一種電化學(xué)基因傳感器法檢測華法林敏感性基因的試劑盒的制作方法
【專利摘要】華法林敏感性基因檢測試劑盒(電化學(xué)基因傳感器法)是以一種電化學(xué)基因傳感器技術(shù)快速檢測人基因組中法林敏感性基因的試劑盒，該試劑盒適用于定性檢測人外周血、各種組織和細胞等臨床樣本中細胞色素CYP2C9基因*2，*3，*5等位基因型和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體1(VKORC1)基因-1639G＞A、1173C＞T等位基因型，上述基因型有助于臨床鑒別對華法林藥物敏感性增加的患者，能夠快速確定華法林劑量范圍，保證療效，減少出血風(fēng)險。把華法林的基因檢測結(jié)果和INR監(jiān)控相結(jié)合，可以更有效、迅速地調(diào)整華法林維持劑量，從而在達到療效的同時減少華法林的出血風(fēng)險。
【專利說明】一種電化學(xué)基因傳感器法檢測華法林敏感性基因的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器法檢測華法林敏感性基因的試劑盒，特別是涉及以一種電化學(xué)基因傳感器技術(shù)快速檢測人基因組中華法林敏感性基因的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性。通過本發(fā)明的試劑盒，實現(xiàn)對人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品中的人基因組中的法林敏感性基因進行快速檢測和分析。
【背景技術(shù)】
[0002]1998年底美國科學(xué)促進會將電化學(xué)基因傳感器技術(shù)列為1998年度自然科學(xué)領(lǐng)域十大進展之一，足見其在科學(xué)史上的意義。它以其可同時、快速、準確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領(lǐng)而顯示出了巨大的威力。這些應(yīng)用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的檢測模式正在被越來越多地應(yīng)用于生物科學(xué)領(lǐng)域。以印刷電路板為載體的微陣列芯片，更以其高效、高通量、低價位等特點，已經(jīng)廣泛用于基礎(chǔ)研究和臨床篩查、輔助診斷。
[0004]微陣列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片等，電化學(xué)基因傳感器芯片以特殊化學(xué)方法處理后的印刷電路板為載體，將各種探針或靶標片段以化學(xué)鍵結(jié)合的方式固定在印刷電路板表面，并 利用二茂鐵衍生物作為電化學(xué)指示劑，形成可用于雜交反應(yīng)或抗原抗體反應(yīng)的微陣列芯片。
[0005]華法林(warfarin)是香豆素類口服抗凝藥，是目前國內(nèi)外最常用的長效抗凝藥，多用于人工瓣膜置換、靜脈血栓形成(肺栓塞)、房顫等的口服抗凝治療。其抗凝效果常以凝血酶原時間(prothrombin time, PT)及國際標準化比率(international normalizedratio, INR)作為監(jiān)測指標。目前臨床上華法林的給藥方案通常采用首先給予一定標準劑量，然后臨床醫(yī)生根據(jù)每個患者INR值的情況，增加或減少劑量直至INR達到靶標。但是在這樣的抗凝療法中，調(diào)整劑量的周期較長，患者發(fā)生血栓或出血的可能性較高。
[0006]造成華法林用量個體差異的原因很多，可分為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要有年齡、性別、體表面積、藥物的相互作用、飲食習(xí)慣和疾病狀態(tài)等。然而，非遺傳因素的影響程度較為有限，并非華法林用量個體差異的主要原因。近年來，隨著藥物基因組學(xué)的進展和華法林藥理作用分子機制的闡明，遺傳因素在華法林用量個體差異中的作用越來越受到人們的重視。目前，已知與華法林的藥效學(xué)和藥動學(xué)相關(guān)的基因達30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I基因(VK0RC1)的基因多態(tài)性和細胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影響華法林用量個體差異最主要的兩個遺傳因素。
[0007]VK0RC1和CYP2C9是目前所知影響華法林用量個體差異最主要的遺傳因素，已有學(xué)者對這兩個基因在華法林個體差異中的貢獻大小進行了研究。這些研究顯示CYP2C9和VK0RC1的多態(tài)性對華法林用量個體差異的貢獻比例分別5~22%和6~37%。將VK0RC1和CYP2C9的多態(tài)性與非遺傳因素，如年齡、性別、體重、合用藥物和治療疾病等相結(jié)合，可解釋華法林用量個體差異原因的33.3%~60.8%。在中國人群中，Veenstra等報道VK0RC1、CYP2C9、年齡、性別可解釋香港中國人華法林用量個體差異原因的60.8%，其中VKORCl和CYP2C9的貢獻是31%和7.9%。Miao等報道的另一組中國人中，VKORCl和CYP2C9對華法林用量個體差異的貢獻分別是49.4%和1.7%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)基因傳感器法檢測華法林敏感性基因的試劑盒，特別是涉及以一種電化學(xué)基因傳感器技術(shù)快速檢測人基因組中法林敏感性基因的試劑盒。本試劑盒可以檢測人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品中的人基因組中的法林敏感性基因。
