一種電化學基因傳感器法檢測人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】人乳頭瘤病毒(HPV)是一種誘發(fā)外生殖器良性病變和女性子宮頸癌的主要病原體。HPV分為低危型和中高危型HPV。低危型HPV常引起外生殖器尖銳濕疣等良性病變；而中高危型HPV與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)病變的發(fā)生密切相關。因此，有針對性地進行HPV的分型檢測，對于宮頸癌的早期診斷和治療具有一定的臨床意義。本發(fā)明針對HPV基因組晚期區(qū)L1區(qū)設計特異引物和20型信號探針，將信號探針分別固定在印刷電路板金電極表面，制備成電化學傳感器，用于捕獲PCR多重擴增產(chǎn)物。由于信號探針標記有二茂鐵分子，通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應用電化學基因傳感器分析系統(tǒng)檢測出電流值，最后進行人乳頭瘤病毒基因型別判定。
【專利說明】—種電化學基因傳感器法檢測人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電化學基因傳感器法檢測人乳頭瘤病毒20個基因分型的試劑盒，特別是涉及以一種電化學基因傳感器技術快速分型檢測20個人乳頭瘤病毒型別的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒，實現(xiàn)對宮頸脫落細胞樣本或生殖泌尿道分泌物樣本中的20個人乳頭瘤病毒型別進行快速檢測和分析。
【背景技術】
[0002]1998年底美國科學促進會將電化學基因傳感器技術列為1998年度自然科學領域十大進展之一，足見其在科學史上的意義。它以其可同時、快速、準確地分析數(shù)以千計基因組信息的本領而顯示出了巨大的威力。這些應用主要包括基因表達檢測、突變檢測、基因組多態(tài)性分析和基因文庫作圖以及雜交測序等方面。
[0003]生物芯片以其高通量、多靶位的檢測模式正在被越來越多地應用于生物科學領域。以印刷電路板為載體的微陣列芯片，更以其高效、高通量、低價位等特點，已經(jīng)廣泛用于基礎研究和臨床篩查、輔助診斷。
[0004]微陣列芯片包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片、抗原芯片、抗體芯片等，電化學基因傳感器芯片以特殊化學方法處理后的印刷電路板為載體，將各種探針或靶標片段以化學鍵結合的方式固定在印刷電路板表面，并利用二茂鐵衍生物作為電化學指示劑，形成可用于雜交反應或抗原抗體反應的微陣列芯片。
[0005]宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13萬，是僅次于乳腺癌而引起婦女癌癥相關死亡的重要原因。近幾年來，隨著生活方式的改變，宮頸癌患者的發(fā)病年齡更趨年輕化，并且病例數(shù)有不斷上升的趨勢。宮頸癌也是目前唯一一種發(fā)病原因比較清楚的癌癥，主要病因是由高危型人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)的持續(xù)感染或反復感染所致，同一型別的高危HPV病毒持續(xù)感染導致發(fā)生宮頸癌或者宮頸病變的風險系數(shù)更高，而不同型別的HPV與宮頸癌的相關性也不一樣，例如HPV16，18型感染與宮頸癌高度相關，60%以上的宮頸癌的發(fā)生是由HPV16，18型的持續(xù)感染所致；低危型如6，11等的持續(xù)感染則幾乎不導致宮頸癌的發(fā)生。
[0006]HPV主要通過性行為傳播，也可通過接觸污染物品傳播。研究表明，幾乎所有(99.7% )的宮頸癌患者中都有HPV的感染；有過性行為的女性，一生中至少感染過一種HPV的機率高達40%左右。只有高危型HPV的持續(xù)或反復感染才有致癌的可能，從HPV感染至宮頸癌發(fā)生需經(jīng)歷多年的時間，通過積極處理HPV感染及癌前病變，可以有效阻斷病情發(fā)展，預防宮頸癌的發(fā)生。因此檢測HPV基因型有助于判斷病情的進展、制定個體化檢查和治療方案。
