專(zhuān)利名稱(chēng)：與酪氨酰-tRNA合成酶的蛋白片段相關(guān)的治療、診斷和抗體組合物的創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體涉及包含氨酰-tRNA合成酶和其他蛋白的新鑒定的蛋白片段的組合物，編碼它們的多核苷酸及其互補(bǔ)物，相關(guān)劑，及其在診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、研究和治療應(yīng)用中的使用方法。
背景技術(shù)：
在過(guò)去的四十年，氨酰-tRNA合成酶(AARS)被認(rèn)為是催化tRNA分子氨?；匦璧墓芗业鞍祝鴗RNA分子氨?；堑鞍追g過(guò)程中遺傳信息解碼的一部分。AARS在這方面已經(jīng)得到廣泛研究，并且克隆了許多它們的全長(zhǎng)序列以進(jìn)行序列分析并提供生化實(shí)驗(yàn)的豐富來(lái)源。然而，一些AARS片段和其他蛋白具有意想不到的與氨?；療o(wú)關(guān)的活性，包括調(diào)節(jié)超出蛋白翻譯的途徑的細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)活性。一般而言，在全長(zhǎng)或親本蛋白序列的情況下未發(fā)現(xiàn)這些意想不到的活性；反而在從其親本序列去除或切除AARS蛋白片段之后，或者通過(guò)表達(dá)并充分純化AARS片段序列，然后測(cè)試新的非合成酶相關(guān)的活性，發(fā)現(xiàn)了這些活性。雖然AARS的全長(zhǎng)序列已經(jīng)知道了一段時(shí)間，但是還沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)分析來(lái)闡釋此類(lèi)AARS蛋白片段或來(lái)自有關(guān)或相關(guān)蛋白的蛋白片段，或者評(píng)價(jià)全長(zhǎng)AARS蛋白在氨基酸合成之外的新生物活性方面的潛在作用。在本說(shuō)明書(shū)的多個(gè)部分，此類(lèi)AARS蛋白片段、AARS結(jié)構(gòu)域或AARS選擇性剪接變體在本文被稱(chēng)為“切除蛋白(resectin) ”。在其最廣的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“切除蛋白”指已經(jīng)從其天然的全長(zhǎng)或親本蛋白序列切離或限制(通過(guò)蛋白水解、選擇性剪接、誘變或重組基因工程)的一部分蛋白，否則其常常掩蓋其新的生物活性。同樣，還沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)分析以考察此類(lèi)切除蛋白在治療各種醫(yī)學(xué)病癥中作為生物治療劑、診斷劑或藥物靶的用途，或者它們與人類(lèi)疾病的潛在關(guān)聯(lián)。作為具有對(duì)哺乳動(dòng)物生命至關(guān)重要的已知功能的必需的管家基因，AARS既沒(méi)有被考慮作為哺乳動(dòng)物的藥物靶，也沒(méi)有通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的基因組測(cè)序、生物信息學(xué)或類(lèi)似工作分析它們以鑒定具有非合成酶活性的切除蛋白。同樣，標(biāo)準(zhǔn)的生化研究工作已經(jīng)遠(yuǎn)離鑒定AARS切除蛋白的生物性質(zhì)及其潛在的治療和診斷相關(guān)性的方向，這主要?dú)w因于之前所理解的其相應(yīng)的全長(zhǎng)親本AARS的作用。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定的與C端AARS多肽的相對(duì)位置和大小重疊的酪氨酰tRNA合成酶的域結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示通過(guò)轉(zhuǎn)錄組的深度測(cè)序鑒定的與C端AARS多肽的相對(duì)位置和大小重疊的酪氨酰tRNA合成酶的域結(jié)構(gòu)示意圖。
發(fā)明概述本發(fā)明的實(shí)施方案一般涉及氨酰-tRNA合成酶(AARS)的蛋白片段的發(fā)現(xiàn)，所述蛋白片段具有非規(guī)范的生物活性，例如細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)活性，和/或治療和診斷相關(guān)的其他特性。AARS是所有生物中存在的蛋白合成器的通用且必要元件，但是人類(lèi)AARS及其相關(guān)蛋白具有天然存在的切除變體，具有強(qiáng)大的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)活性，促進(jìn)人類(lèi)的正常功能。這些蛋白片段的活性不同于AARS公知的蛋白合成活性，并且本發(fā)明包括發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)這些切除蛋白作為新治療劑、新發(fā)現(xiàn)研究試劑和定向生物制劑和診斷劑的新抗原/靶，可能用于治療或診斷許多人類(lèi)疾病，例如炎性、血液學(xué)、神經(jīng)退行性、自身免疫性、血細(xì)胞生成、心血管和代謝疾病或疾患。因此，本發(fā)明的AARS蛋白片段可以被稱(chēng)為“切除蛋白”或者“appendacrine”。如上所述，術(shù)語(yǔ)“切除蛋白”源自從其全長(zhǎng)親本AARS序列環(huán)境切割或切除給定的AARS蛋白片段的過(guò)程，而其全長(zhǎng)親本AARS序列通常掩蓋其非規(guī)范活性。在某些情況下，本發(fā)明的AARS蛋白片段和多核苷酸通過(guò)該切除過(guò)程的發(fā)生被鑒定，而不論是天然存在的(例如，蛋白水解的、剪接變體)、人工誘導(dǎo)的還是預(yù)測(cè)的。術(shù)語(yǔ)“appendacrine”衍生自“附加”(來(lái)自拉丁語(yǔ)-appender)和“分離”或“分辨”(來(lái)自希臘語(yǔ)_ crines)，并且也反映了 AARS蛋白片段的一個(gè)或多個(gè)附加結(jié)構(gòu)域與其相應(yīng)的全長(zhǎng)或親本AARS序列分離。盡管之前已經(jīng)顯示幾種AARS片段具有非合成酶活性，但是有關(guān)生物治療、發(fā)現(xiàn)或診斷功用的此類(lèi)片段的表達(dá)、分離、純化和表征是有限的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員不容易將此類(lèi)活性與整個(gè)AARS家族的每個(gè)成員或替代片段相聯(lián)系。