[0009]本發(fā)明適用于定性檢測人外周血、各種組織和細胞等臨床樣本中細胞色素CYP2C9基因*2，*3，*5等位基因型和維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體I (VKORCl)基因-1639G >AU173C > T等位基因型共5個華法林敏感基因SNP位點。 [0010]本發(fā)明的目的是提供一種使用電化學(xué)基因傳感器技術(shù)來定性檢測樣品中華法林敏感性基因的試劑盒，特別是涉及醫(yī)生對患者的華法林用藥量的判斷應(yīng)用。其基本原理是利用四對寡核苷酸的特異性引物在UNG酶、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反應(yīng)緩沖液中，通過ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)擴增，獲得多重擴增產(chǎn)物；設(shè)計的特異性捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成電化學(xué)傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重擴增產(chǎn)物；特異性信號探針與已捕獲的PCR產(chǎn)物特異結(jié)合。由于信號探針標記有二茂鐵分子，通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應(yīng)用電化學(xué)基因傳感器分析系統(tǒng)檢測出電流值(信號值)，并對各個SNP位點的堿基進行判定，從而達到快速檢測靶多核苷酸的目的，用以指導(dǎo)臨床用藥。
[0011]本發(fā)明所提供的檢測樣品中華法林敏感性基因的試劑盒包括:⑴分別裝有PCR擴增反應(yīng)液、PCR擴增反應(yīng)酶系、電化學(xué)雜交液、空白對照、華法林敏感性基因質(zhì)控品和陽性參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于PCR擴增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴增的24條引物包括:
[0012]正向引物W*2-F1 的序列是:5' -GGATCTCCCTCCTAGTTTCG-3' (SEQ ID NO:1),
[0013]正向引物W*2-F2 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO:2)，
[0014]正向引物W*2-F3的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCT-3' (SEQ ID NO:3)，
[0015]反向引物W*2-R1 的序列是:5' -GTAAGGTCAGTGATATGGAGT-3' (SEQ ID NO:4)，
[0016]反向引物W*2-R2的序列是:5' -CCTTGGTTTTTCTCAACTCCTCC-3' (SEQ ID NO:5),
[0017]反向引物W*2-R3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3' (SEQ ID NO:6),
[0018]正向引物W*3/5-Fl 的序列是:5' -CAGGAAGAGATTGAACGTG-3' (SEQ ID NO:7)，
[0019]正向引物W*3/5-F2的序列是:5' -AGTTTTTACTTGTGTCTTATCAG-3' (SEQ ID NO:8),
[0020]正向引物腫3/5-F3 的序列是:5' -TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3; (SEQ ID NO:9)，
[0021]反向引物腫3/5-R1 的序列是:5' -AAACAAACTTACCTTGGGAAT-3; (SEQ ID NO: 10)，
[0022]反向引物腫 3/5-R2 的序列是:5' -CGAMACATGGAGTTGCAGTGTAG-3' (SEQ ID NO: 11),
[0023]反向引物腫3/5-R3的序列是:5, -GTTGCAGTGTAGGAGAAACAAACTT-3; (SEQ ID NO:12),
[0024]正向引物W1173F1 的序列是:5' -TGACATGGAATCCTGACGT-3' (SEQ ID NO: 13)，
[0025]正向引物W1173F2 的序列是:5' -ACATGGAATCCTGACGTGGC-3' (SEQ ID NO:14),
[0026]正向引物Wl 173F3 的序列是:5' -GTATGACATGGMTCCTGACGTG-3' (SEQ ID NO: 15)，[0027]反向引物W1173R1 的序列是:5' -GMCCAGGTTAGGACTGTCMC-3' (SEQ ID NO:16),
[0028]反向引物Wl 173R2 的序列是:5' -GTGGMCCAGGTTAGGACTGTC-3' (SEQ ID NO: 17)，
[0029]反向引物W1173R3 的序列是:5' -CTGTCAACCCAGTGCCTTGG-3' (SEQ ID NO:18),
[0030]正向引物W1639F1 的序列是:5' -AGGGTAGGTGCAACAGTAA-3' (SEQ ID NO: 19)，
[0031]正向引物 W1639F2 的序列是:5' -AGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA-3; (SEQ ID NO:20)，
[0032]正向引物 W1639F3 的序列是:5' -CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAAG-3; (SEQ ID NO:21),
[0033]反向引物 W1639R1 的序列是:5' -CMGACGCTAGACCCMTGGTTATT-3' (SEQ ID NO:22)，
[0034]反向引物 W1639R2 的序列是:5' -CCTGACCTCMGTGATCCACCC-3' (SEQ ID NO:23)，
[0035]反向引物 W1639R3 的序列是:5' -CACCMGACGCTAGACCCMTG-3' (SEQ ID NO:24)。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，電化學(xué)雜交液中用于特異性結(jié)合PCR產(chǎn)物并指示各個SNP位點的堿基的寡核苷酸信號探針有27條包括:
[0037]2C9star2.WT.SPl 的序列是:5' -GAACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:25)，
[0038]2C9star2.WT.SP2 的序列是:5' -TGAACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:26)，
[0039]2C9star2.WT.SP3 的序列是:5' -AACACGGTCCT-3' (SEQ ID NO:27)，
