專(zhuān)利名稱(chēng)：因子ix多肽及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及用于止血障礙的治療劑的領(lǐng)域。背景領(lǐng)域B型血友病(也稱(chēng)為克雷司馬斯病)是世界上最常見(jiàn)的遺傳性出血性障礙之一。其導(dǎo)致降低的體內(nèi)和體外凝血活性并且需要對(duì)患病個(gè)體終身進(jìn)行醫(yī)療監(jiān)控。在干預(yù)不存的情況下，患病個(gè)體遭受關(guān)節(jié)的自發(fā)性出血，這產(chǎn)生嚴(yán)重的疼痛并且使人虛弱不動(dòng)；出血至肌內(nèi)導(dǎo)致血液在此類(lèi)組織的積累；咽喉和頸內(nèi)的自發(fā)性出血，如果未及時(shí)治療，可引起窒息；腎出血；和；和術(shù)后、小的意外損傷后或拔牙后的重度出血也是非常普遍的。正常體內(nèi)血液凝固最少需要絲氨酸蛋白酶因子II (凝血酶原)、VI1、IX、X和XI (可溶性血漿蛋白質(zhì))；輔因子，包括跨膜蛋白組織因子和血漿蛋白因子V和VIII ;血纖蛋白原、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶因子X(jué)II1、磷脂(包括活化的血小板)和鈣。包括激肽釋放酶、高分子量激肽原和因子X(jué)II在內(nèi)的另外蛋白質(zhì)是一些體外凝固測(cè)試所需要的，并且可在病理狀態(tài)下在體內(nèi)起作用。在血友病中，凝血因某些血漿凝血因子的不存在而受到妨礙。B型血友病由可由因子IX的缺乏(可因因子IX蛋白的減少的合成或具有降低的活性的缺陷分子而導(dǎo)致)引起。血友病的治療通過(guò)利用高度富集 因子IX的外源因子濃縮物替代缺少的凝血因子來(lái)進(jìn)行。然而，從血液產(chǎn)生這樣的濃縮物充滿(mǎn)技術(shù)困難，如在下文描述的。因子IX從血漿(血漿源性因子IX ；pdFIX)的純化幾乎僅產(chǎn)生活性因子IX。然而，從血漿純化這樣的因子IX是非常困難的，因?yàn)橐蜃覫X僅以低濃度存在于血漿中(5ug/mL)。Andersson, Thrombosis Research7:451459 (1975)。此外，從血液的純化需要除去或滅活傳染原例如HIV和HCV。此外，pdFIX具有短半衰期，從而需要頻繁給藥。重組因子IX(rFIX)也是可獲得的，但遭受相同的短半衰期困擾，需要如PdFIX —樣頻繁給藥(例如，2-3次/周，用于預(yù)防)。rFIX還具有與pdFIX相比較更低的增量恢復(fù)(incremental recovery) (K值)，這使得必需使用比對(duì)于PdFIX所使用的劑量更高的劑量的rFIX。減少的死亡率、關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防以及改善的生活質(zhì)量是歸因于血漿源性因子IX和重組因子IX的發(fā)展的重要成就。延長(zhǎng)的免受出血的保護(hù)作用代表了治療B型血友病患者的另一個(gè)關(guān)鍵成就。然而，迄今為止，未曾開(kāi)發(fā)出允許延長(zhǎng)的保護(hù)作用的產(chǎn)品。因此，仍然存在對(duì)治療因因子IX缺乏而引起的血友病的改進(jìn)方法的需要，所述改進(jìn)方法比目前的療法更具耐受性和更有效。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了用于使用包含因子IX的嵌合多肽和此類(lèi)嵌合多肽的雜合體(hybrid)施用因子IX的方法；包含因子IX的嵌合多肽和此類(lèi)嵌合多肽的雜合體；編碼此類(lèi)嵌合和雜合多肽的多核苷酸；包含此類(lèi)多核苷酸的細(xì)胞；和使用此類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生此類(lèi)嵌合和雜合多肽的方法。在一些實(shí)施方案中，因子IX嵌合多肽為因子IX FcRn結(jié)合伴侶(BP)嵌合多肽，例如因子IX Fe嵌合多肽。在其它實(shí)施方案中，因子IX嵌合多肽為因子IX-XTEN多肽。本發(fā)明提供了將因子IX施用給需要其的受試者的方法，包括以約每周一次或更長(zhǎng)的給藥間隔給受試者施用至少約10、至少約20或至少約25IU/kg的劑量的因子IX FcRnBP嵌合多肽，例如因子IX-Fc嵌合多肽或因子IX-XTEN嵌合多肽。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽的血漿水平在至少約6天后在至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的患者群體中達(dá)到至少約lIU/dl的平均波谷(average trough)或在至少約6天后在受試者中達(dá)到至少約1、2、3、4或5IU/dl的波谷。在一些實(shí)施方案中，所述嵌合多肽的血漿水平達(dá)到約1-5或l-3IU/dl的平均波谷。這樣的波谷或平均波谷可在約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約
20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約
34、約35、約36、約37、約38、約39或約40天后達(dá)到。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽與血漿源性因子IX相比較具有大幅減少的磷酸化和硫酸化。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽少于25%被磷酸化并且少于25%被硫酸化，例如，少于25%被完全磷酸化和硫酸化。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽少于約10%被磷酸化并且少于約9%被磷酸化。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽具有與實(shí)施例5-6中因子IX Fe嵌合多肽相似(即，在10%以?xún)?nèi))或相同的Y羧基化模式/分布、Y羧基化含量、唾液酸化模式/分布和/或唾液酸化含量。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽具有大于0.7或大于0.75ug/ml (抗原)的增量恢復(fù)(incremental recovery)。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽具有至少約0.8、至少約0.9或至少約lIU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀(guān)察值)。在一些實(shí)施方案 中，嵌合多肽顯示所述患者群體或所述受試者的一個(gè)或多個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其選自:(a)約3.36 土 0.93mL/hr/kg的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)；約
3.0-3.72,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6,3.7 或 3.72mL/hr/kg 的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)；比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的清除率低約2.5倍的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)；約1.84-4.58mL/hr/kg的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)；(b)至少約68.05±11.16小時(shí)的所述患者群體的平均平均停留時(shí)間(MRT)(活性);約60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小時(shí)的所述患者群體的平均MRT(活性);為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均MRT的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均MRT (活性)；約53.1-85.8小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性)；至少約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85或約90小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性)；(c)約52.5±9.2小時(shí)的所述患者群體的平均t1/20 (活性)；為約47-60小時(shí)、約
47、約48、約49、約50、約51平均t1/20 (活性)、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約
58、約59、約60小時(shí)的所述患者群體；為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均t1/2e的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均t1/20 (活性)；約40-67.4、約40、約45、約50、約
55、約60、約65、約70或約75小時(shí)的所述受試者的1/20 (活性)；(d)約0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值);約 0.85-1.0、約 0.85、約 0.86、約 0.87、約 0.88、約 0.89、約 0.90、約 0.91、約0.92、約 0.93、約 0.94、約 0.95、約 0.96、約 0.97、約 0.98、約 0.99、約 1.0、約 1.05、約 1.10
或約1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)；比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均增量恢復(fù)高約24%的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)；約0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受試者的增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值);(e)約226±67.76 (校正至69.8)mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性);約200-300、約 200、約 210、約 220、約 230、約 240、約 250、約 260、約 270、約 280、約 290 或約300mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性)；約145_365mL/kg的所述受試者的Vss (活性)；(f)約32.44土 10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)；約26-40、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39或約40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)；約
21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受試者的AUC/劑量。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽的劑量包含比目前市售的因子IX產(chǎn)品例如M0N0NINE (pdFIX ；CSL Behring))或 BENEFIX (Wyeth ；rFIX) (0.1%)顯著更低(低 10-100倍)的水平(0.01-0.001%)的激活的FIX(FIXa)。這樣的水平可以比目前市售的產(chǎn)品低
10、20、30、40、50、60、70、80、90 或 100 倍，或者為目前市售的產(chǎn)品的 0.01%,0.05%,0.0033%、0.0025%,0.002%,0.00167%,0.00142%,0.00125%,0.00111% 或 0.001%。在一些實(shí)施方案中，給藥間隔為6-18、6-10、9_18、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18天、每周I次、每月2次或每月I次。給藥間隔可以預(yù)防性給藥間隔、固定的預(yù)防性給藥間隔或個(gè)體化化預(yù)防性給藥間隔。對(duì)需要控制或預(yù)防出血或出血事件、需要間歇治療、需要預(yù)防性治療或需要按需治療的受試者實(shí)施本發(fā)明的方法?？捎糜诒景l(fā)明的方法的治療性劑量為約25-180、約20-180、約20-50、約20-100、約10-180、約10-50、約10-30或約50-100IU/kg。劑量可以是固定劑量或個(gè)體化劑量。在一些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)或皮下施用嵌合多肽。本發(fā)明的方法的受試者可以為人受試者或可以為非人哺乳動(dòng)物。非人哺乳動(dòng)物包括小鼠、狗、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、猴、貓、馬、牛、豬和其它家養(yǎng)動(dòng)物和小動(dòng)物。嵌合多肽可以以包含與所述嵌合多肽締合的第二多肽的雜合體，其中所述第二多肽包含F(xiàn)cRn BP例如Fe或基本上由其組成。嵌合多肽可與表2A(SEQ ID N0:2)和/或2B(SEQ ID NO:4)中的具有或不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX序列、Fe序列或因子IX和Fe序列兩者具有至少90%、 至少95%或100%的同一性?？蓪⑶逗隙嚯幕螂s合體作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的部分施用。本發(fā)明還提供了上述嵌合和雜合多肽本身、編碼它們的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培養(yǎng)的人胚胎細(xì)胞以及產(chǎn)生此類(lèi)嵌合和雜合多肽的方法以及此此類(lèi)方法產(chǎn)生的多肽。附圖簡(jiǎn)述


圖1.因子IX嵌合多肽的一種類(lèi)型，因子IX-Fc雜合體的示意圖。圖2.組平均FIXFc濃度對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)；標(biāo)稱(chēng)劑量比較。圖3.組平均FIXFc活性對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn):標(biāo)稱(chēng)劑量比較。圖4.基線(xiàn)扣除決策數(shù)(baseline subtraction decision tree)。圖5.FIX活性的Cmax和AUC的劑量比例增加。圖6.50 (A)和100⑶IU/kg的rFIXFc的估計(jì)的治療持續(xù)時(shí)間。圖7.FIX抗原的Cmax和AUC的劑量比例增加。圖8.50 (A)和100 (B) IU/kg標(biāo)稱(chēng)劑量的rFIXFc抗原的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估。圖9.rFIXFc活性與抗原水平之間的優(yōu)良關(guān)聯(lián)性。注意，歸因于活性PK的重新計(jì)算，如實(shí)施例11中論述的，R2=0.946。圖10.rFIX-Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和翻譯后修飾。PRO:通過(guò)加工酶切割的多肽。GLA:包含12個(gè)Y-羧基化谷氨酸(Gla)殘基。ACT PEP:經(jīng)切割以產(chǎn)生活性蛋白酶的激活肽。其它修飾:N-和0-糖基化，Asp (64) ^ -輕基化，Tyr硫酸化，Ser磷酸化。圖11.純化中間產(chǎn)物和純化的FIXFc單體的SDS-PAGE凝膠。通過(guò)非還原性SDS-PAGE分析來(lái)自FIXFc的純化的不同步驟的樣品。泳道I =SeeBlue+分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物(Molecular Weight Markers) (Invitrogen)。泳道 2:空泳道。泳道 3:蛋白 A 加載。泳道4:蛋白A洗脫物。泳道5:FraCt0gel DEAE洗脫物。泳道6:Q Seph FF洗脫物。泳道7:最終本體FIXFc.泳道8:空泳道。泳道9:最終本體減小的FIXFc。圖12.FIX-缺陷 型小鼠的FIXFc的功能活性。在時(shí)間=0時(shí)，利用219IU/kg FIXFc給FIX-缺陷型小鼠靜脈內(nèi)給藥(3或4只/組，6組，n=23)或200IU/kgrFIX (3或4只/組，5組，n=23)。在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)上(0.25小時(shí)至96小時(shí))收集血液樣品，使用FIX活性測(cè)定分析凝血活性。*rFIX活性在晚于給藥后48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)上在所有小鼠中都是不可檢測(cè)的。圖13.FIX-缺陷型小鼠的FIXFc對(duì)重組FIX的全血凝固時(shí)間。利用50IU/kgFIXFc或50IU/kgrFIX給FIX-缺陷型小鼠出只/組)靜脈內(nèi)給藥。在給藥之前和在給藥后不同時(shí)間上收集血液樣品。將血液樣品在37°C下溫育，每分鐘I次目測(cè)其血塊的存在。記錄血塊形成所需的時(shí)間，一旦凝血活性回復(fù)至基線(xiàn)(即無(wú)血塊形成)，不再獲取另外的樣品(對(duì)于FIXFc在15分鐘至144小時(shí)收集樣品，或?qū)τ趓FIX在15分鐘至72小時(shí)收集樣品)。圖14.FIX-缺陷型小鼠的FIXFc的藥代動(dòng)力學(xué)。在第0、4和8天給FIX-缺陷型小鼠施用 219IU/kg FIXFc (5 只 / 組，6 組，n=30)或 200IU/kgrFIX (4 或 5 只 / 組，6 組，n=28)。在每一次給藥后15分鐘和96小時(shí)通過(guò)心臟穿刺收集血漿樣品，并且使用FIX活性測(cè)定測(cè)量凝血活性。在每一次給藥后第8、24、48和72小時(shí)通過(guò)尾部放血(tail bleed)收集血漿。使用對(duì)于FIXFc是特異性的ELISA測(cè)量所有樣品的FIXFc水平。(A)測(cè)量的活性對(duì)計(jì)算的活性。在3次劑量后15分鐘和96小時(shí)使用FIX活性測(cè)定測(cè)量FIXFc的凝血活性。FIXFc的體外凝血活性被測(cè)定為43.8±5.4IU/mg。基于該活性(IU/mg)和測(cè)量的蛋白質(zhì)水平，測(cè)定每一次給藥后15分鐘、8、24、48、72和96小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)的計(jì)算的血漿凝血活性水平。(B)在利用最多3個(gè)劑量的200IU/kg rFIX處理的FIX-缺陷型小鼠中，使用FIX-特異性ELISA測(cè)量FIX水平。通過(guò)使用測(cè)量的FIXFc和rFIX的特異性活性，可能比較利用ELISA分析的所有樣品的計(jì)算的凝血活性。
圖15.FIX缺陷型狗的FIXFc的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)。給兩只患有B型血友病的狗靜脈內(nèi)輸注 140IU/kg FIXFc。在 5、15 和 30 分鐘和在 1、2、4、6、8、12、24、27、30、48、
51、54、72、80、96、126、144和168小時(shí)收集血液樣品。(A)將利用FIX捕獲抗體和Fc-HRP檢測(cè)抗體的夾心ELISA用于測(cè)量B型血友病狗的血漿樣品的完整FIXFc的濃度。(B)根據(jù)利用FIXFc產(chǎn)生的校準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)量所有時(shí)間點(diǎn)上的FIX凝血活性。(C)立即分析從動(dòng)物收集的血液的全血凝血時(shí)間。將血液樣品在28°C溫育，每分鐘I次目測(cè)其血塊的存在,記錄其中血塊形成的時(shí)間。圖16.食蟹猴的FIXFc的藥代動(dòng)力學(xué)。給猴子施用單次劑量(0.5、2和10mg/kg，相應(yīng)于約25、100或500IU/kg的)的FIXFc (分別地n=2、3和3)。在給藥后0.25,0.5、1、
8、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)收集血液樣品，并且制備血漿以用于通過(guò)FIXFc-特異性ELISA分析蛋白質(zhì)濃度。圖17.rFIXF和BENEFIX 顯示來(lái)自HemB小鼠的全血的可比較活性和劑量反應(yīng)。(A) ROTEM 參數(shù)。將rFIX或BENEFIX 摻入HemB小鼠血液，并且利用ROTEM 測(cè)量凝血參數(shù)。(B)-(D)劑量反應(yīng)，測(cè)量(B) CT、(C) CFT和(D) a-角。圖18.血友病小鼠的斷尾出血模型(tail clip bleeding model)的急性療效的評(píng)估。圖19.(A)利用rFIXFc或 BENEFIX 處理的個(gè)體HemB小鼠的斷尾后的失血。(B)在HemB小鼠的斷尾后中值失血的rFIXFc和BENEFIX 的劑量反應(yīng)。圖20.HemB小鼠的尾靜脈橫斷(TVT)出血模型:重度血友病患者的靜脈出血特征的模型。圖21.利用全血ROTEM :處理的HemB小鼠的rFIXFc相對(duì)于BENEFIX 的延長(zhǎng)的活性。(A)CT、(B)CFT、(C) a-角、和(D) ROTE\,1 產(chǎn)生的全血凝血活性(CT)對(duì)aPTT產(chǎn)生的血漿活性之間的部分關(guān)聯(lián)性。圖22.HemB小鼠的靜脈橫斷(TVT)出血模型的rFIXFc相對(duì)于BENEFIX 的延長(zhǎng)的療效。(A)存活率:接受BENEFIX 24小時(shí)TVT前體(pre TVT)的小鼠的存活率與接受rFIXFc72小時(shí)TVT前體的小鼠的相當(dāng)，和(B)再出血:接受BENEFIX 24小時(shí)TVT前體的小鼠的出血率與接受rFIXFc72小時(shí)TVT前體的小鼠的相當(dāng)。圖23.接受12.5至100IU/kg的rFIXFc的單次劑量的12個(gè)受試者的rFIXFc活性的增量恢復(fù)對(duì)體重的關(guān)聯(lián)性。圖24.使用rFIXFc活性的結(jié)構(gòu)PK模型構(gòu)建活性_時(shí)間曲線(xiàn)以在每周I次(A)、每10天I次(B)或每2周I次的給藥方案(C)后獲得高于基線(xiàn)lIU/dL的波谷的蒙特卡羅模擬。中值群體PK參數(shù)和相關(guān)受試者間和受試者內(nèi)差異性取自臨床l/2a期研究。每給藥方案模擬1000個(gè)受試者，每一個(gè)受試者采用14至16個(gè)采樣點(diǎn)，并且圖解地構(gòu)建不同給藥方案的1000個(gè)受試者的活性-時(shí)間曲線(xiàn)的平均值土SD。圖25.基于重新計(jì)算的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，rFIXFc劑量獲得lIU/dL(l%)的波谷的蒙特卡羅模擬。(A)每周I次，⑶每10天I次，和(C)每2周I次。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了利用因子IX使用比利用目前已知的因子IX產(chǎn)品可能獲得的更長(zhǎng)的給藥間隔和/或改善的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)治療因子IX缺陷例如B型血友病的方法。本發(fā)明還提供了改進(jìn)的因子IX嵌合多肽、因子IX嵌合多核苷酸和產(chǎn)生方法。如本文中所用，“施用”意指通過(guò)藥學(xué)上可接受的途徑給受試者提供本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的因子IX多肽。施用的優(yōu)選途徑為靜脈內(nèi)途徑，例如靜脈內(nèi)注射和靜脈內(nèi)輸注，例如通過(guò)中央靜脈進(jìn)入。其它施用途徑包括皮下、肌內(nèi)、口服、經(jīng)鼻和經(jīng)肺施用，優(yōu)選皮下施用。因子IX嵌合多肽和雜合蛋白質(zhì)可作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的部分來(lái)進(jìn)行施用。