專利名稱：變應(yīng)性疾病治療劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及變應(yīng)性疾病，例如哮喘、特異反應(yīng)性皮炎、結(jié)膜炎、鼻炎、食物變應(yīng)性疾病的治療劑及其制備方法。另外，本發(fā)明還涉及從上述治療劑分離出的酵母。
這種變應(yīng)性疾病，有哮喘、特異反應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性結(jié)膜炎、變應(yīng)性鼻炎例如花粉癥、食物變應(yīng)性疾病等。
這些變應(yīng)性疾病的消極的第一治療是回避變態(tài)反應(yīng)原。在家中的塵?；蝌x是變態(tài)反應(yīng)原的情況下，可清潔家中除去變態(tài)反應(yīng)原；當(dāng)花粉是變態(tài)反應(yīng)原的情況下，在花粉飛揚(yáng)的季節(jié)，可控制外出，或帶面具以防止吸入變態(tài)反應(yīng)原；當(dāng)食物是變態(tài)反應(yīng)原的情況下，不吃這種食物。但是，這種消極的治療法不僅費(fèi)功夫，而且要嚴(yán)格限制患者的行動(dòng)。
另外，哮喘的治療，有進(jìn)行停止發(fā)作或預(yù)防發(fā)作的對(duì)癥治療，使用腎上腺素等的交感神經(jīng)類的藥物、副腎皮質(zhì)類甾醇荷爾蒙劑、茶堿類等的藥物。但是，哮喘是終生的疾病，至今還沒有治愈的治療方法。
特異反應(yīng)性皮炎，在嬰幼兒期不僅患者刺癢，而且使患者的父母煩惱，雖然多在成人前治療，但延續(xù)到成人期時(shí)，面部及胸部、肘部及膝部的內(nèi)側(cè)等的皮膚變厚，引起劇烈的刺癢，使處于青春期的男女煩惱。這種病的治療方法，主要是外用療法，根據(jù)癥狀，使用副腎皮質(zhì)荷爾蒙、抗組胺劑、其它的抗炎癥劑。刺癢劇烈時(shí)，必須內(nèi)服抗組胺劑。
但是，這些療法是對(duì)癥療法，并不能完全治愈變應(yīng)性疾病，而且，用藥也有副作用等。
當(dāng)變態(tài)反應(yīng)原可確定時(shí)，有減敏治療法，開始皮下注射該變態(tài)極少量反應(yīng)原的浸取物，此后通過逐漸增加量提高抵抗力的方法。但是，這種療法，由于1周定期注射1-2次，除花費(fèi)時(shí)間長外，還對(duì)某些人沒有效果，而對(duì)另一些人有時(shí)還可引起致人死亡的變應(yīng)性休克。
而且，在哮喘及特異反應(yīng)性皮炎的治療中雖有許多民間偏方，但有時(shí)相反地使癥狀加重。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，是將松科植物的新芽、水和糖類混合，使其自然發(fā)酵得到的物質(zhì)，是對(duì)哮喘及特異反應(yīng)性皮炎之類的變應(yīng)性疾病有效的治療劑。上述的松科植物優(yōu)選松屬的植物，而上述的糖類優(yōu)選砂糖。
而且，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，是將松葉的新芽、水和砂糖混合，使其自然發(fā)酵得到的物質(zhì)，是對(duì)哮喘及特異反應(yīng)性皮炎之類的變應(yīng)性疾病有效的治療劑。
再者，本發(fā)明包括上述變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，該變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法包括(1)將糖類溶于滅菌水中，制備溶解了糖類的溶液的步驟；和(2)將松科植物的新芽加入到上述的溶解了糖類的溶液中，使其自然發(fā)酵的步驟。上述的松科植物優(yōu)選松屬的植物，而上述的糖類優(yōu)選砂糖。
而且，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法的特征是(1)將砂糖溶于滅菌水中，制備溶解了砂糖的溶液的步驟；和(2)將松葉的新芽加入到上述溶解了砂糖的溶液中，使其自然發(fā)酵的步驟。
上述的自然發(fā)酵步驟，是在厭氣條件下，于10-70℃，優(yōu)選20-60℃進(jìn)行3-9個(gè)月，優(yōu)選4-8個(gè)月。
更具體的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法包括(1)將砂糖溶解在熱水中，冷卻至環(huán)境溫度制備砂糖水溶液的步驟；和(2)將水洗過的松葉新芽加入到上述砂糖的水溶液中，裝入容器密封使其自然發(fā)酵的步驟；上述的自然發(fā)酵步驟優(yōu)選將密封容器置于日光直射的地方進(jìn)行直到初冬時(shí)分。
另外，本發(fā)明還企圖將松科植物的新芽、水和糖類混合，使其自然發(fā)酵得到健康食品，這種健康食品是優(yōu)選將松葉的新芽、水和砂糖混合，使其自然發(fā)酵得到的物質(zhì)。
而且，本發(fā)明還包含上述經(jīng)自然發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物，即包含從變應(yīng)性疾病治療劑分離出的新型酵母。這種酵母是在2001年3月12日寄存在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心，茨城縣つくば市東1-1-1中央第6(舊名稱經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，茨城縣つくば市東1-1-3，于2001年4月1日變更名稱)，作為ハルイサンA-3寄存，以寄存號(hào)FERM BP-7499特定的酵母，另外，與這種寄存酵母具有同等菌體性質(zhì)的一連串的酵母都包含在本發(fā)明中。而且，在本發(fā)明中，將使用上述酵母進(jìn)行發(fā)酵得到的發(fā)酵生成物作為對(duì)象，作為該發(fā)酵生成物，例如，有變應(yīng)性治療劑之類的醫(yī)藥品、健康食品、健康飲料或化妝品的原料等。此處，所謂健康食品和健康飲料是指以改善體質(zhì)，維特健康為目的使用的輔助食品和飲料。