[0007]目前確定的HPV型別約有100多種，依其感染的上皮所在部位分為皮膚型HPV和生殖道上皮HPV，大約35種型別涉及生殖道感染，約20種與腫瘤相關。依據(jù)不同型HPV與癌發(fā)生的危險性高低分為低危險型HPV如HPV6，11，42，43，44等，常引起外生殖器濕疣等良性病變包括宮頸上皮內(nèi)低度病變；高危型HPV如16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59，68，73，82等15個型別與宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變(CIN2 / 3)的發(fā)生相關，尤其是HPV16和18型；而26，53，66等疑似高危型別則可能會引起癌前病變，甚至宮頸癌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及一種電化學基因傳感器法分型檢測20個人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒，特別是涉及以一種電化學基因傳感器技術快速分型檢測20個人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒。本試劑盒可以檢測宮頸脫落細胞樣本或生殖泌尿道分泌物樣品中人乳頭瘤病
毒基因。 [0009]本發(fā)明適用于定性并分型檢測宮頸脫落細胞樣本或生殖泌尿道分泌物等臨床樣品中的 HPV16,18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，6，11 等 20 個人
乳頭瘤病毒型別。
[0010]本發(fā)明的目的是提供一種使用電化學基因傳感器技術來定性分型檢測樣品中20個人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒。其基本原理是利用四對寡核苷酸的特異性引物在UNG酶、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、高質量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、Mg2+和PCR反應緩沖液中，通過ABI2700、ABI9700等市售的定性PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)擴增，獲得多重擴增產(chǎn)物；設計的特異性捕獲探針分別固定在特制的印刷電路板金電極表面，制備成電化學傳感器(芯片)，用于捕獲PCR多重擴增產(chǎn)物；特異性信號探針與已捕獲的PCR產(chǎn)物特異結合。由于信號探針標記有二茂鐵分子，通過夾心雜交產(chǎn)生電流的變化，應用電化學基因傳感器分析系統(tǒng)檢測出電流值(信號值)，并對20個不同人乳頭瘤病毒型別的堿基進行判定，從而達到快速檢測靶多核苷酸的目的，用以指導臨床治療。
[0011]本發(fā)明所提供的檢測樣品中人乳頭瘤病毒型別基因的試劑盒包括:(I)分別裝有PCR擴增反應液、PCR擴增反應酶系、電化學雜交液、空白對照、人乳頭瘤病毒陽性質控品和陰性質控品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于PCR擴增反應液中用于靶多核苷酸擴增的37條引物包括:
[0012]正向引物MYl 1-A:5’ -GCACAGGGACATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:1)，
[0013]正向引物MYll-B:5，-GCGCAGGGCCACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:2),
[0014]正向引物MYll-C:5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:3),
[0015]正向引物MYll-D:5’ -GCCCAGGGCCACAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:4),
[0016]正向引物MYll-E:5’-GCTCAGGGTTTAAACAATGG-3，(SEQ ID NO:5),
[0017]正向引物MYll-F:5’ -GCACAAGGCCATAATAATGG(SEQ ID NO:6)，
[0018]正向引物MYll-G:5’-GCCCAGGGTCATAACAATGG-3’ (SEQ ID NO:7),
[0019]正向引物MYll-H:5’-GCACAAGGTCATAATAATGG-3’ (SEQ ID NO:8),
[0020]正向引物MYll-1:5’ -GCICAGGGICATAAIAATGG-3’ (SEQ ID NO:9),
[0021 ]正向引物 MYl 1-J:5’ -GCACAGGGACACAATAATGG-3’ (SEQ ID NO: 10)，
[0022]反向引物MY09-1:5’ -AGGTAGATGAGGTGGTGGGT-3’ (SEQ ID NO:11),
[0023]反向引物MY09-2:5’-ACGCAATCCAGCCTGAACCA-3’ (SEQ ID NO:12),
[0024]反向引物MY09-3:5’-TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA-3’ (SEQ IDNO:13),