[0040]2C9star2.MUT.SPl 的序列是:5' -GAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:28)，
[0041]2C9star2.MUT.SP2 的序列是:5' -TGAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:29)，
`[0042]2C9star2.MUT.SP3 的序列是:5' -TTGAACACAGTCCTCAA-3' (SEQ ID NO:30)，
[0043]2C9star3/5.WT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTAT-3' (SEQ ID NO:31)，
[0044]2C9star3/5.WT.SP2 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTATC-3' (SEQ ID NO:32)，
[0045]2C9star3/5.WT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGGTCAATGTATC-3' (SEQ ID NO:33)，
[0046]2C9star3.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTAT-3' (SEQ ID NO:34)，
[0047]2C9star3.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGGTCAAGGTATC-3' (SEQ ID NO:35)，
[0048]2C9star3.MUT.SP3 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTATC-3' (SEQ ID NO:36)，
[0049]VKORCl 1173C > T.WT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGGGTCGAT-3' (SEQ ID NO:37)，
[0050]VKORCl 1173C>T.WT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGGGTCG-3' (SEQ ID NO:38)，
[0051]VKORCl 1173C > T.WT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGGGTCG-3' (SEQ ID NO:39)，
[0052]VKORCl 1173C > T.MT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGAGTCG-3' (SEQ ID NO:40)，
[0053]VKORCl 1173C> T.MT.SP2 的序列是:5' -AGTCCMGAGTCGATG-3' (SEQ ID NO:41),
[0054]VKORCl 1173C> T.MT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGAGTCGATG-3' (SEQ ID NO:42),
[0055]VK0RC1-1639G > A.WT.SPl 的序列是:5' -GCACCCGGCCA-3' (SEQ ID NO:43)，
[0056]VK0RC1-1639G>A.WT.SP2 的序列是:5' -CGCACCCGICCAAT-3' (SEQ ID NO:44),
[0057]VK0RC1-1639G>A.WT.SP3 的序列是:5' -GCACCCGACCAATG-3' (SEQ ID NO:45),
[0058]VK0RC1-1639G > A.MT.SPl 的序列是:5' -GCACCTGGCCA-3' (SEQ ID NO:46)，
[0059]VK0RC1-1639G > A.MT.SP2 的序列是:5' -GCACCTGGCCAA-3' (SEQ ID NO:47)，
[0060]VK0RC1-1639G > A.MT.SP3 的序列是:5' -GCACCTGGACMTGG-3' (SEQ ID NO:48)，
[0061]2C9star5.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGCTCAATGTAT-3' (SEQ ID NO:49),
[0062]2C9star5.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCTCT-3' (SEQ ID NO:50)，
[0063]2C9star5.MUT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCT-3' (SEQ ID NO:51)。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中PCR擴增反應(yīng)液由(a)耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、(b) UNG酶、(c)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(d)能夠分別與4條雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的4條正向引物，(e)能夠分別與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的4條反向引物。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于PCR擴增反應(yīng)液中的各引物的工作濃度分別為 0.1 μ mol/L W*2-F1、0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/LW*3/5-Fl、0.1 μ mol/L W*3/5_F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/L W1173FU0.1 μ mol/L W1173F2.0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/L W1639F2、0.1 μ mol/L W1639F3.0.01ymol/L ff*2-RU0.01 μ mol/L W*2_R2、0.01 μ mol/L W*2_R3、0.02 μ mol/L W*3/5-Rl、0.02μmol/L W*3/5_R2、0.02 μmol/L W*3/5_R3、0.01 μmol/L W1173R1、0.01 μ mol/L W1173R2.0.01 μ mol/L W1173R3.0.01 μ mol/L W1639RU0.01 μ mol/LW1639R2.0.01 μ mol/L W1639R3。
