專利名稱：自身免疫疾病和變應性疾病的治療藥的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及自身免疫疾病和變應性疾病的治療劑。更具體地，其涉及與Thl7細胞有關的上述疾病的治療劑、表現(xiàn)出對Thl7細胞和類似細胞的細胞毒性的藥物。
背景技術：
基于它們生產(chǎn)的細胞因子的差異等，已經(jīng)將在獲得性免疫中起重要作用的輔助性 T細胞(在下文中稱作“Th細胞”)分類為參與細胞免疫的Thl細胞，和參與體液免疫的 Th2細胞。
但是，近年來，作為不同于Thl細胞和Th2細胞的新的Th細胞亞型，已經(jīng)將Thl7 細胞鑒別為特異性地生產(chǎn)IL-17的Th細胞(非專利文件I)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Thl7細胞參與寬范圍的自身免疫疾病(諸如多發(fā)性硬化、銀屑病、風濕病、炎性腸病)和變應性疾病(諸如接觸性超敏反應、特應性皮炎等)以及例如多發(fā)性硬化，已經(jīng)使用動物模 型發(fā)現(xiàn)，Thl7細胞是比常規(guī)地認為重要的Thl細胞更強的致病細胞(非專利文件1、非專利文件2、非專利文件 3、非專利文件4)。
因而，盡管Thl7細胞正在作為自身免疫疾病、變應性疾病等的新靶標而引起注意，但尚未開發(fā)出選擇性地作用于Thl7細胞的藥物。
例如，已經(jīng)嘗試如下治療自身免疫疾病使用FTY-720 (芬戈莫德)等，非特異性地抑制淋巴細胞向病灶中的浸潤。但是，已經(jīng)報道，停藥會造成立即的征狀惡化(非專利文件5)，問題仍然存在。
不同于該方案，已經(jīng)報道了如下實現(xiàn)的在不同自身免疫病模型中的治療效力使用具有ADCC活性的抗體(抗-淋巴毒素α抗體)，從體內(nèi)消除Thl7細胞和Thl細胞(專利文件I)。但是，由于Thl細胞和Thl7細胞均參與生物學防御(非專利文件2、非專利文件3)，Thl細胞和Thl7細胞的非特異性作用(FTY-720)或功能抑制會過度地降低生物學防御功能。因此，已經(jīng)需要特異性地作用于Thl7細胞的藥物產(chǎn)品，所述Thl7細胞顯示出作為自身免疫疾病的致病細胞的強作用。
為了開發(fā)這樣的藥物產(chǎn)品，例如，在Thl7細胞中特異性地表達的分子可以用作靶標。作為在Thl7細胞中特異性地表達的分子，已經(jīng)鑒別出ROR Y t (它是一種細胞核受體) 等(非專利文件6)，但是尚未發(fā)現(xiàn)Thl7細胞特異性的細胞表面分子(非專利文件7)。
已知Embigin是一種單次跨膜蛋白，其與⑶147 (Basigin)和神經(jīng)絲束蛋白 (neuroplastin)形成一個家族。
已經(jīng)報道，Embigin在胚胎癌細胞(非專利文件8)、小鼠胎兒期(早期內(nèi)胚層) (非專利文件9)、大鼠前列腺、乳腺、心、肝、肺、腦(非專利文件10)、大鼠肌肉(非專利文件 11)、小鼠造血細胞(非專利文件12)中表達。另外，已經(jīng)報道，Embigin在大鼠肝纖維化模型中表現(xiàn)出增加的表達(專利文件2)。
此外，已經(jīng)報道Embigin是隨著抗-⑶3抗體/抗-⑶28抗體對⑶4+細胞的刺激而變化的數(shù)千個基因之一(專利文件3)。但是，該報道是基于被誘導分化成Thl細胞或Th2細胞的細胞與ThO細胞的對比，沒有提供關于Embigin如何在哪一細胞中變化的描述，也根本沒有描述Thl7細胞。
[現(xiàn)有技術文件][專利文件]專利文件1: W02008/063776 專利文件 2: EP-A-1811041 專利文件 3: W02005/016962 [非專利文件]非專利文件I 非專利文件2 非專利文件3 非專利文件4 非專利文件5 非專利文件6 非專利文件7 非專利文件8 非專利文件9 非專利文件10 非專利文件11 非專利文件12J. Exp. Med. (2005) ; 201:233-240 Immunological Reviews (2008); 223:87-113 J. Allergy Clin.1mmunol. (2009); 123:1004-1011 Clinical and Experimental Immunology (2009); 159:109-119 Journal of Neuroimmunology 153 (2004); 108-121 Cell (2006); 126:1121-1133Annual Review of Immunology (2008); 27:485-517 Differentiation. (1990); 45:76-83 Develop. Growth Differ. (1998); 40:277-286 Developmental Genetics (1997); 21:268-278 J. Biol. Chem. (2009); 284:8930-8939 J.1mmunology (2008); 180:1719-1728。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題 本發(fā)明的課題是，提供自身免疫疾病和變應性疾病的治療劑，諸如多發(fā)性硬化等的治療劑和針對Thl7細胞的細胞毒性劑，所述治療劑靶向Thl7細胞。另外，本發(fā)明的課題是， 發(fā)現(xiàn)在Thl7細胞中更選擇性地表達的細胞表面分子，并提供用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)、Thl7細胞標志物和方便的檢測Thl7細胞的方法。
解決問題的方式發(fā)明人已經(jīng)進行了深入研究，并發(fā)現(xiàn)，Embigin在Thl7細胞表面上高度表達，但是以極低的水平在其它血細胞(包括血液衍生的培養(yǎng)的細胞諸如Thl細胞、Th2細胞、ThO細胞、B細胞、白細胞等)中表達。此外，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的抗-Embigin抗體會選擇性地減少或消除Thl7細胞，且具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗-Embigin抗體會選擇性地減少或消除Thl7細胞并表現(xiàn)出對自身免疫病模型動物的預防或治療效果，因而與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的抗-Embigin抗體和具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗-Embigin抗體可用于自身免疫疾病和變應性疾病、特別是多發(fā)性硬化，這導致本發(fā)明的完成。
另外，他們新近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于與抗-Embigin抗體綴合的藥物會有效地到達Thl7 細胞，因而所述抗-Embigin抗體可用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)中。
此外，發(fā)明人已經(jīng)進行了 Thl7細胞的深入研究，并發(fā)現(xiàn)，由于與在其它血細胞中相比，Embigin在Thl7細胞中高度地表達，因而通過檢查血細胞中Embigin的表達，可以方便地測定Thl7細胞。
因此，本發(fā)明涉及下述內(nèi)容。
[I] 一種用于預防和/或治療自身免疫病或變應性疾病的藥劑，所述藥劑包含抗-Embigin抗體。
[2]根據(jù)[I]所述的藥劑,其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
[3]根據(jù)[I]所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
[4]根據(jù)[3]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體具有誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性的細胞毒性(CDC)的結(jié)構(gòu)。
[5]根據(jù)[3]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGU IgG3或IgM0
[6]根據(jù)[I]所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
[7]根據(jù)[6]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
[8]根據(jù)[I] - [7]中任一項所述的藥劑，其中所述疾病與Thl7細胞有關。
[9]根據(jù)[I] - [7]中任一項所述的藥劑，其中所述疾病是多發(fā)性硬化、銀屑病、 風濕病、炎性腸病、接觸性超敏反應、類固醇抵抗型哮喘、慢性非傳染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、腎小球腎炎或特應性皮炎。
[10]根據(jù)[I] - [7]中任一項所述的藥劑，其中所述疾病是多發(fā)性硬化。
[11] 一種針對Thl7細胞的細胞毒性劑，所述細胞毒性劑包含抗-Embigin抗體。
[12]根據(jù)[11]所述的藥劑,其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
[13]根據(jù)[11]所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
[14]根據(jù)[13]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體具有誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性的細胞毒性(CDC)的結(jié)構(gòu)。
[15]根據(jù)[13]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGl、IgG3或IgM。
[16]根據(jù)[11]所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
[17]根據(jù)[16]所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
[18] 一種用于藥物遞送系統(tǒng)(DDS)中的抗-Embigin抗體，所述藥物遞送系統(tǒng)用于將藥物遞送給Thl7細胞。
[19]根據(jù)[18]所述的抗體，所述抗體與前述藥物綴合。
[20]根據(jù)[18]或[19]所述的抗體，其中所述藥物是細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素。
[21] 一種用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)，所述藥物遞送系統(tǒng)使用抗-Embigin抗體。
[22]根據(jù)[21]所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述抗-Embigin抗體與前述藥物綴合。
[23]根據(jù)[21]或[22]所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述藥物是細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素。
[24] 一種用于檢測Thl7細胞的試劑,所述試劑包含抗-Embigin抗體。
[25]根據(jù)[24]所述的試劑,其中所述抗-Embigin抗體被突光物質(zhì)或放射性同位素所標記。
[26] 一種用于檢測Thl7細胞的試劑，所述試劑包含能夠特異性地檢測Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸。
[27]—種用于檢測Thl7細胞的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)[24] - [26]中任一項所述的試劑。
[28] 一種用于檢測Thl7細胞的方法,所述方法包括測量Embigin的表達。
[29]根據(jù)[28]所述的方法,所述方法包括測量Embigin在得自試驗動物的細胞中的表達。
[30]根據(jù)[28]或[29]所述的方法，所述方法包括使用根據(jù)[24] - [26]中任一項所述的試劑，測量Embigin的表達。
[31] Embigin或Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為標志物分子在Thl7細胞的檢測中的用途。
[32] 一種用于預防和/或治療受試者的自身免疫病或變應性疾病的方法，所述方法包括給所述受試者施用有效量的抗-Embigin抗體。
[33]根據(jù)[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
[34]根據(jù)[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
[35]根據(jù)[34]所述的方法，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體具有誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性的細胞毒性(CDC)的結(jié)構(gòu)。
[36]根據(jù)[34]所述的方法，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGl、IgG3或IgM。
[37]根據(jù)[32]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
[38]根據(jù)[37]所述的方法，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
[39]根據(jù)[32] - [38]中任一項所述的方法，其中所述疾病與Thl7細胞有關。
[40]根據(jù)[32] - [38]中任一項所述的方法，其中所述疾病是多發(fā)性硬化、銀屑病、風濕病、炎性腸病、接觸性超敏反應、類固醇抵抗型哮喘、慢性非傳染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、腎小球腎炎或特應性皮炎。
[41]根據(jù)[32] - [38]中任一項所述的方法，其中所述疾病是多發(fā)性硬化。