圖2是表示本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的變異原性的篩選試驗(yàn)結(jié)果曲線圖，示出了使用堿基對(duì)置換型菌株(TA100□；TA1535○；WP2u v r△)時(shí)的結(jié)果。另外，在圖中，A和B分別表示的是A沒有代謝活性化的情況(-S9)；B代謝活性化的情況(+S9)的結(jié)果。
圖3是表示本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的變異原性的篩選試驗(yàn)結(jié)果曲線圖，示出了使用移碼型菌株(TA98□；TA1537○)時(shí)的結(jié)果。另外，在圖中，A和B分別表示的是A沒有代謝活性化的情況(-S9)；B代謝活性化的情況(+S9)的結(jié)果。
圖4是表示本發(fā)明變應(yīng)性疾病治療劑藥效的曲線圖，示出了本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑適用在器官浴情況下，用蛋白的清蛋白(OVA)誘發(fā)(感作)的豚鼠的摘出器官的收縮率，對(duì)OVA的量的測(cè)定結(jié)果。在圖中，A表示I群的結(jié)果；B表示II群的結(jié)果。另外，○為對(duì)照組(注射用水)的結(jié)果；●表示添加0.02％本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的結(jié)果。而且，*表示在p＜0.05時(shí)與對(duì)照組相比有意義。
圖5是表示本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑藥效的曲線圖，示出了小鼠耳朵浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)的結(jié)果。在圖中，I組是投服1-氯-2，4-二硝基苯(DNCB)和本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑(簡記為HAR)的情況；II組是投服DNCB和注射用水(DW)的情況；III組是投服丙酮-橄欖油(4∶1)混合液和本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的情況。在圖中，**表示在p＜0.01時(shí)對(duì)III組有意義和#表示在p＜0.05時(shí)對(duì)II組有意義。
在本發(fā)明中可使用的松科植物，可列舉所謂的冷杉屬、海參威冷杉、ォオシラビソ、青冷杉、白冷杉、冷杉；雪松屬、千島葉松、落葉松、歐洲云杉、赤暇夷松、云杉；云杉屬、ヤツガタケト云杉、虎尾云杉、アイグロ松、黃松、タギヨウシヨウ、紅松、大黃松、五須松、キタゴヨウ、高松、硬葉松、ストロ—ブ松、ヨ—ロツアカ松、火炬松、クロ松、日本黃杉、日本鐵杉、鐵杉屬等。其中的松屬植物，優(yōu)選アイグロ松、黃松、タギヨウシヨウ、紅松、大黃松、五須松、キタゴヨウ、高松、硬葉松、ストロ—ブ松、ヨ—ロツアカ松、火炬松、クロ松，特別是黃松、タギヨウシヨウ、紅松、大黃松、高松、クロ松等一般育成的松，從可得到的容易性方面看是優(yōu)選的。
本發(fā)明中使用的糖類，可列舉食用糖、轉(zhuǎn)化糖、麥芽糖之類的糖。其中從可得到的容易性看優(yōu)選食用糖，但是所用的食用糖可使用白砂糖、黑砂糖、三溫糖、甜菜糖、玉米砂糖等任意一種砂糖，優(yōu)選使用白砂糖。
所使用的水，使用預(yù)先滅菌的水，優(yōu)選防止雜菌的繁殖；滅菌方法可使用一般公知的方法，例如，煮沸等的方法。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，在使用上述滅菌水溶解了糖類的溶液中，加入松科植物的新芽，通過使其自然發(fā)酵得到，但是，加入水溶液的松科植物的新芽，可以是從任何種類的松科植物采摘的新芽，特別優(yōu)選從松屬植物采摘的新芽。采摘的時(shí)期優(yōu)選松科植物的花初開時(shí)期，此時(shí)采摘的新芽用作變應(yīng)性疾病的治療劑特別有效。假如是松的情況下，根據(jù)其地區(qū)的氣候，通常在4月上旬-6月下旬，由于在枝的末端開放紅色的雌花，新枝的周圍開放黃色的雄花，所以優(yōu)選在開放的這些花謝了后，采用位于枝末端的新芽。
發(fā)酵使用原液的制備，相對(duì)約1升水以約0.5公斤的比率溶解糖類，相對(duì)得到的溶液，按約25條的比率添加松科植物的新芽。此時(shí)，糖類沒有必要完全溶解，即使在原液中存在未溶解的糖也無妨礙。另外，在發(fā)酵的原液中，如按上述比率含有松葉的新芽之類的松科植物新芽最好，但即使含新芽以外的葉或花也無妨礙。
自然發(fā)酵是在厭氣的條件下進(jìn)行，于10-70℃，優(yōu)選20-60℃靜置3-9個(gè)月，優(yōu)選4-8個(gè)月進(jìn)行發(fā)酵。作為厭氣條件，例如采用裝入密閉的遮光容器中等方法，將該密閉的容器靜置于直射日光的地方直到初冬完成。經(jīng)過自然發(fā)酵的這段期間后，開封容器，取出除去松科植物的新芽等固形物，得到本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑。另外，新芽的采摘時(shí)期，也就是與裝入的時(shí)期兼顧，在制備的地方開花期是從4月中旬到5月上旬，若將開花結(jié)束采摘新芽的時(shí)期定為5月中旬到6月初，發(fā)酵結(jié)束期則定為初冬(11月中旬)，上述的初冬之際，完全是一個(gè)目標(biāo)，可以任意地變更。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，對(duì)變應(yīng)性疾病，特別是對(duì)哮喘及特異反應(yīng)性皮炎有效，但是，當(dāng)從作用機(jī)理考慮時(shí)，可以認(rèn)為，除這些之外，對(duì)藥物引起的變應(yīng)性體克、變應(yīng)性鼻炎、急性蕁麻疹、花粉癥、食物過敏等的變應(yīng)性I型疾病、自身免疫性溶血性貧血、藥物過敏引起的溶血或血小板減少等的變應(yīng)性II型疾病、血清病、SEL、急性腎炎、多發(fā)性動(dòng)脈炎等變應(yīng)性III型疾病和接觸性皮炎、變應(yīng)性腦炎等的變應(yīng)性IV型疾病的改善和治療是有效的。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，是通過將自然發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物原物使用的，但是，也可向其中加入甜味劑和香料，制備成易飲用的飲品，為了長期保存等，也可添加保存劑等各種添加劑。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的用量，通常，對(duì)成人，1日服用2-3次，每次服用30-50毫升。而對(duì)非成人，服用成人量的一半。另外，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑由于既無毒性、也無變異原性物質(zhì)而是安全的，所以即使超過上述的服用量服用也沒有任何問題。