[0066]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中PCR擴增反應(yīng)酶系由(a)耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、(b) UNG酶、(c)脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)組成。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于PCR擴增反應(yīng)液及酶系中的鎂離子最佳濃度為5mmol/L、耐熱Taq酶最佳用量為8U/反應(yīng)、UNG酶最佳用量為0.1U/反應(yīng)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0.24mmol/Lo
[0068]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于PCR擴增的最佳反應(yīng)溫度和時間為:50°C 3min ;然后 95°C 預(yù)變性 15min ;最后 94°C 30s, 56°C 35s, 72 °C 40s45 個循環(huán)；72 °C 7min。
[0069]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中電化學(xué)雜交液包括雜交液1、雜交液I1、雜交液III三種，雜交液I的主要成分為上述的9種信號探針(SEQ ID NO:25~SEQ IDNO:51)，每種信號探針的濃度均為0.175pmol/yL ;雜交液II的主要成分為蛋白質(zhì)；雜交液III的主要成分為高氯酸鈉，其濃度為0.8mol/L。
[0070]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中空白對照為滅菌純化水。
[0071]根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中華法林敏感性基因質(zhì)控品為含有已擴增好的華法林敏感性基因常見型別片段的DNA，雙鏈DNA濃度為30ng/ μ L。
[0072]本發(fā)明提供的檢測試劑盒可以檢測出人基因組DNA的最低濃度為IOng/μ L，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。
[0073]本發(fā)明針對人基因組中的法林敏感性基因片段設(shè)計特異引物和探針，可檢測出人基因組中的法林敏感性基因,但不能檢測出人基因組中的非法林敏感性基因片段,說明本試劑盒具有很好的特異性。
[0074]本發(fā)明提供的檢測試劑盒可以靈敏、快速地檢測人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品中的人基因組中的華法林敏感性基因的型別；可為華法林的臨床用藥量提供可靠的實驗證據(jù)，有效降低華法林用藥不當造成的患者出血風(fēng)險，還可對療效進行有效監(jiān)測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0075]圖1顯示華法林敏感性基因檢測結(jié)果
[0076]圖2顯示華法林敏感性基因檢測結(jié)果【具體實施方式】
[0077]下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。
[0078]實施例1:華法林敏感性基因檢測試劑的研制
[0079]1、引物和探針的設(shè)計:通過對Genebank數(shù)據(jù)庫已有的人基因組上的華法林敏感性基因序列以及國內(nèi)外已發(fā)表文獻中報導(dǎo)的相關(guān)核酸序列進行序列比對分析，以華法林敏感性基因的保守片段為擴增靶位點，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)計的基本原則，利用軟件，人工設(shè)計多對引物和探針。
[0080]2、樣本的選擇:根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道表明，可以選擇人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品。
[0081]3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
[0082]樣品的準備:以臨床收集的經(jīng)驗證為華法林藥物敏感性基因檢測位點有突變的抗凝全血樣本6例和體外培養(yǎng)的人細胞樣本2例作為陽性參考品，用吸附法提取上述陽性參考品的人基因組DNA，待用。
[0083]引物探針的篩選:以上述I中設(shè)計的多組引物探針分別檢測上述的由陽性參考品提取的人基因組DNA，經(jīng)反復(fù)試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復(fù)性好的最佳引物探針組合:序列表中 SEQ ID NO:1 ~SEQ ID NO:51。