[0025]反向引物MY09_4:5’-GACGATGTGCGGGTGGATGT-3’ (SEQ ID NO:14)，[0026]反向引物MY09-5:5’-GCATAGATGAAAAACAAACTGTA-3’ (SEQ ID NO:15)，
【權利要求】
1.一種電化學基因傳感器法檢測人乳頭瘤病毒20種分型的試劑盒，該試劑盒包括:PCR擴增反應液、PCR擴增反應酶系、電化學雜交液、人乳頭瘤病毒陽性質控品和陰性質控品。其中PCR擴增反應液由PCR反應緩沖液、鎂離子溶液、能夠分別與20個不同型別的雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結合的10條正向引物、能夠分別與20個不同型別的雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結合的27條反向引物組成；PCR擴增反應酶系由Taq酶、UNG酶和dNTPs組成；電化學雜交液由雜交液1、雜交液I1、雜交液III組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于PCR擴增反應液中用于靶多核苷酸擴增的10條正向引物和27條反向引物的序列包括:
正向引物 MYl 1-A: GCACAGGGACATAACAATGG
正向引物 MYl 1-B: GCGCAGGGCCACAATAATGG
正向引物 MYl 1-C: GCACAGGGACATAATAATGG
正向引物 MYl 1-D: GCCCAGGGCCACAACAATGG
正向引物 MYl 1-E: GCTCAGGGTTTAAACAATGG
正向引物 MYl 1-F: GCACAAGGCCATAATAATGG
正向引物 MYl 1-G: GCCCAGGGTCATAACAATGG
正向引物 MYl 1-H: GCACAAGGTCATAATAATGG
正向引物 MYll-1:GCICAGGGICATAAIAATGG
正向引物 MYl 1-J:GCACAGGGACACAATAATGG
反向引物 MY09-1:AGGTAGATGAGGTGGTGGGT
反向引物 MY09-2:ACGCAATCCAGCCTGAACCA
反向引物 MY09-3:TGCCTAACTGAAATATAAATTGTAA
反向引物 MY09-4:GACGATGTGCGGGTGGATGT
反向引物 MY09-5:GCATAGATGAAAAACAAACTGTA
反向引物 MY09-6:GCACACTTGAAAAATAAACTGTAA
反向引物 MY09-7:TGGAAAATAAACTGCAAATCA
反向引物 MY09-8:AGGTGGAAGCAGCAGGACGC
反向引物 MY09-9:CCTATTCTTCACCATGCCTTA
反向引物 MY09-10:CGATGATGCGGGGCGTTTTA
反向引物 MY09-11:AGAGGATACAGGCGGTTTAG
反向引物 MY09-12:AACACAAATTGTAATTCATATTCC
反向引物 MY09-13:TTTGCGTTTGGTGGATGGTG
反向引物 MY09-14:GGGTAGAGGTAGGGGCAGGC
反向引物 MY09-15:TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC
反向引物 MY09-16:GCAGTAGTTGCTGTGGCGGG
反向引物 MY09-17:GGTAGCATCCATTGTGTGTAAA
反向引物 MY09-18:CGAGGAAGCGGAAGAGGATG
反向引物 MY09-19:TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
反向引物 MY09-20:GGGCTGTAGAGGGCTTAGAC
反向引物 MY09-21:TGCGTCCCAAAGGAAACTGATC反向引物 MY09-22:CTACCTAAAGGAAACTGATC 反向引物 MY09-23:AACTTGCGACCCAATGCAAACTG 反向引物 MY09-24:CGTCCTAAAGGAAACTGGTC 反向引物 MY09-25:CGACCCAATGGAAACTGATC 反向引物 MY09-26:TTTACGGCCCAACGGAAACTGATC 反向引物 MY09-27:TGCGCCCTAAGGGAAACTGGGT。
3.根據(jù)權利要求2所述的引物序列，其特征還在于正向引物工作濃度均為0.5i!mOl/L，反向引物的工作濃度均為0.03iimol / L0
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR擴增反應酶系中Taq酶的濃度為7U /反應，UNG酶的濃度為0.1U /反應，dNTPs的濃度為0.6mmol / L。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于用于PCR擴增反應的反應條件為:500C 3 分鐘；95°C 15 分鐘；94°C 30 秒，45°C 30 秒，72°C 30 秒，50 個循環(huán)；72°C 7 分鐘。