本發(fā)明的有利方面包括:改善的方案順從性；減少的穿透性出血(break throughbleed);增加的保護(hù)關(guān)節(jié)免受出血的作用；關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防；減少的發(fā)病率；減少的死亡率；延長(zhǎng)的保護(hù)免受出血的作用；減少的血栓形成事件；和改善的生活質(zhì)量。如本文中所用，“嵌合多肽”意指在其內(nèi)包含至少兩個(gè)來(lái)自不同來(lái)源的多肽(或其部分例如子序列或肽)的多肽。嵌合多肽可包括2、3、4、5、6、7或更多個(gè)來(lái)自不同來(lái)源(例如不同基因、不同cDNA或不同動(dòng)物或其它物種)的多肽或其部分。嵌合多肽可包括一個(gè)或多個(gè)連接不同多肽或其部分的接頭。因此，多肽或其部分可被直接連接，或它們可通過(guò)接頭間接連接或通過(guò)兩者連接在單個(gè)嵌合多肽內(nèi)。嵌合多肽可包括幫助蛋白質(zhì)純化或檢測(cè)的另外的肽例如信號(hào)序列和序列例如6His和FLAG。此外，嵌合多肽可具有至N和/或C末端的氨基酸或肽添加。本發(fā)明的示例性嵌合多肽為因子IX-FcRn BP嵌合多肽，例如因子IX-Fc嵌合多肽，例如圖1 (SEQ ID N0:2(表2))和實(shí)施例1_4中的具有或不具有其信號(hào)序列或前肽的FIXFc。本發(fā)明的另一個(gè)示例性嵌合多肽包括但不限于因子IX-XTEN嵌合多肽?？蓪⒁蜃覫X融合至XTEN的N末端或C末端。嵌合多肽可包含序列，所述序列與因子IX和FcRn BP，例如表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽序列的Fe氨基酸序列(SEQ ID NO: 2的氨基酸I至642)，或可選擇地具有前肽序列，或可選擇地具有信號(hào)序列和前肽序列的Fe氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性。如本文中所用，“培養(yǎng)”、“為培養(yǎng)”和“培育(culturing) ”意指在體外條件下溫育細(xì)胞，所述體外條件允許細(xì)胞生 長(zhǎng)或分裂或維持細(xì)胞的存活狀態(tài)。如本文所用，“培養(yǎng)的細(xì)胞”意指在體外增殖的細(xì)胞。如本文中所用，“因子IX”和“FIX”，除非另外指出，否則意指在凝血中具有其正常作用的功能性因子IX多肽。因此，術(shù)語(yǔ)因子IX包括具有功能的變體多肽(variantpolypeptide)和編碼此類(lèi)功能性變體多肽的多核苷酸。優(yōu)選因子IX多肽為人、?？苿?dòng)物、豬科動(dòng)物、科動(dòng)物犬、貓科動(dòng)物和鼠科動(dòng)物因子IX多肽。因子IX的全長(zhǎng)多肽和多核苷酸序列是已知的，同樣地許多功能變體例如片段、突變體和修飾形式的全長(zhǎng)序列和多核苷酸序列也是知的。因子IX多肽包括全長(zhǎng)因子IX、在N末端除去Met的全長(zhǎng)因子IX、除去信號(hào)序列的全長(zhǎng)因子IX、成熟因子IX(除去信號(hào)序列和前肽)和在N末端具有額外Me的成熟因子IX。因子IX優(yōu)選通過(guò)重組方法(“重組因子IX”或“rFIX”)制備，即其不是天然存在的或來(lái)源于血漿。許多功能性因子IX變體是已知的。國(guó)際公布號(hào)W002/040544A3(將其通過(guò)引用整體并入本文)在第4頁(yè)第9-30行和第15頁(yè)第6-31行公開(kāi)了顯示增加的對(duì)肝素導(dǎo)致的抑制的抗性的突變體。國(guó)際公布號(hào)W003/020764A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)在表2和3(在第14-24行)和在第12頁(yè)第1-27行公開(kāi)了具有減少的T細(xì)胞免疫原性的因子IX突變體。國(guó)際公布號(hào)W02007/149406A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)在第4頁(yè)第I行至第19頁(yè)第11行公開(kāi)了顯示增加的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、增加的體內(nèi)和體外半衰期以及增加的對(duì)蛋白酶的抗性的功能性突變型因子IX分子。W02007/149406A2還在第19頁(yè)第12行至第20頁(yè)第9行公開(kāi)了嵌合和其它變體因子IX分子。國(guó)際公布號(hào)W008/118507A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)在第5頁(yè)第14行至第6頁(yè)第5行公開(kāi)了顯示增加的凝血活性的因子IX突變體。國(guó)際公布號(hào)W009/051717A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)在第9頁(yè)第11行至第20頁(yè)第2行公開(kāi)了具有增加的N聯(lián)接的和/或O聯(lián)接的糖基化位點(diǎn)的數(shù)目的因子IX突變體，所述增加的糖基化位點(diǎn)導(dǎo)致增加的半衰期和/或回收率。國(guó)際公布號(hào)W009/137254A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)還在第2頁(yè)段落
至第5頁(yè)段落
和第16頁(yè)段落
至第24頁(yè)段落
公開(kāi)了具有增加的糖基化位點(diǎn)數(shù)目的因子IX突變體。國(guó)際公布號(hào)W009/130198A2 (將其通過(guò)引用整體并入本文)在第4頁(yè)第26行至第12頁(yè)第6行公開(kāi)了具有增加的糖基化位點(diǎn)的功能性突變型因子IX分子，所述增加的糖基化位點(diǎn)導(dǎo)致增加的半衰期。國(guó)際公布號(hào)W009/140015A2(將其通過(guò)引用整體并入本文)在第11頁(yè)段落
至第13頁(yè)段落
公開(kāi)了具有增加的Cys殘基的數(shù)目的功能性因子IX突變體，所述Cys殘基可用于聚合物(例如，PEG)綴合。此外，已在血友病患者中鑒定了因子IX的數(shù)百個(gè)非功能性突變，許多所述突變公開(kāi)于國(guó)際公布號(hào)W009/137254A2(將其通過(guò)引用并入本文)的第11_14頁(yè)的表I中。此類(lèi)非功能性突變不包括在本發(fā)明中，但提供了另外的指導(dǎo)，根據(jù)所述指導(dǎo)突變或多或少可能導(dǎo)致功能性因子IX多肽。因子IX (或嵌合多肽的因子IX部分)可與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽序列的因子IX氨基酸序列(SEQ ID N0:2的氨基酸I至415)或可選擇地，具有前肽序列或具有前肽和信號(hào)序列(全長(zhǎng)因子IX)的因子IX氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性。因子IX促凝劑活性表 示為國(guó)際單位(IU)。一個(gè)IU的因子IX活性大致相應(yīng)于一毫升正常人血漿中的因子IX的量。用于測(cè)量因子IX活性的幾個(gè)測(cè)定是可獲得的，包括一期凝血測(cè)定(one stage clotting assay)(激活的部分促凝血酶原時(shí)間；aPTT)、凝血酶生成時(shí)間(TGA)和旋轉(zhuǎn)血栓彈力圖(rotational thromboelastometry) (ROTEVTr')。參見(jiàn)，例如實(shí)施例3。如本文中所用，“FcRn結(jié)合伴侶”或“FcRn BP”除非另外明確地指出，否則意指功能性新生兒Fe受體(FcRn)結(jié)合伴侶。FcRn結(jié)合伴侶是可被FcRn受體特異性結(jié)合,隨后被FcRn結(jié)合伴侶的FcRn受體主動(dòng)運(yùn)輸?shù)娜魏畏肿?。因此，術(shù)語(yǔ)FcRn BP包括具有功能性的IgG Fe的任何變體。例如，已基于X射線(xiàn)晶體學(xué)(Burmeister等人1994，Nature372:379，通過(guò)引用整體并入本文)描述了結(jié)合FcRn受體的IgG的Fe部分的區(qū)域。Fe與FcRn的主要接觸區(qū)域位于CH2與CH3結(jié)構(gòu)域的接合處附近。Fc-FcRn接觸全部在單個(gè)Ig重鏈內(nèi)。FcRnBP包括完整的IgG、IgG的Fe片段和IgG的包括FcRn的完整結(jié)合區(qū)域的其它片段。主要接觸位點(diǎn)包括CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314以及CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428和433-436。參考免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區(qū)域的氨基酸編號(hào)，其全都基于Kabat等人1991，免疫學(xué)目標(biāo)蛋白質(zhì)序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest),美國(guó)公共衛(wèi)生部(U.S.Department of PublicHealth, Bethesda) ;MD (將其通過(guò)引用整體并入本文)。(已從幾種哺乳動(dòng)物物種包括人分離了 FcRn受體。人FcRn、大鼠FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Story等人1994，J.Exp.Med.180:2377),通過(guò)引用整體并入本文)。FcRn BP可包括具有或不具有免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)的免疫球蛋白的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。示例性FcRn BP變體提供于W02004/101740和TO2006/074199 (將其通過(guò)引用整體并入本文)中。FcRn BP還包括白蛋白及其結(jié)合FcRn的片段。優(yōu)選地，白蛋白為人白蛋白。因子IX可融合至白蛋白的N末端或白蛋白的C末端，只要因子IX-白蛋白融合蛋白的因子IX組分可被具有酶促活性的前蛋白轉(zhuǎn)化酶加工以產(chǎn)生包含加工的因子IX的多肽即可?？捎糜诒景l(fā)明的白蛋白的實(shí)例例如其片段是已知的。例如，美國(guó)專(zhuān)利N0.7，592，010 ;美國(guó)專(zhuān)利N0.6，686，179 ;和 Schulte, Thrombosis Res.124 副刊 2: S6-S8 (2009)，將所述專(zhuān)利和文獻(xiàn)的每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文。FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)可包含一個(gè)或多個(gè)突變以及突變的組合。FcRn BP(或嵌合多肽的FcRn BP部分)可包含賦予增加的半衰期的突變體，例如 M252Y、S254T、T256E 及其組合，如 Oganesyan 等人，Mol.1mmunol.46:1750 (2009)(將其通過(guò)引用整體并入本文)中所公開(kāi)的；H433K、N434F及其組合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23:1283 (2005)(將其通過(guò)引用整體并入本文)中所公開(kāi)的；U.S.2009/0264627 A1 (將其通過(guò)引用整體并入本文)的第1_2頁(yè)段落
以及實(shí)施例9和10中公開(kāi)的突變體；和U.S.20090163699A1 (將其通過(guò)引用整體并入本文)的第2頁(yè)段落
至
中公開(kāi)的突變體。FcRn BP (或嵌合多肽的FcRn BP部分)還可包括下列突變:可按照公認(rèn)的方法例如定向誘變等修飾IgG的Fe區(qū)域以產(chǎn)生可被FcRn結(jié)合的修飾IgG或其Fe片段或部分。此類(lèi)修飾包括遠(yuǎn)離FcRn接觸位點(diǎn)的修飾以及在接觸位點(diǎn)內(nèi)的保持或甚至增強(qiáng)對(duì)FcRn的結(jié)合的修飾。例如，可置換人IgGlFc(Fcyl)的下列單個(gè)氨基酸殘基而無(wú)Fe對(duì)于FcRn的結(jié)合親和力的顯著丟失:P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A 和 K447A，其中例如 P238A 代表在位置編號(hào)238上野生型脯氨酸被丙氨酸置換。除了丙氨酸外，其它氨基酸也可置換上述位置上的野生型氨基酸?？蓪⑼蛔儐蝹€(gè)地引入Fe，從而產(chǎn)生超過(guò)100種與天然Fe不同的FcRn結(jié)合伴侶。此外，此類(lèi)單個(gè)突變的2、3或更多個(gè)的組合可被一起引入，從而產(chǎn)生超過(guò)數(shù)百種FcRn結(jié)合伴侶。此類(lèi)突變中的某些可賦予FcRn結(jié)合伴侶新的功能性。例如，一個(gè)實(shí)施方案包括N297A，除去了高度保守的N糖基化位點(diǎn)。該突變的作用是減小免疫原性，從而增強(qiáng)FcRn結(jié)合伴侶的循環(huán)半衰期，并且使得FcRn結(jié)合伴侶不能結(jié)合FcyR1、FCyRIIA、FCyRIIB和FcyRIIIA,但不削弱對(duì)于 FcRn 的親和力(Routledge 等人 I995，Transplantation6O:別7,將其通過(guò)引用整體并入本文；Friend等人1999，Transplantation68:1632,將其通過(guò)引用整體并入本文；Shields等人1995，J.Biol.Chem.276:6591，將其通過(guò)引用整體并入本文)。此外，至少3種人Fe y受體似乎識(shí)別IgG上更低的鉸鏈區(qū)(通常氨基酸243-237)內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)。因此，具有新功能性和潛在減小的免疫原性的另一個(gè)實(shí)例可產(chǎn)生自該區(qū)域的突變，如例如通過(guò)將人IgGl “ " ELLG"的氨基酸233-236替換成來(lái)自IgG2 “PVA”的相應(yīng)序列(具有一個(gè)氨基酸缺失)。已顯示，當(dāng)引入此類(lèi)突變時(shí)，介導(dǎo)不同效應(yīng)子功能的FcyR1、FcyRII 和 FcyRIII 將不結(jié)合 IgGl (Ward 和 Ghetiel995, Therapeutic Immunology2:77,將其通過(guò)引用整體并入本文；和Armour等人1999，Eur.J.1mmunol.29:2613,將其通過(guò)引用整體并入本文)。作為從上述突變產(chǎn)生的新功能性的另一個(gè)實(shí)例，對(duì)于FcRn的親和力在一些情況下可被增加至超過(guò)野生型的所述親和力。該增加的親和力可反映在增加的“結(jié)合”率(“on”” rate)、減小的“解離”率(“off”rate)或增加的“結(jié)合率”和減小的“解離”率。據(jù)信賦予增加的對(duì)于FcRn的親和力的突變包括T256A、T307A、E380A和N434A (Shields等人2001，J.Biol.Chem.276:6591，將其通過(guò)引用整體并入本文)。FcRn BP (或嵌合多肽的FcRn BP部分)可與表2A或2B中顯示的不具有信號(hào)序列的Fe氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸I至227)或可選擇地，具有信號(hào)序列的Fe氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性?！半s合”多肽和蛋白質(zhì)，如本文中所用，意指嵌合多肽與第二多肽的組合。雜合體中的嵌合多肽和第二多肽彼此通過(guò)非共價(jià)蛋白質(zhì)間相互作用例如電荷-電荷或疏水相互作用締合。雜合體中的嵌合·多肽和第二多肽可通過(guò)共價(jià)鍵例如二硫鍵彼此締合。嵌合肽與第二肽可通過(guò)超過(guò)一種類(lèi)型的鍵例如非共價(jià)鍵和二硫鍵彼此締合。雜合體描述于 W02004/101740、W02005/001025、美國(guó)專(zhuān)利 N0.7，404，956、美國(guó)專(zhuān)利 N0.7，348，004 和W02006/074199中，將所述申請(qǐng)和專(zhuān)利中的每一個(gè)通過(guò)引用整體并入本文。第二多肽可以是相同嵌合多肽的第二拷貝，或其可以是非完全相同的嵌合多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，第二多肽為包含F(xiàn)cRn BP例如Fe的多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合多肽為因子IX-FcRn BP，例如因子IX-Fc嵌合多肽，并且第二多肽基本上由Fe組成。參見(jiàn)，例如，圖1實(shí)施例1-3和表
2(SEQ ID NO: 2和4)。參見(jiàn)例如，US7404956，將其通過(guò)引用整體并入本文。雜合體中的第二多肽可包含與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸I至227)或可選擇地，具有信號(hào)序列的氨基酸序列具有至少90%或至少95%或100%的同一性的序列或基本上由所述序列組成。本發(fā)明的多肽還包括融合至一個(gè)或多個(gè)XTEN多肽的因子IX。Schellenburger等人，Nat.Biotech.27:1186-90 (2009)，將其通過(guò)引用整體并入本文?？蓪⒁蜃覫X融合至XTEN多肽的N末端或融合至XTEN多肽的C末端。XTEN多肽包括但不限于W02009/023270、W02010/091122、W02007/103515、US2010/0189682 和 US2009/0092582 中公開(kāi)的多肽，將所述申請(qǐng)中的每一個(gè)通過(guò)弓I用整體并入本文。如本文中所用，“給藥間隔”意指給受試者施用的多個(gè)劑量之間經(jīng)歷的時(shí)間的量。使用嵌合FIX-FcRn BP例如嵌合FIX-Fc的本發(fā)明方法的給藥間隔可以為等量的(以IU/kg計(jì))不具有FcRn BP例如Fe部分的所述因子IX ( S卩，由所述FIX組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5至8倍。當(dāng)施用例如本發(fā)明的因子IX-Fc嵌合多肽(或雜合體)時(shí)，給藥間隔可以為等量的不具有FcRn BP例如Fe部分的所述因子IX( S卩，由所述FIX組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍。給藥間隔可以為等量的不具有例如Fe部分的所述因子ix( S卩，由所述FIX組成的多肽)所需的給藥間隔的至少約1.5倍至8倍。在一些實(shí)施方案中，給藥間隔為6-18、6-10、9_18、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18天。給藥間隔可以為至少約每周I次，可以為6-10天，例如約7-10、約7-9、約7-8、約8_10、約9_10、約6-7、約8-9、約6、約7、約8、約9或約10天。給藥間隔可以為9-18天，例如約9-17、約9-16、約9-15、約9-14、約9-13、約9-12、約 9-11、約 9-10 天、約 10-18、約 11-18、約 12-18、約 13-18、約 14-18、約 15-18、約 16-18、約 17-18 天、約 10-11、約 11-12、約 12-13、約 13-14、約 14-15、約 15-16 和約 16-17 天、約 9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17或約18天，給藥間隔可以為約10-14天。給藥間隔可以為約每2周I次或每月2次。給藥間隔可以長(zhǎng)于18天，例如，約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39或約40天。給藥間隔可以為固定的間隔，例如7天(對(duì)于25-50IU/kg)、10-13 天(對(duì)于 50-100IU/kg)或 14 天(對(duì)于 100_150IU/kg)。確定固定間隔和劑量以便間隔和劑量的組合可在受試者群體中或在單個(gè)受試者中導(dǎo)致至少約1-5或至少約1-3或至少約1、至少約2或至少約3IU/dl FIX的活性的波谷。固定給藥間隔也可以為 7 天(對(duì)于 20-50IU/kg)、10-14 天(對(duì)于 50_100IU/kg)、14-16 天(對(duì)于 100-150IU/kg)、7 天(對(duì)于 10-50IU/kg)、10-13 天(對(duì)于 15-lOOIU/kg)或 14-15 天(對(duì)于 50-150IU/kg)。固定給藥間隔還可以為7天(對(duì)于10-30IU/kg)、10天(對(duì)于15-50IU/kg)、ll天(對(duì)于 20-70IU/kg)、12 天(對(duì)于 25-85IU/kg)、13 天(對(duì)于 30 至 100IU/kg)、14 天(對(duì)于 40至 125IU/kg)和 15 天(對(duì)于 50 - 150IU/kg)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，給藥間隔為每周I次20IU/kg，每10天I次40IU/kg或每2周