[42] 一種用于在Thl7細胞中誘導細胞損傷的方法,所述方法包括使抗-Embigin 抗體與所述Thl7細胞接觸。
[43]根據(jù)[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
[44]根據(jù)[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
[45]根據(jù)[44]所述的方法，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體具有誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性的細胞毒性(CDC)的結(jié)構(gòu)。
[46]根據(jù)[44]所述的方法，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGl、IgG3或IgM。
[47]根據(jù)[42]所述的方法，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
[48]根據(jù)[47]所述的方法，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
[49]根據(jù)[42] - [48]中任一項所述的方法，所述方法包括通過給受試者施用有效量的抗-Embigin抗體,使抗-Embigin抗體與所述受試者中的Th 17細胞接觸。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于預防或治療自身免疫疾病或變應性疾病的藥劑以及針對 Thl7細胞的細胞毒性劑。
此外，本發(fā)明可以提供用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)、用于檢測 Thl7細胞的試劑、和Thl7細胞的檢測方法，所述檢測方法可以方便地檢測Thl7細胞。


圖1的圖顯示了通過流式細胞術評價的抗-Embigin抗體與表達小鼠Embigin的大鼠細胞和大鼠細胞的結(jié)合活性。相對于抗-Embigin抗體的同種型(大鼠IgG)是5 μ g/ mL濃度,并使用培養(yǎng)物上清液作為抗-Embigin抗體(抗-emb抗體)。
圖2的圖顯示了通過流式細胞術評價的抗-Embigin抗體與表達小鼠Embigin 的倉鼠細胞和倉鼠細胞的結(jié)合活性。同種型是5 μ g/mL濃度，并使用培養(yǎng)物上清液作為抗-Embigin抗體(抗-emb抗體)。
圖3的圖顯示了通過蛋白質(zhì)印跡法評價的、從Thl7細胞和Treg細胞制備的蛋白中含有的Embigin的量。
圖4的圖顯示了通過qRT-PCR方法評價的、從Thl7細胞、Thl細胞、Th2細胞、ThO 細胞和Treg細胞制備的總RNA中含有的Embigin mRNA的量。
圖5的圖顯示了通過流式細胞術評價的、在含有Thl7的不同細胞的細胞膜上的 Embigin的量。顯示了當使用抗-Embigin抗體時的幾何平均值與同種型(大鼠IgG)的幾何平均值之比。當發(fā)現(xiàn)多個峰時，顯示每個值。通過抗-小鼠B220抗體(B細胞標志物)、 抗-小鼠⑶Ila抗體(白細胞標志物)或抗-小鼠⑶3抗體(⑶3陽性的細胞標志物)來鑒別各細胞。
圖6的圖顯示了通過流式細胞術評價的、抗-人Embigin抗體與下述細胞的結(jié)合活性表達與小鼠Embigin相對應的人基因(智人Embigin,在下文中稱作“人Embigin”) 的小鼠細胞和小鼠細胞。相對于抗-人Embigin抗體的同種型(大鼠IgG)是5 yg/mL濃度，并使用培養(yǎng)物上清液作為抗-Embigin抗體(抗-emb抗體)。
圖7的圖顯示了通過流式細胞術評價的在人Thl7細胞膜表面上的Embigin表達。 同種型(大鼠IgG)是5 μ g/mL濃度,并使用培養(yǎng)物上清液作為抗-Embigin抗體(抗-emb抗體)。
圖8的圖顯示了經(jīng)毒素修飾的抗-Embigin抗體在致病細胞中的細胞衰竭特異性的評價。
圖9的圖顯示了抗-Embigin抗體在致病細胞中的細胞衰竭特異性的評價。
圖10的圖顯示了通過蛋白質(zhì)印跡法和使用商購可得的器官集合(organ panel) 評價的、小鼠不同器官的小鼠Embigin表達量。以1/1000倍稀釋度，使用商購可得的兔抗-小鼠Embigin抗體。
圖11的圖顯示了抗-Embigin抗體(抗-Emb抗體)的施用對轉(zhuǎn)移至小鼠脾的突光標記的致病細胞的細胞數(shù)目的影響的評價。小鼠的CFSE標記的致病細胞是1. 5 X IO7 細胞，并使用30 μ g或100 μ g抗-Embigin抗體。使用流式細胞術檢測熒光細胞的數(shù)目。 在該圖中，Λ顯示了每個個體的測量值。
圖12的圖顯示了抗-Embigin抗體在致病細胞中的細胞衰竭特異性的評價。
圖13的圖顯示了，在用抗-Embigin抗體選擇性地衰竭Thl7細胞以后，將細胞轉(zhuǎn)移進小鼠中得到的多發(fā)性硬化模型的臨床評分的評價。轉(zhuǎn)移的細胞是3 X IO6細胞，并使用I μ g/mL的抗-Embigin抗體。評價臨床評分至細胞轉(zhuǎn)移后第20天。
圖14的圖顯示了，在病狀發(fā)作之前，給小鼠施用抗-Embigin抗體對臨床評分的影響的評價，所述小鼠通過用PLP免疫而誘導制成多發(fā)性硬化模型。PLP與弗氏完全佐劑相混合，并皮下地免疫I次。在免疫接種以后，在第7天和第14天(用箭頭指示)施用抗-Embigin抗體(300 μ g) 2次。評價臨床評分至PLP免疫接種以后第18天。
圖15的圖顯示了，在病狀發(fā)作之后，給小鼠施用抗-Embigin抗體對臨床評分的影響的評價，所述小鼠通過用PLP免疫而誘導制成多發(fā)性硬化模型。PLP與弗氏完全佐劑相混合，并皮下地免疫I次。在PLP免疫接種以后第12天，基于臨床評分，將表現(xiàn)出病狀的小鼠分組，在分組當天和分組7天后(用箭頭指示)，施用抗-Embigin抗體(100 μ g) 2次。 評價臨床評分至PLP免疫接種以后第23天。
具體實施方式
下面詳細地解釋本發(fā)明。
1. 在本發(fā)明中的抗-Embifiin抗體已知Embigin是一種單次跨膜蛋白，其與⑶147 (Basigin)和神經(jīng)絲束蛋白 (neuroplastin)形成一個家族。已知Embigin具有下述氨基酸序列例如，人Embigin (NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_940851，SEQ ID NO:1)、大鼠Embigin (NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號 NP_446171)或小鼠 Embigin (NCBI 數(shù)據(jù)庫登錄號NP_034460, SEQ ID NO: 8)。
作為編碼Embigin的基因(在下文中稱作“Embigin基因”)的核酸序列，還已知 例如，人Embigin基因(NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NM_198449, SEQ ID NO: 2)或小鼠Embigin基因(NCBI 數(shù)據(jù)庫登錄號NM_010330，SEQ ID NO: 9)。
在本說明書中的Embigin不僅包括這些已知序列所示的“蛋白”或“(多)肽”，而且包括例如，它們的同系物(同系物和剪接突變體)、突變體、衍生物、成熟形式、氨基酸修飾形式等，只要它們的生物學功能與顯示人Embigin的特定氨基酸序列的生物學功能等效。在這里，同系物的實例包括與人蛋白相對應的其它生物學物種(諸如小鼠、大鼠等)的蛋白。從通過 HomoloGene (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/HomoloGene/)鑒別出的基因的堿基序列，可以推論地鑒別出它們。另外，所述突變體包括天然存在的等位基因突變體、 非天然存在的突變體、以及具有通過刪除、置換、添加或插入而人工地改變的氨基酸序列的突變體。上述突變體的實例包括與無突變的蛋白或(多)肽具有至少70%、優(yōu)選地80%、更優(yōu)選地95%、進一步更優(yōu)選地97%的同源性的那些突變體。另外，所述氨基酸修飾形式包括: 天然存在的氨基酸修飾形式和非天然存在的氨基酸修飾形式，可以具體地提及氨基酸的磷酸化形式。
在本發(fā)明中的抗-Embigin抗體可以是任意的,只要它會特異性地識別Embigin。 “特異性地識別”是指特異性地結(jié)合Embigin。具體地，它可以是能夠特異性地識別Embigin 基因的表達產(chǎn)物(蛋白)(在本說明書中，在下文中也稱作“Embigin”)的抗體，能夠識別 Embigin的細胞外區(qū)域(SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第32個至第257個)的抗體是優(yōu)選的。
要用于本發(fā)明中的上述抗體包括多克隆和單克隆抗體。根據(jù)重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的類型，將抗體分成5大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在它們中，有些抗體被進一步分成亞類或同種型(例如，在IgG的情況下，IgGU IgG2、IgG3、IgG4等)。
所述抗體包括人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段或由Fab表達文庫生成的片段、小抗體(也包括抗體片段)、多特異性抗體等、以及經(jīng)修飾的抗體，諸如與藥物綴合的抗體等。此外，也包括上述抗體的具有抗原結(jié)合性質(zhì)的部分、具有增強的細胞毒性誘導活性的抗體、雙特異性抗體、與蛋白融合的抗體等。
作為要用于本發(fā)明中的抗-Embigin抗體,例如,可以使用商購可得的抗-Embigin 抗體(Santa Cruz生產(chǎn)，eBioscience等生產(chǎn))，或它可以是使用已知方式生產(chǎn)的多克隆或單克隆抗體。
作為要用于本發(fā)明中的抗-Embigin抗體，從哺乳動物衍生出的單克隆抗體和多克隆 抗體是特別優(yōu)選的。通過本領域普通技術人員已知的方法，可以生產(chǎn)單克隆抗體和多克隆抗體。
從哺乳動物衍生出的單克隆抗體和多克隆抗體的實例包括在動物血液中生產(chǎn)的那些，由雜交瘤生產(chǎn)的那些，由通過基因工程方式用含有抗體基因的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)的那些，由最佳抗體(其通過噬菌體展示從含有1，000，000，000，000種分子的龐大克隆文庫中篩選出)的基因在CHO細胞工廠中大量生產(chǎn)的那些，使用生產(chǎn)人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠直接生產(chǎn)的人抗體，等等。
要用作敏化抗原的蛋白不受它的起源動物物種(諸如人、小鼠、大鼠等)的限制， 所述敏化抗原用于得到本發(fā)明的抗-Embigin抗體，用于制備多克隆抗體。但是，優(yōu)選地考慮與要用于細胞融合的母細胞的相容性來進行確定，通常，從哺乳動物衍生出的蛋白是優(yōu)選的，從人類衍生出的蛋白是特別優(yōu)選的。也可以是完整蛋白或蛋白的部分肽。例如，當 Embigin是人Embigin時,可以使用表達人Embigin蛋白和人Embigin的細胞、人Embigin 的部分肽等。蛋白的部分肽的實例包括蛋白的氨基(N)端片段和羧基(C)端片段。在本發(fā)明中的抗-Embigin抗體是指,與全長Embigin蛋白或其片段反應的抗體。
例如，可以如下得到多克隆抗體。也就是說，使用下述物質(zhì)免疫小動物(諸如兔等) 以得到血清天然的Embigin蛋白，或由微生物(諸如大腸桿菌等)表達為含有GST的融合蛋白的重組Embigin蛋白，或其部分肽。其通過下述方法純化，以得到多克隆抗體例如，硫酸銨沉淀、蛋白A、蛋白G柱、DEAE離子交換色譜法、與Embigin蛋白或合成肽偶聯(lián)的親和柱坐寸ο
根據(jù)例如使用桿狀病毒的方法(例如，W098/46777等)等，可以制備抗原。當所述抗原具有低免疫原性時，給它綴合具有免疫原性的大分子(諸如白蛋白等)，并用于免疫接種。
作為單克隆抗體的生產(chǎn)方法，根據(jù)已知方法，用敏化抗原免疫動物。作為一般的方法，將敏化抗原腹腔內(nèi)地或皮下地注射給哺乳動物。具體而言，用PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)、鹽水等稀釋敏化抗原或在其中懸浮至足夠的量，并根據(jù)需要在其中混合合適量的常規(guī)佐劑，例如，弗氏完全佐劑。乳化所述混合物，并每隔4 - 21天免疫哺乳動物數(shù)次。也可在以敏化抗原進行免疫接種時使用合適的載體。
以此方式，免疫哺乳動物，證實血清中所需抗體水平的增加，從所述哺乳動物得到免疫細胞，并進行細胞融合。免疫細胞的特別優(yōu)選的實例包括脾細胞。作為要與前述免疫細胞融合的其它母細胞，使用哺乳動物骨髓瘤細胞。作為骨髓瘤細胞，優(yōu)選地使用各種已知的細胞系，例如，P3U1 (P3-X63Ag8Ul)，P3 (P3x63Ag8. 653) (J.1mmno1. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C. , Eur. J. Tmmunol. (1976) 6，511-519)，MPC-1l (Margulies, D. H.等人，Cell (1976) 8，405-415)，SP2/0 (Shulman, M.等人，Nature (1978) 276，269-270)，F(xiàn)O (de St. Groth, S. F.等人， J. Tmmunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge,1. S. , J. Exp. Med. (1978) 148，313-323)，R210 (Galfre, G.等人，Nature (1979) 277，131-133)等。
基本上根據(jù)已知方法,例如，Kohler, Milstein等人的方法(Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46)等,可以進行前述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合。