本發(fā)明的通過自然發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物，不僅可作為變應(yīng)性疾病的治療劑，而且也可作為健康食品或健康飲料使用。所謂的健康食品或健康飲料不是以治療作為主要目的，而是用于改善體質(zhì)，保持健康狀態(tài)。此時(shí)，考慮到消費(fèi)者的嗜好，添加上述的甜味劑或香料等，制成易食、易飲且符合嗜好的食品或飲品。
而且，本發(fā)明還包含從上述發(fā)酵產(chǎn)物分離的酵母。這種酵母是如下分離的物質(zhì)。
使用作為本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的發(fā)酵的產(chǎn)物，通過GPLP瓊脂平板培養(yǎng)法在平板上培養(yǎng)，提取在培養(yǎng)平板上具有生育優(yōu)勢(shì)的菌落，得到分離酵母。對(duì)分離酵母進(jìn)行形態(tài)觀察和性狀試驗(yàn)，參考下述文獻(xiàn)決定其在生物學(xué)上的所屬。文獻(xiàn)(Kurtzman，C.P.等，[The yeasts，A TaxonomicStudy]4版(1998)；Elsevier Science B.V.；Bar nett，J.A.等，[yeastsCharaceristics and identification]3版(2000)；Cambridge University Press；引用這些文獻(xiàn)作為本申請(qǐng)說明書的一部分)。而且，發(fā)酵產(chǎn)物中的酵母數(shù)為1.4×105/克。分離酵母的性狀試驗(yàn)結(jié)果示于表1，分離酵母的子囊孢子的一例示于


圖1。
表1分離酵母的性狀試驗(yàn)項(xiàng)目試驗(yàn)結(jié)果營養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài) 卵形—橢圓形增殖形式多頭出芽液體培養(yǎng)雖見到沉淀但未見形成皮膜(25℃，3日)偽菌絲 形成(25℃，3日)子囊孢子在獨(dú)立的營養(yǎng)細(xì)胞間接合，形成1-4個(gè)橢圓形的子囊孢子，但子囊未開裂(參考
圖1)氮源的資化性硝酸鹽 -乙胺+在無維生素的培養(yǎng)基中生育-在氯化鈉存在下生育10％+12.5％ +15％微弱16％-在放線菌酮存在下生育0.1％ -0.01％ -在1％乙酸存在下生育 +37℃下生育 -尿素的分解 -DBB的顯色 -發(fā)酵性葡萄糖 +半乳糖 -蔗糖-麥芽糖 -乳糖-棉籽糖 -海藻糖 -碳源的資化性葡萄糖 +半乳糖 -蔗糖-麥芽糖 -維生素二糖 -海藻糖 -乳糖-密二糖 -棉籽糖 -松三糖 -淀粉-D-木糖 -L-阿拉伯糖 -D-核糖 -L-鼠李糖-D-葡萄糖胺 -N-乙酰-D-葡萄糖胺 -乙醇+丙三醇 +赤鮮醇四硝酸酯 -核(糖)醇+D-甘露(糖)醇+檸檬酸鹽-肌醇-按以上的結(jié)果，，分離酵母在形態(tài)上和性狀上被判定為雙孢接合酵母菌屬(Zygosaccharomyces bispoms)。這種雙孢接合酵母菌屬是子囊菌酵母的一屬，在各自獨(dú)立的細(xì)胞間接合，形成1-4個(gè)球形—橢圓形的子囊孢子。另外，雙孢接合酵母菌屬是耐浸透壓性的酵母，是從發(fā)酵食品、清涼飲料中分離出的酵母。
另一方面，對(duì)分離出的酵母和對(duì)照株進(jìn)行DNA的相同性試驗(yàn)時(shí)，得到下面的結(jié)果。即按照江崎孝行等，《日本細(xì)菌學(xué)會(huì)志》，45卷，851頁(1990)和高橋正明等，《東京農(nóng)業(yè)大學(xué)同位素中心研究報(bào)告》，7號(hào)，69頁(1993)(這些文獻(xiàn)作為本申請(qǐng)的說明書一部分引入)，使用雙孢接合酵母菌屬IFO 1131和拜列氏接合酵母菌屬IFO 1098(Zygosaccharomyces bailii IFO 1098)作為對(duì)照株與得到的酵母，通過用微板的光生物素標(biāo)記法進(jìn)行DNA-DNA的雜交試驗(yàn)。而且，DNA的制備是按Jahnke，K.-D.等，《Trans.Br.mycol.Soc.》87卷，175-191頁(1986)(該文獻(xiàn)作為本申請(qǐng)說明書的一部分引入)制備。結(jié)果示于表2。
表2分離酵母和對(duì)照株的DNA-DNA雜交相同性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)照株 相同性(％)雙孢接合酵母菌屬IFO1131 72％拜列氏接合酵母菌屬IFO1098 98％根據(jù)上述與對(duì)照株相同性試驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明的酵母無論形態(tài)上和性狀上均判定為雙孢接合酵母菌屬，但是DNA序列本身與其說是雙孢接合酵母菌屬，不如說是近于拜列氏接合酵母菌屬，因而可理解為與任何一個(gè)對(duì)照株不相同的新種菌株。申請(qǐng)人將推定屬于接合酵母菌屬的新種酵母命名為[ハルイサンA-3]。另外，這種新種酵母[ハルイサンA-3]不僅是新種株，而且是新種的種或?qū)倥c否現(xiàn)在還沒有定論。但是，申請(qǐng)人根據(jù)專利手續(xù)上的微生物寄存的國際承認(rèn)的布達(dá)佩斯條約，將分離的命名為[ハルイサンA-3]的新種酵母，于2001年3月12日寄存于新名稱為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄存中心，日本國茨城縣つくば市東1-1-1中央第6(舊名稱經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所，日本國茨城縣つくば市東1-1-3)，寄存號(hào)為FERM BP-7499。而且，上述的寄存單位，于2001年4月1日具有獨(dú)立行政法人資格，由于改編成獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所，于2001年4月1日變更名稱。