I次 100IU/kg (每月 2 次)。給藥間隔可以可選擇地為基于關(guān)于該受試者的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)或其它信息針對(duì)每一個(gè)個(gè)體確定的個(gè)體 化間隔。個(gè)體化劑量/給藥間隔組合可以與上述段落中的固定間隔方案的所述組合相同或可以不同，如實(shí)施例中舉例說(shuō)明的。方案初期可以為固定給藥間隔，隨后其可改變成個(gè)體化給藥間隔。如本文中所用，“按需治療”意指意欲在短時(shí)間過(guò)程中發(fā)生并且響應(yīng)目前病況例如出血事件或感覺(jué)到的短期需要例如計(jì)劃的手術(shù)的治療?？尚枰葱柚委煹牟r包括出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、出血、出血至肌內(nèi)、口腔出血(oral hemorrhage)、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)出血、腹腔內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘(illiopsoas sheath)出血。還包括除此類(lèi)出血事件外的出血事件。受試者可需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期管理或手術(shù)治療。此類(lèi)手術(shù)包括小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、其它牙手術(shù)/胸面部手術(shù)(thoraco-facial surgery)、腹股溝疝切開(kāi)手術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換術(shù)、其它關(guān)節(jié)置換術(shù)、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)。還可包括除此類(lèi)手術(shù)外的手術(shù)。可需要按需治療的另外的病況包括表26中所列的病況。可需要按需治療的另外的病況包括少量出血、關(guān)節(jié)積血、表淺肌肉出血、軟組織出血、中度出血、解剖造成的肌內(nèi)或軟組織出血(intramuscle or soft tissue hemorrhagewith dissection)、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、瘀傷(bruises)、切傷、刮擦、關(guān)節(jié)出血、鼻出血、口出血(mouth bleed)、牙銀出血、顱內(nèi)出血、腹膜內(nèi)出血、少量自發(fā)性出血、重度創(chuàng)傷后出血、中度皮膚擦傷或至關(guān)節(jié)、肌肉、內(nèi)臟器官或腦的自發(fā)性出血。按需治療的其它原因包括對(duì)手術(shù)的圍手術(shù)期管理或拔牙、大手術(shù)、廣泛的口腔手術(shù)、泌尿外殼手術(shù)、疝氣手術(shù)、矯形手術(shù)例如膝、髖或其它大關(guān)節(jié)的置換的需要?？s寫(xiě):AUCinf 從0至無(wú)窮大的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下面積AUCa 分布期范圍內(nèi)的濃度-曲線(xiàn)下面積AUC0 消除期范圍內(nèi)的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)下面積AHL 分布期半衰期BHL 消除期半衰期；也稱(chēng)為t1/2C168 在給藥后約168小時(shí)高于基線(xiàn)的估計(jì)的FIXFc活性Cmax 在Tmax時(shí)存在的最大濃度CV%變異系數(shù) ％ (Percent coefficient of variation)Cl清除率IVR體內(nèi)恢復(fù)(%)K-值增量恢復(fù)MRT平均停留時(shí)間N編號(hào)NC不可計(jì)算的NR未報(bào)道的SD標(biāo)準(zhǔn)誤差SE標(biāo)準(zhǔn)誤差TBLPl 當(dāng)FIXFc活性已降至高于基線(xiàn)約lIU/dL時(shí)模型預(yù)測(cè)的給藥后時(shí)間TBLP3 當(dāng)FIXFc活性已降至高于基線(xiàn)約3IU/dL時(shí)的模型預(yù)測(cè)的給藥后時(shí)間TBLP5 當(dāng)FIX Fc活性已降至高于基線(xiàn)約5IU/dL時(shí)模型預(yù)測(cè)的給藥后時(shí)間Vss處于穩(wěn)態(tài)的分布體積V1中央腔隙的分布體積藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)包括上述術(shù)語(yǔ)和下列術(shù)語(yǔ)，除非另外指出，否則所述術(shù)語(yǔ)具有其在本領(lǐng)域內(nèi)的通常含義。一些術(shù)語(yǔ)在實(shí)施例中更詳細(xì)地解釋。PK參數(shù)可基于FIX抗原水平(順便插一句，在本文中通常表示為“抗原”)或FIX活性水平(順便插一句，在本文中通常表示為“活性”)。在文獻(xiàn)中，PK參數(shù)通?；谝騼?nèi)源性、無(wú)活性的FIX在一些患者的血漿中的存在而產(chǎn)生的FIX活性水平，這干擾了使用抗FIX抗體測(cè)量施用的(即，外源性)FIX的能力。然而，當(dāng)將FIX作為包含異源多肽例如FcRn BP的融合蛋白質(zhì)的部分施用時(shí)，施用的(即，外源性)FIX抗原可使用針對(duì)異源多肽的抗體來(lái)精確地測(cè)量。此外，某些PK參數(shù)可基于模型預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)(順便插一句，通常在本文中表示為“模型預(yù)測(cè)的”)或基于觀(guān)察到的數(shù)據(jù)(順便插一句，通常在本文中表示為“觀(guān)察到的”)，并且優(yōu)選基于觀(guān)察到的數(shù)據(jù)。如本文中所用，“基線(xiàn)”在施用劑量之前受試者的最低的測(cè)量的血漿因子IX水平。在實(shí)施例1中描述的首次應(yīng)用于人體的研究(first-1n-human study)中,在給藥前的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上因子IX的血漿水平:在篩選隨訪(fǎng)時(shí)和即將給藥前。為了計(jì)算，給藥前時(shí)間處理為0(基線(xiàn))，即以產(chǎn)生“扣除基線(xiàn)的”數(shù)據(jù)。參見(jiàn)，例如，圖4?；蛘撸?a)其治療前FIX活性小于1%,不具有可檢測(cè)的FIX抗原以及具有無(wú)義基因型(nonsense genotype)的患者的基線(xiàn)被確定為0%，(b)治療前FIX活性小于1%并且具有可檢測(cè)的FIX抗原的患者的基線(xiàn)設(shè)置為0.5%，(c)其治療前FIX活性為1-2%的患者的基線(xiàn)為Cmin(在整個(gè)PK研究中最低的活性)，和(d)其治療前FIX活性大于等于2%的患者的基線(xiàn)為2%。高于給藥前基線(xiàn)的活性被認(rèn)為是來(lái)自先前治療的殘留藥物，并且可衰退至基線(xiàn)，在rFIXFc給藥后將其從PK數(shù)據(jù)扣除。參見(jiàn)實(shí)施例11。“血漿濃度對(duì)時(shí)間曲線(xiàn)下面積” (“AUC”)，如本文中所用，其基于施用后因子IX的消除的速度和程度。基于曲線(xiàn)的斜率使用外推法測(cè)定在指定的時(shí)期例如12、18、24、36、48或72小時(shí)或無(wú)窮大的范圍內(nèi)的AUC。除非在本文中另外明確地指出，否則測(cè)定無(wú)窮大范圍的AUC (AUCinf)。還可在每劑的基礎(chǔ)上計(jì)算AUC。與許多其它PK參數(shù)一樣，可在單個(gè)受試者中或在針對(duì)其計(jì)算平均值的受試者的群體中進(jìn)行AUC的測(cè)定。在實(shí)施例1中，患者群體的平均AUC/劑量為32.44IU*h/dL每IU/kg，并且個(gè)體受試者的范圍為21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg。(關(guān)于基于活性的平均AUC/劑量，參見(jiàn)表13)。因此，患者群體的平均AUC/劑量可為約26-40、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39或約40IU*h/dL每IU/kg。關(guān)于AUC/劑量和基于抗原的其它AUC參數(shù)，參見(jiàn)表14?！绑w內(nèi)恢復(fù)”(“IVR”)表示為增量恢復(fù)(K-值)，這為扣除給藥前水平的觀(guān)察到的峰值活性，隨后將其除以劑量。還可基于百分比計(jì)算IVR，如在實(shí)施例中所描述的。為了清楚起見(jiàn)，在本文中使用單位(K值或IU/dl每IU/kg對(duì)％)?？蓽y(cè)定患者群體的平均IVR或可測(cè)定單個(gè)受試者的單獨(dú)的IVR。實(shí)施例1中描述的首次應(yīng)用于人體的研究中使用的FIXFc顯示患者群體的約0.93IU/dl每IU/kg的平均IVR ;和在0.62至1.17IU/dl每IU/kg (表13)的范圍內(nèi)的每一個(gè)受試者的IVR。因此，本發(fā)明的嵌合多肽顯示0.85-1.15 (例如，約0.85、約 0.86、約 0.87、約 0.88、約 0.89、約 0.90、約 0.91、約 0.92、約 0.93、約 0.94、約 0.95、約0.96、約0.97、約0.98、約0.99、約1.0、約1.05、約1.10、約1.15)的患者群體的平均IVR以及至少約0.6、約0.7，0 .8、約0.9、約1.0、約1.1或約1.2IU/dl每IU/kg的受試者的IVR。如本文中所用，“清除率”(“CL”)是身體消除藥物的能力的量度，表示為在一段時(shí)間內(nèi)清除了藥物的血漿的體積。實(shí)施例1中描述的研究中使用的FIXFc顯示約3.36mL/hr/kg的平均CL(參見(jiàn)表13)，其比由因子IX(BENEFIX )組成的多肽的CL(8.2mL/hr/kg)低約2.5倍；個(gè)體受試者的CL值的范圍為1.84-4.58ml/h/kg。因此，本發(fā)明的嵌合多肽顯示 3.0-3.72,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6、3.7 或 3.72mL/hr/kg 的群體的平均 CL。關(guān)于基于抗原的CL,參見(jiàn)表14。如本文中所用，“平均停留時(shí)間”(“MRT”)為藥物分子在體內(nèi)的平均壽命的量度。實(shí)施例中描述的研究中使用的FIXFc顯示約68.05小時(shí)的平均MRT (參見(jiàn)表13);在個(gè)體受試者中，MRT值的范圍為53.1-85.8小時(shí)。因此，本發(fā)明的嵌合多肽在群體中顯示60-78、約60、約62、約64、約66、約68、約70、約72、約74、約76或約78小時(shí)的平均MRT和至少約
50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85或約90小時(shí)的受試者的MRT。關(guān)于基于抗原的MRT，參見(jiàn)表14。
如本文中所用，“t1/2e”或“t1/2e”或“ML”是與消除期相關(guān)的半衰期，t1/2e = (ln2)/與終末期相關(guān)的消除速率常數(shù)。在實(shí)施例1中描述的研究中，使用的FIXFc顯示為約52.5小時(shí)的患者群體的平均t1/2z(參見(jiàn)表13)并且個(gè)體受試者的t1/20值的范圍為47-60小時(shí)。因此，本發(fā)明的嵌合多肽顯示大于約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59或約60小時(shí)的平均t1/2e。關(guān)于基于抗原的t1/2e，參見(jiàn)表14。如本文中所用，“波谷”，為在施用本發(fā)明的嵌合多肽或另一種因子IX分子的劑量后并且在施用下一個(gè)劑量(如果有的話(huà))之前達(dá)到的最低血漿IX活性水平。波谷在本文中可與“閾值”互換使用。從測(cè)量的因子IX水平扣除基線(xiàn)因子IX水平以計(jì)算波谷水平。在一些實(shí)施方案中，波谷在6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13或約14天后為1_5或l-3IU/dl。在一些實(shí)施方案中，嵌合多肽的血漿水平在至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%的患者群體中在至少約6天后達(dá)到至少約lIU/dl的平均波谷或在受試者中在至少約6天后達(dá)到至少約1、2、3、4或5IU/dl的波谷。在一些實(shí)施方案中，所述嵌合多肽的血漿水平達(dá)到約1-5或l-3IU/dl的 平均波谷。這樣的波谷或平均波谷可在約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約
23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約
37、約38、約39或約40天后達(dá)到。如本文中所用，“處于穩(wěn)態(tài)的分布體積(Vss) ”是藥物已分布至其中的表觀(guān)空間(apparent space)(體積)。Vss=體內(nèi)的藥物的量除以穩(wěn)態(tài)時(shí)的血衆(zhòng)濃度。在實(shí)施例1中，群體中發(fā)現(xiàn)的平均Vss為約226mL/kg并且受試者的范圍為約145_365mL/kg。(參見(jiàn)表13)。因此，患者群體的平均Vss可以為200-300、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290或約300mL/kg。個(gè)體受試者的Vss可以為約145、約150、約160、約 170、約 180、約 190、約 200、約 210、約 220、約 230、約 240、約 250、約 260、約 270、約280、約 290、約 300、約 310、約 320、約 330、約 340、約 350、約 360 或約 370ml/kg。關(guān)于基于抗原的Vss,參見(jiàn)表14?！岸嚯摹?、“肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用并且是指由共價(jià)地聯(lián)接的氨基酸殘基組成的多聚化合物?！岸嗪塑账帷焙汀昂怂帷笨苫Q使用并且是指由共價(jià)聯(lián)接的核苷酸殘基組成的多聚化合物。多核苷酸可以為DNA、cDNA、RNA、單鏈或雙鏈的、載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒。多核苷酸包括表I中的多核苷酸，其編碼表2的多肽(參見(jiàn)表I)。多核苷酸還可包括表I的多核苷酸的片段，例如編碼表2的多肽的片段例如因子IX、Fc、信號(hào)序列、前肽、6His和表2的多肽的其它片段的多核苷酸的片段。如本文中所用，〃預(yù)防性治療〃意指在整個(gè)時(shí)間過(guò)程中以多個(gè)劑量給受試者施用因子IX多肽以升高受試者血漿的因子IX活性的水平。優(yōu)選地，升高的水平足以降低自發(fā)性出血的發(fā)病率或足以在發(fā)生意外損傷的情況下防止出血。預(yù)防性治療減少或預(yù)防出血事件，例如在按需治療下描述的出血事件。預(yù)防性治療可以是固定的或可以是個(gè)體化的，如在“給藥間隔”下描述的，例如以補(bǔ)償患者間的差異性。如本文中所用，“受試者”意指人或非人哺乳動(dòng)物。非人哺乳動(dòng)物包括小鼠、狗、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、猴子、貓、馬、牛、豬和其它家養(yǎng)動(dòng)物和小動(dòng)物。受試者還包括小兒人類(lèi)。小兒人類(lèi)受試者出生至20歲，優(yōu)選出生至18歲出生至16歲，出生至15歲，出生至12歲，出生至11歲，出生至6歲，出生至5歲，出生至2歲以及2至11歲?？蓪?duì)需要控制或預(yù)防出血或出血事件的受試者實(shí)施本發(fā)明的方法。此類(lèi)受試者包括需要控制或預(yù)防少量出血、關(guān)節(jié)積血、表淺肌肉出血、軟組織出血、中度出血、解剖造成的骨內(nèi)或軟組織出血、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、瘀傷、切傷、刮擦、關(guān)節(jié)出血、鼻出血、口出血、牙齦出血、顱內(nèi)出血、腹膜內(nèi)出血、少量自發(fā)性出血、重度創(chuàng)傷后出血、中度皮膚擦傷或自發(fā)性出血至關(guān)節(jié)、肌肉、內(nèi)臟器官或腦的出血的受試者。此類(lèi)受試者還包括需要圍手術(shù)期管理例如與手術(shù)或拔牙相關(guān)的出血的管理的受試者。如本文中所用，“治療劑量”意指實(shí)現(xiàn)治療目的劑量，如本文中所描述的。血漿源性因子IX(pdFIX)的需要的劑量的計(jì)算基于經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):平均起來(lái)，IIU pdFIX每kg體重產(chǎn)生約lIU/dL(l%)的血漿因子IX活性。在此基礎(chǔ)上，使用下式確定需要的劑量:需要的單位=體重(kg) X期望的因子IX升高(IU/dL或正常的％)xl(IU/kg每IU/dL)因?yàn)镕IXFc (例如如實(shí)施例和圖1中所描述的)具有與pdFIX相似的增量恢復(fù)(與BENEFIX 的增量恢復(fù)不同)，使用上式或?qū)⑵渥髀晕⒄{(diào)整來(lái)測(cè)定所需劑量。關(guān)于各種按需治療需要的具體推薦劑量，也參見(jiàn)表26。對(duì)于使用pdFIX的小兒受試者，劑量指導(dǎo)與對(duì)于成年人的相同。然而，小兒患者可具有更低的增量恢復(fù)，因此劑量可能需要上調(diào)?？捎糜诒景l(fā)明的方法的治療劑量為10-180、20-180或25_180IU/kg，更優(yōu)選，6-10天的給藥間隔的優(yōu)選劑量如下:約25-110、約30-110、約40-110、約50-110、約60-110、約 70-110、約 80-110、約 90-110 和約 100-110 ;約 30-100、約 30-90、約 30-80、約 30-70、約 30-60、約 30-50、約 30-40IU/kg ； ^ 40-110、約 50-100、約 60-90 和約 70-80IU/kg ； ^40-50、約 50-60、約 60-70、約 70-80、約 80-90、約 90-100 和約 100-110IU/kg ;約 25、約 30、約 35、約 40、約 45、約 50、約 55、約 60、約 65、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 95、約 100、約105和約110IU/kg。6-10天的給藥間隔包括每周一次的給藥間隔。對(duì)于6-10天(例如每周一次)的另外的治療劑量，給藥間隔包括20-50、20-100和20-180IU/kg，更具體地，對(duì)于6-10天(例如每周一次)的優(yōu)選劑量，給藥間隔如下:約20-110、約20-100、約20-90、約 20-80、約 20-70、約 20-60、約 20-50、約 20-40、約 20-30、約 20-40 和約 20IU/kg。也參見(jiàn)實(shí)施例10和11。如果對(duì)于給定的患者有效，劑量可以為低于20IU/kg，例如約10、約11、約
12、約 13、約 14、約 15、約 16、約 17、約 18 或約 19IU/kg。9-18天，例如每月2次的給藥間隔的優(yōu)選治療劑量如下:約50-180、約60_180、約70-180、約 80-180、約 90-180、約 100-180、約 110-180、約 120-180、約 130-180、約 140-180、約 150-180、約 160-180 和約 170-180IU/kg ;約 90-170、約 90-160、約 90-150、約 90-140、約90-130、約 90-120、約 90-110 和約 90_100IU/kg ;約 100-170、約 110-160、約 120-150 和約130-140IU/kg ;約 90-100、約 100-110、約 110-120、約 120-130、約 130-140、約 140-150、約150-160 和約 160-170IU/kg ;約 60、約 70、約 80、約 90、約 95、約 100、約 105、約 110、約 115、約 120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約 150、約 155、約 160、約 165、約 170、約 175和約180IU/kg。也參見(jiàn)實(shí)施例10和11。優(yōu)選治療劑量為10-50、15-100、20-100、20-50、50-100、10、20、40、50 和 100IU/
kg 。
治療劑量可以為約20-50、約 20-100、約 20-180、25_110、約 30-110、約 40-110、約 50-110、約 60-110、約 70-110、約 80-110、約 90-110、約 100-110、約 30-100、約 30-90、約 30-80、約 30-70、約 30-60、約 30-50、約 30_40IU/kg、約 40-110、約 50-100、約 60-90、約70-80IU/kg、約 40-50、約 50-60、約 60-70、約 70-80、約 80-90、約 90-100、約 100-110IU/kg、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約 90、約 95、約 100、約 105 和約 110IU/kg。對(duì)于約 6-10、約 7-10、約 7-9、約 7-8、約 8-10,約9-10、約6-7、約8-9、約6、約7、約8、約9天和約10天以及每周I次的給藥間隔這些劑量是優(yōu)選的。治療劑量可以為約90-180、約 100-180、約 110-180、約 120-180、約 130-180、約140-180、約 150-180、約 160-180 和約 170_180IU/kg。劑量可以為約 90-170、約 90-160、約 90-150、約 90-140、約 90-130、約 90-120、約 90-110 和約 90_100IU/kg。劑量可以為約100-170、約 110-160、約 120-150 和約 130_140IU/kg。劑量可以為約 90-100、約 100-110、約110-120、約 120-130、約 130-140、約 140-150、約 150-160 和約 160_170IU/kg。劑量可以為約 90、約 95、約 100、約 105、約 110、約 115、約 120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約150、約155、約160、約165、約170、約175和約180IU/kg。這些劑量對(duì)于約9-18、約9-17,約 9-16、約 9-15、約 9-14、約 9-13、約 9-12、約 9-11、約 9-10、約 10-18、約 11-18、約 12-18、約 13-18、約 14-18、約 15-18、約 16-18、約 17-18、約 10-11、約 11-12、約 12-13、約 13-14、約14-15、約15-16和約16-17天、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17和約18天，每月I次或每月2次(每2周I次)的給藥間隔是優(yōu)選的。優(yōu)選的治療劑量和給藥間隔如下:每周I次20IU/kg、每10天I次40IU/kg以及每2周I次100IU/kg(每月2次)。劑 量和給藥間隔的另外的組合包括:至少約50IU/kg的劑量和至少約7天的給藥間隔、至少約100IU/kg的劑量和至少約9天的給藥間隔、至少約100IU/kg的劑量和至少約12天的給藥間隔、至少約150IU/kg的劑量和至少約14天的給藥間隔、20-50或20-100IU/kg并且所述給藥間隔為每周I次，20_50IU/kg的劑量和7天的給藥間隔，50-100IU/kg的劑量和10-14天的給藥間隔或100-150IU/kg的劑量和14-16天的給藥間隔。給藥間隔與劑量的優(yōu)選組合還包括10-50IU/kg(對(duì)于7天)、15-100IU/kg(對(duì)于 10-13 天)、50-150IU/kg (對(duì)于 14-15 天)、10_30IU/kg (對(duì)于 7 天)、15_50IU/kg (對(duì)于10 天)、20-70IU/kg (對(duì)于 11 天)、25-85IU/kg (對(duì)于 12 天)、30 至 100IU/kg (對(duì)于 13 天)、40 至 125IU/kg (對(duì)于 14 天)和 50_150IU/kg (對(duì)于 15 天)。如本文中所用，“變體”是指與原始多核苷酸或多肽不同但保留其基本性質(zhì)例如因子IX促凝劑活性或Fe (FcRn結(jié)合)活性的多核苷酸或多肽。通常地，變體總體上十分相似，并且在許多區(qū)域中與原始多核苷酸或多肽相同。變體包括多肽和原始多肽的多核苷酸片段、缺失、插入和修飾形式。變體多核苷酸可包含這樣的核苷酸序列或可選擇地由所述核苷酸序列組成，所述核苷酸序列與例如SEQ ID NO:1或3 (因子IX部分、Fe部分，單獨(dú)地或一起地)的核苷酸編碼序列或其互補(bǔ)鏈、已知的突變和重組因子IX或Fe (例如本文中引述的公布和專(zhuān)利中公開(kāi)的突變和重組因子IX或Fe)的核苷酸編碼序列或其互補(bǔ)鏈、編碼SEQ ID N0:2或4的多肽(因子IX部分、Fe部分，單獨(dú)地或一起地)的核苷酸序列和/或任何此類(lèi)核酸分子的多核苷酸片段(例如，本文中描述的那些片段)具有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在嚴(yán)格雜交條件下或在嚴(yán)格度更低的條件下與此類(lèi)核酸分子雜交的多核苷酸也被包括為變體，對(duì)于由此類(lèi)多核苷酸編碼的多肽亦如此，只要它們是有功能的。變體多肽可包含這樣的氨基酸序列或可選擇地由所述氨基酸序列組成，所述氨基酸序列與例如SEQ ID N0:2或4中顯示的多肽序列(因子IX部分、Fe部分，單獨(dú)地或一起地)和/或此類(lèi)多肽的任一個(gè)的多肽片段(例如，本文中描述的那些片段)具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 的同一性。關(guān)于具有與參照核苷酸序列具有至少例如95%的“同一性”的核苷酸序列的核酸，該核酸的核苷酸序列旨在與參照核酸完全相同，除核苷酸序列可包括每參照核苷酸序列的100個(gè)核苷酸最多5個(gè)點(diǎn)突變外。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得具有與參照核苷酸序列具有至少95%的同一性的核苷酸序列的核酸，可缺失或利用另外的核苷酸置換參照序列的最高5%的核苷酸或可將最高5%的參照序列總核苷酸的多個(gè)核苷酸插入?yún)⒄招蛄兄?。查?xún)序列可以是例如SEQ ID NO:1或3中顯示的完整序列、0RF(開(kāi)放閱讀框架)或如本文中所述指定的任何片段。實(shí)際上，無(wú)論任何特定的核酸分子或多肽是否與本發(fā)明的核苷酸序列或多肽具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其都可使用已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)常規(guī)地測(cè)定。用于測(cè)定查詢(xún)序列(參照或原始序列)與主題序列之間的最佳總體配對(duì)的優(yōu)選方法(也稱(chēng)為全局序列比對(duì))可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosc1.(1990)6:237-245)(將其通過(guò)引用整 體并入本文)的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定。在序列比對(duì)中，查詢(xún)序列和主題序列都為DNA序列?？赏ㄟ^(guò)將U轉(zhuǎn)換成T來(lái)比較RNA序列。所述全局序列比對(duì)的結(jié)果以同一性百分比表示。用于DNA序列的FASTDB比對(duì)以計(jì)算同一性百分比的優(yōu)選參數(shù)為:矩陣=單個(gè)，k-元組(tuple) =4,錯(cuò)配罰分=1,連接罰分(Joining Penalty) =30,隨機(jī)化組長(zhǎng)度(Randomization Group Length) =0,截評(píng)分(Cutoff Score) =1,空位罰分(GapPenalty) =5,空位大小罰分(Gap Size Penalty) 0.05,窗口大小=500或目標(biāo)核苷酸的長(zhǎng)度，以較短者為準(zhǔn)。