更具體地，例如，在有細胞融合促進劑存在下，在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中，進行前述細胞融合。作為融合促進劑，使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血凝集病毒(HVJ)等，當需要時， 還可以進一步加入助劑諸如二甲基亞砜等，用于提高融合效率。
可以任選地確定要使用的免疫細胞和骨髓瘤細胞的比例。例如，使用的免疫細胞優(yōu)選地是骨髓瘤細胞的1-10倍。作為要用于前述細胞融合的培養(yǎng)基，例如，RPMI1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基對于前述骨髓瘤細胞系的生長而言是優(yōu)選的，也可以使用為這類細胞培養(yǎng)通常使用的培養(yǎng)基，且進一步，還可以組合地使用血清添加物諸如胎牛血清(FCS)等。
就細胞融合而言，在前述培養(yǎng)基中將給定量的前述免疫細胞和骨髓瘤細胞混合均勻，所述培養(yǎng)基中通常預先加入30-60% (w/v)濃度的、加熱至約37°C的PEG溶液(例如， 約1000-6000的平均分子量)，并混合所述混合物，以形成目標雜交瘤。然后，重復下述操作接連地加入合適的培養(yǎng)基、離心混合物并除去上清液，以除去不利于雜交瘤生長的細胞融合劑等。
除了通過用抗原免疫除了人類以外的動物來得到上述雜交瘤以外，還可以通過在體外用下述物質(zhì)敏化人淋巴細胞例如，通過EB病毒感染而永生化的人淋巴細胞，來制備生產(chǎn)人抗-Embigin抗體的細胞系Embigin蛋白，表達Embigin蛋白的細胞或其裂解物。此外，為了穩(wěn)定地維持抗體分泌能力，可以使敏化的淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞(如上所述) 或從人類衍生出的具有持久的分裂潛能的骨髓瘤細胞，例如，U266進行融合，以得到生產(chǎn)具有所需活性(Embigin結(jié)合活性)的人抗體的雜交瘤。
通過在常規(guī)選擇培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)中培養(yǎng)，確定如此得到的雜交瘤。在上述HAT培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)足以殺死除了目標雜交瘤以外的細胞(未融合的細胞)的時間(通常數(shù)天至數(shù)周)。然后，進行常規(guī)的有限稀釋方法，并進行生產(chǎn)目標抗體的雜交瘤的篩選和單克隆。
可以在常規(guī)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)如此制備的生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤，且可以在液氮中長期保藏。為了從雜交瘤得到單克隆抗體，采用下述方法包括根據(jù)常規(guī)方法培養(yǎng)雜交瘤以在其培養(yǎng)物上清液中得到抗體的方法，或包括將雜交瘤施用給與其相容的哺乳動物并得到在腹水流體等中的增殖的細胞的方法。前一種方法適用于得到非常純的抗體，后一種方法適用于抗體的大規(guī)模生產(chǎn)。
人抗體是指作為人衍生的抗體基因的表達產(chǎn)物的抗體。人抗體可以如下得到例如，將人抗體基因基因座引入轉(zhuǎn)基因的動物中，以賦予生產(chǎn)人衍生的抗體的能力，并將抗原施用給該動物。作為這樣的轉(zhuǎn)基因的動物，可以提及小鼠，能夠生產(chǎn)人抗體的小鼠的生產(chǎn)方法描述在例如W002/ 43478中。
本發(fā)明中的單克隆抗體包括由這樣的重鏈和/或輕鏈組成的單克隆抗體所述重鏈和/或輕鏈各自具有構(gòu)成所述抗體的重鏈和/或輕鏈的氨基酸序列，其中一個至幾個氨基酸被刪除、置換或添加。通過部分地改變編碼氨基酸序列的堿基序列，可以向本發(fā)明抗體的氨基酸序列中引入氨基酸的這種部分改變(刪除、置換、插入、添加)。根據(jù)常規(guī)方法 (Proc. Natl. Acsd. Sc1. USA. , 1984 Vol. 81, 5662-5666; Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989)第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，使用已知的位點特異性的誘變，可以引入堿基序列的這種部分改變。
在本發(fā)明中，還可以使用基因重組抗體，其被人工地改變，以降低對人的異源抗原性等，例如，嵌合(型)抗體和人源化的抗體。這些改變的抗體可以使用已知方法來生產(chǎn)。
嵌合抗體是這樣的免疫球蛋白分子其特征在于，從不同的動物物種衍生出的2 個或更多個部分的結(jié)合。通常，嵌合抗體的可變區(qū)源自非人哺乳動物的抗體(例如，小鼠單克隆抗體)，且其免疫球蛋白恒定區(qū)源自人免疫球蛋白分子。優(yōu)選地，選擇具有低免疫原性的可變區(qū)，并與也具有低免疫原性的人恒定區(qū)相組合。優(yōu)選地，所述組合也具有低免疫原性。嵌合抗體包括單價、二價或多價免疫球蛋白。單價嵌合抗體是嵌合H鏈通過二硫鍵與嵌合L鏈結(jié)合而形成的二聚體(HL)。二價嵌合抗體是通過至少I個二硫鍵結(jié)合的2個HL 二聚體形成的四聚體(H2L2)。
在本技術領域中已經(jīng)描述了嵌合抗體及其生產(chǎn)方法(Morrison等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 81: 6851-6855 (1984) ; Boulianne等人，Nature 312: 643-646 (1984) ; Liu 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 84: 3439-3443 (1987) ; Sun 等人， Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 84: 214-218 (1987) ; Better 等人，Science 240: 1041-1043 (1988)；和 Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。
人源化的抗體也稱作重構(gòu)的人抗體，其如下得到將非人哺乳動物(例如，小鼠)的抗體的互補性決定區(qū)(CDR)移植進人抗體的互補性決定區(qū)中，用于這方面的一般的基因重組方法也是已知的(參見EP-A-EP125023和W092/19759)。通過已知方法，可以生產(chǎn)人源化的抗體。例如，通過PCR方法，從制備成在末端上具有重疊區(qū)的幾種寡核苷酸，合成設計為連接小鼠抗體的CDR和人抗體的框架區(qū)(FR;框架區(qū))的DNA序列。使得到的DNA與編碼人抗體C區(qū)的DNA相連，然后整合進表達載體中，將所述表達載體引入宿主中以允許生產(chǎn)，由此得到人源化的抗體(參見EP-A-EP239400和W092/19759)。作為人抗體的框架區(qū)(其通過 CDR相連)選擇這樣的框架區(qū)其中互補性決定區(qū)形成良好抗原結(jié)合位點。在必要的情況下， 可以置換在抗體的可變區(qū)的框架區(qū)中的氨基酸，使得重構(gòu)的人抗體的互補性決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y(jié)合位點(Sato, K.等人，CancerRes. (1993) 53，851-856)。
對于嵌合抗體和人源化的抗體，使用了人抗體C區(qū)。作為人抗體C區(qū)，可以提及 Cy，且可以使用例如C Y 1、C Y 2、C Y 3或C γ4。另外，為了提高抗體或其生產(chǎn)的穩(wěn)定性,可以修飾人抗體C區(qū)。嵌合抗體由源自非人哺乳動物的抗體的可變區(qū)和人抗體衍生的C區(qū)組成，人源化的抗體由源自非人哺乳動物的抗體的互補性決定區(qū)和人抗體衍生的框架區(qū)和C 區(qū)組成。由于在人體中的抗原性較低，它作為要用于本發(fā)明中的抗體是有益的。
要用于本發(fā)明中的抗體可以是抗體的片段或其修飾形式，只要它可以優(yōu)選地用于本發(fā)明中?？贵w片段的實例包括Fab、F(ab’)2、Fv或單鏈抗體(scFv)(其中Fv的H鏈 (VH)和L鏈(VL)用合適的接頭相連，以形成Fv)、雙體(其中含有VH和VL的多肽二聚體通過分子間VH-VL相互作用而裝配)、微體(minibody)(它是一種二聚體,其中恒定區(qū)的一部分(CH3)與scFv的H鏈結(jié)合)、其它小抗體等。
所述小抗體沒有特別限制，只要它含有全長抗體(完整抗體，例如，完整IgG等) 的一部分缺失的抗體片段，且具有與抗原(Embigin蛋白)的結(jié)合潛力。所述抗體片段沒有特別限制，只要它是全長抗體的一部分，且優(yōu)選地含有重鏈可變區(qū)(VH)和/或輕鏈可變區(qū) (VL)。
所述單鏈抗體也稱作“單鏈Fv”，也就是說，“scFv”抗體片段，且含有抗體的VH和 VL結(jié)構(gòu)域，且這些結(jié)構(gòu)域存在于多肽單鏈中。所述“Fv”片段是最小的抗體片段，且含有完全的抗原識別位點和結(jié)合位點。通常，所述“Fv”片段是二聚體(VH-VL 二聚體)，其中一個 VH和VL通過非共價鍵強烈地相連。每個可變區(qū)的3個互補性決定區(qū)(OTR)相互作用，以在VH-VL 二聚體的表面上形成抗原結(jié)合位點。6個CDR形成一種抗體的抗原結(jié)合位點。甚至一個可變區(qū)(或僅含有3個對抗原特異性的CDR的一半Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管其親和力低于完整結(jié)合位點的親和力。所述scFv多肽另外含有在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使得scFv可以形成抗體結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 編· Springer-Verlag, New York,第 269-315 頁(1994))。
可以如下生產(chǎn)小抗體和單鏈抗體例如，用酶(例如，木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)處理抗體以生成抗體片段，或構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，并將所述基因引入表達載體中以允許在合適的宿主細胞中表達(參見，例如，Co，M. S.等人，J.1mmunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, Μ.和 Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515， Lamoyi, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J.等人,Methods in Enzymology (1989) 121，663-669，Bird, R. E.等人，TIBTECH (1991) 9， 132-137)。
通過連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)，可以得到SCFv。這些區(qū)域存在于單個多肽鏈中。通常，F(xiàn)v多肽另外含有在VH和VL之間的多肽接頭，因此scFv可以形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)(關于 scFv 的綜述,參見Pluckthun“The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” 第 113 卷(Rosenburg 和 Moore 編(Springer-Verlag, New York)第 269-315 頁，1994))。 所述接頭沒有特別限制，只要它不會抑制與其兩端連接的抗體可變區(qū)的表達。
在該scFv中，H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)通過接頭(優(yōu)選肽接頭)相連(Huston, J. S. 等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. U.S.A. (1988) 85，5879-5883)。在 scFv 中的 H 鏈 V 區(qū)和L鏈V區(qū)可以源自上面描述為抗體的那些區(qū)域中的任一種。作為連接V區(qū)的肽接頭，例如，使用由12-19個氨基酸殘基組成的任選的單鏈肽。
如下得到編碼scFv的DNA :使用編碼前述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA和編碼其 L鏈或L鏈V區(qū)的DNA作為模板，使用限定兩端的引物對，通過PCR方法擴增編碼那些序列的所需氨基酸序列的DNA部分，然后組合地擴增編碼肽接頭部分的DNA和限定使得所述接頭部分的兩端分別與H鏈和L鏈相連的引物對。制備出編碼scFv的DNA以后，根據(jù)常規(guī)方法，可以得到含有所述DNA的表達載體和用所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主，并可以根據(jù)常規(guī)方法使用所述宿主得到scFv。
雙體是指通過基因融合構(gòu)建的二價抗體片段(Holliger P等人，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 90: 6444-6448 (1993)，EP-A-404097, W093/11161 等)。所述雙體是由 2個多肽鏈構(gòu)成的二聚體。通常，在多肽鏈中，VL和VH分別通過短接頭(其具有例如約5個殘基)連接在同一鏈中，所述接頭因為太短而不能彼此結(jié)合。在同一多肽鏈上編碼的VL和 VH不能形成單鏈 可變區(qū)片段(因為它們之間的接頭太短)，但是會形成二聚體，因此，所述雙體具有2個抗原結(jié)合位點。
SC (Fv) 2是由2個VH和2個VL組成的小抗體，所述VH和VL通過接頭等連接成單鏈(Hudson 等人，J Immunol.方法 1999; 231: 177-189)?？梢匀缦轮苽?sc (Fv) 2 :例如，通過接頭來連接2個scFv。