本發(fā)明分離的新種酵母，考慮其與松科植物的新芽一起作為變應(yīng)性疾病的治療劑具有明顯的效果，是極其有用的酵母。
下面，舉例詳細(xì)說明本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，但是，本發(fā)明不受以下實(shí)例的限制。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑例可按如下方法制備。
在松樹開花結(jié)束之際(在福島縣為5月中旬-6月初)，采摘長葉松、黃松、落葉松的松葉的新芽，采摘的松葉新芽用水洗凈。將白砂糖加入到熱水中使其溶解，將冷卻至室溫附近的砂糖水和經(jīng)水洗凈的松葉的新芽裝入容器、例如塑料制的容器中密封，靜置于日光直射的地方直到初冬(在福島縣為11月中旬)，通過自然發(fā)酵制備。在初冬之際打開容器，取出并除去松葉，得到本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑。
使用的砂糖水，對(duì)約每2升水按約1公斤白砂糖的比率添加，松葉按50條比率添加。
如上所述，在約2升水中使用1公斤白砂糖、約50條松葉的新芽制備時(shí)，得到具有約1，2升(裝入的砂糖水約60％)的白色混濁液狀的變應(yīng)性疾病治療劑。對(duì)這種治療劑分析所含的成分時(shí)，得到如表3所示的結(jié)果。
表3變應(yīng)性疾病治療劑的成分分析值成分含量分析方法水分98.0％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南 常壓加熱干燥法蛋白質(zhì) 0.0％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南 氮定量換算法脂質(zhì)0.4％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南 醚提取法(斯庫勒法)灰分0.1％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南 直接灰化法糖類1.5％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南 計(jì)算算出粗纖維 0.0％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南實(shí) 亨內(nèi)伯格氏小孔(ヘンネベルゲスト—マン)改良法食物纖維2.4％ 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南プロスキ—法鈉 5.1毫克/100克 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南磷 ＜0.5毫克/100克*1 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南鐵 0.11毫克/100克 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南鈣 1.66毫克/100克 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南鉀 18.3毫克/100克 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南一般活菌2700個(gè)/克 食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南大腸菌群陰性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)指南維生素B1＜0.01毫克/100克*1 HPLC法維生素B2＜0.01毫克/100克*1 HPLC法麥角甾醇0.07毫克/100克 HPLC法煙酸胺 0.04毫克/100克 微生物定量法*2葡聚糖 0.03毫克/100克 酶法
*1小于檢測(cè)范圍*2使用菌株胚芽乳桿菌屬ACTT8014這種分析，僅對(duì)主要與一般食品相關(guān)的上述檢查項(xiàng)目進(jìn)行，在本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑中，有存在除上述成分之外的可能性。因此，哪種成分是作為變應(yīng)性疾病治療劑特別有效的成分，雖不能明確，但是作為變應(yīng)性疾病治療劑的藥效是奏效的。
下面，對(duì)如上所述制備的多個(gè)本發(fā)明變應(yīng)性疾病治療劑，對(duì)治療劑中所含的真菌數(shù)、酵母數(shù)、一般細(xì)菌數(shù)(活菌數(shù))進(jìn)行了研究。關(guān)于真菌數(shù)和酵母數(shù)，用GPLP瓊脂平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，關(guān)于一般細(xì)菌數(shù)(活菌數(shù))，用抗真菌劑添加SCDLP瓊脂平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行用酒石酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值為3.5，和未調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的兩種物質(zhì)的試驗(yàn)測(cè)定。得到的結(jié)果示于表4.