如果主題序列由于5’或3’缺失而非因內(nèi)部缺失而比查詢(xún)序列短，則必須對(duì)結(jié)果進(jìn)行手工校正。這是因?yàn)楫?dāng)計(jì)算同一性百分比時(shí)，F(xiàn)ASTDB程序不負(fù)責(zé)主題序列的5’和3’截?cái)?。?duì)于相對(duì)于查詢(xún)序列在5’或3’末端截?cái)嗟闹黝}序列，通過(guò)將未配對(duì)/比對(duì)的作為主題序列的5’和3’的查詢(xún)序列的堿基的數(shù)目計(jì)算為查詢(xún)序列的總堿基的百分比來(lái)校正同一性百分比。核苷酸是否配對(duì)/比對(duì)通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定。隨后從使用指定的參數(shù)利用上述FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比扣除該百分比，以獲得終同一性百分比評(píng)分。該校正的評(píng)分是用于本發(fā)明的目的評(píng)分。為了手工調(diào)整同一性百分比評(píng)分，僅計(jì)算不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的主題序列的5’和3’堿基之外的堿基，如通過(guò)FASTDB比對(duì)顯示的。例如將90個(gè)堿基的主題序列與100個(gè)堿基的查詢(xún)序列比對(duì)以測(cè)定同一性百分比。缺失存在于主題序列的5’末端，從而FASTDB比對(duì)不顯示5’末端上的前10個(gè)堿基的配對(duì)/比對(duì)。10個(gè)未配對(duì)的堿基代表10%的序列(5’和3’末端上未配對(duì)的堿基數(shù)目/查詢(xún)序列的堿基的總數(shù))，因此從通過(guò)FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比評(píng)分扣除10%。如果剩余的90個(gè)堿基完全配對(duì)，則終同一性百分比將為90%。在另一個(gè)實(shí)例中，將90個(gè)堿基的主題序列與100個(gè)堿基的查詢(xún)序列比較。這一次缺失為內(nèi)部缺失，以便在主題序列的5’或3’上不存在不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的堿基。在該情況下，通過(guò)FASTDB計(jì)算的同一性百分比不通過(guò)手工校正。再次地，僅對(duì)不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的主題序列的5’和3’堿基進(jìn)行手工校正。為了本發(fā)明的目的，將不進(jìn)行其它手工校正。關(guān)于具有與本發(fā)明的查詢(xún)氨基酸序列具有至少例如95%的“同一性”的氨基酸序列的多肽，主題多肽(subject polypeptide)的氨基酸序列旨在與查詢(xún)序列完全相同，除主題多肽序列可包括每查詢(xún)氨基酸序列的100個(gè)氨基酸最多5個(gè)氨基酸的改變外。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得具有與查詢(xún)氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列的多肽，可插入、缺失、(插入缺失(indels))或利用另外的氨基酸置換主題序列的最多5%的氨基酸殘基。參照序列的這些改變可在參照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置之間的任何位置上發(fā)生，單獨(dú)地散布在參照序列的殘基間或以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)的組群散布在參照序列內(nèi)。實(shí)際上，無(wú)論任何特定的核酸分子或多肽是否與SEQ ID NO: 2 (因子IX部分、Fe部分，單獨(dú)地或一起地)或4的氨基酸序列或已知的因子IX或Fe多肽序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性，其都可使用已知的計(jì)算機(jī)程序來(lái)常規(guī)地測(cè)定。用于測(cè)定查詢(xún)序列(參照或原始序列)與主題序列之間的最佳總體配對(duì)的優(yōu)選方法(也稱(chēng)為全局序列比對(duì))可使用基于Brutlag等人(Comp.App.Biosc1.(1990)6:237-245)(將其通過(guò)引用整體并入本文)的算法的FASTDB計(jì)算機(jī)程序來(lái)測(cè)定。在序列比對(duì)中，查詢(xún)序列和主題序列都為核苷酸序列或都為氨基酸序列。所述全局序列比對(duì)的結(jié)果以同一性百分比表示。用于FASTDB氨基酸比對(duì)的優(yōu)選參數(shù)為:矩陣=PAM0，k-元組=2，錯(cuò)配罰分=1，連接罰分=20，隨機(jī)化組長(zhǎng)度=0,截止評(píng)分=1,窗口大小=序列全長(zhǎng),空位罰分(Gap Penalty) =5,空位大小罰分(Gap Size Penalty) 0.05，窗口大小=500或目標(biāo)核苷酸的長(zhǎng)度，以較短者為準(zhǔn)。如果主題序列由于N或 C末端缺失而非因內(nèi)部缺失而比查詢(xún)序列短，則必須對(duì)結(jié)果進(jìn)行手工校正。這是因?yàn)楫?dāng)計(jì)算全局同一性百分比時(shí)，F(xiàn)ASTDB程序不負(fù)責(zé)主題序列的N和C末端截?cái)?。?duì)于相對(duì)于查詢(xún)序列在N或C末端截?cái)嗟闹黝}序列，通過(guò)將未與相應(yīng)的主題殘基配對(duì)/比對(duì)的作為主題序列的N和C末端的查詢(xún)序列的堿基的數(shù)目計(jì)算為查詢(xún)序列的總堿基的百分比來(lái)校正同一性百分比。殘基是否配對(duì)/比對(duì)通過(guò)FASTDB序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)確定。隨后從使用指定的參數(shù)利用上述FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比扣除該百分t匕，以獲得終同一性百分比評(píng)分。該終同一性百分比評(píng)分是用于本發(fā)明的目的評(píng)分。為了手工調(diào)整同一性百分比評(píng)分，僅考慮不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的主題序列的N和C末端的殘基。S卩，僅在王題序列的N和C末端的最遠(yuǎn)端殘基外側(cè)的查詢(xún)殘基位直。例如，將90個(gè)氨基酸殘基的主題序列與100個(gè)氨基酸的查詢(xún)序列比對(duì)以測(cè)定同一性百分比。缺失在主題序列的N末端發(fā)生，從而FASTDB比對(duì)不顯示N末端上的前10個(gè)殘基的配對(duì)/比對(duì)。10個(gè)未配對(duì)的殘基代表序列的10%(N和C末端上未配對(duì)的殘基數(shù)目/查詢(xún)序列的殘基的總數(shù))，因此從通過(guò)FASTDB程序計(jì)算的同一性百分比評(píng)分扣除10%。如果剩余的90個(gè)殘基完全配對(duì)，終同一性百分比為90%。在另一個(gè)實(shí)例中，將90個(gè)殘基的主題序列與100個(gè)殘基的查詢(xún)序列比較。這時(shí)缺失為內(nèi)部缺失，因此在主題序列的N或C端上不存在不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的殘基。在該情況下，不對(duì)利用FASTDB計(jì)算的同一性百分比進(jìn)行手工校正。再次地，僅對(duì)不與查詢(xún)序列配對(duì)/比對(duì)的主題序列的N和C末端外的殘基位置(如在FASTDB比對(duì)中顯示的)進(jìn)行手工校正。為了本發(fā)明的目的，將不進(jìn)行其它手工校正。多核苷酸變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者中包含改變。特別優(yōu)選的是包含產(chǎn)生沉默置換、添加或缺失但不改變編碼的多肽的性質(zhì)或活性的改變的多核苷酸變體。通過(guò)因遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性導(dǎo)致的沉默置換產(chǎn)生的核苷酸變體是優(yōu)選的。此外，其中以任意組合置換、缺失或添加5-10、1-5或1-2個(gè)氨基酸的變體也是優(yōu)選的?？梢蚨鄠€(gè)理由(例如最優(yōu)化用于特定宿主的密碼子表達(dá)(將人mRNA中的密碼子改變成由細(xì)菌宿主例如大腸桿菌(E.coli)優(yōu)選的密碼子))產(chǎn)生多核苷酸變體。天然存在的變體稱(chēng)為“等位基因變體”，是指占據(jù)生物體的染色體上給定的基因座的基因的幾個(gè)替代形式之一(Genes II, Lewin, B.編著，John Wiley & Sons, NewYork(1985))。這些等位基因變體可在多核苷酸和/或多肽水平上變化并且包括在本發(fā)明中?；蛘?，非天然產(chǎn)生的變體可通過(guò)誘變技術(shù)或通過(guò)直接合成產(chǎn)生。 通過(guò)使用已知的蛋白質(zhì)工程和重組DNA技術(shù)的方法，可產(chǎn)生變體來(lái)改善或改變多肽的特征。例如，可從分泌蛋白質(zhì)的N端或C端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸而無(wú)生物功能的顯著喪失。Ron等人，J.Biol.Chem.268:2984-2988(1993)(將其通過(guò)引用整體并入本文)的作者報(bào)道了即使在缺失3、8或27個(gè)氨基-末端氨基酸殘基后仍然具有肝素結(jié)合活性的變體KGF蛋白。類(lèi)似地，干擾素Y在從該蛋白質(zhì)的羧基端缺失8-10個(gè)氨基酸殘基后顯示了最多高10倍的活性。(Dobeli等人，J.Bi0techn0l0gy7:199-216(1988)，將其通過(guò)引用整體并入本文)。此外，大量證據(jù)顯示變體通常保持與天然存在的蛋白質(zhì)的生物活性相似的生物活性。例如，Gayle及同事(J.Biol.Chem.268:22105-22111 (1993)，將其通過(guò)引用整體并入本文)進(jìn)行了人細(xì)胞因子IL-1a的廣泛突變分析。它們使用隨機(jī)誘變產(chǎn)生超過(guò)3，500個(gè)個(gè)體IL-1a突變體，在分子的整個(gè)長(zhǎng)度范圍內(nèi)每變體平均改變2.5個(gè)氨基酸。在每一個(gè)可能的氨基酸位置上檢查到多個(gè)突變 。研究者發(fā)現(xiàn)“大部分分子可被改變，而對(duì)[結(jié)合或生物活性]幾乎無(wú)影響”(參見(jiàn)摘要)。事實(shí)上，所檢查的超過(guò)3，500個(gè)核苷酸的序列中僅23個(gè)獨(dú)特的氨基酸的序列產(chǎn)生了在活性上 與野生型顯著不不同的蛋白質(zhì)。如上所提及的，多核苷酸變體包括修飾多肽。修飾包括乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價(jià)交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、Y -羧基化、糖基化、GPI錨的形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蘧?；⒀趸?、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)運(yùn)-RNA個(gè)導(dǎo)的氨基酸至蛋白質(zhì)的添加例如精氨?；捅樵诘鞍谆Ｐg(shù)語(yǔ)“約”在本文中用于意指近似地、大致地、左右或在某范圍內(nèi)。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“約”與數(shù)字范圍結(jié)合使用時(shí)，其通過(guò)延伸高于和低于所示數(shù)值的邊界修飾該范圍。一般地，術(shù)語(yǔ)“約”在本文中用于修飾高于或低于所述值上或下(更高或更低)10%的差異的數(shù)值。由于現(xiàn)已詳細(xì)地描述了本發(fā)明，因此通過(guò)參考下列實(shí)施例可更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)施例隨同本發(fā)明包括的，僅用于舉例說(shuō)明目的并且無(wú)意限定本發(fā)明。本文中提及的所有專(zhuān)利和公布通過(guò)引用明確地并入本文。實(shí)施例1.首次應(yīng)用于人體的(FiH)試驗(yàn)
首次應(yīng)用于人體的研究是測(cè)定FIXFc (重組人凝血因子IX融合蛋白)的安全性、耐受性和藥代動(dòng)力學(xué)(PK)參數(shù)的開(kāi)放性、劑量遞增的1/2期研究。FIXFc為包含偶聯(lián)至來(lái)自人IgGl的Fe結(jié)合域的人凝血因子IX的重組融合蛋白。融合蛋白在人胚腎細(xì)胞(HEK293)中表達(dá)。參見(jiàn)實(shí)施例3。FIXFc正被開(kāi)發(fā)來(lái)用于控制和預(yù)防B型血友病(先天性因子IX缺陷或克雷司馬斯病)患者的出血事件，包括控制和預(yù)防手術(shù)背景中的出血。FIXFc為由凝血因子IX(FIX)和人抗體(IgGl同種型)的Fe結(jié)構(gòu)域組成的重組融合蛋白質(zhì)。FIXFc分子為具有通過(guò)Fe的鉸鏈區(qū)中的兩個(gè)二硫鍵結(jié)合在一起的FIXFc單鏈(FIXFc-sc)和Fe單鏈(Fc-sc)的異二聚體。參見(jiàn)圖1和表2。rFIXFc藥品為期望用于靜脈內(nèi)(IV)施用的澄清無(wú)色溶液。在IOmL的一次使用的小瓶中以1000IU/5mL體積提供rFIXFc。將藥品包裝在具有溴丁基瓶塞和可撕下的平面鋁頂封(tear-off plain aluminum overseal)的USP I型玻璃小瓶中。rFIXFc藥品在添加有145mM NaCl和0.1%聚山梨酯20的IOmM磷酸鈉緩沖液pH7.0中包含200IU/mL。不應(yīng)當(dāng)稀釋rFIXFc 溶液。研究設(shè)計(jì)。招募總共14個(gè)先前治療的重度B型血友病患者，在約10分鐘的時(shí)間內(nèi)利用FIXFc通過(guò)靜脈內(nèi)(IV)輸注治療所述患者。在研究中評(píng)估6個(gè)劑量水平1、5、12.5、25、50和100IU/kg。在劑量水平1、5、12.5和25IU/kg上每劑量水平招募一個(gè)患者，在50和100IU/kg上每劑量水平招募至少3個(gè)可評(píng)估的患者。在篩選后(14天的FIXFc劑量?jī)?nèi)安排的)，開(kāi)始患者的治療期。每一個(gè)劑量水平的治療期包括單次劑量的FIXFc (第I天)，(對(duì)于劑量水平I和5IU/kg)直至完成72小時(shí)安全性觀(guān)察期(3天)或(在12.5至100IU/kg的劑量水平下)直至獲得患者的最后PK樣品(約10天)。招募利用1、5、12.5或25IU/kg進(jìn)行治療的患者，以始于lIU/kg的順序方式治療所述患者。在同一天不治療接受50IU/kg的患者，并且相隔至少一天給藥。在50IU/kg患者的治療后，開(kāi)始100IU/kg患者的治療。治療后的時(shí)期為始于患者接受FIXFc的劑量的當(dāng)天的30天的安全性觀(guān)察期并且與治療期重疊，因?yàn)樵谠摃r(shí)間過(guò)程中，患者一直在經(jīng)歷所需的研究評(píng)估例如PK取樣。抽取被賦予劑量水平12.5至100IU/kg的患者的血液樣品以評(píng)估FIX活性和FIXFc濃度。正好在施用FIXFc之前、在輸注結(jié)束后15分鐘和在輸注結(jié)束后第1、3、6、9、24、48、72、96、120、168和240小時(shí)或直至達(dá)到基線(xiàn)FIX水平時(shí)抽取血液樣品。如果患者在240小時(shí)時(shí)間點(diǎn)(研究的第11天)上繼續(xù)具有高于基線(xiàn)的FIX水平，則在第288小時(shí)(研究的第13天)采樣，如果FIX水平在研究的第13天高于基線(xiàn)則再次在第336小時(shí)(研究的第15天)采樣。患者10接受出血的BENEFIX 治療，然后在給藥后第216小時(shí)進(jìn)行預(yù)先安排的FIXFc采樣。因此，從分析排除216小時(shí)和隨后時(shí)間點(diǎn)的FIXFc活性和抗原數(shù)據(jù)。無(wú)感覺(jué)到已影響該研究的間斷分析結(jié)果的另外偏差發(fā)生。對(duì)于因子IX抗原，在FIXFc的IV輸注后，對(duì)個(gè)體患者觀(guān)察到的FIXFc濃度對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。使用模型依賴(lài)性方法進(jìn)行初步分析。使用用戶(hù)確定的初始參數(shù)估計(jì)，將FIXFc濃度數(shù)據(jù)與從中央隔室消除的兩隔室開(kāi)放模型進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合，以計(jì)算初始參數(shù)值。產(chǎn)生WinNonlin估計(jì)的微觀(guān)速度常數(shù)，并且利用I/(Y_hatJ_hat)的函數(shù)對(duì)FIXFc濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)。兩隔室模型未充分描述觀(guān)察到的兩個(gè)受試者(例如，患者5和6)的數(shù)據(jù)。因此，使用WinNonlin非隔室分析IV-輸注輸入模型(AUC計(jì)算的線(xiàn)性梯形法則)對(duì)這兩個(gè)患者進(jìn)行不依賴(lài)于模型的分析。對(duì)于非隔室分析，使用描述回歸的終端對(duì)數(shù)-線(xiàn)性下降的數(shù)據(jù)點(diǎn)從β期計(jì)算半衰期。使用最少3點(diǎn)來(lái)描述消除期。這在大致4至14天之間進(jìn)行。對(duì)于抗原的PK分析，利用“mg/kg”劑量等同物。基于60.2IU/mg的對(duì)于FIXFc的特異性活性測(cè)定這些值。將實(shí)際采樣時(shí)間、劑量和輸注持續(xù)時(shí)間用于計(jì)算。將標(biāo)稱(chēng)采樣時(shí)間和劑量用于產(chǎn)生表和濃度-時(shí)間圖。提供個(gè)體和平均PK參數(shù)以及描述性統(tǒng)計(jì)。不進(jìn)行正式的統(tǒng)計(jì)分析，因?yàn)槊恳粋€(gè)組群的劑量范圍和受試者人數(shù)太小以至于不能進(jìn)行有意義的分析。對(duì)于因子IX活性，按照基線(xiàn)扣除決策樹(shù)(圖4)將基線(xiàn)扣除法用于活性對(duì)時(shí)間的曲線(xiàn)。對(duì)于基線(xiàn)衰減(baseline decay),在lIU/dL下定義為小于1%的活性值。為了進(jìn)行計(jì)算，將給藥前時(shí)間處理為O。此外，在代表至基線(xiàn)水平的返回的時(shí)間點(diǎn)上截?cái)嗷€(xiàn)校正的活性數(shù)據(jù)。對(duì)在FIXFc的IV輸注施用后獲得的扣除基線(xiàn)的FIX活性對(duì)照時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)分析。利用模型依賴(lài)性評(píng)估進(jìn)行IV-輸注劑量組的分析。使用WinNonlin確定的參數(shù)邊界值，將扣除基線(xiàn)的數(shù)據(jù)與從中央隔室消除的兩隔室開(kāi)放模型進(jìn)行計(jì)算機(jī)擬合，以計(jì)算初始參數(shù)值。產(chǎn)生WinNonlin估計(jì)的微觀(guān)速度常數(shù)，利用I/(Y_hatJ_hat)的函數(shù)對(duì)FIXFc活性數(shù)據(jù)進(jìn)行加權(quán)。將實(shí)際采樣時(shí)間、劑量和輸注持續(xù)時(shí)間用于計(jì)算。將標(biāo)稱(chēng)采樣時(shí)間和劑量用于產(chǎn)生表和濃度-時(shí)間圖。當(dāng)不能從實(shí)際數(shù)據(jù)獲得時(shí)，使用WinNonlin產(chǎn)生的微觀(guān)速度常數(shù)模擬FIXFc活性水平對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)來(lái)獲得給藥后168小時(shí)(C168)和達(dá)到高于rFIXFc的基線(xiàn)(TBLPl) lIU/dL時(shí)的時(shí)間。在本實(shí)施例中提供了個(gè)體和平均PK參數(shù)以及描述性統(tǒng)計(jì)。不進(jìn)行正式統(tǒng)計(jì)分析，因?yàn)槊恳粋€(gè)組群的劑量范圍和受試者人數(shù)太小以至于不能進(jìn)行有意義的分析。FIXFc抗原藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果顯示FIXFc血漿濃度在短暫的FIXFc的IV輸注后急劇增加，對(duì)于12.5,25,50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平分別具有1670 (n=l)、2730(n=l)、7510 土 2480和15400 土 3960ng/mL的平均(土 SD) Cniax值，并且對(duì)于所有患者在第一個(gè)半小時(shí)內(nèi)達(dá)到。所有FIXFc治療的患者具有劑量相關(guān)的全身性FIXFc血漿暴露的增加(如通過(guò)Cmax和AUCinf評(píng)估的)。雖然在12.5和25IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量上限定于單個(gè)可評(píng)估的患者，但觀(guān)察到的Cmax和AUCinf的增加合理地在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)與劑量成比例。(表3顯示個(gè)體患者和組的平均FIXFc抗原的PK總結(jié)數(shù)據(jù)；通過(guò)標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量、輸注持續(xù)時(shí)間和患者人數(shù)分選的。表4顯示個(gè)體患者和組的平均FIXFc抗原的PK總結(jié)數(shù)據(jù)；通過(guò)標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量、“mg/kg”等同劑量和患者人數(shù)分選的，顯示個(gè)體患者和組的平均FIXFc抗原的PK總結(jié)數(shù)據(jù)；通過(guò)標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量、“mg/kg”等同劑量和患者人數(shù)分選的，并且參見(jiàn)表11)。FIXFc血漿濃度在短暫的IV輸注后以雙指數(shù)方式下降。分布(α)和消除(β)半衰期值在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)似乎是不依賴(lài)于劑量的，個(gè)體患者的α和β半衰期值分別在9.79至21.2小時(shí)和71.0至140小時(shí)的范圍。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均α半衰期值(土SD)分別為13.1±4.77和12.1±2.33小時(shí)。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均β半衰期值(土SD)分別為110±26.5和95.8±11.1小時(shí)。此外，測(cè)定Cl、Vss和MRT的主要PK參數(shù)值，并 且一般地，所述PK參數(shù)值在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)似乎都是不依賴(lài)于劑量的。如所指出的，該評(píng)估在12.5和25IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平上受到單個(gè)患者數(shù)據(jù)的限制。(表12和圖2、7和8)。