[0084]引物濃度的優(yōu)化:在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，上下游引物量比例由4/1至20/1的梯度，分別使用從0.05 μ mol/L至0.30 μ mol/L濃度梯度的上游引物進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的各引物的工作濃度分別為0.1 μ mol/L ff*2-FU0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/L W*3/5_F1、0.1 μ mol/LW*3/5-F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/Lffl 173FU0.1 μ mol/L W1173F2、0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/LW1639F2、0.1，μ mol/L W1639F3、0.01 μ mol/L ff*2-RU0.01ymol/L W*2_R2、0.01 μ mol/LW*2_R3、0.02 μ mol/L ff*3/5-RU0.02 μ mol/L W*3/5-R2、0.02 μmol/L W*3/5_R3、0.01 μmol/LWl173R1、0.01 μmol/L W1173R2、0.01 μ mol/L W1173R3.0.01 μ mol/L W1639RU0.01 μ mol/LW1639R2、0.01 μ mol/LW1639R3。
[0085]熱啟動Taq酶用量的優(yōu)化:在50 μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從4U (酶單位)至10U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的Taq酶用量為6U/反應(yīng)。
[0086]UNG酶用量的優(yōu)化:在50μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從
0.05U (酶單位)至0.2U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的UNG酶用量為0.1U/反應(yīng)。
[0087]dNTPs濃度的優(yōu)化:在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.lmmol/L至0.28mmol/L濃度梯度的dNTPs進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為 0.24mmol/L0
[0088]加樣量的優(yōu)化:在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別測試從5 μ L至15 μ L梯度的加樣量，進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳加樣量為10 μ L。
[0089]反應(yīng)溫度的優(yōu)化:根據(jù)酶的活性和寡多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的反應(yīng)溫度和時間為:50°C 3min，95°C預(yù)變性 15min ;然后 94°C 30s, 56°C 35s，72°C 40s, 40 個循環(huán)；最后 72°C延伸 7min。
[0090]雜交液I中信號探針濃度的優(yōu)化:在雜交反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.1Opmol/人份至0.20pmol/人份濃度梯度的信號探針進行雜交反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的每種信號探針的濃度均為0.175pmol/ μ L。
[0091]雜交液II量的優(yōu)化:在雜交反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5 μ L至15 μ L梯度的雜交液II進行雜交反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗，最終確定最佳的雜交液II量為10 μ Lo
[0092]雜交液III濃度的優(yōu)化:在雜交反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 0.4mol/L至1.5mol/L梯度的雜交液III進行雜交反應(yīng),經(jīng)多次重復(fù)試驗,最終確定最佳的雜交液III濃度為0.8mol/L。
[0093]4、最低檢出量實驗:將人基因組濃度為20ng/μ L的由人抗凝全血提取的DNA梯度稀釋成IOng/ μ L，5ng/ μ L，2ng/ μ L，lng/ μ L，0.5ng/ μ L作為線性與最低檢出量參考品，進行PCR檢測分析，當DNA濃度為Ing/μ L時，檢測樣品在反應(yīng)體系中的量為10ng，仍能檢測到各位點有正常信號值，即最低檢出量可達到10ng。
[0094]5、標本檢測:以人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品作為待檢標本，分別用吸附法提取標本的DNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴增體系檢測，結(jié)果表明:本試劑盒可以很靈敏的檢測出臨床標本中的華法林藥物敏感性基因位點。
[0095]實施例2:華法林敏感性基因檢測試劑盒(電化學(xué)基因傳感器法)及其使用
[0096]1、制備包括下列組成成分的試劑盒:華法林PCR反應(yīng)液A(888 μ L/管)I管、華法林PCR反應(yīng)液B (72 μ L/管)1管、華法林敏感性基因質(zhì)控品(50 μ L/管)1管、空白對照(50 μ L/管)1管、雜交液I (1680 μ L/管)1管、雜交液II (240 μ L/管)I管、雜交液III (480 μ L/管)I管、電化學(xué)傳感器(芯片)(8個/包)3包。
[0097]2、標本采集、運送和保存
[0098]2.1適用樣本類型:抗凝全血等。
[0099]2.2樣品采集與前處理(注意無菌操作):用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL,注入含EDTA或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5~10次，使抗凝劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。
[0100]2.3保存與運送:標本可立即用于測試；在-20±5°c保存期為9個月；若要長期保存，需儲存于_80±5°C ;標本應(yīng)避免反復(fù)凍融。標本運送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封運輸，運輸時間不應(yīng)超過7天。
[0101]3、檢測步驟
[0102](I)基因組DNA提取