表4變應(yīng)性疾病治療劑中含有的微生物數(shù)微生物發(fā)酵產(chǎn)物1發(fā)酵產(chǎn)物2 發(fā)酵產(chǎn)物3 發(fā)酵產(chǎn)物4真菌數(shù)個(gè)/0.1克陰性 陰性 陰性 陰性酵母數(shù)個(gè)/克 1.3×1023.3×1051.6×1053.3×104一般細(xì)菌數(shù)個(gè)/克 100以下 100以下- -一般細(xì)菌數(shù)個(gè)/克 100以下 100以下100以下 100以下pH值調(diào)節(jié)根據(jù)上述結(jié)果可知，在本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑中，未見到真菌發(fā)生，而一般的細(xì)菌(活菌數(shù))也極少。另外，可以見到，由于發(fā)酵產(chǎn)物組雖有一些標(biāo)準(zhǔn)離差，但酵母在發(fā)酵產(chǎn)物中仍以102-105個(gè)/克數(shù)量級(jí)級(jí)存在。在這種發(fā)酵產(chǎn)物中存在的酵母就是相當(dāng)于寄存的新種酵母。
下面，對(duì)本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的口服毒性進(jìn)行了研究。使用本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的原液和在原液中添加蜂蜜(10重量％)兩種物質(zhì)，對(duì)分別給藥2000毫克/公斤體重的這些被驗(yàn)物質(zhì)的組，和作為對(duì)照組給藥注射用水的組(給藥量0毫克/公斤)，對(duì)一組雌雄各5只的SD系[CrjCD(SD)IGS]大白鼠，使用裝有鼻飼經(jīng)口胃服入的一次性注射器(容量1毫升)，強(qiáng)制經(jīng)口給藥，設(shè)定15日(含給藥日)的觀察期，對(duì)毒性反應(yīng)和大概的致死量進(jìn)行了研究。
通過試驗(yàn)期，包含對(duì)照組的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑和向其中添加了蜂蜜的治療劑給藥2000毫克/公斤ouy的劑量組的雌雄鼠，未見到死亡。而且，一般情況下，在體重和剖檢中，未見到源于給藥被驗(yàn)物質(zhì)的變化。根據(jù)上述的結(jié)果，可以得出結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑對(duì)雌雄鼠的大概致死劑量在2000毫克/公斤體重以上。
下面，對(duì)本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的變異原性進(jìn)行了研究。關(guān)于本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的變異原性，使用根據(jù)Ames等的變異方法(Maron，D.M.等[Revised methods for the Salmonella mutagenicity test]，Mutation Res.，113卷，173-215頁(1983)，引入該文獻(xiàn)作為本申請(qǐng)說明書的一部分)的平板法，鼠傷寒沙門菌的組胺酸要求性即TA98、TA100、TA1535、TA1537株和大腸菌的色胺酸的要求性即Wp2uvrA株分別進(jìn)行處置，在代謝活性化情況下和沒有代謝活性化情況下的兩種情況下對(duì)變異原性進(jìn)行了研究。
作為試驗(yàn)用量，按每板312.5、625、1250、2500和5000微克進(jìn)行試驗(yàn)。其結(jié)果，各試驗(yàn)菌株的被驗(yàn)物質(zhì)組的復(fù)原變異菌落數(shù)，無論有無代謝活性化的情況，都未見到用量的依存性和陰性對(duì)照組增加了2倍以上。另外，也沒有見到生育障礙和被驗(yàn)物質(zhì)的沉淀。結(jié)果示于圖2和圖3。圖2示出了使用堿基對(duì)置換型菌株(TA100□、TA1535○、WP2uvrA△)時(shí)的結(jié)果。在圖中，分別表示的是A是沒有代謝活化性的情況、B是代謝活化性的情況、添加S9混合物情況的結(jié)果。圖3示出了使用移碼型菌株(TA98□、TA1537○)的情況的結(jié)果。在圖中，分別表示的是A是沒有代謝活化性的情況、B是代謝活化性的情況、添加S9混合物情況的結(jié)果。而且，作為陰性對(duì)照物質(zhì)，在制備被驗(yàn)物質(zhì)時(shí)使用了作為容劑用的注射用蒸餾水。再者，作為陽性對(duì)照物質(zhì)，使用2-(2-呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基-)丙烯酰胺(AF-2)、2-氨基蒽(2-AA)、疊氮鈉(SA)和9-氨基吖啶(9-AA)的各化合物。AF-2、9AA、2-AA用DMSO溶解，SA用注射用蒸餾水溶解，根據(jù)菌株和有無代謝活性化情況分別使用。
根據(jù)上述結(jié)果可以判定，這種試驗(yàn)條件下的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的變異原性為陰性。
下面對(duì)本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的藥理作用進(jìn)行研究。作為研究抗變應(yīng)性作用之一即抗哮喘作用的方法，是對(duì)用豚鼠摘出氣管的平滑肌的收縮作用進(jìn)行了研究。另外，作為研究特異反應(yīng)性皮炎改善作用的方法，進(jìn)行了作為變應(yīng)性接觸皮炎典型之一的小鼠耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)(earswelling test)。
1.使用豚鼠摘出氣管的平滑肌收縮試驗(yàn)購進(jìn)5周齡的Hartley系雄豚鼠(活)22只，進(jìn)行包含1周檢疫期的預(yù)備飼養(yǎng)，在本試驗(yàn)中使用在該期間內(nèi)未見異常的20只，進(jìn)行如下的平滑肌肉收縮試驗(yàn)。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，用注射用水稀釋到預(yù)定的濃度使用。用生理鹽水溶解作為變應(yīng)性誘導(dǎo)物質(zhì)使用的OVA。在豚鼠的誘發(fā)給藥中，將OVA與弗羅因德氏完全佐劑(FCA)等量混合后作為給藥檢體。