在本發(fā)明中，作為連接抗體的可變區(qū)的接頭，可以使用可通過基因工程引入的肽接頭，在合成的化合物接頭中公開的接頭(參見例如，Protein Engineering, 9(3)， 299-305，1996)等。當使用肽接頭時，其長度沒有特別限制，本領域普通技術人員可以根據(jù)目標適當?shù)剡x擇長度。所述長度通常是1- 100個氨基酸，優(yōu)選地3 - 50個氨基酸，進一步優(yōu)選地5 - 30個氨基酸，特別優(yōu)選地12 - 18個氨基酸(例如，15個氨基酸)。合成的化合物接頭(化學交聯(lián)劑)是通常用于交聯(lián)肽的交聯(lián)劑。其實例包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二琥珀酰亞胺基辛二酸鹽(DSS)、雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸鹽(BS3)、二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸鹽)(DSP)、二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸鹽)(DTSSP)、乙二醇雙(琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸鹽)(磺基-EGS)、二琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(DST)、二磺基琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(磺基-DST)、雙 [2-(琥珀酰亞胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(BS0C0ES)、雙[2-(磺基琥珀酰亞胺基氧基碳酰氧基)乙基]砜(磺基-BS0C0ES)等。這些交聯(lián)劑是商購可得的。
可以如下生產(chǎn)這些抗體的片段以與上面相同的方式，得到其基因，表達所述基因，并使宿主生產(chǎn)它們。在本申請的權利要求中的“抗體”也包括那些抗體片段。
經(jīng)修飾的抗體的實例包括與各種分子綴合的抗體，所述分子是諸如聚乙二醇 (PEG)、熒光物質(zhì)、放射性同位素、藥物等。在本申請的權利要求中的“抗體”也包括這些經(jīng)修飾的抗體。通過將化學修飾應用于得到的抗體，可以得到這樣的經(jīng)修飾的抗體。在本領域中已經(jīng)建立了所述方法及其用途。
具有增強的細胞毒性誘導活性的抗體的實例包括巖藻糖-缺陷型抗體，在糖鏈處添加了平分型N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的抗體，通過置換Fe區(qū)中的氨基酸而改變了對 Fe Y受體的結(jié)合活性的抗體，等。通過本領域普通技術人員已知的方法，可以生產(chǎn)這些具有增強的細胞毒性誘導活性的抗體。
當將不同亞類中的抗體轉(zhuǎn)化成人IgGl時，可以如下得到它例如，從源自生產(chǎn)抗體的雜交瘤的cDNA中，僅分離出可變區(qū)的編碼區(qū)，將所述編碼區(qū)引入含有人IgGl的恒定區(qū)的載體中，例如，N5KGl_Val Lark載體(IDEC Pharmaceuticals, N5KG1 (美國專利 6001358))。
雙特異性抗體是識別兩類抗原的抗體，其制備方法也是已知的(例如，Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374)。所述抗原之一是 Embigin,另一種抗原是除了 Embigin以外的異源抗原。異源抗原的實例包括、但不限于免疫效應細胞的其它細胞表面抗原，例如，CD3、CD28、CD16、CD64 等。
與蛋白融合的抗體是，在所述抗體的N-端或C-端處與異源蛋白融合的抗體，其制備方法也是已知的(例如，Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。所述抗體僅需要是通過使異源蛋白與抗-Embigin抗體結(jié)合得到的嵌合分子。異源蛋白的實例包括、但不限于Fc受體、細胞因子等。
從細胞內(nèi)外、和宿主，可以分離如上所述生產(chǎn)和表達的抗體，并均勻地純化。通過親和色譜法，可以分離和純化要用于本發(fā)明中的抗體。要用于親和色譜法的柱的實例包括蛋白A柱和蛋白G柱。要用于蛋白A柱的載體的實例包括HyperD、P0R0S、瓊脂糖 F.F.等。 另外，可以使用通常用于蛋白的分離和純化方法，且沒有任何限制。
例如，可以如下分離和純化在本發(fā)明中使用的抗體適當?shù)剡x擇和組合除了上述親和色譜法以外的色譜法、過濾、超濾、鹽析、透析等。色譜法的實例包括離子交換色譜法、 疏水色譜法、凝膠過濾等。這些色譜法可以應用于HPLC (高效液相色譜法)。另外，也可以使用反相HPLC。
2.本發(fā)明的預防劑或治療劑和針對Thl7細胞的細胞毒件劑發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于經(jīng)毒素修飾的抗-Embigin抗體和與磁性珠子綴合的抗-Embigin抗體會選擇性地衰竭Thl7細胞,且進一步,作為大鼠IgG2b的抗-Embigin抗體不僅選擇性地減少Thl7細胞，而且顯示出對自身免疫病模型動物的預防或治療效果，所以使用抗-Embigin抗體(例如，與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的抗-Embigin抗體,具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗-Embigin抗體，等)作為與Thl7細胞有關的自身免疫或變應性疾病的預防劑或治療劑，特別是多發(fā)性硬化的預防劑或治療劑。
因此，本發(fā)明提供了自身免疫病或變應性疾病的預防劑或治療劑，其含有抗-Embigin抗體。
在本發(fā)明的自身免疫病或變應性疾病的預防劑或治療劑中含有的抗-Embigin抗體沒有特別限制，只要它是在“1.在本發(fā)明中的抗-Embigin抗體”中描述的抗體。例如，可以優(yōu)選地使用表現(xiàn)出細胞毒性的抗-Embigin抗體、具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin 抗體等。
“細胞毒性”的實例包括細胞殺死活性、細胞功能障礙活性和細胞生長抑制活性。 在本發(fā)明中，需要存在這些活性中的至少一種。另外，所述抗-Embigin抗體本身可以具有細胞毒性(例如，ADCOCDC-非依賴性的細胞凋亡誘導活性等)，并優(yōu)選地，可以如下使用表現(xiàn)出細胞毒性的藥物使它們與抗體綴合，以賦予所述抗體細胞毒性。
表現(xiàn)出細胞毒性的藥物的實例包括細胞毒性物質(zhì)(諸如細菌衍生的毒素等)、 化學治療劑和放射性同位素。其具體實例包括放射性核素諸如碘(131碘131ι、125碘 125I)、釔(9。釔=90Y)、銦(111 銦=111In)、锝(99m 锝=99mTc)等(J. ff. Goding.，Monoclonal Antibodies: principles and practice. , 1993 ACADEMIC PRESS),細菌衍生的毒素諸如銅綠假單孢菌毒素(假單胞菌外毒素)、白喉毒素和蓖麻蛋白，化學治療劑諸如甲氨蝶呤、絲裂霉素、卡奇霉素、阜草素等(D. J. King. , Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies. , 1998 T. J.1nternational Ltd, M. L. Grossbard., Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer. , 1998 Marcel Dekker Inc, John M Lambert, Current Opinion in Pharmacology (2005)第 5卷，第 543-549 頁)等。不具有副作用且具有強細胞毒性的藥物是優(yōu)選的。
在抗體和藥物之間的鍵可以是共價鍵和非共價鍵中的任一種(例如，離子鍵)。 例如，可以如下得到抗-Embigin抗體和藥物的復合物使用抗體分子中的反應基團(例如， 氨基、羧基、羥基等)或配位基團，并使特定藥物與抗體接觸，所述藥物具有能夠與所述反應基團反應形成鍵的官能團(在細菌衍生的毒素或化學治療劑的情況下)，或具有能夠與配位基團形成復合物的可離子化基團(在放射性核素的情況下)，其中如果必要的話，所述反應基團可以在被具有更高反應性的基團結(jié)合以后使用，或在轉(zhuǎn)化成具有更高反應性的基團以后使用?；蛘?，還可以使用生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)來形成復合物。在本領域中已經(jīng)確立了這樣的結(jié)合方法(Bioconjugate Chem. (2010)第 21 卷，5-13，Accounts of chemical research (2008)第41卷，第I期，98-107)。目前，已經(jīng)在臨床上開發(fā)了與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的多種IgG(Current Opinion in Pharmacology (2005)第5卷， 第543-549頁)。作為本發(fā)明的表現(xiàn)出細胞毒性的抗-Embigin抗體，可以提及例如這樣的抗-Embigin抗體它是與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的IgG。
作為在本說明書中的“具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體”，可以提及特異性地識別Embigin且具有前述誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗體。如在實施例14 - 17中所示， 具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗-Embigin抗體會選擇性地消除Thl7細胞，并表現(xiàn)出對自身免疫病動物模型的預防或治療效果。因此，當所述抗-Embigin抗體是具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗體時，即使所述抗體本身不具有細胞毒性且未與具有所述活性的藥物綴合時，所述抗體也可以表現(xiàn)出作為自身免疫病或變應性疾病的預防劑或治療劑或針對Thl7細胞的細胞毒性劑的功能。
具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗體的具體實例包括下述的(a) - (C)。
(a) 一種抗體，其具有在效應細胞存在下誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性 (ADCC)的結(jié)構(gòu)。
(b) 一種抗體，其具有誘導補體依賴性的細胞毒性(CDC)的結(jié)構(gòu)。
(c) 一種抗體，其具有誘導抗體依賴性的細胞吞噬作用(ADCP)的結(jié)構(gòu)。
上述(a)的具有在效應細胞存在下誘導抗體依賴性的細胞的細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗體是廣泛已知的。其實例包括屬于諸如下述亞類的抗體小鼠IgG2a和IgG3、人IgGl和 IgG3、大鼠IgG2b等等。
作為這些亞類的藥用抗體，利妥昔單抗(商品名Rituxan (Chugai Pharmaceutical Co. , Ltd.))、曲妥單抗(商品名赫賽汀(Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.))等是已知的(參見，例如，Nat. Rev.1mmunol. 2010; 10: 301-316)。
上述(b)的具有誘導補體依賴性的細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗體也是廣泛已知的。其實例包括屬于諸如下述亞類的抗體小鼠IgM、IgG2a和IgG3、人IgM、IgGl和IgG3、大鼠IgG2b坐坐寸寸ο
抗體的ADCC和⑶C活性在很大程度上取決于IgG的亞類，且已經(jīng)澄清，IgGl和 IgG3在人類中具有強 活性。因而，具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的人抗體的實例包括這樣的抗體所述抗體具有IgGl的恒定區(qū)、IgG3的恒定區(qū)或IgM的恒定區(qū)。具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的人抗體的優(yōu)選實例包括IgGl或IgG3亞類的IgG抗體和IgM抗體。
可以如下檢查抗體的細胞毒性誘導活性例如，在ADCC活性的情況下，在有抗-Embigin抗體存在下溫育靶細胞(Thl7細胞和強制表達Embigin的細胞系)和表達Fe 受體的效應細胞(NK細胞、單核細胞等)，在CDC活性的情況下，在有新鮮的人血清(包括補體)存在下溫育靶細胞和抗體，并計數(shù)活細胞和/或死細胞。
此外，本發(fā)明的“具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體”也包括具有誘導 2類細胞毒性活性的結(jié)構(gòu)的抗體，具有增強的細胞毒性誘導活性的抗體，結(jié)合Embigin和除了 Embigin以外的抗原的雙特異性抗體,與蛋白融合的抗-Embigin抗體,等。
具有增強的細胞毒性誘導活性的抗體的實例包括Fc區(qū)糖鏈的巖藻糖缺失的抗體，在糖鏈處添加了平分型N-乙?；咸前?GlcNAc)的抗體，通過置換Fe區(qū)中的氨基酸而改變了對Fe Y受體的結(jié)合活性的抗體，等。這些操作可以使對效應細胞上的Fe受體的結(jié)合活性增強至100倍或更多。另外，當抗-Embigin抗體屬于人IgG2或IgG4亞類時,通過前述基因重組方法，可以將恒定區(qū)改變成人IgGl或IgG3亞類。此外，可以如下賦予超過天然亞型IgGl和IgG3的CDC活性制備同種型嵌合抗體，所述嵌合抗體將人IgG3序列的一部分摻入人 IgGl 中(綜述參見 Cancer Res. 2008; 68: 3863-3872; Nat. Rev.1mmunol. 2010 (如上所述))。
“與Thl7細胞有關的疾病”是指其中Thl7細胞是致病細胞的疾病，其中Thl7細胞被懷疑為致病細胞的疾病，其中Thl7細胞會加速病狀惡化的疾病，或其中Thl7細胞具有加速病狀惡化的可能性的疾病。
與Thl7細胞有關的疾病的實例包括自身免疫疾病諸如多發(fā)性硬化、銀屑病、風濕病、炎性腸病等、變應性疾病諸如接觸性超敏反應、類固醇抵抗型哮喘、腎小球腎炎、特應性皮炎等和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。在文獻等中已經(jīng)報道了 Thl7細胞在這些疾病中的參與(Annu. Rev. Physiol. (2010) 72: 495-516，J Am Soc Nephrol (2010) 21: 925-931)。具體地，已經(jīng)使用動物模型澄清，Thl7細胞是比常規(guī)地認為重要的Thl細胞更強的多發(fā)性硬化致病細胞(J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240)。