[0103]建議取200 μ L樣本進行核酸提取。可采用中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的全血基因組提取試劑盒，該試劑盒可用于對人全血基因組DNA的提取，請按照試劑盒說明書進行操作；也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。
[0104](2) PCR 擴增
[0105]取適量PCR反應(yīng)管，每管加入華法林PCR反應(yīng)液Α37μ L、華法林PCR反應(yīng)液Β3 μ L (也可根據(jù)PCR反應(yīng)用量，計算各組分所需總量，混勻后分裝40 μ L于單個PCR反應(yīng)管中)；于上述PCR反應(yīng)管中分別加入提取后的樣本核酸10 μ L，另取兩管分別加入華法林敏感性基因質(zhì)控品和空白對照各?ο μ L，8，OOOg離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀。在適用的儀器上按照下列條件進行PCR循環(huán)程序的設(shè)置:50°C 3分鐘，95°C預(yù)變性15分鐘，然后按94°C 30秒一56 0C 35秒一72 0C 40秒擴增，45個循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。
[0106](3)雜交操作
[0107]取一 0.2mL的離心管，依次加入70 μ L雜交液1,10 μ L雜交液II, 20 μ L雜交液III以及25 μ LPCR產(chǎn)物，充分混勻(注意盡量不要有氣泡)，將混勻的液體移入電化學(xué)傳感器(芯片)的管中，壓緊管蓋。在傳感器插入DA9000儀器(由中山大學(xué)達安基因股份有限公司自主研發(fā)的與本試劑盒匹配的專用雜交檢測儀)的檢測模塊前，檢查是否已正確地標記，確認樣本管的序列號與傳感器是否匹配。然后選定與本試劑盒匹配的專用雜交檢測程序，開始運行。大約30min后，雜交完成，輸出報告單。
[0108](4)結(jié)果分析
【權(quán)利要求】
1.一種檢測華法林敏感性基因的試劑盒，該試劑盒包括:(1)分別裝有PCR擴增反應(yīng)液、PCR擴增反應(yīng)酶系、電化學(xué)雜交液、空白對照、華法林敏感性基因質(zhì)控品和陽性參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于PCR擴增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴增的24條引物包括: 正向引物 W*2-F1 的序列是:5' -GGATCTCCCTCCTAGTTTCG-3'， 正向引物 W*2-F2 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3'， 正向引物 W*2-F3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTTTCTCT-3'， 反向引物 W*2-R1 的序列是:5' -GTAAGGTCAGTGATATGGAGT-3'， 反向引物 W*2-R2 的序列是:5' -CCTTGGTTTTTCTCAACTCCTCC-3'， 反向引物 W*2-R3 的序列是:5' -ATCTCCCTCCTAGTTTCGTT-3'， 正向引物 W*3/5-Fl 的序列是:5' -CAGGAAGAGATTGAACGTG-3'， 正向引物 W*3/5-F2 的序列是:5' -AGTTTTTACTTGTGTCTTATCAG-3'， 正向引物 W*3/5-F3 的序列是:5' -TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG-3'， 反向引物 W*3/5-Rl 的序列是:5' -AAACAAACTTACCTTGGGAAT-3'， 反向引物 W*3/5-R2 的序列是:5' -CGAAAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3'， 反向引物 W*3/5-R3 的序列是:5' -GTTGCAGTGTAGGAGAAACAAACTT-3'， 正向引物 W1173F1 的序列是:5' -TGACATGGAATCCTGACGT-3'， 正向引物 W1173F2 的序列是:5' -ACATGGAATCCTGACGTGGC-3'， 正向引物 W1173F3 的序列是:5' -GTATGACATGGAATCCTGACGTG-3'， 反向引物 W1173R1 的序列是:5' -GAACCAGGTTAGGACTGTCAAC-3'， 反向引物 W1173R2 的序列是:5' -GTGGAACCAGGTTAGGACTGTC-3'， 反向引物 W1173R3 的序列是:5' -CTGTCAACCCAGTGCCTTGG-3'， 正向引物 W1639F1 的序列是:5' -AGGGTAGGTGCAACAGTAA-3'， 正向引物 W1639F2 的序列是:5' -AGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA-3'， 正向引物 W1639F3 的序列是:5' -CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAAG-3'， 反向引物 W1639R1 的序列是:5' -CAAGACGCTAGACCCAATGGTTATT-3'， 反向引物 W1639R2 的序列是:5' -CCTGACCTCAAGTGATCCACCC-3'， 反向引物 W1639R3 的序列是:5' -CACCAAGACGCTAGACCCAATG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應(yīng)液中的各引物的工作濃度分別為 0.1 μ mol/L W*2-F1、0.1 μ mol/L W*2_F2、0.1 μ mol/L W*2_F3、0.1 μ mol/LW*3/5-Fl、0.1 μ mol/L W*3/5_F2、0.1 μ mol/L W*3/5_F3、0.1 μ mol/L W1173FU0.1 μ mol/L W1173F2.0.1 μ mol/L W1173F3、0.1 μ mol/L W1639FU0.1 μ mol/L W1639F2、0.1 μ mol/L W1639F3.0.01ymol/L ff*2-RU0.01 μ mol/L W*2_R2、0.01 μ mol/L W*2_R3、0.02 μ mol/L W*3/5-Rl、0.02μ mol/L W*3/5_R2、0.02 μ mol/L W*3/5_R3、0.01 μ mol/L W1173RU0.01 μ mol/L W1173R2、0.01 μ mol/LW1173R3、0.01 μ mol/LW1639Rl、0.01 μ mol/LW1639R2、0.01ymol/LW1639R3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應(yīng)液中耐熱DNA聚合酶的濃度為8U/反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應(yīng)液中UNG酶的濃度為.0.1U/反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應(yīng)液中dNTPs的濃度為.0.24mmol/L0
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于用于PCR擴增反應(yīng)條件為:50°C3min ；.95°C 15min ；94°C 30s, 56°C 35s,72°C 40s, 45 個循環(huán)；72°C 7min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于電化學(xué)雜交液包括雜交液1、雜交液I1、雜交液III三種，雜交液I的主要成分為9種信號探針；雜交液II的主要成分為蛋白質(zhì)；雜交液III的主要成分為高氯酸鈉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的電化學(xué)雜交液，其特征還在于電化學(xué)雜交液I中用于特異性結(jié)合PCR產(chǎn)物并指示各個SNP位點的堿基的寡核苷酸信號探針有27條包括: 2C9star2.WT.SPl 的序列是:5' -GAACACGGTCCT-3'， 2C9star2.WT.SP2 的序列是:5' -TGAACACGGTCCT-3'， 2C9star2.WT.SP3 的序列是:5' -AACACGGTCCT-3'， 2C9star2.MUT.SPl 的序列是:5' -GAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star2.MUT.SP2 的序列是:5' -TGAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star2.MUT.SP3 的序列是:5' -TTGAACACAGTCCTCAA-3'， 2C9star3/5.WT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTAT-3'， 2C9star3/5.WT.SP2 的序列是:5' -GAAGGTCAATGTATC-3'， 2C9star3/5.WT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGGTCAATGTATC-3'， 2C9star3.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTAT-3'， 2C9star3.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGGTCAAGGTATC-3'， 2C9star3.MUT.SP3 的序列是:5' -GAAGGTCAAGGTATC-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGGGTCGAT-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGGGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.WT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGGGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SPl 的序列是:5' -TCCAAGAGTCG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SP2 的序列是:5' -AGTCCAAGAGTCGATG-3'， VKORCl 1173C > T.MT.SP3 的序列是:5' -TCCAAGAGTCGATG-3'， VK0RC1-1639G > A.WT.SPl 的序列是:5' -GCACCCGGCCA-3'， VK0RC1-1639G > A.W T.SP2 的序列是:5' -CGCACCCGICCAAT-3'， VK0RC1-1639G > A.WT.SP3 的序列是:5' -GCACCCGACCAATG-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SPl 的序列是:5' -GCACCTGGCCA-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SP2 的序列是:5' -GCACCTGGCCAA-3'， VK0RC1-1639G > A.MT.SP3 的序列是:5' -GCACCTGGACAATGG-3'， 2C9star5.MUT.SPl 的序列是:5' -GAAGCTCAATGTAT-3'， 2C9star5.MUT.SP2 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCTCT-3'， 2C9star5.MUT.SP3 的序列是:5' -GAGAAGCTCAATGTATCT-3'。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所檢測的樣品可選自但不局限于人體細胞、抗凝全血、或組織等樣品。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627789SQ201310366835
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月21日
【發(fā)明者】陳華云, 李明, 肖湘文, 趙麗, 黃桃生 申請人:中山大學(xué)達安基因股份有限公司