利要求36的修飾的FVII多肽，其中FVII多肽中的修飾對應于選自K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199D 和 K199E 的置換。
38.權(quán)利要求36的修飾的FVII多肽，其中FVII多肽中的修飾對應于用Y置換197位的氨基酸。
39.權(quán)利要求36的修飾的FVII多肽，其進ー步包含在FVII多肽中另一位置的進ー步修飾。
40.權(quán)利要求39的修飾的FVII多肽，其中所述進ー步修飾是氨基酸置換、插入或者缺失。
41.權(quán)利要求39的修飾的FVII多肽，其中所述進ー步修飾是氨基酸置換或者插入，所述氨基酸置換或插入的位置對應于選自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置，其中第一個修飾與第二個修飾在不同氨基酸。
42.權(quán)利要求39的修飾的FVII多肽，其中所述進ー步氨基酸修飾選自對應于如下的置換:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和 K341Q。
43.權(quán)利要求41的修飾的FVII多肽，其中所述進ー步修飾是選自如下的氨基酸插入:G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA 和 K197I198insS。
44.權(quán)利要求42的修飾的FVII多肽，其包含選自對應于如下置換的修飾:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q 和 K197E/K199E/K341Q。
45.權(quán)利要求36的修飾的因子VII(FVII)多肽，所述修飾的因子VII (FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因或種變體或者其活性片段中包含兩或多個修飾，其中: 所述兩或多個氨基酸修飾選自對應于具有SEQ ID N0:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的兩或多個如下氨基酸修飾或者在FVII多肽的對應殘基中的氨基酸修飾:D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D1961、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G2371、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、 D196K197insK、 D196K197insR、 D196K197insY、 D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K1971198insE、K1971198insY、K197I198insA 或K197I198insS ； 至少ー個修飾選自 D196F、D196W、D196L、D1961、K197E、K197D、K197L、K197M、K1971、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D和K199E，并且第二個修飾與第一個修飾不同。
46.權(quán)利要求45的修飾的FVII多肽，其中所述FVII多肽含有2、3、4、5、6或7個修飾。
47.權(quán)利要求45的 修飾的FVII多肽，其包含選自如下的修飾:D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q 和K197E/G237V/M298Q。
48.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其與未修飾的FVII多肽相比表現(xiàn)出組織因子途徑抑制劑(TFPI)抗性增加。
49.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其進ー步包含異源Gla結(jié)構(gòu)域或者其實現(xiàn)磷脂結(jié)合的足夠部分。
50.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其包含一或多個進ー步的氨基酸修飾，該修飾増加對抗凝血酶-1II (AT-1II)的抗性、增強磷脂結(jié)合力和/或親和性、増加組織因子(TF)親和性、増加內(nèi)在活性、増加TF依賴性催化或者凝血活性、増加凝血活性、改變多肽構(gòu)象以改變酶原性、通過改變高活性與低活性FVIIa構(gòu)象之間的平衡使之有利于高活性構(gòu)象而增加催化或凝血活性、増加蛋白酶抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、増加穩(wěn)定性，和/或促進化學基團連接。
51.權(quán)利要求36的修飾的FVII多肽，其包含在具有SEQID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的Q176、M298或E296位置或者在FVII多肽的對應殘基中的一或多個進ー步修飾。
52.權(quán)利要求51的修飾的FVII多肽，其中所述氨基酸修飾選自Q176A、M298Q、E296V和 E296A。
53.權(quán)利要求52的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的氨基酸修飾:K197E/G237V/M298Q、K197E/G237V/M298Q/K341Q、K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q、和 K197E/M298Q。
54.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其包含選自如下的一或多個進ー步
55.權(quán)利要求54的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽具有SEQID NO:3所示氨基酸序列。
56.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其中未修飾的FVII多肽具有SEQIDNO:3所示氨基酸序列。
57.權(quán)利要求36-56任ー項的修飾的FVII多肽，其具有SEQID NO:225_230、232、233、235、242-244和250任一項所示氨基酸序列。
58.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是人多肽。
59.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是非人多肽。
60.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是活性或者成熟多肽。
61.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其中僅ー級序列被修飾。
62.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其進ー步包含化學修飾或者翻譯后修飾。
63.權(quán)利要求62的修飾的FVII多肽，其中FVII多肽被糖基化、羧化、羥化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化，或者與聚こニ醇(PEG)部分綴合。
64.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是單鏈多肽。
65.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是雙鏈多肽。
66.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其是活化的多肽。
67.權(quán)利要求66的修飾的FVII多肽，其中活化通過自身激活蛋白酶解、因子IX(FIXa)裂解、因子X(FXa)裂解、因子XII (FXIIa)裂解或者凝血酶裂解實現(xiàn)。
68.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其保留未修飾的FVII多肽的ー或多種活性。
69.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60個氨基酸位置的修飾，條件是所述多肽保留未修飾的FVII多肽的至少ー種FVII活性， 其中所述ー或多種活性選自組織因子(TF)結(jié)合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂結(jié)合力以及凝血活性。
70.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽的核苷酸序列。
71.載體,其包含權(quán)利要求70的核酸分子。
72.權(quán)利要求71的載體,其中所述載體是原核載體、病毒載體或者真核載體。
73.權(quán)利要求71的載體，其中所述載體是哺乳動物載體。
74.權(quán)利要求71的載體，其中所述載體是選自腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨細胞病毒的病毒載體。
75.分離的細胞或細胞培養(yǎng)物，其包含權(quán)利要求71的載體。
76.權(quán)利要求75的細胞或細胞培養(yǎng)物，其是真核細胞。
77.權(quán)利要求76的細胞或細胞培養(yǎng)物，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
78.權(quán)利要求77的細 胞或細胞培養(yǎng)物，其中所述哺乳動物細胞選自幼倉鼠腎細胞(BHK-21)或者293細胞或者CHO細胞。
79.細胞，其包含權(quán)利要求71的載體，其中所述細胞是酵母細胞。
80.權(quán)利要求79的細胞，其是畢赤酵母(Pichiasp.)細胞。
81.權(quán)利要求79的細胞,其是巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)細胞。
82.藥物組合物，其包含治療有效濃度或量的權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽。
83.權(quán)利要求82的藥物組合物，其被配制為經(jīng)局部、系統(tǒng)或者局域(topical)給予的形式。
84.權(quán)利要求82的藥物組合物，其被配制為經(jīng)ロ服、經(jīng)鼻、肺、頰、透皮、皮下、十二指腸內(nèi)、腸道、胃腸外、靜脈內(nèi)或者肌內(nèi)給予的形式。
85.權(quán)利要求82的藥物組合物，其被配制為控制釋放形式。
86.權(quán)利要求82的藥物組合物，其被配制為單ー劑量給予形式。
87.權(quán)利要求36-47任ー項的修飾的FVII多肽，用于治療通過給予FVII或者促凝劑治療的疾病或病癥。
88.權(quán)利要求82的藥物組合物在制備治療通過給予FVII或者促凝劑治療的疾病或病癥的藥物中的應用，其中要治療的疾病或病癥選自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病、血友病、因子VII缺陷、出血疾病、手術出血或者外傷導致的出血。
89.權(quán)利要求87的修飾的FVII多肽，其中被治療的疾病或病癥選自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病(hemorrhagic disorder)、血友病、因子VII缺陷、出血疾病(bleedingdisorder)、手術出血或者外傷導致的出血。
90.權(quán)利要求89的修飾的FVII多肽，其中所述疾病是血友病A或者血友病B或者血友病Co
91.權(quán)利要求89的修飾的FVII多肽，其中所述疾病是先天性或獲得性血友病。
92.權(quán)利要求89的修飾的FVII多肽，其中所述疾病或病癥是由于手術或外傷所致出血并發(fā)癥導致。
93.權(quán)利要求92的修飾的FVII多肽，其中出血是急性關節(jié)積血、慢性血友病性關節(jié)病、血腫、血尿、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、胃腸道出血，或者腦出血。
94.權(quán)利要求92的修飾的FVII多肽，其中手術是心臟手術、血管成形術、肺手術、腹部手術、脊椎手術、腦手術、血管手術、口腔手術，或者器官移植術。
95.權(quán)利要求94的修飾的FVII多肽，其中所述手術是選自骨髄、心、肺、胰腺和肝的移植術的器官移 植手術。
【文檔編號】C12N15/81GK103451172SQ201310367450
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2008年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2007年4月13日
【發(fā)明者】E·L·麥迪遜, C·D·薩諾斯, S·W·拉格爾斯, S·庫格林 申請人:催化劑生物科學公司