另外，由于體內(nèi)的主要的IL-17生產(chǎn)細胞是Thl7細胞，與IL-17有關的疾病也被包括在“與Thl7細胞有關的疾病”中。已知，通過抑制IL-17生產(chǎn)或抑制IL-17的功能，可以改善諸如類風濕性關節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、慢性非傳染性葡萄膜炎等疾病(J.1mmunol. (2003) 171: 6173-6177， Inflamm Bowel Dis (2006): 2: 382-388， Sci Transl Med (2010) 2; 52ra72)。
由于Thl細胞和Thl7細胞也參與身體的防御功能，非特異性的免疫抑制或Thl細胞和Thl7細胞的功能抑制可能過度地降低身體的防御功能。因此，預期本發(fā)明的治療劑 (其選擇性地作用于Thl7細胞)會實現(xiàn)減少的副作用。另外，由于Thl7細胞作為自身免疫疾病的致病細胞顯示出比Thl細胞更強的作用(這取決于疾病)，本發(fā)明的治療劑通過選擇性地作用于Thl7細胞而表現(xiàn)出對與Thl7細胞有關的自身免疫疾病等的優(yōu)良的作用。
另外，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與表現(xiàn)出細胞毒性的藥物綴合的抗-Embigin抗體或具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)的抗-Embigin抗體也可用作針對Thl7細胞的細胞毒性劑，因為經(jīng)皂草素修飾的抗-Embigin抗體和與磁性珠子綴合的抗-Embigin抗體會選擇性地衰竭Thl7 細胞，并且大鼠IgG2b抗體(即是能夠誘導ADCC和⑶C活性的抗體的抗-Embigin抗體)也會選擇性地衰竭Thl7細胞。
因此，本發(fā)明提供了針對Thl7細胞的細胞毒性劑，其含有抗-Embigin抗體。
本發(fā)明的“針對Th 17細胞的細胞毒性劑”是會對Th 17細胞造成細胞損傷的藥物。因此，本發(fā)明的針對Thl7細胞的細胞毒性劑的實例包括前述的表現(xiàn)出細胞毒性的抗-Embigin抗體和具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體。
本發(fā)明的針對Thl7細胞的細胞毒性劑可以用于證實Thl7細胞在某種病理學狀況中的參與，例如，通過·將所述藥劑施用給各種動物疾病模型。
迄今為止，已經(jīng)主要通過Thl7細胞轉(zhuǎn)移證實了 Thl7細胞作為自身免疫疾病的致病細胞的研究。但是，它們不是使用非常純的Thl7細胞進行轉(zhuǎn)移的研究，而是允許混合除了 Thl7細胞以外的細胞的那些研究(J. Exp. Med. (2005) 233-240)。因此，使用本發(fā)明的針對Thl7細胞的細胞毒性劑，可以更清楚地分析Thl7在病理學中的參與，且本發(fā)明的藥劑可用于研究多種疾病的治療。例如，作為自身免疫病模型，可以提及實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)-發(fā)病模型，這是一種多發(fā)性硬化模型，且可以使用通過用肽(自身抗原)諸如PLP或MOG等免疫廣泛使用的小鼠和大鼠而得到的EAE模型(Methods Mol Biol. 2009; 549: 157-73，Brain (2004) ; 127: 2201-2213)，盡管不限于此。
本發(fā)明的針對Thl7細胞的細胞毒性劑可以另外用于預防或治療前述的“與Thl7 細胞有關的疾病”。
根據(jù)在下述的“5.本發(fā)明的Thl7細胞的檢測方法”中描述的方法，通過計數(shù)Thl7 細胞的數(shù)目，可以證實本發(fā)明的針對Thl7細胞的細胞毒性劑的效果。
本發(fā)明的治療劑和針對Thl7細胞的細胞毒性劑可以含有任選的載體，例如，藥學上可接受的載體，且可以以藥物組合物的形式作為藥物施用。
藥學上可接受的載體的實例包括、但不限于賦形劑諸如蔗糖、淀粉等，粘合劑諸如纖維素、甲基纖維素等，崩解劑諸如淀粉、羧甲基纖維素等，潤滑劑諸如硬脂酸鎂、微粉硅膠等，香料諸如檸檬酸、薄荷醇等，防腐劑諸如苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉等，穩(wěn)定劑諸如檸檬酸、梓檬酸鈉等，懸浮液諸如甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，分散劑諸如表面活性劑等，稀釋劑諸如水、鹽水等，蜂蠟等。
本發(fā)明的藥劑可以口服地和腸胃外地施用，優(yōu)選腸胃外施用。其具體實例包括注射劑型、經(jīng)鼻施用劑型、經(jīng)肺施用劑型、透皮施用形式等。注射劑型的實例包括靜脈內(nèi)注射、 肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等，它們可以全身地或局部地施用。
盡管本發(fā)明的藥劑的劑量可以隨下述因素而變化給藥目的、給藥方法、給藥途徑、劑型、給藥對象的狀況(性別、年齡、體重、嚴重性等)，當通過注射施用給成年人時，通?？梢源_定在下述范圍內(nèi)的劑量每Ikg體重O. 0001 mg - 100 mg，或每位患者每次注射1-1000 mg、優(yōu)選地5 - 50 mg。但是,本發(fā)明的藥劑和/或組合物不限于這些劑量。
另外，關于給藥間隔，只要效果持續(xù)，就可以不施用下一次給藥。例如，在治療期間，給藥可以是每2 - 8周I次，每幾周I次，或每幾個月I次，或每幾年I次。·
根據(jù)已知的制藥方法配制本發(fā)明的藥劑，并施用。例如，它可以以在水或其它藥學上可接受的液體中的無菌溶液或懸浮液注射劑的形式使用。另外，可以如下配制它適當?shù)嘏c例如藥理學上可接受的載體或介質(zhì)(具體地，無菌的水和鹽水、乳化劑、助懸劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、媒介物、防腐劑等)相組合，并在普遍接受的藥用用途所需的單位劑型中混合。 在這些制品中的活性成分的量應當設定為在標定范圍內(nèi)的合適體積。
根據(jù)一般的制備用途，使用諸如注射用蒸餾水等媒介物，可以配制用于注射的無菌組合物。注射用水溶液的實例包括鹽水、等張溶液，所述等張溶液包括葡萄糖和其它助劑，諸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉，且它們可以與合適的溶解助劑(例如， 醇，特別是乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)和非離子的表面活性劑(例如，聚山梨酯80TM、HC0-50)組合使用。
油狀液體的實例包括芝麻油和大豆油，它們可以與苯甲酸芐酯和苯甲醇(作為溶解助劑)組合使用。另外，可以組合地使用緩沖劑(例如，磷酸鹽緩沖劑、醋酸鈉緩沖劑)、 安撫劑(例如，鹽酸普魯卡因)、穩(wěn)定劑(例如，苯甲醇、苯酹)和抗氧化劑。制備的注射溶液通常裝入合適的安瓿中。
3. 本發(fā)明的用于藥物遞送系統(tǒng),的抗-EmbiRin抗體本發(fā)明提供了用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)和可用于所述DDS 的抗-Embigin抗體。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于與其它血細胞相比，Embigin在Thl7細胞中高度地表達，且經(jīng)毒素修飾的抗-Embigin抗體和與磁性珠子綴合的抗-Embigin抗體會衰竭Th 17細胞,所以抗-Embigin抗體可用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)中。
由于本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)的抗-Embigin抗體會特異性地結(jié)合Embigin (它是 Thl7細胞的細胞膜表面抗原)，通過使目標藥物與所述抗體綴合而形成的復合物可以將所述藥物遞送給Thl7細胞。
抗-Embigin抗體的實例包括在“1.在本發(fā)明中的抗-Embigin抗體”中詳細描述的抗體。它也可以是商購可得的抗-Embigin抗體(例如，由Santa Cruz等銷售的抗-Embigin 抗體)。
所述藥物沒有特別限制，只要它可以與抗-Embigin抗體形成復合物。其實例包括細胞毒性物質(zhì)諸如細菌衍生的毒素等，化學治療劑和放射性同位素。其具體實例包括在“2.本發(fā)明的治療劑和針對Thl7細胞的細胞毒性劑”中詳細描述的藥物。優(yōu)選的藥物是這樣的藥物其沒有副作用，且表現(xiàn)出強細胞毒性諸如細胞殺死活性、細胞生長抑制活性等。在本領域中已經(jīng)確立了藥物和抗體的結(jié)合方法。
本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)(DDS)是以施用抗-Embigin抗體和藥物的復合物為特征的藥物遞送系統(tǒng)，且可以將目標藥物遞送給Thl7細胞。
本發(fā)明的DDS可以在體外和在體內(nèi)施用。
在“體外”的情況下，通過將抗-Embigin抗體和藥物的復合物加入培養(yǎng)細胞或從哺乳動物收集的細胞的培養(yǎng)用培養(yǎng)基中，可以將藥物遞送給Thl7細胞。
在“體內(nèi)”的情況下，通過皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、經(jīng)滲透泵給藥、經(jīng)尾靜脈給藥等方式，給單個哺乳動物施用抗-Embigin抗體和藥物的復合物，可以將藥物遞送給體內(nèi)的 Thl7細胞。所述哺乳動物的實例包括人、猴、小鼠、大鼠等。
4.本發(fā)明的Thl7細胞檢測試劑和試劑盒盡管已知Thl7細胞與多種疾病有關，尚未報道Thl7細胞-特異性的細胞表面分子。
發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn),Embigin或Embigin基因可用作Thl7細胞標志物，因為Embigin 在小鼠Thl7細胞和人Thl7細胞中高度地表達，且特別是在血細胞中，Thl7細胞比其它血細胞更高地表達Embigin。
本發(fā)明的Thl7細胞檢測試劑含有抗-Embigin抗體或能夠特異性地檢測Embigin 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸。
抗-Embigin抗體的實例包括在“1.本發(fā)明的抗-Embigin抗體”中詳細描述的抗體。另外，所述抗-Embigin抗體可以是用熒光物質(zhì)或放射性同位素標記的經(jīng)修飾的抗體。 作為標記，可以使用與下述核酸中的標記類似的標記。熒光物質(zhì)的實例包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等，放射性同位素的實例包括1251、1311、3h、14c等。根據(jù)常規(guī)方法，可以用熒光物質(zhì)或放射性同位素標記抗體。使用被突光標記等標記的抗-Embigin抗體,通過FACS等可以容易地檢測Thl7細胞。
所述“能夠特異性地檢測Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸”可以是任意核酸，只要它可以特異性地檢測Embigin的mRNA，且根據(jù)所述檢測方法可以適當?shù)剡x擇和使用探針或引物。探針的實例包括這樣的多核苷酸序列所述序列包含Embigin mRNA的核酸序列的15 個堿基或更多、優(yōu)選地18個堿基或更多、更優(yōu)選約20個堿基或更多、最優(yōu)選地全長的連續(xù)核苷酸序列，或其互補序列。弓I物的實例包括包含一對DNA序列的多核苷酸序列，所述DNA 序列由15個堿基或更多、優(yōu)選地18個堿基或更多、更優(yōu)選約20個堿基或更多且100個堿基或更少、優(yōu)選地50個堿基或更少、更優(yōu)選約40個堿基或更少組成，它們會提供具有下述長度的PCR擴增的序列例如，100個堿基或更多、優(yōu)選地200個堿基或更多，且，例如，1000 個堿基或更少、優(yōu)選地500個堿基或更少，且它們分別被包含在Embigin mRNA的核酸序列和其互補鏈序列內(nèi)。
所述核酸探針或引物可以含有其它序列(不與檢測對象多核苷酸互補的核苷酸序列)，只要不損害特異性檢測即可。
另外，也可以用合適的標記來標記所述核酸探針和引物，所述標記是例如放射性同位素(例如，1251、1311、3h、14c等)、酶(例如，β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等)、熒光物質(zhì)(例如，熒光胺、異硫氰酸熒光素等)、發(fā)光物質(zhì)(例如，魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等)等?；蛘?，可以另外在熒光物質(zhì)附近綴合猝滅劑(猝滅物質(zhì))，后者會吸收由熒光物質(zhì)(例如，F(xiàn)AM、VIC等)發(fā)射的熒光能。在這樣的實施方案中，當熒光物質(zhì)和猝滅劑在檢測反應過程中分離時，檢測到熒光。
所述核酸探針可以是DNA、RNA和嵌合核酸中的任一種，且是單鏈或雙鏈?；陉P于Embigin基因的核酸序列的已知信息(例如，SEQ ID NO: 2所示的人Embigin基因的核酸序列)，根據(jù)常規(guī)方法，并使用例如DNA/RNA自動合成儀，可以合成能夠特異性地檢測 Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸探針。
本發(fā)明也提供了一種用于檢測Thl7細胞的試劑盒。本發(fā)明的用于Thl7細胞檢測的試劑盒含有用于測量Embigin的表達的試劑。通過使用本發(fā)明的試劑盒測量Embigin 的表達，可以方便地檢測Thl7細胞。
本發(fā)明的試劑盒含有抗-Embigin抗體或能夠特異性地檢測Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸，特別是前述的用于Thl7細胞檢測的試劑。