I-1誘發(fā)法設(shè)定如下所示的4組試驗(yàn)。
表5各組的構(gòu)成給藥物質(zhì)和給藥量(給藥容量)組誘發(fā)給藥 被驗(yàn)物質(zhì)給藥 只數(shù)(皮下)(0.2毫升 (口服)(2毫升)I 0.5％OVA與等量的FCA 4％的本發(fā)酵產(chǎn)物 5的混合物II0.5％OVA與等量的FCA 注射用水 5的混合物III 生理鹽水 4％本發(fā)酵產(chǎn)物 5IV無處置 無處置5用于誘發(fā)的OVA或生理鹽水的給藥，每周進(jìn)行2次，進(jìn)行2周，共計(jì)4次皮下給藥。作為被驗(yàn)物質(zhì)的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑(發(fā)酵產(chǎn)物)或注射用水的給藥從氣管摘出日3日前直到前日的3日間經(jīng)口服給藥進(jìn)行。
從最終誘發(fā)給藥的11日后經(jīng)過5日，從各組中取1只動(dòng)物摘出氣管，進(jìn)行平滑肌收縮試驗(yàn)。而且，在氣管摘出時(shí)開腹，由下大動(dòng)脈采血得到血清，測(cè)定血清中的抗OVA IgG抗體值，確認(rèn)誘發(fā)成立的同時(shí)，對(duì)口服給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的影響進(jìn)行研究。
I-2用摘出氣管進(jìn)行的平滑肌收縮試驗(yàn)體重520.7-681.5克的動(dòng)物，腹腔內(nèi)給藥30毫克/公斤體重戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。開胸摘出氣管，在克-漢(Krebs-Henseleit)液中制作連鎖標(biāo)本。在通入95％O2-5％CO2的混合氣體的37℃克-漢液中，在負(fù)荷為0.5克時(shí)，用位移轉(zhuǎn)換器(45347，日本電氣三榮)等張性地測(cè)定氣管標(biāo)本的張力位移，用記錄器(RECTI-HORIZ-8K，日本電氣三榮)記錄。開始時(shí)，用乙酰膽堿10-4M誘發(fā)收縮，將該收縮設(shè)定為100％。與經(jīng)口服給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑對(duì)由OVA0.1-1000ng/ml、組胺10-8-10-3M和乙酰膽堿10-5-10-4誘發(fā)收縮的的影響進(jìn)行比較。另外，將本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑在器官浴中直接使用(最終濃度0.02％，孵化10分鐘)，對(duì)其影響進(jìn)行研究。
I-3抗-OVA IgG抗體值的測(cè)定使用用封閉劑(大日本制藥(株))封閉的OVA固相化的微診斷板(NUNC)。
將血清用BPS-Tween稀釋10、100、1000、10000倍，在N＝2按每100微升將其均勻添加在池中。
于室溫下反應(yīng)2小時(shí)后，用BPS-Tween洗凈。此后，向各池按每100微升均勻添加用封閉劑10倍稀釋液(添加0.05％疊氮鈉)稀釋至1000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記抗豚鼠IgG，于室溫反應(yīng)2小時(shí)。
用BPS-Tween洗凈后的磷酸酶基質(zhì)盒(KLP)顯色，用5N氫氧化鈉水溶液停止反應(yīng)，用自動(dòng)板式記錄器(Bio-Tek儀器公司)測(cè)定405nm的吸光度。
求出二池吸光度的平均值，將顯示IV組的血清吸光度的平均值+3SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)以上的吸光度的結(jié)果判斷為陽性。
I-4結(jié)果使用豚鼠摘出氣管的平滑肌進(jìn)行收縮試驗(yàn)，動(dòng)物在此過程中無死亡，沒有見到可認(rèn)為是起因于被驗(yàn)物質(zhì)的給藥所引起的一般狀態(tài)的變化。
在誘發(fā)給藥OVA，并給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的I組和只用OVA誘發(fā)的II組之間，在摘出氣管標(biāo)本的OVA、組胺和乙酰膽堿誘發(fā)收縮方面沒有見到差別。另外，沒有用OVA誘發(fā)，給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的III組與無處置組即IV組之間，在組胺和乙酰膽堿誘發(fā)收縮方面也沒有見到差別。而且，在該III組與IV組中未見到OVA誘發(fā)收縮。
但是，在II組中的OVA誘發(fā)收縮，可認(rèn)為是通過在器官浴(浴內(nèi)濃度0.02％)中使用本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑有抑制傾向(OVA10ng/毫升、p＜0.05，參照?qǐng)D4)。對(duì)組胺和乙酰膽堿誘發(fā)的收縮，在全部組中，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑都顯示出沒有影響—有抑制傾向(例如，III組，組胺在10-6M時(shí)p＜0.05)。
血清中的抗-OVA IgG抗體值，IV組的吸光度平均值+3SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)是0.243。對(duì)此，OVA誘發(fā)給藥的I組和II組的104倍稀血清的平均吸光度分別為1.465和1.488，可確認(rèn)OVA的誘發(fā)成立。I組和II組的吸光度沒有明顯差別，未見到因本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑給藥的影響。