此外，對(duì)50和lOOIU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均Cl值分別為2.28±0.374和2.11 ± 0.464mL/h/kg。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均Vss值分別為259 土 78.5和238±52.2mL/kg。此外，對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均MRT值分別為112±21.5和114±17.1小時(shí)?；€(xiàn)校正的FIXFc活性藥代動(dòng)力學(xué)的結(jié)果顯示FIXFc活性在FIXFc的短暫IV輸注后急劇增加，對(duì)于12.5、25、50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平分別具有11.9(n=l)、19.9(n=l)、41.6±8.97和98.2±8.21IU/dL的平均(土SD)模型預(yù)測(cè)的Cniax值，并且對(duì)于所有患者在前半小時(shí)內(nèi)達(dá)到。(表5顯示個(gè)體患者和組的平均基線(xiàn)校正的FIXFc活性對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)；按標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量、輸注持續(xù)時(shí)間和患者人數(shù)分選的。表6顯示個(gè)體患者和組的平均FIXFc活性的PK總結(jié)數(shù)據(jù)；按標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量、“mg/kg”等同劑量和患者人數(shù)分選的)。所有FIXFc處理的患者具有劑量相關(guān)的FIX活性的增加(相對(duì)于給藥前基線(xiàn)反應(yīng))。雖然限于在12.5和25IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平上的單個(gè)可評(píng)估的患者，但觀(guān)察到的Cmax和AUCinf的增加在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)合理地與劑量成比例。(表6、9和13以及圖3和5)。在輸注結(jié)束后，基線(xiàn)校正的FIX活性的下降顯示雙指數(shù)衰減；特征在于快速分布(α)期，然后對(duì)數(shù)-線(xiàn)性消除(β)期。在α期中，F(xiàn)IXFc活性的下降速度可隨個(gè)體患者α半衰期變化(從0.140變化至16.6小時(shí))而變化。平均α半衰期值的表面上劑量依賴(lài)性增加在12.5和25IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平上被單個(gè)患者所混淆。相反地，消除(β )半衰期的值在劑量范圍內(nèi)似乎是不依賴(lài)于劑量的，個(gè)體患者的β半衰期值在25至100IU/kg的劑量范圍內(nèi)從42.1變化至67.4小時(shí)。雖然已進(jìn)行了評(píng)估和報(bào)道，但利用12.5IU/kg的rFIXFc治療的患者I的消除半衰期因該患者的FIX水平僅在最多96小時(shí)內(nèi)可被檢測(cè)(從而導(dǎo)致截短的終末期并且促成終末消除半衰期的低估)而不包括在總結(jié)評(píng)估中。對(duì)于50和lOOIU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均β半衰期值(土SD)分別為52.1±10.4和52.5±10.1小時(shí)，對(duì)于組合的25、50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量，所述平均β半衰期值為52.5±9.2(范圍為40-67.4)小時(shí)。(表6、8和13)。

此外，測(cè)定CUV1Jss和MRT的主要PK參數(shù)值，并且一般地，所述PK參數(shù)值在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)全都似乎是不依賴(lài)于劑量的。此外，對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均Cl值分別為3.77± 1.12和
2.89±0.615mL/h/kg，對(duì)于組合的25、50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量，所述平均Cl值為
3.36±0.928mL/h/kg。(表 6、8 和 13)。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均Vss值為分別264±77.6和179±31.lmL/kg,對(duì)于組合的25、50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量，所述平均Vss值為226±69.8mL/kg。(表6、8和13)。此外，對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平，平均MRT值分別為71.7±13.0和62.8±8.82小時(shí)，對(duì)于組合的25,50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量，所述平均MRT值為68.05±11.16小時(shí)。(表6、8和13)。除了主要PK參數(shù)外，測(cè)定次要PK參數(shù)(例如，C168、K_值、IVR等)以評(píng)估FIXFc的作用持續(xù)時(shí)間。如所預(yù)期的，觀(guān)察到的C168、TBLPU TBLP3和TBLP5值的劑量依賴(lài)性增力口。相反地，K值和IVR值在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)似乎是不依賴(lài)于劑量的。在整個(gè)劑量范圍內(nèi)，個(gè)體患者模型預(yù)測(cè)的和觀(guān)察到的K值分別在0.61至1.02IU/dL每IU/kg的范圍內(nèi)和0.62至1.17IU/dL每IU/kg的范圍內(nèi)。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平的平均模型預(yù)測(cè)的K值分別為0.76和0.90IU/dL每IU/kg,對(duì)于組合的25,50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量，所述K 值為 0.821 ±0.1387(范圍為 0.61-1.02) IU/dL 每 I IU/kg 對(duì)于 50 和 100IU/kg 的標(biāo)稱(chēng)劑量水平的平均模型預(yù)測(cè)的IVR值分別為34.5%和35.1%。對(duì)于50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量水平的平均觀(guān)察K值分別為0.86和1.02IU/dL每IU/kg，對(duì)于組合的25、50和100IU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量所述K值為0.926±0.1787 (范圍為0.97-1.17) IU/dL每I IU/kg 對(duì)于50和lOOIU/kg的標(biāo)稱(chēng)劑量平均觀(guān)察IVR值分別為39.2%和39.8%。(表6、7、8和13)。表7A-7B(顯示7)顯示個(gè)體患者和組的平均FIXFc活性次要PK的總結(jié)數(shù)據(jù)；按標(biāo)稱(chēng)劑量、實(shí)際劑量和患者人數(shù)分選的。每一個(gè)I IU/kg的輸注的rFIXFc使血漿FIX活性平均升高0.93 土 0.18IU/dl，并且該增量恢復(fù)(K值)顯示微弱的與體重正相關(guān)(R2=0.336，p=0.048)(圖23)。FIXFc活性的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估與對(duì)于rFIXFc抗原的藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估一致(例如，比較表13和14)。此外，在rFIXFc活性與抗原水平之間存在優(yōu)良的相關(guān)性，這表明rFIXFc的體內(nèi)活性的保持。(圖9)。此外，相對(duì)于BENEFIX (Wyeth)的歷史數(shù)據(jù)，rFIXFc顯示(表8)下列:從25至100IU/kg的劑量線(xiàn)性t1/20增加至3倍平均停留時(shí)間增加至3倍

24%的提高的增量恢復(fù)減少2.5倍的清除率FIXFc為由連接至人IgGl的Fe結(jié)構(gòu)域的FIX組成的重組融合蛋白質(zhì)。FIXFc已被設(shè)計(jì)為FIX的長(zhǎng)效形式。利用FIXFc的臨床前研究已顯示與BENEFIX (商購(gòu)可得的重組FIX產(chǎn)品)相比較的FIX活性的半衰期的延長(zhǎng)。本研究的原理是評(píng)估FIXFc在重度B型血友病患者中的安全性和PK。為了進(jìn)行該研究，可獲得12個(gè)年齡為18至76歲的可評(píng)估的受試者來(lái)進(jìn)行PK評(píng)分。在約10分鐘的時(shí)間每個(gè)受試者接受以12.5,25,50或100IU/kg體重的標(biāo)稱(chēng)劑量靜脈內(nèi)輸注FIXFc的單次施用。在輸注前以及在給藥后最多14天獲得用于FIXFc活性和抗原濃度的PK評(píng)估的血漿樣品。在本研究中使用模型依賴(lài)性和不依賴(lài)于模型的方法獨(dú)立地表征FIXFc抗原和活性?xún)烧叩腜K。在以12.5、25、50和100IU/kg體重的單次IV劑量施用后，F(xiàn)IXFc可被良好地耐受。在本研究中無(wú)藥物相關(guān)嚴(yán)重不利事件的證據(jù)。在任何受試者中未檢測(cè)到rFIXFc的中和或結(jié)合抗體。在施用12.5至100IU/kg的劑量后，對(duì)于FIXFc抗原和活性，觀(guān)察到Cmax和AUCinf的與劑量大致成比例的增加，但在所有劑量上V與Cl相似。這些結(jié)果表明FIXFc抗原和活性在評(píng)估的劑量范圍內(nèi)顯示線(xiàn)性PK。相對(duì)小的V參數(shù)值可表示FIXFc進(jìn)入間隙液但不穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)液。在輸注結(jié)束時(shí)在0.5小時(shí)內(nèi)觀(guān)察到FIXFc抗原和活性的峰值血漿水平，并且在給藥后數(shù)天仍然是可檢測(cè)的。對(duì)于FIXFc抗原和活性都觀(guān)察到減少的清除率和延長(zhǎng)的半衰期的證據(jù)。對(duì)于50和100IU/kg的劑量水平，與FIXFc抗原濃度相關(guān)的平均清除率和終末消除半衰期值分別為2.28和2.llmL/h/kg以及110和95.8小時(shí)。類(lèi)似地，在相同的劑量范圍內(nèi)，與FIXFc活性水平相關(guān)的平均清除率和終末消除半衰期值分別為3.77和2.89mL/h/kg以及52.1和52.5小時(shí)。本研究中觀(guān)察到的FIXFc活性PK結(jié)果與報(bào)道的BENEFIX 活性的PK (BENEFIX 的產(chǎn)品特征概述；2009年11月18日)的比較顯示相對(duì)于BENEFIX ，F(xiàn)IXFc清除率減少約3倍并且FIXFc終末消除半衰期和平均停留時(shí)間增加約3倍。鑒于觀(guān)察到的PK的改善，F(xiàn)IXFc將提供延長(zhǎng)的免受出血的保護(hù)作用，從而允許對(duì)B型血友病個(gè)體進(jìn)行更低頻率的注射。基于該試驗(yàn)的結(jié)果，可使用100IU/kg的劑量每?jī)芍躀次或兩月2次和使用更低的劑量至少每周I次施用rFIXFc。這樣的方案需要更少次的注射。此外，rFIXFc的使用將具有其它潛在的臨床影響例如:中央靜脈進(jìn)入(central venousaccess);改善的方案順從性；減少的穿破性出血；和增強(qiáng)的保護(hù)關(guān)節(jié)免受出血的作用。實(shí)施例2.B-LONGI/2/3 期試驗(yàn)這將是重組長(zhǎng)效促凝因子IX Fe融合蛋白(rFIXFc)在預(yù)防和治療先前治療的患有重度B型血友病的受試者的出血中的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)和療效的開(kāi)放性多中心評(píng)估。利用目前在售的FIX產(chǎn)品的治療使得必需每周給藥2-3次。將所需給藥間隔延長(zhǎng)至每周I次或更長(zhǎng)的具有延長(zhǎng)的半衰期的產(chǎn)品被醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是對(duì)于重度血友病患者的治療的顯著提聞。rFIX產(chǎn)品的劑量水平在臨床預(yù)防性研究中可廣泛地變化:報(bào)道的劑量從10至 171IU/kg 變化(Roth 等人，Blood98:3600 (2001))或從 40 至 100IU/kg 變化(MASACRecommendationl77, National Hemophilia Foundation (2006 年 10 月))。此外，在不具有出血的臨床體征的受試者的預(yù)防性治療過(guò)程中FIX活性的波谷水平經(jīng)預(yù)測(cè)在0.2至3.8IU/dL的范圍內(nèi)變化(Carlsson等人，血友病4:83 (1998))?？紤]到個(gè)體患者間的差異性，基于患者的臨床狀態(tài)的個(gè)體化給藥方案是普通實(shí)踐。評(píng)估單次劑 量的rFIXFc的冷凍液體制劑的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)的l/2a期研究(實(shí)施例1)的結(jié)果已顯示藥物在從I至ιοοιυ/kg變化的劑量上可被良好地耐受，并且PK表征顯示優(yōu)于目前可獲得的治療的幾個(gè)有利方面，即為先前對(duì)于BENEFIX 所報(bào)道的3倍長(zhǎng)的半衰期和MRT (61小時(shí)對(duì)19小時(shí))。本研究的目的是前瞻性測(cè)定凍干的rFIXFc在人中的PK參數(shù)估計(jì)，將這些PK參數(shù)估計(jì)與BENEFIX 在人中的PK參數(shù)估計(jì)相比較，和顯示凍干的rFIXFc在預(yù)防和治療先前治療的患有重度B型血友病的受試者的出血中的療效和其反復(fù)給藥對(duì)于所述受試者的安全性。研究必須采用4個(gè)方式(arm):低劑量預(yù)防性方案(n=25)、高劑量預(yù)防性方案(n=25)、按需方案(n=20)和大手術(shù)方案(n=5)。低劑量方案方式可包括利用BENEFIX 給藥，然后交換成rFIXFc給藥的PK亞組(n=16)。本發(fā)明的主要目的是:評(píng)估rFIXFc在所有治療方式中的安全性和耐受性；評(píng)估rFIXFc在所有治療方式中的療效；和評(píng)估預(yù)防性療法高于按需療法的療效(方式I和2對(duì)按需方案方式3之間的出血事件的年度化數(shù)量的比較)。本發(fā)明的次要目的是:比較rFIXFc與BENEFIX 的PK參數(shù)估計(jì)；評(píng)rFIXFc在按需方式和手術(shù)方式中的療效；評(píng)估和比較PK亞組中rFIXFc在基線(xiàn)與第26周(±1周)上的PK參數(shù)估計(jì)；評(píng)估受試者對(duì)所有方式的治療的反應(yīng)；和評(píng)估所有方式中rFIXFc的消耗。主要選擇標(biāo)準(zhǔn)(Inclusion Criteria):
男性且12歲及更大并且體重至少40kg經(jīng)診斷患有B型血友病(基線(xiàn)因子IX水平低于或等于2%)對(duì)任何因子IX產(chǎn)品的至少100天暴露的歷史血小板計(jì)數(shù)彡100，000個(gè)細(xì)胞/μ LINR(國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率)(1.40，如通過(guò)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)值域確定的CD4計(jì)數(shù)彡200個(gè)細(xì)胞/μ L主要排除標(biāo)準(zhǔn)(Exclusion Criteria):因子IX抑制劑的歷史腎或肝功能障礙經(jīng)診斷患有除B型血友病外的另一種凝血缺陷與任何FIX或IV免疫球蛋白施用相關(guān)的過(guò)敏性反應(yīng)的先前歷史

服用全身性免疫抑制藥(例如，全身性糖皮質(zhì)激素；然而，允許HAART(高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法)實(shí)施例3.FIXFc在HEK293細(xì)胞中的產(chǎn)生在含有FIXFc (直接融合至Fe區(qū)域的天然FIX)的表達(dá)盒和單獨(dú)的Fe的表達(dá)盒的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生FIXFc。還用PC5的表達(dá)盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，所述PC5為允許FIX多肽的完全加工的加工酶。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有維生素K的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且它們分泌三種蛋白質(zhì)=FIXFc 二聚體、FIXFc單體(一個(gè)FIXFc鏈和一個(gè)Fe鏈)和Fe 二聚體。利用柱層析(蛋白A、Fract0gel DEAE和具有低離子強(qiáng)度的CaCl2的Q瓊脂糖假-親和力洗脫)純化FIXFc單體(“FIXFc”)，滅活病毒并且過(guò)濾以給人受試者施用。也參見(jiàn)Peters 等人，Blood.2010 年 3 月 11 日；115(10):2057-64(2010 年 I 月 7 日電子出版)；和美國(guó)專(zhuān)利N0.7，566，565 ;將每一個(gè)所述文獻(xiàn)和專(zhuān)利通過(guò)引用整體并入本文。通過(guò)使用MLA Electral600C(Medical Laboratory Automation/InstrumentLabs, Pleasantville, NY)定量其恢復(fù)FIX-缺陷型血漿的凝血活性的能力來(lái)測(cè)量FIXFc的促凝劑活性。將結(jié)果與使用世界衛(wèi)生組織FIX標(biāo)準(zhǔn)的系列稀釋物產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比較。因子IX的絲氨酸磷酸化和酪氨酸硫酸化被認(rèn)為對(duì)于體內(nèi)恢復(fù)是非常重要的。已報(bào)道由于Μ0Ν0ΝΙΝΕ 的更高的磷酸化/硫酸化水平(>90%/>90%對(duì)〈10%/5%) ,Μ0Ν0ΝΙΝΕ (由CSL Berhing銷(xiāo)售的血漿純化的因子IX(pdFIX))具有比BENEFIX (由Wyeth銷(xiāo)售的重組(rFIX))更好的體內(nèi)恢復(fù)。然而，HEK293細(xì)胞中產(chǎn)生的FIXFc幾乎不具有磷酸化/硫酸化(<10%/4%，這與BENEFIX 非常相似)，并且顯示比BENEFIX (0.7)更好的IVR (1.0IU/dl每IU/kg)。此外，如上所述產(chǎn)生的FIXFc 具有比 M0N0NINE (pdFIX)或 BENEFIX (rFIX)(0.1%)顯著更低(低10-100倍)的水平(0.01-0.001%)的激活的FIX(FIXa)(產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì))。所得的FIXFc在施用后將具有比Μ0Ν0ΝΙΝΕ 或BENEFIX 更少的不期望的血栓形成事件。實(shí)施例4.小兒研究:成人與小兒群體的發(fā)展之間的外推和相互關(guān)系顯示與FIX藥代動(dòng)力學(xué)的關(guān)系的患者特征包括年齡依賴(lài)性生理變化(Bjijrkman和 Berntorp, Clin.Pharmacokinetics40:815-32 (2001);和 Bjorkman, HemophiIia9 (增刊
I):101-10(2003))以及身體大小和組成(Shapiro, Hemophiliall:571-82 (2005))。因此，總體上已發(fā)現(xiàn)FIX的體重調(diào)節(jié)的清除率(CL)在從嬰兒期至成人期的生長(zhǎng)過(guò)程中隨年齡和/或體重增長(zhǎng)而減少，而終末半衰期(t1/2)相應(yīng)增加。對(duì)于rFIX產(chǎn)品(BENEFIX )，CL和處于穩(wěn)態(tài)的的體積分布(Vss)在兒童中增加，隨后在年人期過(guò)程中保持恒定；因此在小兒研究中密切監(jiān)測(cè)這些參數(shù)。FIX促凝活性物質(zhì)的活性(FIX:C)的峰值水平取決于在FIX的單次和/或重復(fù)給藥后FIX:C的初始分布體積。FIX的初始分布非?？臁Ｈ欢?，已顯示BENEFIX 的體內(nèi)恢復(fù)(平均增量恢復(fù))通常比單克隆抗體純化的血漿源性凝血因子(PdFIX)的體內(nèi)恢復(fù)低30%(Roth等人，Blood98:3600-3606 (2001))。此外，利用pdFIX的研究已顯示15歲及以下的受試者具有比年齡更大的受試者顯著更低的恢復(fù)(White等人，Thromb.Haemost.73:779_84 (1995))。因此，也將在小兒研究中進(jìn)行波谷和峰值水平的監(jiān)測(cè)。由于研究已顯示兒童與成人相比較可作出不同的反應(yīng)，利用縮短的藥代動(dòng)力學(xué)采樣在兒童中進(jìn)行利用50IU/kg的rFIXFc的基線(xiàn)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估。最近完成了·評(píng)估rFIXFc的單次靜脈內(nèi)施用在患有重度B型血友病的年齡18歲及以上的PTP中的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)的l/2a期研究(SYN-FIXFc-07-001)。來(lái)自該在人中的初始探索的初步結(jié)果顯示rFIXFc的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(平均終末半衰期、MRT和AUC)與文獻(xiàn)中對(duì)于BENEFIX (參見(jiàn)上文)所報(bào)道的相比較增加約3倍。此外，rFIXFc可被良好地耐受并且不存在注射部位反應(yīng)的體征以及不存在抑制劑的產(chǎn)生。綜上所述，這些安全性和藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果支持評(píng)估rFIXFc在預(yù)防和治療104個(gè)患有重度B型血友病(〈2%)的12歲及以上的PTP(對(duì)于先前的產(chǎn)品進(jìn)行至少100個(gè)治療ED)的出血中的安全性、藥代動(dòng)力學(xué)和療效的1/2/3期立項(xiàng)研究(998HB102研究(B-LONG)，參見(jiàn)上文)的啟動(dòng)。一旦可從立項(xiàng)研究獲得充足的安全性數(shù)據(jù)，則可啟動(dòng)小兒計(jì)劃以進(jìn)一步研究rFIXFc在兒童中的安全性和療效。rFIX在人中的延長(zhǎng)的半衰期的證明將意味著需要更低頻率的注射來(lái)預(yù)防和治療患有B型血友病的個(gè)體的出血。在先前治療的兒章 12歲)中進(jìn)行的2/3期小兒PTP研究一旦從立項(xiàng)研究(998HB102研究)獲得26ED的關(guān)于10個(gè)PTP (彡12歲)的數(shù)據(jù)，立即啟動(dòng)3期小兒研究。將在約25個(gè)臨床部位全局性進(jìn)行該2/3期小兒研究(在于招募前已對(duì)FIX產(chǎn)品進(jìn)行至少50個(gè)ED的PTP中進(jìn)行的)。將按照預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)篩選并且選擇約25個(gè)患有重度B型血友病(<2IU/dL[〈2%]內(nèi)源性FIX)的2_11歲的PTP(以確保20個(gè)可評(píng)估的受試者)。所有可評(píng)估的受試者將完成研究的藥代動(dòng)力學(xué)部分(關(guān)于研究前FIX產(chǎn)品的PK和隨后關(guān)于rFIXFc的PK)，并且將接受每周I次的rFIXFc給藥，進(jìn)行52周。本研究將記錄增量恢復(fù)、體內(nèi)半衰期、AUC和rFIXFc的清除。所有受試者將經(jīng)歷利用研究前FIX和rFIXFc的基線(xiàn)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估，并且每一個(gè)受試者的研究持續(xù)時(shí)間將為約69周，包括篩選和隨訪(fǎng)。每一個(gè)受試者將接受50IU/kg的rFIXFc的基線(xiàn)藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)估，然后接受每周I次利用50-60IU/kg的rFIXFc的重復(fù)給藥。關(guān)于患者的順從性,可如下將縮短的藥代動(dòng)力學(xué)取樣用于研究前產(chǎn)品和用于rFIXFc:給藥前、注射結(jié)束時(shí)、注射結(jié)束后30+10分鐘、3±1小時(shí)、24±3小時(shí)(第I天)、72±3小時(shí)(第3天)、120±3小時(shí)(第5天)和168±3小時(shí)(第7天)。為了解決免疫原性，將每周I次利用rFIXFc治療所有受試者，進(jìn)行最少50ED。將包括用于即時(shí)安全性(immediate safety)和耐受性的評(píng)估的安全性參數(shù),例如:(a) rFIXFc注射前和注射后30分鐘的生命體征(脈搏、血壓、呼吸速率、溫度)；(b)血液學(xué)和凝固參數(shù)；(C)臨床化學(xué)；(d)使用Nijmegen-改良Bethesda測(cè)定進(jìn)行的頻繁的FIX抑制劑測(cè)定(即將進(jìn)行第一次暴露時(shí)，ED4[第4周]、ED12、ED24、ED36和ED50);和(e)不利事件。通過(guò)評(píng)估出血事件的數(shù)目、出血間隔和治療次數(shù)以及每年和每事件的FIX的消耗來(lái)評(píng)估療效。在先前未治療的兒章(O - 11歲)中進(jìn)行的2/3期PUP研究一旦可在先前的研究中獲得來(lái)自10個(gè)先前治療的兒童(2-11歲)的關(guān)于完全動(dòng)力學(xué)參數(shù)和50ED的數(shù)據(jù)，就可啟動(dòng)2/3期小兒PUP研究。將在約60個(gè)臨床部位全局性地進(jìn)行該研究。將按照預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)篩選并且選擇最多30個(gè)患有重度B型血友病(<2IU/dL[〈2%]內(nèi)源FIX)的O歲和以上的PUP (以確保20個(gè)可評(píng)估的受試者)。由于可按照改進(jìn)的預(yù)防性方案使用rFIXFc開(kāi)始初始治療，因此研究的參與可變化。預(yù)期每患者研究參與為約4年，包括篩選和隨訪(fǎng)。在該時(shí)間過(guò)程中，預(yù)期大多數(shù)患者對(duì)于rFIXFc達(dá)到50ED。為了解決免疫原性，利用rFIXFc治療所有受試者，進(jìn)行約50ED或達(dá)到4年。將包括用于進(jìn)行即時(shí)安全性和耐受性評(píng)估的安全性參數(shù):(a)使用Nijmegen-改良Bethesda測(cè)定進(jìn)行的頻繁的FIX抑制劑測(cè)定；和(b)不利事件。通過(guò)評(píng)估出血事件的數(shù)目、出血間隔和治療次數(shù)以及每年和每事件的FIX的消耗來(lái)評(píng)估療效。實(shí)施例5.非人動(dòng)物的生物化學(xué)表征、活性和PK分析表征實(shí)施例3中產(chǎn)生的rFIXFc的翻譯后修飾，獲得下列結(jié)果(參見(jiàn)表15和圖