在用于Thl7細胞檢測的試劑中含有的抗-Embigin抗體或核酸，通常以下述形式被包含在本發(fā)明的試劑盒中以合適的濃度溶解在水或合適的緩沖液(例如，TE緩沖液、 PBS等)中的其水溶液的形式，或核酸陣列的形式，其中將核酸探針固定化在固相載體上。
本發(fā)明的試劑盒可以在它的構(gòu)成中另外含有根據(jù)Embigin的測量方法實施所述方法必需的其它組分。例如，當使用RNA印跡法或核酸陣列進行測量時，本發(fā)明的試劑盒可以另外含有印跡緩沖液、標記試劑、印跡膜等。當使用原位雜交進行測量時，本發(fā)明的試劑盒可以另外含有標記試劑、生色底物等。另外，當使用FACS進行測量時，所述試劑盒可以含有熒光標記的第二抗體、細胞固定劑等。
5.本發(fā)明的Thl7細胞檢測方法發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Embigin在小鼠Thl7細胞和人Thl7細胞中高度地表達，且特別是在血細胞中，Embigin在Thl7細胞中 比在其它血細胞中更高地表達，基于此，他們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了使用Embigin的表達作為指標的Thl7細胞檢測方法。
本發(fā)明的Thl7細胞檢測方法包括測量Embigin在細胞或組織中的表達的步驟, 和基于表達水平和Thl7細胞之間的正相關來檢測Thl7細胞的步驟。根據(jù)本發(fā)明，可以比以前更容易地檢測Thl7細胞。
“Embigin的表達”在本發(fā)明中是指，Embigin蛋白或Embigin基因的表達。
通過測量Embigin在細胞或組織中的表達，可以具體地執(zhí)行本發(fā)明的方法。所述細胞僅需要是從試驗動物得到的細胞或培養(yǎng)細胞，且得到的血細胞或從血細胞衍生出的培養(yǎng)細胞是優(yōu)選的。所述組織僅需要是從試驗動物得到的組織，且優(yōu)選地是允許免疫染色的形式。
本發(fā)明的方法可以應用于，例如，從試驗動物(諸如人、大鼠、小鼠等)得到的細胞、組織等。
使用前述的本發(fā)明的用于Thl7細胞檢測的試劑和根據(jù)其本身已知的方法，可以測量Embigin的表達。測量方法的實例包括FACS、蛋白質(zhì)印跡法、RT-PCR、RNA印跡法、原位雜交、核酸陣列、組織染色等。
然后，基于測量的Embigin的表達水平，可以檢測Thl7細胞。如在下述的實施例中所示，由于Embigin在Thl7細胞中的表達水平較高，基于Embigin表達水平和Thl7細胞之間的正相關，當Embigin的表達水平或濃度在測量對象的細胞或組織中較高時，可以判斷所述細胞是Thl7細胞。
迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)這樣的Thl7細胞的細胞表面分子其能夠?qū)崿F(xiàn)使用單一分子來鑒別Thl7細胞。但是，本發(fā)明的Thl7細胞檢測方法可以使用方便的方法諸如FACS等來檢測Thl7細胞。具體地，當將本發(fā)明的方法應用于血細胞或血液衍生的培養(yǎng)細胞時，可以容易地檢測Thl7細胞。因此，就研究涉及Thl7細胞的自身免疫疾病和變應性疾病、檢查試驗動物中是否存在增加的Thl7細胞等而言，本發(fā)明的方法是非常有用的。實施例
在下面，通過參照實施例解釋本發(fā)明，所述實施例不應解釋為限制性的。_7] 參照實施例1-1.針對小鼠Embigin的抗體的制備(I)將用于表達小鼠Embigin的逆轉(zhuǎn)錄病毒導入大鼠細胞中，以制備過表達小鼠Embigin 的細胞。用過表達小鼠Embigin的細胞免疫大鼠(Wistar, 5-周齡，CLEAJapan, Inc.)。 在免疫接種以后，得到淋巴細胞，并通過PEG方法與骨髓瘤細胞融合，以得到雜交瘤。
使用用于免疫接種的過表達小鼠Embigin的細胞作為陽性對照細胞，使用與陽性對照細胞相同、但是僅導入載體的宿主細胞作為陰性對照細胞，通過流式細胞術，篩選生產(chǎn)抗-小鼠Embigin抗體的雜交瘤。
如下通過流式細胞術來評價結(jié)合活性。
以IxlO4 -1xlO6細胞，使用陽性對照細胞或陰性對照細胞，加入雜交瘤培養(yǎng)物上清液或5 μ g/mL的合適的大鼠IgG，使所述混合物反應30 min。用FACS緩沖液洗滌細胞 I次，加入突光標記的抗-大鼠IgG抗體,使所述混合物反應30 min。反應以后,通過離心操作收集細胞·，懸浮于PBS或FACS緩沖液中，并進行流式細胞術。使用的流式細胞計是流式細胞計FC500 (Beckman Coulter)。使用前向散射和側(cè)向散射直方圖，設定對活細胞群的門控，并進行分析。
得到僅與表達Embigin的陽性對照細胞強烈反應的雜交瘤(2G21、2G23、3E64、 3E66)。圖1顯示了評價結(jié)果。
為了進一步證實反應特異性,使用過表達小鼠Embigin的細胞(宿主倉鼠細胞) 作為陽性對照細胞，并使用僅導入載體的倉鼠細胞作為陰性對照細胞，通過流式細胞術評價了 2G21 和 3E64。使用流式細胞計 FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)進行分析，證實了 2G21和3E64僅與陽性對照細胞的強反應。圖2顯示了評價結(jié)果。
參照實施例1-2.針對小鼠Embigin的抗體的制備⑵使用96-孔板，通過有限稀釋方法，進一步對在上述參照實施例1-1中制備的抗-Embigin抗體3E64進行單克隆。純化該克隆的抗體，以得到抗-Embigin抗體(3E64D1)。
另外，證實該抗體克隆為大鼠IgG2b抗體。已知大鼠IgG2b具有誘導細胞毒性的結(jié)構(gòu)。
參照實施例2._小鼠各種輔助性T細胞的制備(I)小鼠Thl7細胞的制備通過參考公開的參考文獻(Nature Immunology (2007)第8卷903-905，Nature Immunology (2007)第 8 卷 958-966， Nature Immunology (2007)第 8 卷 1390-1397， Nature (2007)第 448 卷 480-484，J. Biol. Chem. (2008)第 283 卷 17003-17008)，制備小鼠Thl7細胞。
從SJL小鼠(CHARLESRIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)或Rag2 K0/D011. 10 Tg 小鼠(Taconic Farms, Inc.)分離出脾,并制備細胞懸浮液。用細胞過濾網(wǎng)(直徑70 μ m, Becton, Dickinson and Company)過濾細胞懸浮液，并離心(300Xg, 4°C , 5 min),除去上清液。用 ACK 溶液(TAKARA BIO INC.)溶血以后，用 RPMI1640 (Nacalai Tesque)洗滌細胞，以制備脾細胞。當從SJL小鼠制備時，使用CD4+ T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.)，從洗滌過的細胞制備⑶4+T細胞。
在抗-⑶3 ε /抗-⑶28抗體固相板上培養(yǎng)⑶4+Τ細胞。為了培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基(Invitrogen),所述培養(yǎng)基加入了 20 ng/mL小鼠IL_6、3 ng/mL小鼠 TGF-β 1,20 ng/mL 小鼠 IL-23、10 μ g/mL 抗-小鼠 IFN-Y 抗體、10 μ g/mL 抗-小鼠 IL-4 抗體和10 yg/mL抗-小鼠IL-2抗體，通過傳代培養(yǎng)適當?shù)鼐S持所述細胞，并誘導分化成 Thl7細胞。使用分化誘導了 5-14天的Thl7細胞進行試驗。
(2)小鼠Treg細胞的制備從小鼠脾制備CD4+T細胞，并在抗-CD3 ε /抗-CD28抗體固相板上培養(yǎng)。為了培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基加入了 20 ng/mL小鼠TGF-β UlOO IU/mL小鼠IL-2、100 nM視黃酸(全反式)和10 μ g/mL抗-小鼠IL-6，通過傳代培養(yǎng)適當?shù)鼐S持所述細胞，并誘導分化成Treg細胞。使用分化誘導了 5-14天的Treg細胞進行試驗。
⑶小鼠Thl細胞的制備 從小鼠脾制備CD4+T細胞，并在抗-CD3 ε /抗-CD28抗體固相板上培養(yǎng)。為了培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基加入了 20 ng/mL小鼠IL-12和10 μ g/mL抗-小鼠IL-4，通過傳代培養(yǎng)適當?shù)鼐S持所述細胞，并誘導分化成Thl細胞。使用分化誘導了 5-14天的Thl細胞進行試驗。
⑷小鼠Th2細胞的制備從小鼠脾制備CD4+T細胞，并在抗-CD3抗體/抗-CD28抗體固相板上培養(yǎng)。為了培養(yǎng)， 使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基加入了 20 ng/mL小鼠IL_4、5 μ g/ mL抗-小鼠IFN- Y和5 μ g/mL抗-小鼠IL-12，通過傳代培養(yǎng)適當?shù)鼐S持所述細胞，并誘導分化成Th2細胞。使用分化誘導了 5-14天的Th2細胞進行試驗。
(5)小鼠ThO細胞的制備關于小鼠ThO細胞，從小鼠脾制備⑶4+T細胞，并在抗-⑶3 ε /抗-⑶28抗體固相板上培養(yǎng)。為了培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基加入了 10 μ g/ mL抗-小鼠IL-4、10 μ g/mL抗-小鼠IFN- Y和10 μ g/mL抗-小鼠IL-12，通過傳代培養(yǎng)適當?shù)鼐S持所述細胞，以制備ThO細胞，其用于試驗。
參照實施例3.針對人Embigin的抗體的制備將表達人Embigin的逆轉(zhuǎn)錄病毒導入小鼠細胞中，以制備過表達人Embigin的細胞。用過表達人Embigin的細胞免疫小鼠(Balb/c，5-周齡，CLEAJapan，Inc.)。在免疫接種以后，得到淋巴細胞，并通過PEG方法與骨髓瘤細胞融合，以得到雜交瘤。
使用用于免疫接種的過表達人Embigin的細胞作為陽性對照細胞，使用與陽性對照細胞相同、但是僅導入載體的宿主細胞作為陰性對照細胞，通過流式細胞術，篩選生產(chǎn)抗-人Embigin抗體的雜交瘤。使用流式細胞計FC500 (Beckman Coulter),得到表現(xiàn)出雜交瘤陽性反應的雜交瘤(6G1E6和7C4E10)，它們僅與表達Embigin的陽性對照細胞強烈地反應。圖6顯示了評價結(jié)果。
參照實施例4.人Thl7細胞的制備根據(jù)公開的參考文獻PNAS (2007) ; 104: 17034-17039，制備了人Thl7細胞。
在含有脂多糖、抗-⑶3抗體、抗-1FN- Y抗體、抗-1L-4抗體和抗_IL_12抗體的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)從人外周血制備的記憶CD4+T細胞和單核細胞3天，進一步在含有抗-CD2 抗體 / 抗-CD3 抗體 / 抗-CD28 抗體固相珠子(Cell Activation/Expansion Kit human, Miltenyi Biotec Κ· K.)、IL-2、IL-1 β、IL-6、IL-23、抗-1FN-γ 抗體、抗-1L-4 抗體和抗-1L-12抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 - 20天，以造成分化成Thl7細胞。
實施例1.通過蛋白質(zhì)印跡法評價在Thl7細胞中的表達特異性為了證實在Thl7細胞中的表達特異性，通過蛋白質(zhì)印跡法對比了 Treg細胞(它是輔助性T細胞之一)和Th 17細胞的Embigin表達水平。
將Thl7細胞和Treg細胞(通過從Rag2 K0/D011. 10 Tg小鼠或SJL小鼠脾細胞分化而制備)溶解于含有80 mM NaCl,50 mM Tris-HCl (pH 8)、2 mM CaCl2,1% Triton X-100 和蛋白水解酶抑制劑(Complete , Boehringer Ingelheim)的溶解緩沖液中，并離心 (12000 rpm, 4°C，30 min)。使用上清液作為蛋白溶液。將所述蛋白溶液與樣品緩沖液(用于SDS-PAGE，2倍濃縮，含有2-巰基乙醇)(Nacalai Tesque)混合，并在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳等量的蛋白。電泳以后，使用Trans-Blot SD半干電泳轉(zhuǎn)移池(BIO-RAD)， 將它轉(zhuǎn)移至Immobilon-P (Millipore)。使用轉(zhuǎn)移的膜,進行蛋白質(zhì)印跡法。為了檢測，使用兔抗-Embigin多克隆抗體(MGENEX)和HRP標記的山羊抗-兔Ig抗體(BI0S0URCE)。通 LAS-3000 (Fujifilm),使用 ECL Plus 蛋白質(zhì)印跡法檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Japan), 進行檢測。
結(jié)果顯示在圖3中。發(fā)現(xiàn)Embigin在Treg細胞中幾乎不表達,但是在Thl7細胞中高度表達。
實施例2.通過aRT-PCR方法評價在輔助件T細胞中的表汰特異件從Thl7細胞、Thl細胞、Th2細胞、ThO細胞和Treg細胞(通過從Rag2 K0/D011.1OTg 小鼠脾細胞分化而制備)，并使用TRIzol (Invitrogen),制備總RNA。通過TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems)和 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems),評價總 RNA 中的 Embigin mRNA 的量。通過 ABI7900 (Applied Biosystems)進行測量，并同時評價持家基因36B4的表達。在基于36B4表達量的修正以后，以Treg細胞的表達水平作為1，進行計算。
使用Embigin 引物(SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO: 4)和 36B4 引物(SEQ ID NO: 5 和SEQ ID NO: 6)，進行檢測。
結(jié)果顯示在圖4中。在小鼠輔助性T細胞中，發(fā)現(xiàn)Embigin可用作Thl7細胞的標志物，因為它在Thl7細胞中特別高地表達。
實施例3.通過流式細胞術評價細胞膜表面蛋白的Thl7細胞特異件為了評價細胞膜表面蛋白在Thl7細胞中的表達特異性，通過流式細胞術，用不同細胞中的表達水平進行了對比。