II.使用小鼠的耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)(ear swelling test)購進(jìn)6周齡的BALB/c系雄小鼠(BALB/c AnNCrj，SPF)18只，進(jìn)行包含1周檢疫期的預(yù)備飼育，在本試驗(yàn)中，使用在該期間未見異常的15只，進(jìn)行下述的耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)(ear swelling test)。
作為被驗(yàn)物質(zhì)的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑以注射用水稀釋至預(yù)定的濃度使用。作為變應(yīng)性誘發(fā)物質(zhì)使用的1-氯-2，4-二硝基苯(DNCB)，溶解在丙酮∶橄欖油＝4∶1的混合液中使用。
II-1誘發(fā)法設(shè)定下述所示的3組試驗(yàn)。
表6各組的構(gòu)成給藥物質(zhì)和給藥量(給藥容量)組 誘發(fā)給藥被驗(yàn)物質(zhì)給藥 只數(shù)
(涂布/皮下)(0.1毫升) (口服)(0.2毫升)I 0.1％DNCB/1％DNCB和 2％本發(fā)明的發(fā)酵產(chǎn)物5FCA的等量混合物II 0.1％DNCB/1％DNCB和 注射用水 5FCA的等量混合物III丙酮∶橄欖油混合液 2％的本發(fā)明酵產(chǎn)物 5(4∶1)/橄欖油連續(xù)涂布4日溶解在丙酮∶橄欖油混合液中的0.1％DNCB或者丙酮∶橄欖油混合液，該12日后，皮下給藥溶解在橄欖油中的1％DNCB或者橄欖油。
在最終給藥的13日后進(jìn)行耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)。本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑(發(fā)酵產(chǎn)物)或注射用水的給藥，是從引起目的3日前到前日的3日間口服給藥進(jìn)行。
II-2耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)在誘發(fā)給藥結(jié)束13日后，在動(dòng)物的左耳涂布1％DNCB，右耳涂布20微升的丙酮·橄欖油而引起。24小時(shí)后和48小時(shí)后用ダイアルシツクネスゲ—ジ(三豐制作所)測(cè)定左右耳厚度各2次。求出2次測(cè)定的平均值，求出每個(gè)個(gè)體左右耳大厚度差。而且，求出每組的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，進(jìn)行組間差的檢定。
2次測(cè)定值的差在0.1毫米以上時(shí)進(jìn)行復(fù)測(cè)，選擇2個(gè)相近的值求出平均值。
II-3結(jié)果使用BALB/c系小鼠的耳浮腫厚度測(cè)定試驗(yàn)，動(dòng)物在試驗(yàn)過程中無死亡，未見到可認(rèn)為是被驗(yàn)物質(zhì)給藥引起的一般狀態(tài)的變化。
在DNCB引起后24小時(shí)的測(cè)定中用DNCB誘發(fā)，給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的I組與只用DNCB誘發(fā)的II組相比，因DNCB引起的耳殼的肥厚反應(yīng)明顯被抑制(p＜0.05，參照?qǐng)D5)。在DNCB引起后48小時(shí)的反應(yīng)中，I組和II組之間未見差別。對(duì)照組即用丙酮·橄欖油誘發(fā)，給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的III組，幾乎未見到因DNCB引起的耳殼肥厚。
如上上述，在用豚鼠摘出氣管的試驗(yàn)中，未見到因口服給藥本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的影響。另一方面，在器官浴中直接使用本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的情況下，對(duì)OVA、組胺、乙酰膽堿全部的刺激都可見到收縮反應(yīng)整個(gè)被抑制的傾向。根據(jù)該結(jié)果可以認(rèn)為，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑對(duì)細(xì)胞膜直接作用、具有使膜穩(wěn)定的作用。
再者，在使用BALB/c系小鼠的耳浮腫測(cè)定試驗(yàn)中，在DNCB引起后24小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑給藥組的反應(yīng)被明顯地抑制。從本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑給藥引起的3日前—前日的3日進(jìn)行之后，這次見到的抑制，不是誘發(fā)成立的抑制，而可認(rèn)為是通過引起的誘發(fā)淋巴球傳達(dá)到炎癥細(xì)胞的信號(hào)和炎癥反應(yīng)被抑制。
這樣，可以看到，本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，通過細(xì)胞膜的穩(wěn)定作用等，可抑制組胺等炎癥性物質(zhì)的游離，顯示出抗變應(yīng)性的作用。
下面，描述使用本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑的、具體的治療實(shí)例。
例1哮喘的治療7歲的哮喘男孩，早晚各一次服用約30-50毫升的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑時(shí)，服用1個(gè)月后，與服用前相比癥狀減輕，經(jīng)過3個(gè)月后，感覺非常良好。
例2哮喘的治療65歲因哮喘早晚咳嗽痛苦的男性患者，早晚各一次服用約30-50毫升的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，服用約2周后，早晚咳嗽消失。
例3特異反應(yīng)性皮炎的治療患特異反應(yīng)性皮炎的2位成人女性，早晚各一次服用約30-50毫升的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑時(shí)，服用2周后，兩人的癥狀都予改善。