11)。rFIXFc的前肽在產(chǎn)生過(guò)程中被正確加工。rFIXFc的Y -羧基化模式與rFIX的γ-羧基化模式相似。此外，rFIXFc的總Gla/分子(11.2 + 0.7)與rFIX相當(dāng)。因?yàn)槟承埢系腨 -羧基化是FIX活性所必需的，因此這些是重要結(jié)果。此外，rFIXFc的Ser 158磷酸化和Tyrl55硫酸化可與rFIX相比較。FIX中的N聯(lián)接的聚糖未被完全唾液酸化，與rFIX相似。第一 EGF結(jié)構(gòu)域中的rFIXFc O聯(lián)接的糖基化與FIX相同，雖然相對(duì)比率不同。rFIXFc的Asp64具有比rFIX或血漿源性FIX(pdFIX)程度更高的β-羥基化。激活的FIX以比在rFIX或pdFIX制劑中低得多的水平存在于rFIXFc制劑，如在實(shí)施例3中更詳細(xì)地論述的。此外，給不同的動(dòng)物物種施用rFIXFc以測(cè)定其活性和PK參數(shù)。結(jié)果示于表16和圖12-16中。實(shí)施例6.Y -羧基化本研究的目的是分析和表征臨床前批次的FIXFc材料和商購(gòu)可得的FIX產(chǎn)品中的谷氨酸(Gla)的Y-羧基化，以表征富集的“峰”級(jí)分和源于假-親和力色譜離子交換步驟的高鹽洗脫“條帶(strip) ”級(jí)分的Gla含量，以及利用陰離子交換HPLC進(jìn)一步分離富集的“峰”和高鹽洗脫“條帶”級(jí)分并且進(jìn)一步表征分離的種類(lèi)。為了實(shí)現(xiàn)該目的，開(kāi)發(fā)了許多互補(bǔ)分析方法。此類(lèi)方法包括使用堿水解以測(cè)定(總)Gla含量的氨基酸分析(AAA)、使用Lys-C肽以測(cè)定Gla分布的肽圖譜(LC/MS)、分離同種型的完整分子的分析陰離子-交換HPLC以及測(cè)定生物活性的激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT) ο

含有2個(gè)Gla (E)的肽為:
- K1K2:YNSGKL7E8EFVQGNL15ER17ECM20E21EK.[M+H]+6Gla=2953.9.[M+H]+5Gla=2909.9- K3 =CSF26E27EAR30EVF33ENT36ERTT40EFffK.[M+H]+6Gla=2959.9.[M+H]+5Gla=2915.9.[M+H]+4Gla=2871.9使30微克的樣品(源于富集的峰級(jí)分、高鹽條帶級(jí)分和來(lái)自分析陰離子-交換HPLC的每一個(gè)種類(lèi))變性，將其還原、烷基化，利用Lys-C(1:20，E:S)進(jìn)行降解。利用2%TFA粹滅降解，將其注射至 JupiterC18 (2.0x250mm) Phenomenex 柱上。在 AgilentllOO 系統(tǒng)上進(jìn)行分離。將柱子維持在25°C，利用多步驟乙腈梯度進(jìn)行洗脫肽。以“三重”播放模式(“Triple Play”mode)進(jìn)行質(zhì)譜法(Thermo-Fisher LCQ)?；パa(bǔ)方法被開(kāi)發(fā)來(lái)分析和表征臨床前rFIXFc材料的Gla含量和分布。進(jìn)行臨床前批次的rFIXFc (富集的峰級(jí)分)的谷氨酸(Gla)含量和分布的Y-羧基化，并將其與商購(gòu)可得的產(chǎn)品進(jìn)行比較。分析顯示相對(duì)于商購(gòu)可得的產(chǎn)品的相似的Gla含量和分布。分析高鹽洗脫“條帶”級(jí)分，并將其與富集的峰級(jí)分相比較。分析顯示降低的Y-羧基化水平。從假-親和力層析離子-交換步驟分離FIXFc (富集的峰級(jí)分)，并且通過(guò)分析陰離子交換HPLC將其進(jìn)一步分成3個(gè)同種型。AEX柱負(fù)載和分離的種類(lèi)被高度Y-羧基化。(AEX柱負(fù)載為在高鹽洗脫步驟過(guò)程中從假-親和力層析離子-交換步驟收集的條帶級(jí)分)。AEX柱負(fù)載和分離的種類(lèi)具有生物活性。Gla含量和分布與rFIX相似。肽圖譜顯示4/5/6Gla在K3肽上的分布。肽圖譜顯示在K1K2肽上存在密集群體的6Gla和痕量水平的5Gla。從假-親和力層析離子-交換步驟分離FIXFc (條帶峰級(jí)分)，并利用分析陰離子交換HPLC將其進(jìn)一步分成2種同種型。AEX柱負(fù)載和分離的種類(lèi)的Y-羧基化水平下降。相對(duì)于FIXFc的富集的峰級(jí)分，Gla含量下降。觀(guān)察到降低的水平的生物活性。肽圖譜顯示在K1K2中相對(duì)于富集的峰級(jí)分存在增加的群體的5Gla，并且可暗示對(duì)生物活性的影響。參考資料(將所述每一份參考資料通過(guò)引用整體并入本文):Dumont JA，等人，Monomeric Fe Fusion Molecules in Therapeutic Abs-From Bench to Clinic,第33章第779-795 頁(yè)；Gillis s 等人,Protein Science (1997) 6:185 ；White GC,等人，J.Thrombosisand Haemostasis(1997)78:261 ;Hansson K 和 Stenflo J, Journal Thrombosis andHaemostasis (2005) 3:2633 ;和 Peters RT 等人，Blood (2010) 115:2057。實(shí)施例7.在HemB小鼠出血模型中評(píng)估rFIXFc促凝活性物質(zhì)的活性在HemB小鼠的體外全血ROTEM中和在HemB小鼠的體內(nèi)斷尾出血模型中顯示了rFIXFc與BENEFIX 的可比較的效力利用氯化鈣作為激活物(NATEM)，通過(guò)旋轉(zhuǎn)血小板彈力儀('ROTEM'Pentapharm GmbH, Munich, Germany)評(píng)估rFIXFc形成堅(jiān)硬且穩(wěn)定的血塊的能力。將通過(guò)大靜脈從HemB小鼠收集的混合全血分成7等份，用rFIXFc摻入所述等份至7.4%、0.74%和
0.074%的終濃度的正常血漿FIX活性或摻入BENEFIX 至10%、1%、0.1%的正常活性。作為陰性對(duì)照，用FIX配制緩沖液摻入血液樣品。 產(chǎn)生來(lái)自5只HemB小鼠的總共10份血液混合物以完整評(píng)估。通過(guò)加入CaCl2引發(fā)NATEM反應(yīng)。評(píng)估凝血參數(shù)，包括凝血時(shí)間(CT)、血塊形成時(shí)間(Clot Formation Time) (CFT)和α角。CT、CFT和α角的平均值和SD概述于表17中。將所述3個(gè)參數(shù)的劑量反應(yīng)繪制于圖17中。在測(cè)試的劑量范圍內(nèi)，所有3個(gè)參數(shù)在rFIXFc與BENEFIX 之間是可比較的(p>0.05，利用單因素ANOVA (Kruskal-Wallis)分析)。還在HemB小鼠斷尾出血模型中評(píng)估了 rFIXFc的急性療效。(圖18)。按照體重和年齡的平等形式將雄性HemB小鼠分層至不同的處理組。在斷尾損傷之前，利用50mg/kg氯胺酮和0.5mg/kg右美托咪啶的混合物麻醉小鼠，將其置于加熱墊上以幫助維持體溫。隨后將小鼠尾巴浸沒(méi)在37°C水中進(jìn)行10分鐘以擴(kuò)張側(cè)脈。在靜脈擴(kuò)張后，通過(guò)尾靜脈注射rFIXFc、BENEFIX 或媒介物，5分鐘后，使用#11具有直邊的解剖刀切取尾的遠(yuǎn)端4mm。將流出的血收集至13ml的溫鹽水中進(jìn)行30分鐘，然后定量失血的重量。測(cè)試6個(gè)rFIXFc處理組(720、360、240、120、80、40IU/kg, n=15)和 3 個(gè) BENEFIX 處理組(360、120、40IU/kg, n=15)。個(gè)體動(dòng)物的失血值和每個(gè)處理組的中值失血的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)示于圖19(A)中，并且每個(gè)處理組的中值失血體積概述于表18中。rFIXFc和BENEFIX 的中值失血體積的劑量反應(yīng)是可比較的(P=0.9315,利用非配對(duì)t檢驗(yàn)和Welch’s校正)。為了確定rFIXFc相對(duì)于BENEFIX 的延長(zhǎng)3倍的半衰期是否導(dǎo)致rFIXFc的延長(zhǎng)的療效，本發(fā)明人在HemB小鼠的離體ROTEMk:測(cè)定和尾靜脈橫斷出血模型(Tail VeinTransection bleeding model) (TVT)中評(píng)估了 rFIXFc 和 BENEFIX 的療效。圖 20。對(duì)于離體ROTEM ，雄性HemB小鼠通過(guò)靜脈內(nèi)注射接受50IU/kg的rFIXFc或100IU/kg 的 BENEFIX 。在 rFIXFc 給藥后 5 分鐘、24、72、96、120、168 和 216 小時(shí)(在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，n=8只 小鼠)或在BENEFIX 給藥后5分鐘、24、48、72和96小時(shí)(n=4只小鼠/時(shí)間點(diǎn))從處理的動(dòng)物的大靜脈收集全血。立即利用NATEM分析血液樣品。CTXFI^P α角的平均值和SD示于表19中，CT、CFI^P α-角對(duì)時(shí)間曲線(xiàn)示于圖21中。與BENEFIX 相比較，rFIXFc在第5分鐘顯示了可比較的CTXFI^P α角，但在72小時(shí)后顯示了顯著增加的CT、CFT和α角，雖然其劑量比BENEFIX 低2倍。為了評(píng)估rFIXFc和BENEFIX 的預(yù)防性療效，按照體重和年齡的平等形式將雄性HemB小鼠分層至9個(gè)不同的處理組中。在進(jìn)行尾靜脈橫斷前72小時(shí)以4IU/kg、13IU/kg、40IU/kg和120IU/kg的劑量通過(guò)iv注射施用rFIXFc，然而在損傷之前24小時(shí)施用相同劑量的BENEFIX 。在尾靜脈橫斷之前，利用50mg/kg氯胺酮/0.125mg/kg右美托咪啶/0.1mg/kg 丁丙諾啡的混合物麻醉小鼠。為了在尾靜脈橫斷后允許小鼠維持正?；顒?dòng)，提供Img/kg阿替美唑溶液以逆轉(zhuǎn)右美托咪啶的作用，隨后立即用直邊11號(hào)手術(shù)刀片在其中尾巴的直徑為約3_的區(qū)域進(jìn)行側(cè)尾靜脈橫斷。用溫鹽水洗掉流出的血液以確保清楚地觀(guān)察到傷口，隨后將小鼠單獨(dú)地關(guān)養(yǎng)在用白紙鋪墊的清潔的籠中，進(jìn)行另外24小時(shí)。觀(guān)察再出血和體力活動(dòng)，每小時(shí)記錄一次直至損傷后12小時(shí)。在鑒定后立即使垂死的小鼠安樂(lè)死，進(jìn)行損傷后24小時(shí)的檢定以完成研究。至安樂(lè)死的時(shí)間的卡普蘭-邁耶曲線(xiàn)和TVT后24小時(shí)的存活率的圖表示于圖22中。對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(Log-rank test)確定所有具有高于4IU/kg劑量的處理組比媒介物組顯著更好(p〈0.001)。此外，在損傷前72小時(shí)接受相同劑量的rFIXFc的小鼠之間的存活率是可比較的，對(duì)于在損傷前24小時(shí)接受BENEFIX 的小鼠，情況亦如此(對(duì)于 4、13、40 和 120IU/kg 的劑量組，分別地 p=0.4886,0.9268,0.7279 和 0.5209)。將 TVT后24小時(shí)的存活率作圖，從曲線(xiàn)外推每一種分子的ED50值，兩個(gè)處理的ED50在17.8IU/kg (對(duì)于rFIXFc)和15.4IU/kg (對(duì)于rFIX)上是相似的。因此，rFIXFc在HemB小鼠中提供了相對(duì)于可比較的劑量的BENEFIX 延長(zhǎng)3倍的保持持續(xù)時(shí)間，如通過(guò)尾靜脈橫斷損傷后的存活率和再出血測(cè)量的。因此，rFIXFc在HemB小鼠中提供了相對(duì)于可比較的劑量的BENEFIX 延長(zhǎng)3倍的保護(hù)持續(xù)時(shí)間，如通過(guò)尾靜脈橫斷損傷后的存活率和再出血測(cè)量的?？傊?，如數(shù)據(jù)顯示的，雖然15.4IU/kg的BENEFIX 導(dǎo)致50%的HemB小鼠活過(guò)在給藥后24小時(shí)進(jìn)行的尾靜脈橫斷，但17.8IU/kg的rFIXFc獲得50%的在給藥后72小時(shí)遭受損傷的動(dòng)物的存活率。因此，rFIXFc顯示了相對(duì)于BENEFIX 延長(zhǎng)3倍的與其半衰期延長(zhǎng)相關(guān)的預(yù)防性療效。來(lái)自出血模型的結(jié)果通過(guò)來(lái)自利用100IU/kg的BENEFIX 或50IU/kg的rFIXFc處理的HemB小鼠的全血的離體ROTEMr'.分析進(jìn)一步證實(shí)。在給藥后5分鐘，在兩個(gè)處理組中都觀(guān)察到血塊形成的可比較的促進(jìn)。然而，主要ROTEM .參數(shù)例如凝血時(shí)間、血塊形成時(shí)間和α -角在給藥后72至216小時(shí)在rFIXFc-處理的小鼠中得到顯著促進(jìn)，雖然rFIXFc的劑量比BENEFIX 低2倍。簡(jiǎn)而言之，rFIXFc的急性療效可與BENEFIX 的急性療效相比較，如在HemB小鼠的體外全血ROTEM 和斷尾出血模型中顯示的。rFIXFc的延長(zhǎng)的預(yù)防性療效示于來(lái)自處理的HemB小鼠的離體全血ROTEM "中并且其在HemB小鼠的尾靜脈橫斷出血模型中被測(cè)定為BENEFIX 的約3倍。rFIXFc的延長(zhǎng)的療效與先前在HemB小鼠的藥代動(dòng)力學(xué)研究中顯示的rFIXFc相對(duì)于BENEFIX 延長(zhǎng)3倍的T1/2密切相關(guān)。因此，rFIXFc對(duì)于按需治療具有完全活性，同時(shí)獲得顯著延長(zhǎng)的預(yù)防性保護(hù)作用，潛在地減少了給藥頻率，這正處于3期研究的調(diào)查中。實(shí)施例8.在FIX-缺陷型小鼠的單次皮下劑量后rFIXFc和BENEFIX 的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)分析在于FIX-缺陷型小鼠中進(jìn)行200或400IU/kg的單次靜脈內(nèi)或皮下注射后測(cè)定重組因子IX-Fc (rFIXFc)和BEN EFIX (rFIX)的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和藥效動(dòng)力學(xué)(PD)曲線(xiàn)。通過(guò)大靜脈收集全血(n=4只小鼠/時(shí)間點(diǎn)/處理)。使用人FIX-特異性ELISA測(cè)定血漿的rFIXFc和BENEFIX 濃度。使用激活部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)測(cè)定法測(cè)定rFIXFc和BENEFIX 的活性。使用WinNonLin，利用模型依賴(lài)性方法進(jìn)行PK分析。結(jié)果示于表22和23中。對(duì)于FIXFc，F(xiàn)IX-缺陷型小鼠中的生物利用度為38%(對(duì)于200IU/kg的劑量)和38-46% (對(duì)于組合劑量)(抗原ELISA)，以及29% (對(duì)于200IU/kg的劑量)和29-39% (對(duì)于組合劑量)(aPTT活性測(cè)定)，而rFIX分別為23%和19%。rFIXFc具有與BENEFIX 相比較提高至1.5-1.7倍(200IU/kg的劑量)和1.5-2.5倍(組合劑量)的生物利用度。對(duì)于rFIXFc，終末半衰期(抗原ELISA)為62小時(shí)(對(duì)于200IU/kg的劑量)和51-62小時(shí)(對(duì)于組合劑量)，以及終末半衰期(aPTT活性測(cè)定)為42小時(shí)(對(duì)于200IU/kg的劑量)和40-42小時(shí)(對(duì)于組合劑量)，然而對(duì)于BENEFIX ，終末半衰期為24小時(shí)(抗原ELISA)(對(duì)于200IU/kg的劑量)和17小時(shí)(aPTT活性測(cè)定)(對(duì)于200IU/kg的劑量)。這顯示對(duì)于rFIXFc半衰期延長(zhǎng)至2.5-2.6倍(200IU/kg的劑量和組合劑量)。此外，如表22和23顯示的，rFIXFc相對(duì)于BENEFIX 具有增加至4.5-5.6倍的AUC/劑量和增加至1.9-3.7倍的Cmax/劑量。
重組因子IX Fe融合(rFIXFc)蛋白是重組FIX (rFIX)的長(zhǎng)效形式，其將提供更低頻率的rFIX給藥來(lái)治療B型血友病。從小鼠至非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物以及在B型血友病患者中，rFIXFc具有相對(duì)于rFIX (BENEFIX )延長(zhǎng)約3倍的半衰期。對(duì)于預(yù)防性治療，rFIX的靜脈內(nèi)遞送仍然是令人煩擾的遞送方法，特別地對(duì)于兒童和在具有不易進(jìn)入的靜脈的患者中。rFIX的皮下施用呈現(xiàn)為侵襲性較小并且給藥頻率減少的更吸引人的遞送途徑。這樣，rFIXFc的皮下遞送將導(dǎo)致比靜脈內(nèi)遞送更少的疼痛和不適，并且因比靜脈內(nèi)途徑更容易施用和以更少次數(shù)施用而導(dǎo)致改善的順從性。預(yù)防性方案還改善了生活質(zhì)量并且臨床結(jié)果將包括減少的出血發(fā)病率。使用人FIX特異性ELISA測(cè)量小鼠血漿的rFIXFc濃度，所述ELISA測(cè)量分子的FIX部分，將mg/kg標(biāo)稱(chēng)劑量用于分析。rFIXFc和BENEFIX 的PK參數(shù)的概述示于表20 (抗原ELISA)和表21 (aPTT活性測(cè) 定)中，n=4/組?？乖突钚缘姆治龆硷@示rFIXFc的Cmax和AUC相對(duì)于BENEFIX 都得到顯著增加。通過(guò)使用抗原ELISA，相對(duì)于BENEFIX 的23%，rFIXFc的生物利用度(F%)為38%。類(lèi)似地，通過(guò)使用aPTT活性測(cè)定，相對(duì)于BENEFIX 的19%，rFIXFc的生物利用度為29%。因此，rFIXFc顯示生物利用度增加至BENEFIX 的1.5至
1.6倍。消除半衰期的測(cè)量顯示rFIXFc顯著延長(zhǎng)半衰期，無(wú)論是通過(guò)抗原測(cè)定(rFIXFc62小時(shí)對(duì)BENEFIX 24小時(shí))還是通過(guò)活性測(cè)定(rFIXFc42小時(shí)對(duì)BENEFIX 17小時(shí))測(cè)定測(cè)量的。這些數(shù)據(jù)顯示rFIXFc具有為BENEFIX 的2.6至2.5倍的延長(zhǎng)的半衰期。皮下施用至FIX-缺陷型小鼠的rFIXFc顯示rFIXFc與BENEFIX 相比較的Cmax和AUC均增加的PK和H)曲線(xiàn)?？傮w上，與具有19-23%的生物利用度和17-24%的半衰期的BENEFIX 相比較，rFIXFc分別具有29%(活性)至38%(抗原)的生物利用度和42小時(shí)(活性)至62小時(shí)(抗原)的半衰期。因此，F(xiàn)IX-缺陷型小鼠中皮下遞送的rFIXFc的半衰期顯示增加至靜脈內(nèi)提供的目前銷(xiāo)售的rFIX產(chǎn)品的約2.2倍(抗原)至3.3倍(活性)。總體上，這些數(shù)據(jù)支持皮下遞送的rFIXFc對(duì)于B型血友病患者的預(yù)防性治療可具有臨床益處的概念。實(shí)施例9.在食蟹猴中單次皮下給藥后rFIXFc的藥代動(dòng)力學(xué)分析在食蟹猴中50IU/kg、100IU/kg或200IU/kg的單次皮下給藥后研究重組因子IX-Fc (rFIXFc)的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)曲線(xiàn)。使用FIX-特異性ELISA測(cè)量血漿的rFIXFc濃度。使用WinNonLin，利用模型依賴(lài)性方法進(jìn)行初步分析。參見(jiàn)表22-25。血漿濃度對(duì)時(shí)間數(shù)據(jù)(通過(guò)FIX-特異性ELISA測(cè)量的)的藥代動(dòng)力學(xué)分析顯示生物利用度和終末半衰期在劑量間是相似的。rFIXFc的生物利用度為40%(50IU/kg)、34%(100IU/kg) ,36%(200IU/kg)和 36-45%(組合劑量)。rFIXFc 的終末半衰期為 61 小時(shí)(50IU/kg)、45 小時(shí)(lOOIU/kg)、49 小時(shí)(200IU/kg)和 44-58 小時(shí)(組合劑量)。使用人FIX特異性ELISA測(cè)量猴血漿的rFIXFc濃度，所述ELISA測(cè)量分子的FIX部分，將mg/kg標(biāo)稱(chēng)劑量用于分析。加標(biāo)回收(Spike and recovery)分析顯示該FIX特異性ELISA測(cè)定用于在評(píng)估的血漿濃度范圍內(nèi)檢測(cè)rFIXFc的精確度。rFIXFc的PK參數(shù)的概述示于表 22(50幾/1^)、表 23(100幾/1^)和表 24 (200IU/kg)中，n=3 只 / 組。對(duì)于 rFIXFcSC, Cmax的幾何平均值和幾何平均值的CV%為860+22 (50IU/kg)、1630+97 (100IU/kg)和3，750+26 (200IU/kg)，各自顯示劑量依賴(lài)性增加。對(duì)于AUC看到類(lèi)似的增加。生物利用度(F%)的幾何平均值為 40+16 (50IU/kg)、30+75 (100IU/kg)和 36+27 (200IU/kg)，顯示了生物利用度在劑量間是相似的。終末半衰期的測(cè)量顯示半衰期在劑量之間(58+39小時(shí)(50IU/kg) ,45+13 小時(shí)(lOOIU/kg)和 46+44 小時(shí)(200IU/kg))是相似的。皮下施用至食蟹猴的rFIXFc顯示具有Cmax和AUC的劑量依賴(lài)性增加的PK曲線(xiàn)?？傮w上，生物利用度為30-40%，半衰期為45-58小時(shí)。因此，猴子中皮下遞送的rFIXFc的半衰期顯示增加至靜脈內(nèi)提供的目前銷(xiāo)售的rFIX產(chǎn)品的約2.8倍。總體上，這些數(shù)據(jù)支持皮下遞送的rFIXFc對(duì)于B型血友病患者的預(yù)防性治療可具有臨床益處的概念。實(shí)施例10.預(yù)測(cè)的預(yù)防性給藥方案與標(biāo)準(zhǔn)推薦的每周2次或3次的25至40IU/kg的FIX的給藥方案相比較，來(lái)自上述l/2a期研究的中值rFIXFc活性的PK結(jié)果顯示，以約22.5IU/kg約每周I次或以約45IU/kg約每10天I次或以約120IU/kg約每2周I次的rFIXFc給藥足以維持高于基線(xiàn)1%的波谷(圖24)。這些模型模擬評(píng)估得到可從l/2a期試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)驗(yàn)證，其完全落在隨時(shí)間過(guò)去的活性的模擬曲線(xiàn)(simulated activity-over-time curve)的95%置信區(qū)間內(nèi)。這些方案通常在療法開(kāi)始時(shí)使用。鑒于相對(duì)于血漿FIX活性的波谷水平的報(bào)道的臨床穿破性出血事件的異質(zhì)性(heterogeneity),需要個(gè)別地調(diào)整維持劑量。在重新計(jì)算1/2期研究的PK結(jié)果(參見(jiàn)實(shí)施例11)后，新型預(yù)測(cè)的給藥方案(例如用于預(yù)防)為每周I次20IU/kg、每10天I次40IU/kg或每2周I次(每月2次)100IU/kg。也參見(jiàn)表27和圖25。實(shí)施例11.來(lái)自首次應(yīng)用于人體的(FiH)的研究(實(shí)施例1)的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的重新計(jì)算具有多種B型血友病基因型例如終止密碼子/無(wú)義和錯(cuò)義突變的受試者，包括在實(shí)施例1中描述的FiH研究中。幾個(gè)受試者具有與顯著減少的FIX活性相關(guān)的顯著降低的內(nèi)源性FIX抗原水平，然而具有錯(cuò)義基因型的少數(shù)受試者具有比測(cè)量的活性更多的抗原，這顯示了功能失調(diào)的循環(huán) 蛋白質(zhì)。2個(gè)受試者中的治療前FIX活性超過(guò)2IU/dL,這可能歸因于從基于歷史測(cè)試和疾病表型的他們最后一次FIX濃縮物輸注的不完全沖洗?；谠撔畔?，在不扣除基線(xiàn)的情況下重新計(jì)算來(lái)自實(shí)施例1的PK數(shù)據(jù)，這在下面進(jìn)行了詳細(xì)地描述。參見(jiàn)表27。與實(shí)施例1的PK計(jì)算(基于活性)相反，如果在不扣除基線(xiàn)的情況下建立rFIXFc活性PK的模型，如最近對(duì)于糖基PEG化(glycoPEGylated)的rFIX的PK分析所報(bào)道的(Negrier 等人，Blood D0I10.1182/blood201102335596 (2011)，將其通過(guò)引用整體并入本文)，所得的消除半衰期和MRT的評(píng)估比實(shí)施例1中的評(píng)估長(zhǎng)得多，分別地為82.2±21.6小時(shí)和96.8±22.0小時(shí)(平均值土SD)。然而，應(yīng)理解并非所有重度B型血友病患者都具有0%的內(nèi)源FIX活性，并且考慮到患者的基因型和內(nèi)源FIX抗原水平，本發(fā)明人在其PK建模中采用基線(xiàn)扣除分析法。具體地，(a) 2個(gè)患者的基線(xiàn)被確定為0%，因?yàn)樗鼈兊闹委熐癋IX活性〈1%，它們不具有可檢測(cè)的FIX抗原并且具有無(wú)義基因型，(b)將3個(gè)患者的基線(xiàn)設(shè)置在0.5%，因?yàn)樗鼈兊闹委熐癋IX活性〈1%并且它們具有可檢測(cè)的FIX抗原，(c)對(duì)于其治療前FIX活性在1- 2%之間的患者，Cmin (在整個(gè)PK研究中最低的活性)被確定為基線(xiàn)，以及(d)對(duì)于其治療前FIX活性彡2%的患者，2%(其為試驗(yàn)招募的上限)為基線(xiàn)。高于給藥前基線(xiàn)的活性被認(rèn)為是來(lái)自先前治療的殘留藥物，使其衰減至基線(xiàn)，并且在rFIXFc給藥后將其從PK數(shù)據(jù)扣除。