從SJL小鼠脾細胞分化出Thl7細胞、Treg細胞、Thl細胞和Th2細胞，制備，并進行試驗。另外，還對沒有經(jīng)過分化誘導的脾細胞和從小鼠外周血制備的紅血細胞進行了試驗。
使用生產(chǎn)抗-小鼠Embigin抗體的克隆2G23、3E64的培養(yǎng)物上清液，并使用熒光標記的山羊抗-大鼠IgM和IgG抗體(Beckman Coulter, Inc.)作為第二抗體,將Embigin 染色。作為抗-小鼠Embigin抗體的陰性對照，以與在參照實施例1中相同的方式用大鼠 IgG (Becton, Dickinson and Company)將細胞染色。關于小鼠脾細胞，為了鑒別B細胞、 白細胞和CD3陽性細胞，用熒光標記的抗-小鼠B220抗體(B細胞標志物)、熒光標記的抗-小鼠⑶Ila抗體(白細胞標志物)或熒光標記的抗-小鼠⑶3抗體(⑶3陽性的細胞標志物)將它們?nèi)旧Ｍㄟ^流式細胞術，評價這些樣品。使用的流式細胞計是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。使用前向散射和側(cè)向散射直方圖，設定對活細胞群的門控，并進行分析。在分析每種B細胞、白細胞、CD3陽性細胞時，進一步設定在B220、CDlla 和⑶3陽性的級分中的每個門控，并進行分析。通過抗-小鼠Embigin抗體的幾何平均值與同種型(大鼠IgG)的幾何平均值之比，對比各個樣品。
結(jié)果顯示在圖5中。盡管Embigin在B細胞、白細胞、⑶3陽性細胞、紅血細胞和 Treg細胞中的表達水平非常低，與這些細胞相比，Embigin在Thl7細胞的細胞膜表面上高度地表達。因而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過檢查Embigin的表達，可以檢測Thl7細胞。
實施例4.在人Thl7細朐中的Embigin表汰研究通過流式細胞術，評價了 Embigin在人Thl7細胞膜表面上的表達。
在含有12-肉豆蘧酸-13-乙酸佛波醇酯、離子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培養(yǎng)基中，處理從外周血分化出的人Thl7細胞4小時,并用生產(chǎn)抗-人Embigin抗體的克隆6G1E6、7C4E10的培養(yǎng)物上清液和作為第二抗體的PE標記的山羊抗-小鼠Ig抗體(Beckman Coulter, Inc.)染色。作為抗-人Embigin抗體的陰性對照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)對細胞染色。此外,用 APC標記的抗-⑶4抗體對細胞染色。使用BD Cytofix/Cytoperm固定/透化溶液試劑盒 (Becton, Dickinson and Company),對這些樣品進行透化，并用FITC標記的抗-人IL-17 抗體染色。通過流式細胞術，評價這些樣品。使用的流式細胞計是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。使用前向散射和側(cè)向散射直方圖，設定對活細胞群的門控，并將 CD4+IL17+細胞作為Thl7細胞進行分析。
結(jié)果顯示在圖7中。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，Embigin在人Thl7細胞中表達。
實施例5.使用經(jīng)毒素修飾的抗-Embigin抗體造成的小鼠Thl7細胞的詵擇件衰竭(細胞死亡)使用致病細胞，評價了使用抗-Embigin抗體是否可能造成Thl7細胞選擇性衰竭(細胞死亡)。
通過參考J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240，制備了致病細胞。
換而言之，與弗氏完全佐劑一起，用PLP肽(SEQ ID NO: 7)免疫SJL小鼠(5-周齡，CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.)，并在 10天后收集淋巴結(jié)細胞。在有PLP 和IL-23存在下培養(yǎng)5天以后，進一步在有IL-23和IL-2存在下培 養(yǎng)所述細胞3 - 5天， 以得到致病細胞。
使用CD4+ T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.)，從制備的致病細胞制備 CD4+T細胞。
通過在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠Embigin 抗體(2G21、3E64)、抗-1gG、Rat、 Goat-Poly、阜草素〈Rat_ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 36 小時，進行細胞除去操作。作為對照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗體，以相同方式處理所述細胞。在含有12-肉豆蘧酸-13-乙酸佛波醇酯、離子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培養(yǎng)基中處理反應以后的細胞4小時，并用Per-CP 標記的抗-小鼠CD4抗體(COSMO BIO CO.，LTD.)、PE標記的抗-小鼠IFN Y抗體(BD Biosciences)和Alexa488標記的抗-小鼠IL17抗體(BD Pharmingen)染色。通過流式細胞術，評價這些樣品。使用的流式細胞計是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。將CD4+IL17.細胞歸類為Thl7細胞，將CD4+IFN y +IUT細胞歸類為Thl細胞， 將CD4+IFN Y —IL17—細胞歸類為其它細胞，并基于對照組中的每種細胞群的測量值(作為 100%)，評價存活細胞比率。
結(jié)果顯示在圖8中。由于Thl7細胞的存活細胞比率顯著低于Thl細胞和其它細胞的比率，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用皂草素(它是一類毒素)修飾的抗-Embigin抗體會選擇性地衰竭Thl7 細胞。
實施例6.抗-小鼠IgG-綴合的磁性珠子對Thl7細胞的選擇性衰竭使用致病細胞，評價了使用抗-Embigin抗體是否可能造成Thl7細胞選擇性衰竭(細胞死亡)。
使用CD4+ T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.)，從以與在實施例5相同的方式制備的致病細胞制備CD4+T細胞。
將致病細胞和抗-小鼠Embigin抗體(2G23或3E66)在4°C混合30 min,并離心 ( 1000 rpm, 3 min),以回收細胞。將抗-大鼠IgG抗體修飾的磁性珠子(Dynal)加入回收的細胞中，將它們在4°C混合30 min。除去通過磁性與磁性珠子結(jié)合的細胞，重復該操作2 次，并回收未與磁性珠子結(jié)合的細胞。作為對照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗體。 作為對照，使用沒有經(jīng)過細胞除去操作的細胞。
在含有12-肉豆蘧酸-13-乙酸佛波醇酯、離子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培養(yǎng)基中處理這些細胞4小時，并用Per-CP標記的抗-小鼠 CD4 抗體(C0SM0 BIO CO.，LTD.)、PE 標記的抗-小鼠 IFNy 抗體(BD Biosciences)和 Alexa488標記的抗-小鼠IL17抗體(BD Pharmingen)染色。通過流式細胞術,評價這些樣品。使用的流式細胞計是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。將 CD4+IL17+ 細胞歸類為Thl7細胞，將CD4+IFNY+IL17-細胞歸類為Thl細胞，將CD4+IFN Y 1L17-細胞歸類為其它細胞，并基于對照組中的每種細胞群的測量值(作為100%)，評價存活細胞比率。
結(jié)果顯示在圖9中。由于Thl7細胞的存活細胞比率顯著低于Thl細胞和其它細胞的比率，發(fā)現(xiàn)可以選擇性地衰竭Thl7細胞。
實施例7 .在小鼠組織(組織集合)中的Embigin的表汰使用每種小鼠組織蛋白印跡諸如INSTA-Blot Mouse Tissue (MGENEX)等，并與抗-小鼠Embigin抗體(IMGENEX)和HRP標記的山羊抗-兔Ig抗體(BI0S0URCE)反應， 以進行蛋白質(zhì)印跡法。使用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡法檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Japan)和LAS-3000 (Fujifilm)，進行檢測。
實施例8. Embigin在人Thl7細朐以外的細朐中的表汰研究通過下述方法，可對比Embigin在不同人細胞中的表達水平。
通過Dynabeads Regulatory CD4+CD25+ T 細胞試劑盒(Invitrogen),從人外周血分離出 CD4+CD25+T 細胞，并使用 Dynabeads Human Treg Expander (Invitrogen)放大培養(yǎng)，以制備人Treg細胞，對其進行試驗。用生產(chǎn)抗-人Embigin抗體的克隆6G1E6、7C4E10 的培養(yǎng)物上清液和作為第二抗體的PE標記的山羊抗-小鼠Ig抗體(Beckman Coulter, Inc.)對人Treg細胞染色。作為抗-人Embigin抗體的陰性對照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)對細胞染色。通過流式細胞計FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company),分析這些樣品。
另外，用生產(chǎn)抗-人Embigin抗體的克隆6G1E6、7C4E10的培養(yǎng)物上清液和作為第二抗體的PE標記的山羊抗-小鼠Ig抗體(Beckman Coulter, Inc.),對人外周血中的細胞染色。作為抗-人Embigin抗體的陰性對照，以相同方式用小鼠IgG (Becton, Dickinson and Company)對細胞染色。通過流式細胞計 FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company),分析這些樣品。當細分析外周血中的不同細胞時,用APC標記的抗-⑶4抗體對細胞染色以鑒別CD4陽性細胞，或用APC標記的抗-DX5抗體對細胞染色以鑒別NK細胞，或用APC標記的抗-⑶IIc抗體對細胞染色以鑒別樹突細胞，或用APC標記的抗-⑶8抗體對細胞染色以鑒別⑶8陽性細胞，或用APC標記的抗-⑶Ilb抗體對細胞染色以鑒別巨噬細胞， 或用APC標記的抗-B220抗體對細胞染色以鑒別B細胞，各自之后進行流式細胞術分析。
實施例9.證實Thl7細胞在體內(nèi)的衰竭通過在J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240中描述的方法，可以 證實Thl7細胞在體內(nèi)的選擇性衰竭。
用5-或6- (N-琥珀酰亞胺基氧基羰基)_熒光素3’，6’-二乙酸鹽(CFSE， D0JIND0 LABORATORIES)，標記通過與在實施例5類似的方法制備的致病細胞。
經(jīng)由尾靜脈，將CFSE標記的細胞轉(zhuǎn)移進小鼠中，并施用經(jīng)毒素修飾的抗-小鼠 Embigin抗體。作為對照，使用大鼠IgG替代經(jīng)毒素修飾的抗-小鼠Embigin抗體，以相同方式處理細胞。在4小時至4天以后，從外周血、脾、中樞神經(jīng)、淋巴組織等回收細胞。在含有12-肉豆蘧酸-13-乙酸佛波醇酯、離子霉素和BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培養(yǎng)基中處理得到的細胞4小時，并用Per-CP標記的抗-小鼠⑶4抗體(C0SM0 BIO CO.，LTD.)、PE標記的抗-小鼠IFNy抗體(BD Biosciences)或PE標記的抗-小鼠IL17抗體(BD Pharmingen)染色。通過流式細胞術,評價這些樣品。設定對活細胞群和 CFSF陽性細胞的門控，將CD4+IL17+細胞歸類為Thl7細胞，將CD4+IFN Y+IL17—細胞歸類為 Thl細胞，將CD4+IFN Y -1LlT細胞歸類為其它細胞，并基于對照組中的每種細胞群的測量值(作為100%)，評價存活細胞比率。
實施例10. Thl7細胞衰竭的發(fā)作抑制作用的離體證實通過下述方法，可以證實Thl7細胞的選擇性衰竭在自身免疫病模型中的發(fā)作抑制作用。
以與實施例5相同的方式，使用CD4+T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.), 從致病細胞制備CD4+T細胞。通過在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠Embigin抗體(2G21、3E64)、抗-1gG、Rat、Goat_Poly、阜草素<Rat_ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，進行細胞除去操作。作為對照，使用大鼠IgG替代抗-小鼠Embigin抗體?；蛘撸ㄟ^使用在實施例6中的磁性珠子，也可能特異性地消除Thl7。
通過尾靜脈，以3 X IO6細胞/只，將經(jīng)過細胞除去操作以后的細胞施用給對照組的小鼠。隨著時間觀察四肢和尾巴的麻痹以及體重，并評價EAE (實驗性自身免疫性腦脊髓炎)征狀。
實施例11.通過抗體施用來衰竭Thl7細胞的發(fā)作抑制作用的i正實在自身免疫病模型中，通過下述方法，可以證實Thl7細胞·的選擇性衰竭對疾病發(fā)作的抑制作用。
以與實施例5相同的方式，使用CD4+T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.), 從致病細胞制備CD4+T細胞。以3 X IO6細胞/只，從尾靜脈給小鼠施用細胞。
在細胞轉(zhuǎn)移的同時，或在發(fā)作等以后，將具有細胞衰竭能力的抗-Embigin抗體 (例如，皂草素化的抗體、具有ADCC活性的抗體等)施用給小鼠，隨著時間觀察四肢和尾巴的麻痹以及體重，并以此為基礎評價對EAE發(fā)作的作用。