例4特異反應(yīng)性皮炎的治療由幼兒期起就因特異反應(yīng)性皮炎而痛苦，在服用本治療劑前，頭、腕關(guān)節(jié)和膝內(nèi)側(cè)3處有炎癥，21歲的女性患者，每日2-3次，每次各服用約30-50毫升的本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，首先，膝內(nèi)側(cè)炎癥痊愈，看見沒化妝的皮膚，第3周頭部的部分傷消失，隨后左腕部分炎癥痊愈，2個(gè)月后，右手腕部分炎癥痊愈，可恢復(fù)美麗的皮膚。
這樣，可以看到，許多人服用的結(jié)果，對(duì)變應(yīng)性疾病的治療具有效果。哮喘或特異反應(yīng)性皮炎的情況下，從2周左右癥狀減輕，3個(gè)月癥狀消失，沒有復(fù)發(fā)。
本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，與現(xiàn)有的變應(yīng)性疾病治療劑相比，是可治愈變應(yīng)性疾病、特別是哮喘和特異反應(yīng)性皮炎的藥物，服用期間短，沒有副作用，是極其有用的變應(yīng)性疾病治療劑。
權(quán)利要求
1.一種變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，將松科植物的新芽、水和糖類混合，使其經(jīng)自然發(fā)酵得到。
2.按權(quán)利要求1記載的變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，上述的松科植物是松屬的植物。
3.按權(quán)利要求1記載的變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，上述的糖類是砂糖。
4.按權(quán)利要求1記載的變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，上述的變應(yīng)性疾病是哮喘。
5.按權(quán)利要求1記載的變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，上述的變應(yīng)性疾病是特異反應(yīng)性皮炎。
6.一種變應(yīng)性疾病治療劑，其特征是，將松葉的新芽、水和砂糖混合，使其自然發(fā)酵得到。
7.一種變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，包含將糖類溶于滅菌水中、制備溶解了糖類的溶液的步驟，和將松科植物的新芽加入到上述溶解了糖類的溶液中、使其自然發(fā)酵的步驟。
8.按權(quán)利要求7所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的松科植物是松屬植物。
9.按權(quán)利要求7所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的糖類是砂糖。
10.按權(quán)利要求7所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的自然發(fā)酵是在厭氣的條件下于10-70℃進(jìn)行3-9個(gè)月。
11.一種變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，包含將砂糖溶于滅菌水中、制備溶解了砂糖的溶液的步驟，和將松葉的新芽加入到溶解了砂糖的溶液中、使其自然發(fā)酵的步驟。
12.按權(quán)利要求11所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的自然發(fā)酵是在厭氣的條件下，于10-70℃進(jìn)行3-9個(gè)月。
13.一種變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，包含將砂糖溶解在熱水中、冷卻至環(huán)境溫度、制備砂糖水溶液的步驟，和將經(jīng)水洗的松葉新芽加入到上述的砂糖水溶液中、裝入容器內(nèi)密封、使其自然發(fā)酵的步驟。
14.按權(quán)利要求13所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的自然發(fā)酵是在10-70℃下進(jìn)行3-9個(gè)月。
15.按權(quán)利要求13所記載的變應(yīng)性疾病治療劑的制備方法，其特征是，上述的自然發(fā)酵是將密封的容器在直射日光照射的地方進(jìn)行到初冬。
16.一種健康食品，其特征是，將松科植物的新芽、水和糖類混合，使其自然發(fā)酵得到。
17.一種健康食品，其特征是，將松葉的新芽、水和砂糖混合，使其自然發(fā)酵得到。
18.一種酵母，其特征是，用寄存號(hào)FERM BP-7499寄存的酵母或與用寄存號(hào)FERM BP-7499寄存的酵母具有同等菌體性質(zhì)的酵母。
19.使用權(quán)利要求18所記載的酵母使其發(fā)酵得到的發(fā)酵生成物。
20.按權(quán)利要求19記載的發(fā)酵生成物，其特征是，上述的發(fā)酵生成物是變應(yīng)性疾病治療劑、健康食品、健康飲料的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及變應(yīng)性疾病的治療劑及其制備方法。本發(fā)明提供的變應(yīng)性疾病的治療劑是將松科植物的新芽、水和糖混合后，使其次自然發(fā)酵得到的。上述的松科植物優(yōu)選松屬的植物。本發(fā)明的變應(yīng)性疾病治療劑，服用時(shí)間短、沒有副作用，可治愈疾病，是變應(yīng)性疾病，特別是哮喘和特異反應(yīng)性皮炎的有效治療劑。另外，本發(fā)明還提供了從變應(yīng)性疾病治療劑分離出的酵母。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1436084SQ01811286
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月14日
發(fā)明者福田春 申請(qǐng)人:福田光次