所得的rFIXFc的平均終末半衰期(56.7±10.9小時(shí)，范圍為42.4 - 74.5小時(shí))和MRT(71.8±10小時(shí)，范圍為53.2-85.9小時(shí))約為對(duì)于rFIX所報(bào)道的3倍。報(bào)道的rFIX的終末半衰期為19.3±4.97小時(shí)(范圍為11.1-36.4小時(shí))以及MRT為26.0±6.07小時(shí)(范圍為 15.8-46.1 小時(shí))。Roth 等人，Blood98:3600-3606 (2001);和 Summary ofProduct Characteristics for BENEFIX , Electronic Medicines Compendium(2010)(http: //www.medicines, org.uk/emc/medicine/20376/SPC/BENEFIX /#PHARMAC0DYNAMIC_PR0PS)，將所述每一篇文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。因此，rFIXFc的范圍不與rFIX的范圍重疊。類(lèi)似地，rFIXFc活性的平均CL(3.18±0.78mL/hr/kg,范圍為2.05-4.18mL/hr/kg)比對(duì)于rFIX所報(bào)道的活性的平均CL(8.40±2.01mL/hr/kg,范圍為4.66-13.64mL/hr/kg)低2.6倍,雖然兩種蛋白質(zhì)的Vss在4_5倍血衆(zhòng)體積上是可比較的。雖然在rFIXFc抗原PK中觀(guān)察到朝向提高的相同趨勢(shì)，但rFIXFc抗原的Τ1/2α和T172 β都顯著比來(lái)源于FIX活性測(cè)量的更長(zhǎng)。針對(duì)rFIXFc抗原估計(jì)的Τ1/2α明確地偏離通常與FIX相關(guān)的Τ1/2 α (23小時(shí))。此外，在rFIXFc的輸注之前可能的從研究前替代療法的不完全沖洗有時(shí)導(dǎo)致更高的基線(xiàn)值，這反過(guò)來(lái)可導(dǎo)致rFIXFc T172 β的低估，如通過(guò)FIX活性測(cè)量的。許多受試者在達(dá)到給藥后336小時(shí)(14天)的更晚的時(shí)間點(diǎn)上具有高達(dá)3IU/dL的aPTT活性，充分高于aPTT測(cè)定的定量檢出限(lIU/dL)。然而，從終末半衰期的評(píng)估除去這些時(shí)間點(diǎn)，因?yàn)樗鲋堤幱谥委熐盎€(xiàn)或僅略高于治療前基線(xiàn)，因此被認(rèn)為已返回至基線(xiàn)。相反地，rFIXFc的較低但可檢測(cè)的終末期水平可利用特異性且高靈敏性rFIXFc抗原ELISA來(lái)顯示，所述ELISA可檢測(cè)與1.0IU/dl的aPTT下限相比較低至0.lIU/dL。剩余的PK參數(shù)(活性)相對(duì)于消除半衰期和MRT發(fā)生少量改變。參見(jiàn)表27 (B)?；谠谳斪⒑罅⒓串a(chǎn)生的Cmax和AUCinf(表4)觀(guān)察到FIX活性的與劑量成比例的線(xiàn)性增力口。FIX活性在輸注rFIXFc后顯示雙指數(shù)衰減，特征在于快速分布(α)期，隨后對(duì)數(shù)-線(xiàn)性消除(β)期。對(duì)于單個(gè)受試者平均分布半衰期(Τ1/2α)是高度可變的(對(duì)于兩個(gè)更高的劑量組平均為3.4和10.3小時(shí))(表27(B))。平均消除半衰期(Τ1/2 β )在測(cè)試的治療性劑量范圍內(nèi)是不依賴(lài)于劑量的，即在25IU/kg、50IU/kg和100IU/kg時(shí)分別為53.5小時(shí)、57.5±8.2小時(shí)和56.5±14.I小時(shí)。達(dá)到高于基線(xiàn)1%(IIU/dL)的時(shí)間(rFIXFc活性的評(píng)估)顯示與劑量成比例的增加。其對(duì)于25,50和lOOIU/kg的劑量分別為7.3,10.1 + 1.5和12.3±2.5天。在給藥后168小時(shí)(I周)，對(duì)于25、50和100IU/kg的劑量組，血漿FIX活性分別保持在高于基線(xiàn)的 1.1 IU/dL、2.5±0.9IU/dL 4.6±1.7IU/dL。在 25 至 100IU/kg的劑量范圍內(nèi)MRT、CL和Vss也不是劑量依賴(lài)性的。此外，每個(gè)lIU/kg的輸注的rFIXFc使血漿FIX活性平均升高0.93±0.18幾/也(表27 ))，并且該增量恢復(fù)(K)顯示微弱的與體重的正相關(guān)性(R2=0.336，p=0.048)。長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)性臨床經(jīng)驗(yàn)已顯示低至I至2IU/dL的持續(xù)血漿因子活性足以防止重度A型和B型血友病患者的自發(fā)性出血事件(Nilsson等人，J.1ntern.Med.232:25-32 (1992)，將該文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文)，增加的出血事件與低于1%的正常FVIII活性的時(shí)間量相關(guān)。Collins等人，Thromb Haemost7:413-420 (2009),將其通過(guò)引用整體并入本文。因此，PK分析提供了利 用個(gè)體化劑量建模最優(yōu)化預(yù)防性治療以獲得持續(xù)的高于基線(xiàn)l%(lIU/dL)的波谷水平，減少峰/谷變化和提高治療的成本效益。Carlsson等人,HaemophiIia4:83-88 (1998) ；Kisker 等人,HaemophiIia9:279-284 (2003)，將所述每一篇文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。為了構(gòu)建在不同的給藥方案后濃度-時(shí)間曲線(xiàn)，使用rFIXFc的群體PK模型進(jìn)行蒙特卡羅模擬。測(cè)試群體的模型參數(shù)(CL、分布體積、隔室間清除率和第二隔室的體積)、個(gè)體間差異和殘留差異性的平均評(píng)估被采用于該l/2a期研究。Wang等人，J.Clin.Pharmacol.49:1012-1024 (2009)，將其通過(guò)引用整體并入本文。每給藥方案模擬1000個(gè)受試者，每一個(gè)受試者使用14至16個(gè)采樣點(diǎn)。對(duì)于每周I次的給藥采用14個(gè)采樣點(diǎn)，對(duì)于每10天I次的給藥采用15個(gè)采樣點(diǎn)，對(duì)于隔周I次的給藥采用16個(gè)采樣點(diǎn)。按照公開(kāi)的方法即，基于Z=BW-0.5的乘冪方程產(chǎn)生體重(BW) ,Wang等人(2009)。假定1000個(gè)受試者的中值BW為75kg?；谀M的濃度-時(shí)間曲線(xiàn)，用圖為不同給藥方案構(gòu)建1000個(gè)受試者的藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)。圖25。與標(biāo)準(zhǔn)推薦的每周2次的25至40IU/kg的FIX的給藥方案相比較，來(lái)自本研究的中值rFIXFc活性PK建模結(jié)果顯示，以20IU/kg每周I次的rFIXFc給藥或以40IU/kg每10天I次的rFIXFc給藥或以100IU/kg每2周I次的rFIXFc給藥足以維持高于基線(xiàn)1%的波谷。圖25。這些模型模擬評(píng)估得到可從該l/2a期研究獲得的數(shù)據(jù)驗(yàn)證，其完全落在隨時(shí)間過(guò)去的活性的模擬曲線(xiàn)的95%的置信區(qū)間內(nèi)。然而，鑒于相對(duì)于血漿FIX活性的波谷水平的報(bào)道的臨床突破性出血事件的異質(zhì)性(Bjorkman, HaemophiIia9:101-110 (2003)
；Ahnstrom等人，HaemophilialO: 689-697 (2004),將所述每一篇文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文)，需要個(gè)別地調(diào)整維持劑量。表表1:多核苷酸序列:FIx-FcA.FTX-Fc 鏈 DNA 序列(SEQ ID NO:1，其編碼 SEQ ID NO:2)pSYN-FIX-030 核苷酸序列(ntl 至 7583):FIX外顯子I (信號(hào)肽，第I個(gè)氨基酸前肽):nt690_777FIX 最小內(nèi)含子:nt778_1076FIX 前肽序列:ntl077_1126 成熟FIX 序列:ntll27_2371Fe:nt2372-3052gcgcgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaa
權(quán)利要求
1.一種將因子IX施用給需要其的人受試者的方法，其包括以約每周I次或更長(zhǎng)的給藥間隔給所述受試者施用劑量為至少約25IU/kg的包含因子IX和FcRn結(jié)合伴侶(FcRn BP)的嵌合多肽。
2.一種將因子IX施用給需要其的人受試者的方法，其包括以約每周I次或更長(zhǎng)的給藥間隔給所述受試者施用劑量為至少約10或至少約20IU/kg的包含因子IX和FcRn結(jié)合伴侶(FcRn BP)的嵌合多肽。
3.一種將因子IX施用給需要其的人受試者的方法，其包括給以約每周I次或更長(zhǎng)的給藥間隔給所述受試者施用劑量為至少約10iu/kg的包含因子IX和XTEN的嵌合多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽的血漿水平在至少約6天后在至少約80%的患者群體中達(dá)到至少約lIU/dl的波谷或在至少約6天后在所述受試者中達(dá)到至少約lIU/dl的波谷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽的血漿水平達(dá)到 在患者群體中約l-5IU/dl的平均波谷；或 在所述受試者中約l- 5IU/dl的波谷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量中少于25%的所述因子IX嵌合多肽被完全磷酸化并且所述劑量中少于25%的所述因子IX嵌合多肽被完全硫酸化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述劑量中少于約10%的所述嵌合多肽被磷酸化并且所述劑量中少于約9%的所述嵌合多肽被硫酸化。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量具有大于0.75IU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀(guān)察值)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述劑量具有至少約0.8、至少約0.9或至少約lIU/dL每IU/kg的平均增量恢復(fù)(K-值)(活性；觀(guān)察值)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽顯示所述患者群體或所述受試者的一個(gè)或多個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所述參數(shù)選自: 約3.36 ±0.93mL/hr/kg的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性);約 3.0-3.72,3.0,3.1,3.2,3.3,3.4,3.5,3.6、3.7 或 3.72mL/hr/kg 的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)； 比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的清除率低約2.5倍的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)； 約1.84-4.58mL/hr/kg的所述受試者的清除率(CL)(活性) 至少約68.05±11.16小時(shí)的所述患者群體的平均平均停留時(shí)間(MRT)(活性)； 約60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小時(shí)的所述患者群體的平均MRT (活性)； 為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均MRT的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均MRTU^i); 約53.1-85.8小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性); 至少約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85或約90小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性)； 約52.5±9.2小時(shí)的所述患者群體的平均t1/2e (活性)；為約47-60小時(shí)、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約.57、約58、約59、約60小時(shí)的所述患者群體的平均t1/20 (活性);為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均t1/2e的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均t1/20 (活性)； 約40-67.4、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70或約75小時(shí)的所述受試者的tl/2 0 (活性); 約0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)；約 0.85-1.15、約 0.85、約 0.86、約 0.87、約 0.88、約 0.89、約 0.90、約 0.91、約 0.92、約 0.93、約 0.94、約 0.95、約 0.96、約 0.97、約 0.98、約 0.99、約 1.0、約 1.05、約 1.10 或約.1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRN BP的多肽的平均增量恢復(fù)高約24%的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 約0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受試者的增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 約226 ±67.76mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性)；約 200-300、約 200、約 210、約 220、約 230、約 240、約 250、約 260、約 270、約 280、約 290或約300mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性); 約145-365mL/kg的所述受試者的Vss (活性)； 約32.44± 10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)；約 26-40、約 26、約 27、約 28、約 29、約 30、約 31、約 32、約 33、約 34、約 35、約 36、約 37、約38、約39或約40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)； 約21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受試者的AUC/劑量。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔為6-10天。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量選自約25-110、約30-110、約40-110、約 50-110、約 60-110、約 70-110、約 80-110、約 90-110 和約 100-110IU/kg。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量選自約30-100、約30-90、約30-80、約.30-70、約 30-60、約 30-50 和約 30_40IU/kg。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量選自約40-110、約50-100、約60-90和約 70-80IU/kg。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量選自約40-50、約50-60、約60-70、約70-80、約 80-90、約 90-100 和約 100-110IU/kg。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量選自約25、約30、約35、約40、約45、約 50、約 55、約 60、約 65、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 95、約 100、約 105 和約 110IU/kg 。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約7-10、約7-9和約7-8天。
18.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約8-10和約.9-10 天。
19.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約6-7和約8-9天。
20.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約6、約7、約8、約9和約10天。
21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量為約30-50IU/kg并且所述給藥間隔為約7天。
22.根據(jù)權(quán)利要求4-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中在至少約90%的所述患者群體中達(dá)到所述波谷。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中在約100%的所述患者群體中達(dá)到所述波谷。
24.根據(jù)權(quán)利要求1_11、22和23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為約50IU/kg，并且所述給藥間隔為約7天。
25.根據(jù)權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為約50IU/kg，所述給藥間隔為約7天，并且在約100%的所述患者群體中達(dá)到所述波谷。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔為9-18天。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量選自約90-180、約100-180、約110-180、約 120-180、約 130-180、約 140-180、約 150-180、約 160-180 和約 170_180IU/kg。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量選自約90-170、約90-160、約90-150、約 90-140、約 90-130、約 90-120、約 90-110 和約 90_100IU/kg。
29.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量選自約100-170、約110-160、約120-150 和約 130-140IU/kgo
30 .根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量選自約90-100、約100-110、約110-120、約 120-130、約 130-140、約 140-150、約 150-160 和約 160_170IU/kg。
31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量選自約90、約95、約100、約105、約110、約 115、約 120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約 150、約 155、約 160、約 165、約170、約 175 和約 180IU/kg。
32.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約9-17、約9-16、約 9-15、約 9-14、約 9-13、約 9-12、約 9-11 和約 9-10 天。
33.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約10-18、約11-18、約 12-18、約 13-18、約 14-18、約 15-18、約 16-18 和約 17-18 天。
34.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約10-11、約11-12、約 12-13、約 13-14、約 14-15、約 15-16 和約 16-17 天。
35.根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔選自約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17和約18天。