或者，將諸如PLP或MOG等肽施用給廣泛地使用的小鼠或大鼠以制備EAE模型(根據(jù)在 Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73·，Brain (2004) ; 127:2201-2213 中描述的方法)，并在肽施用的同時，在EAE等發(fā)作之前,施用具有細胞衰竭能力的抗-Embigin抗體 (例如，皂草素化的抗體、具有ADCC活性的抗體等)，并評價對EAE發(fā)作的作用。
實施例12. Thl7細胞衰竭對復發(fā)的抑制作用的i正實由于許多自身免疫疾病表現(xiàn)出重復的征狀惡化階段和緩解階段，復發(fā)的抑制對于治療而言是重要的。
使用例如EAE模型，可以證實這一點。
在EAE發(fā)作以后，或在EAE征狀消退以后，將抗-Embigin抗體施用給在Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73·，Brain (2004) ; 127:2201-2213 等中描述的 EAE 模型，并評價對復發(fā)的效力。
實施例13. 小鼠組織中的Embifiin表達研究為了研究Embigin在小鼠的每種組織中的表達，使用INSTA-Blot Mouse Tissue (IMGENEX)作為各小鼠組織蛋白印跡，使其與抗-小鼠Embigin抗體(MGENEX)和HRP標記的山羊抗-兔Ig抗體(BI0S0URCE)反應，以進行蛋白質(zhì)印跡法。使用ECL Plus蛋白質(zhì)印跡法檢測系統(tǒng)(GE Healthcare Japan)和 LAS-3000 (Fujifilm),進行檢測。
結(jié)果顯示在圖10中。盡管證實了 Embigin在肌肉和脾中的表達，其表達水平非常低，沒有組織強烈地表達Embigin。因此，預期含有抗-Embigin抗體的治療劑會表現(xiàn)出對身體的每個組織更少的副作用。
實施例14. Th 17細胞衰竭的體內(nèi)證實根據(jù)在J. Exp. Med. (2005) 201; 233-240中描述的方法，在體內(nèi)證實了 Thl7細胞的選擇性衰竭。
與弗氏完全佐劑一起，用PLP部分肽(PLP139_151，SEQ ID NO: 7)免疫5_周齡雌性 SJL/J小鼠，并在10天后制備淋巴結(jié)細胞。在有PLP和IL-23存在下培養(yǎng)5天以后，進一步在有IL-23和IL-2存在下培養(yǎng)所述細胞3 - 5天，以得到致病細胞。使用⑶4+ T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec K. K.)，從所述致病細胞制備⑶4+T細胞。該細胞群含有30 -50%的Thl7細胞。通過用于流式細胞術的CellTrace CFSE細胞增殖試劑盒(Invitrogen)， 用二乙酸羧基熒光素琥珀酰亞胺基酯(CFSE)標記該致病細胞。將抗-小鼠Embigin抗體 (3E64D1)施用給小鼠，并以1.5 x IO7細胞，將CFSE標記的細胞從尾靜脈施用給小鼠。作為對照，使用大鼠IgG2b。I天后，從脾得到細胞。通過流式細胞術，評價得到的細胞。計算 CFSE陽性細胞的數(shù)目，將對照組中的CFSE陽性細胞數(shù)目(作為100%)的減少，評價為細胞衰竭率。
結(jié)果顯示在圖11中。經(jīng)證實，抗-Embigin抗體的施用會以劑量依賴性的方式減少轉(zhuǎn)移的CFSE陽性細胞的數(shù)目。該結(jié)果已經(jīng)證實，抗-Embigin抗體可以通過所述抗體的 ADCC和⑶C活性來減少Thl7細胞的數(shù)目。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，給個體施用抗-Embigin抗體可以在體內(nèi)減少Thl7細胞的數(shù)目。
實施例15. Thl7細胞衰竭的發(fā)作抑制作用的離體i正實在自身免疫病模型中，通過下述方法證實了 Thl7細胞的選擇性衰竭的發(fā)作抑制作用。
與弗氏完全佐劑一起，用PLP部分肽(PLP139_151)免疫5_周齡雌性SJL/J小鼠，并在 10天后制備淋巴結(jié)細胞。在有PLP和IL-23存在下培養(yǎng)5天以后，進一步在有IL-23和IL-2 存在下培養(yǎng)所述細胞3 - 5天，以得到致病細胞。使用CD4+ T細胞分離試劑盒(Miltenyi Biotec !(.^，從所述致病細胞制備^^+了細胞。通過在含有IL-23、IL-2、抗-小鼠 Embigin 抗體(3E64D1) I μ g/mL、抗-1gG、Rat、Goat-Poly、阜草素 <Rat_ZAP> (Advanced Targeting Systems)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，進行細胞除去操作。作為對照，使用大鼠 IgG2b替代抗-小鼠Embigin抗體。在含有12-肉豆蘧酸_13_乙酸佛波醇酯、離子霉素、BD GolgiStop (Becton, Dickinson and Company)的培養(yǎng)基中處理反應以后的一部分細胞4 小時，并用Per-CP標記的抗-小鼠CD4抗體(C0SM0 BIO CO.，LTD.)、PE標記的抗-小鼠 IFN Y 抗體(BD Biosciences)和 Alexa488 標記的抗-小鼠 IL17 抗體(BD Pharmingen)對細胞染色。通過流式細胞術，評價這些樣品。使用的流式細胞計是FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company)。將 CD 4+IL17+細胞歸類為 Thl7 細胞，將 CD4+IFN γ+IL17-細胞歸類為Thl細胞，并基于對照組中的每種細胞群的測量值(作為100%)，評價存活細胞比率?？梢宰C實Thl7細胞選擇性的細胞衰竭。結(jié)果顯示在圖12中。
以3 X IO6細胞/只，將在細胞除去操作以后的細胞或?qū)φ战M的細胞從尾靜脈轉(zhuǎn)移至小鼠，并隨著時間觀察四肢和尾巴的麻痹以及體重，并以此為基礎評價實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的征狀。根據(jù)下述標準，以評分來顯示征狀的嚴重性水平。0:沒有征狀O. 5 :尾巴輕度麻痹1:尾巴麻痹2:后爪輕度麻痹3:后爪中等至嚴重麻痹，或前肢輕度麻痹4:后爪完全麻痹，或前肢中等至嚴重麻痹5:四肢麻痹或處于生死攸關期6:死亡結(jié)果顯示在圖13中。通過使用抗-Embigin抗體對Th 17細胞的選擇性衰竭,完全抑制了 EAE征狀。
實施例16.通過抗體施用實現(xiàn)的Thl7細胞衰竭的發(fā)作抑制作用的i正實使用活動的EAE發(fā)作模型(它是一種自身免疫病模型)，證實了抗-Embigin抗體的EAE 發(fā)作抑制作用。
(I)活動的EAE發(fā)作模型的制備使用EAE小鼠，它是一種多發(fā)性硬化動物模型。通過SD. Miller等人的方法(Curr. Protoc.1mmunol. 2010; 88:15.1. 1-15.1. 20.)引起 EAE。也就是說，將與弗氏完全佐劑混合的PLP部分肽(PLP139_151) (150 μ g)皮下地注射給9-周齡雌性SJL/J小鼠(購自 CHARLES RIVER)的下背部。隨時間觀察四肢和尾巴的麻痹以及體重，并評價EAE征狀。EAE 征狀的評分遵循實施例15。
(2)抗體施用和用于預防疾病發(fā)作的評價將抗-Embigin抗體(3E64D1)懸浮于PBS溶液中，并以O. 3 μ g/小鼠，靜脈內(nèi)地施用給在上述(I)中制備的小鼠。將大鼠IgG2b靜脈內(nèi)地施用給對照組。在肽致敏以后第7天和第14天進行施用，每天I次。隨時間觀察四肢和尾巴的麻痹以及體重，并評價EAE征狀。
結(jié)果顯示在圖14中。抗-Embigin抗體的施用完全抑制了 EAE病狀的發(fā)作。所述結(jié)果已經(jīng)證實，抗-Embigin抗體可以抑制多發(fā)性硬化(MS)的發(fā)作。
實施例17. Thl7細胞衰竭對復發(fā)的抑制作用的i正實由于許多自身免疫疾病表現(xiàn)出重復的征狀惡化階段和緩解階段，復發(fā)的抑制對于治療而言是重要的。
使用EAE模型證實了這一點。在EAE發(fā)作以后，將抗-Embigin抗體施用給在 Methods Mol Biol. 2009; 549:157-73·，Brain (2004) ; 127:2201-2213等中描述的EAE 模型，并評價對復發(fā)的效力。使用臨床評分和體重作為指標，將在肽致敏以后第12天表 現(xiàn)出發(fā)作的動物分組。在肽免疫接種第12天分組以后馬上，和在第19天，靜脈內(nèi)地施用抗-Embigin抗體(3E64D1)，每天I次。此后,評價對EAE征狀的作用。EAE征狀的評分遵循在實施例15中所示的標準。
結(jié)果顯示在圖15中。經(jīng)證實,抗-Embigin抗體的施用會快速地降低臨床評分。在對照組中沒有觀察到在第23天的惡化。該結(jié)果已經(jīng)證實，抗-Embigin抗體會促進多發(fā)性硬化(MS)緩解的誘導并抑制惡化，且因此，它可以用作多發(fā)性硬化的緩解誘導劑或惡化抑制劑。
工業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明，可以提供自身免疫疾病(諸如多發(fā)性硬化等)和變應性疾病的治療劑以及針對Thl7細胞的細胞毒性劑。此外，本發(fā)明也可以提供可用于藥物遞送系統(tǒng)中的抗-Embigin抗體,所述藥物遞送系統(tǒng)可以將藥物等選擇性地且有效地遞送給Thl7細胞，以及Thl7細胞標志物、用于Thl7細胞檢測的試劑和方便的Thl7細胞檢測方法。
本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?010-127316 (提交日2010年6月2 日)，其內(nèi)容全部并入本文中。
權利要求
1.一種用于預防和/或治療自身免疫病或變應性疾病的藥劑，所述藥劑包含抗-Embigin抗體。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
3.根據(jù)權利要求1所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
4.根據(jù)權利要求3所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGl、IgG3或IgM。
5.根據(jù)權利要求1所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
6.根據(jù)權利要求5所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
7.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的藥劑，其中所述疾病與Thl7細胞有關。
8.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的藥劑，其中所述疾病是多發(fā)性硬化、銀屑病、風濕病、炎性腸病、接觸性超敏反應、類固醇抵抗型哮喘、慢性非傳染性葡萄膜炎、慢性阻塞性肺疾病、腎小球腎炎或特應性皮炎。
9.根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的藥劑，其中所述疾病是多發(fā)性硬化。
10.一種針對Thl7細胞的細胞毒性劑，所述細胞毒性劑包含抗-Embigin抗體。
11.根據(jù)權利要求10所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性或細胞毒性誘導活性。
12.根據(jù)權利要求10所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性誘導活性。
13.根據(jù)權利要求12所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體的亞類是IgGl、IgG3或IgM。
14.根據(jù)權利要求10所述的藥劑，其中所述抗-Embigin抗體具有細胞毒性。
15.根據(jù)權利要求14所述的藥劑，其中所述具有細胞毒性的抗-Embigin抗體與細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素綴合。
16.一種用于將藥物遞送給Thl7細胞的藥物遞送系統(tǒng)，所述藥物遞送系統(tǒng)使用抗-Embigin抗體。
17.根據(jù)權利要求16所述的藥物遞送系統(tǒng),其中所述抗-Embigin抗體與前述藥物綴口 ο
18.根據(jù)權利要求16或17所述的藥物遞送系統(tǒng)，其中所述藥物是細胞毒性物質(zhì)、化學治療劑或放射性同位素。
19.一種用于檢測Thl7細胞的試劑,所述試劑包含抗-Embigin抗體。
20.根據(jù)權利要求19所述的試劑，其中所述抗-Embigin抗體被熒光物質(zhì)或放射性同位素所標記。
21.一種用于檢測Thl7細胞的試劑，所述試劑包含能夠特異性地檢測Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酸。
22.—種用于檢測Thl7細胞的試劑盒，所述試劑盒包含根據(jù)權利要求19-21中任一項所述的試劑。
23.一種用于檢測Thl7細胞的方法，所述方法包括測量Embigin的表達。
24.根據(jù)權利要求23所述的方法，所述方法包括測量Embigin在得自試驗動物的細胞中的表達。
25.根據(jù)權利要求24或25所述的方法，所述方法包括使用根據(jù)權利要求19-21中任一項所述的試劑，測量Embigin的表達。
26.Embigin或Embigin基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為標志物分子在檢測Thl7細胞中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了自身免疫疾病或變應性疾病的預防劑或治療劑，其含有抗-Embigin抗體，特別是表現(xiàn)出細胞毒性或細胞毒性誘導活性的抗-Embigin抗體，還提供了涉及Th17細胞的疾病的預防劑或治療劑以及針對Th17細胞的細胞毒性劑。另外，提供了含有抗-Embigin抗體的用于檢測Th17細胞的試劑、使用所述試劑的方便的檢測Th17細胞的方法、使用抗-Embigin抗體以Th17細胞選擇性的方式有效地遞送藥物等的方法、以及針對Th17細胞的藥物遞送系統(tǒng)。
文檔編號A61P37/08GK103025354SQ20118003750
公開日2013年4月3日 申請日期2011年6月2日 優(yōu)先權日2010年6月2日
發(fā)明者木野孝一, 甲斐敏裕, 松本光廣, 梶川益紀, 杉浦雅仁, 清水繪美 申請人:大日本住友制藥株式會社