6.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于電化學雜交液中雜交液I的主要成分為28種信號探針，且濃度均為0.175pmol / u L ;雜交液II的主要成分為蛋白質；雜交液III的主要成分為高氯酸鈉，且濃度為0.8mol / L0
7.根據(jù)權利要 求6所述的電化學雜交液，其特征還在于電化學雜交液I中用于特異性結合PCR產(chǎn)物并指示各個人乳頭瘤病毒型別的寡核苷酸信號探針有28條，包括:
HPV (20 型)? SP-Ol: CACATAATGTCATATTTGTACTGCGT
HPV (20 型)? SP-02:TGCATAAAGTCATATTAGTGCTACGA
HPV (20 型)? SP-03:TAGATAATGTAAAGTTGGTACTGCGAG
HPV (20 型)? SP-04: TAGTAATAGTCATGTTAGTACTGCGGG
HPV (20 型)? SP-05:CACACACAGAAAGATTAGTGCTTCTAG
HPV (20 型)? SP-06: TGCATAATGTCATATTAGTGCTACAAG
HPV (20 型)? SP-07:GGACAATGTAAAATTAGTACTGCGCG
HPV (20 型)? SP-08: CACATATTGTTAAATAGTACTGCGG
HPV (20 型)? SP-09:AACACACAGACATATTGGTACTGCGT
HPV (20 型)? SP-10: TGCTAATGGTTAAATTTGTACTTCTGG
HPV (20 型)? SP-1l:CGTTAATAGTCATGTTTGTATTCCTG
HPV (20 型)? SP-12: CAACAGTAACAAATAGTTGGTTACC
HPV (20 型)? SP-13:AACTGTGACAAACAACTGATTGCCC
HPV (20 型)? SP-14: TGTATCAACTACAGTAACAAACAATT
HPV (20 型)? SP-15: TATCAACACAGGTAATAAAAAGCTGAT
HPV (20 型)? SP-16:AGTATCCACAACAGTAACAAATACCTGA
HPV (20 型)? SP-17:GGTATCTACCACAGTAACAAATAATTG
HPV (20 型)? SP-18:AGTGGTATCCACAACTGTGACAAACAA
HPV (20 型)? SP-19:ATTAGTGCTTCTAGTAGTATCTACAACAGT
HPV (20 型)? SP-20:TTGGTACTTTTAGTAGTGTCAACACAAGTIA
HPV (20 型)? SP-21:GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGTG
HPV (20 型)? SP-22:GGCATACGTTGTAGTAGAGCTACTAGCCTGHPV (20 型)? SP-23:TCATTTTTATATGTACCTTCCTTAGTTACT
HPV (20 型)? SP-24:TCACTAGAAGACACAGCAGAACACACAGACAT
HPV (20 型)? SP-25:GAAGACTCTATAGAGGTAGATAATGTAA
HPV (20 型)? SP-26:CGCAGCAGTGGCAGTGCTAATAGTTAAATTTGTA
HPV (20 型)? SP-27:TCACTAGTTACTTGTGTGCATAAAGTCATATTAG
HPV(20 型)? SP-28:ATGGTAAGGTTAGTACTGCGGGTGGTATCAAC。
8.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于人乳頭瘤病毒陰性質控品為滅菌純化水；陽性質控品為傳代培養(yǎng)的宮頸癌Hela細胞，且DNA濃度為IO4拷貝/ mL。
9.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所檢測的樣品可選自但不局限于宮頸脫落細胞樣本或生殖泌 尿道分泌物。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602755SQ201310366831
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年8月21日 優(yōu)先權日:2013年8月21日
【發(fā)明者】陳華云, 李明, 肖湘文, 黃桃生, 趙麗 申請人:中山大學達安基因股份有限公司