36.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量為約100IU/kg并且所述給藥間隔為至少約12天。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述波谷在至少約70%、約80%或約90%的所述患者群體中為至少約lIU/dl。
38.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述給藥間隔為約12-13天。
39.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量為約100IU/kg并且所述給藥間隔為至少約9天。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述波谷在約100%的所述患者群體中為至少約lIU/dl。
41.根據(jù)權(quán)利要求26或39所述的方法，其中所述給藥間隔為約9-15天。
42.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述劑量為約150IU/kg并且所述給藥間隔為至少約14天。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述波谷在約100%的所述患者群體中為至少約lIU/dl。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者需要控制或預(yù)防出血或出血事件。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述受試者需要控制或預(yù)防少量出血、關(guān)節(jié)積血、表淺肌肉出血、軟組織出血、中度出血、解剖造成的骨內(nèi)或軟組織出血、粘膜出血、血尿、大出血、咽出血、咽后部出血、腹膜后腔出血、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、瘀傷、切傷、刮擦、關(guān)節(jié)出血、鼻出血、口出血、牙齦出血、顱內(nèi)出血、腹膜內(nèi)出血、少量自發(fā)性出血、重度創(chuàng)傷后出血、中度皮膚擦傷或至關(guān)節(jié)、肌肉、內(nèi)臟器官或腦中的自發(fā)性出血。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者需要圍手術(shù)期管理。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述受試者需要與手術(shù)或拔牙相關(guān)的出血的管理。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述受試者將經(jīng)歷，正在經(jīng)歷或已經(jīng)歷大手術(shù)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述大手術(shù)為矯形手術(shù)、廣泛的口腔手術(shù)、泌尿外科手術(shù)或疝氣手術(shù)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述矯形手術(shù)是膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)或其它主要關(guān)節(jié)的置換。
51.根據(jù)權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者需要預(yù)防性治療。
52.根據(jù)權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者需要按需治療。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述受試者需要治療出血事件。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述受試者需要治療出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、出血、出血至肌內(nèi)、口腔出血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)出血、腹腔內(nèi)出血、胸內(nèi)出血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。
55.根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述受試者需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期管理或手術(shù)治療。
56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述手術(shù)為小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝切開(kāi)術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、穿顱術(shù)、骨接合術(shù)、創(chuàng)傷手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。
57.根據(jù)權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試者為人。
58.根據(jù)權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽中的因子IX為人因子IX。
59.根據(jù)權(quán)利要求1-58中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述因子IX為突變型因子IX。
60.根據(jù)權(quán)利要求1-59中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽中的所述FcRnBP為人Fe。
61.根據(jù)權(quán)利要求1-60中任一項(xiàng)所述的方法，其中嵌合多肽中的所述FcRnBP為突變型Fe。
62.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述因子IX與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸I至415)具有至少90%或95%的同一性。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述因子IX與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸I至415)完全相同。
64.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述Fe與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的Fe氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸I至227)具有至少90%或95%的同一性。
65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述Fe與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的Fe氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸I至227)完全相同。
66.根據(jù)權(quán)利要求1-65中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述嵌合多肽以包含與所述嵌合多肽締合的第二多肽的雜合體的形式存在，其中所述第二多肽包含F(xiàn)cRn BP0
67.根據(jù)權(quán)利要求66所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX和Fe氨基酸序列(SEQ ID NO: 2的氨基酸I至642)具有至少90%或95%的同一性的序列。
68.根據(jù)權(quán)利要求67所述的方法，其中所述嵌合多肽包含與2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX和Fe氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸I至642)完全相同的序列。
69.根據(jù)權(quán)利 要求66-68中任一項(xiàng)所述的方法,其中所述第二多肽包含與表2B中顯不的不具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4的氨基酸I至227)具有至少90%或95%的同一丨I"生的序列。
70.根據(jù)權(quán)利要求69所述的方法，其中所述第二多肽包含與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸I至227)完全相同的序列。
71.根據(jù)權(quán)利要求1-70中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者需要以每周I次或更長(zhǎng)的給藥間隔進(jìn)行的長(zhǎng)期治療。
72.根據(jù)權(quán)利要求1-71中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述嵌合多肽作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的部分施用。
73.一種多肽，其包含與表2A中顯示的不包含信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO: 2的氨基酸I至415)具有至少90%或95%的同一性的因子IX，和FcRn BP。
74.根據(jù)權(quán)利要求73所述的多肽，其中所述因子IX與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸I至415)完全相同。
75.一種多肽，其包含與表2A中顯示的具有信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQID NO: 2的氨基酸-46至415)具有至少90%或95%的同一性的因子IX，和FcRn BP0
76.根據(jù)權(quán)利要求75所述的多肽，其中所述因子IX與表2A中顯示的具有信號(hào)序列和前肽的因子IX氨基酸序列(SEQ ID NO:2的氨基酸-46至415)完全相同。
77.根據(jù)權(quán)利要求73-65中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述FcRnBP與表2B中顯示的Fe氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸I至227)具有至少90%或95%的同一性。
78.根據(jù)權(quán)利要求77所述的多肽，其中所述Fe與表2B中顯示的Fe氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸I至227)完全相同。
79.根據(jù)權(quán)利要求73或75所述的多肽，其包含與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX和Fe氨基酸序列(SEQ ID NO: 2的氨基酸I至642)具有至少90%或95%的同一性的序列。
80.根據(jù)權(quán)利要求79所述的多肽，其包含與表2A中顯示的不具有信號(hào)序列和前肽的因子IX和Fe氨基酸序列(SEQ ID NO: 2的氨基酸I至642)完全相同的序列。
81.根據(jù)權(quán)利要求73-80中任一項(xiàng)所述的多肽，其以包含第二多肽的雜合體的形式存在，其中所述第二多肽包含F(xiàn)cRn BP0
82.根據(jù)權(quán)利要求81所述的多肽，其中所述第二多肽包含與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO: 4的氨基酸I至227)具有至少90%或95%的同一性或與表2B中顯示的具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸-20至227)具有至少90%或95%的同一性的序列。
83.根據(jù)權(quán)利要求81所述的多肽，其中所述第二多肽包含與表2B中顯示的不具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:4的氨基酸I至227)完全相同或與表2B中顯示的具有信號(hào)序列的氨基酸序列(SEQID NO:4的氨基酸-20至227)具有至少90%或95%的同一性的序列。
84.根據(jù)權(quán)利要求73-83中任一項(xiàng)所述的多肽，其與血漿源性因子IX相比較具有大幅減少的磷酸化和硫酸化。
85.根據(jù)權(quán)利要求84所述的多肽，其少于約10%被磷酸化并且少于約9%被硫酸化。
86.根據(jù)權(quán)利要求73-85中任一項(xiàng)所述的多肽，其具有大于0.7或0.75的K值。
87.根據(jù)權(quán)利要求86所述的多肽，其具有至少約0.8、至少約0.9或至少約I的K值。
88.根據(jù)權(quán)利要求73-87中任一項(xiàng)所述的多肽，其顯示所述患者群體或所述受試者的一個(gè)或多個(gè)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所述參數(shù)選自: 約3.36 ±0.93mL/hr/kg的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性);約 3.0-3.72、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7 或 3.72mL/hr/kg 的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)； 比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的清除率低約2.5倍的所述患者群體的平均清除率(CL)(活性)； 約1.84-4.58mL/hr/kg的所述受試者的清除率(CL)(活性) 至少約68.05±11.16小時(shí)的所述患者群體的平均平均停留時(shí)間(MRT)(活性)； 約60-78、60、62、64、66、68、70、72、74、76或78小時(shí)的所述患者群體的平均MRT (活性)； 為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均MRT的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均MRTU^i); 約53.1-85.8小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性); 至少約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85或約90小時(shí)的所述受試者的平均停留時(shí)間(MRT)(活性); 約52.5±9.2小時(shí)的所述患者群體的平均t1/2e (活性)； 為約47-60小時(shí)、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約.57、約58、約59、約60小時(shí)的所述患者群體的平均t1/20 (活性)；為包含所述因子IX但無(wú)所述FcRn BP的多肽的平均t1/2e的約3倍長(zhǎng)的所述患者群體的平均t1/20 (活性)； 約40-67.4、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70或約75小時(shí)的所述受試者的tl/2 0 (活性); 約0.93±0.18IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)；約 0.85-1.15、約 0.85、約 0.86、約 0.87、約 0.88、約 0.89、約 0.90、約 0.91、約 0.92、約 0.93、約 0.94、約 0.95、約 0.96、約 0.97、約 0.98、約 0.99、約 1.0、約 1.05、約 1.10 或約.1.15IU/dL每IU/kg的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 比包含所述因子IX但無(wú)所述FcRN BP的多肽的平均增量恢復(fù)高約24%的所述患者群體的平均增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 約0.62-1.17IU/dL每IU/kg的所述受試者的增量恢復(fù)(K值)(活性；觀(guān)察值)； 約226 ±67.76mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性)； 約 200-300、約 200、約 210、約 220、約 230、約 240、約 250、約 260、約 270、約 280、約 290或約300mL/kg的所述患者群體的平均Vss (活性); 約145-365mL/kg的所述受試者的Vss (活性)； 約32.44± 10.75IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)； 約 26-40、約 26、約 27、約 28、約 29、約 30、約 31、約 32、約 33、約 34、約 35、約 36、約 37、約38、約39或約40IU*h/dL每IU/kg的所述患者群體的平均AUC/劑量(活性)； 約21.80-54.30IU*h/dL每IU/kg的所述受試者的AUC/劑量。
89.—種多核苷酸,其編碼根據(jù)權(quán)利要求73-80中任一項(xiàng)所述的多肽。
90.一種多核苷酸，其編碼因子IX-FcRn BP多肽和根據(jù)權(quán)利要求81-88中任一項(xiàng)所述的第二多肽。
91.根據(jù)權(quán)利要求89或90所述的多核苷酸，其為載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒。
92.根據(jù)權(quán)利要求89-91中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其為DNA或RNA。
93.一種培養(yǎng)的人胚胎細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求89-92中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
94.根據(jù)權(quán)利要求93所述的細(xì)胞，其為HEK293細(xì)胞。
95.一種產(chǎn)生因子IX-FcRn BP雜合蛋白的方法，其包括: 在允許所述編碼的因子IX-FcRn BP嵌合多肽和基本上由FcRnBP組成的編碼的多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求93或94所述的細(xì)胞；和回收所述編碼的因子IX-FcRn BP雜合蛋白。
96.一種雜合蛋白，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法產(chǎn)生。
97.根據(jù)權(quán)利要求96所述的雜合蛋白，其與血漿源性因子IX相比較具有大幅減少的磷酸化和硫酸化。
98.根據(jù)權(quán)利要求97所述的雜合蛋白，其少于約10%被磷酸化并且少于約9%被硫酸化。
99.根據(jù)權(quán)利要求96-98中任一項(xiàng)所述的雜合蛋白，其具有大于0.7或0.75的K值。
100.根據(jù)權(quán)利要求99所述的雜合蛋白，其具有為至少約8、約9或約I的K值。
101.根據(jù)權(quán)利要求66-72中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述嵌合多肽以雜合體的形式存在，其中所述雜合體基本上由所述嵌合多肽的單鏈和所述第二多肽的單鏈組成，并且其中所述鏈通過(guò)(a)非共價(jià)相互作用、(b)兩個(gè)二硫鍵或(c) (a)和(b)兩者締合。
102.根據(jù)權(quán)利要求81-88和96-100中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述嵌合多肽以雜合體的形式存在，其中所述雜合體基本上由所述嵌合多肽的單鏈和所述第二多肽的單鏈組成，并且其中所述鏈通過(guò)(a)非共價(jià)相互作用、(b)兩個(gè)二硫鍵或(c) (a)和(b)兩者締合。
103.—種重組因子IX(rFIX)制劑，其在人中具有大于0.75IU/dL每IU/kg的增量恢復(fù)(K-值)并且其中所述制劑中少于25%的rFIX被完全磷酸化和硫酸化。
104.根據(jù)權(quán)利要求103所述的rFIX制劑，其具有至少約0.8、至少約0.9或至少約IIU/dL每IU/kg的增量恢復(fù)(K-值)。
105.根據(jù)權(quán)利要求103所述的rFIX制劑，其中所述rFIX包含F(xiàn)cRnBP。
106.根據(jù)權(quán)利要求105所述的rFIX制劑，其包含F(xiàn)e的FcRn結(jié)合區(qū)域。
107.根據(jù)權(quán)利要求105所述的rFIX制劑，其包含白蛋白的FcRn結(jié)合區(qū)域。
108.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為10-50、10-30、20-50、20-100、10或20IU/kg并且所述給藥間隔為每周I次。
109.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為15-50或40IU/kg并且所述給藥間隔為每10天I次。
110.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為100IU/kg并且所述給藥間隔為每2周I次或每月2次。
111.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述給藥間隔為每周I次。
112.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為15-100IU/kg并且所述給藥間隔為10-13天。
113.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為50-100IU/kg并且所述給藥間隔為10-14天,所述劑量為50-150IU/kg并且所述給藥間隔為14-15天或所述劑量為100-150IU/kg并且所述給藥間隔為14-16天。
114.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述劑量為15-50IU/kg并且所述給藥間隔為10天，所述劑量為20-70IU/kg并且所述給藥間隔為11天，所述劑量為25-85IU/kg并且所述給藥間隔為12天，所述劑量為30-100IU/kg并且所述給藥間隔13天，所述劑量為40-125IU/kg并且所述給藥間隔為14天或所述劑量為50 - 150IU/g并且所述給藥間隔為15天。
115.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其由每周I次的預(yù)防性給藥間隔組成。
116.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其由10-14天的預(yù)防性給藥間隔組成。
117.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其由15-18或16-18天的預(yù)防性給藥間隔組成。
118.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其由每月2次的預(yù)防性給藥間隔組成。
119.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其由每月I次的預(yù)防性給藥間隔組成。
120.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其為固定的或個(gè)體化預(yù)防性劑量和/或給藥間隔。
121.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法， 其中靜脈內(nèi)或皮下施用所述劑量。
全文摘要
本發(fā)明提供了施用因子IX的方法；施用包含因子IX的嵌合和雜合多肽的方法；包含因子IX的嵌合和雜合多肽；編碼此類(lèi)嵌合和雜合多肽的多核苷酸；包含此類(lèi)多核苷酸的細(xì)胞；以及使用此類(lèi)細(xì)胞產(chǎn)生此類(lèi)嵌合和雜合多肽的方法。
文檔編號(hào)A61K39/00GK103140237SQ201180037514
公開(kāi)日2013年6月5日 申請(qǐng)日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者格倫·皮爾斯, 薩曼莎·特魯克斯, 羅伯特·T·彼得斯, 江海燕 申請(qǐng)人:比奧根艾迪克依蒙菲利亞公司