在此，利用了系統(tǒng)的方法發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了用于生物治療發(fā)現(xiàn)和診斷功用的20個(gè)線粒體AARS和20個(gè)胞質(zhì)AARS (和相關(guān)蛋白)的AARS蛋白片段。例如，使用主要鑒定蛋白水解片段的質(zhì)譜(MS)從生物樣品鑒定了本發(fā)明的AARS蛋白片段和編碼它們的多核苷酸中的某些，并且通過(guò)主要鑒定剪接變體的深度測(cè)序技術(shù)鑒定了其他。使用計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)氨基酸序列，例如通過(guò)計(jì)算機(jī)比較來(lái)自人類(lèi)和低等生物的合成酶以及關(guān)鍵區(qū)別(例如蛋白酶位點(diǎn))，鑒定了其他AARS蛋白片段；該方法利用了全長(zhǎng)AARS的序列分析，基于分辨具有非規(guī)范生物活性的蛋白水解片段和功能結(jié)構(gòu)域的具體標(biāo)準(zhǔn)。AARS的新的切除蛋白是意想不到的，并且它們的差異表達(dá)也是意想不到的。特定的切除通常見(jiàn)于不同的處理(例如，從在有或沒(méi)有血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞)、不同的生長(zhǎng)階段(例如，成體腦相對(duì)于胎兒腦)和不同的組織類(lèi)型(例如，胰腺相對(duì)于肝臟)。盡管在相同的細(xì)胞位置以相對(duì)比例的量需要所有氨酰tRNA合成酶的規(guī)范功能，但所有氨酰tRNA合成酶的表達(dá)模式是不同的。人們不會(huì)預(yù)期一種氨酰tRNA合成酶活性的水平在其他氨酰tRNA合成酶活性不增加的同時(shí)增加。質(zhì)譜和深度測(cè)序數(shù)據(jù)指示氨酰tRNA合成酶切除蛋白確實(shí)具有不同的水平并且出現(xiàn)在不同的部位和不同的階段。此外，AARS蛋白片段可以被表達(dá)和純化至足夠高的純度以分辨其生物性質(zhì)。之前，片段常常不具有足夠的純度、折疊和穩(wěn)定性來(lái)實(shí)現(xiàn)非合成酶活性的適當(dāng)?shù)纳锉碚鳌＠?，配合足夠純的、穩(wěn)定的、可溶的且折疊的切除蛋白使用基于細(xì)胞的測(cè)定，以揭示其重要的生物治療、發(fā)現(xiàn)或診斷活性。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及具有生物治療、發(fā)現(xiàn)或診斷功用的酪氨酰tRNA合成酶的蛋白片段，相關(guān)劑和組合物及其使用方法。如本文所描述的，本發(fā)明的組合物用于許多診斷、藥物發(fā)現(xiàn)和治療應(yīng)用。優(yōu)選地，AARS蛋白和片段是純化的并且保存在適合條件下，達(dá)到所述生物治療、發(fā)現(xiàn)或診斷用途所需的程度。某些實(shí)施方案包括組合物，包含至少約100、90、80、70、60、50或40個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列，并且具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度和小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。一方面，所述組合物是治療組合物。在具體實(shí)施方案中，組合物基本沒(méi)有血清。在一些實(shí)施方案中，AARS蛋白片段包含非規(guī)范活性。在一些實(shí)施方案中，非規(guī)范生物活性選自:細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成或活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子受體活性的調(diào)節(jié)、和炎癥的調(diào)節(jié)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于基于細(xì)胞的非規(guī)范生物活性，AARS蛋白片段具有小于約InM、約 5nM、約 IOnMJ^] 50nM、約 IOOnM 或約 200nM 的 EC5(I。在某些實(shí)施方案中，AARS蛋白片段與異源多肽融合。在一些實(shí)施方案中，AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。在一些實(shí)施方案中，AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。在某些實(shí)施方案中，異源多肽與AARS蛋白片段的N端連接。在某些實(shí)施方案中，異源多肽與AARS蛋白片段的C端連接。一方面，在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，異源多肽選自由以下組成的組:純化標(biāo)簽、表位標(biāo)簽、祀向序列、信號(hào)肽、膜轉(zhuǎn)位序列和PK調(diào)節(jié)劑。在某些實(shí)施方案中，組合物包含濃度最少約10mg/mL的AARS蛋白片段。在某些實(shí)施方案中，組合物包含至少90%單分散的AARS蛋白片段。在某些實(shí)施方案中，組合物包含小于約3%的高分子量聚集蛋白。在某`些實(shí)施方案中，組合物在4°C下在PBS中以至少I(mǎi)Omg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集。在某些實(shí)施方案中，組合物在室溫下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集。本文描述了用于測(cè)量切除蛋白的此類(lèi)特征的各種測(cè)定，并可以用來(lái)限定本發(fā)明的各方面。在某些方面中，這些特征對(duì)于本文描述的AARS蛋白片段的生物治療功用是優(yōu)選的。某些實(shí)施方案包括組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，該蛋白片段與表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列相差約1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或添加，其中改變的蛋白片段基本上保持未改變蛋白的非規(guī)范活性或者具有與非規(guī)范活性相關(guān)的顯性負(fù)表型，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度和小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。在具體實(shí)施方案中，組合物基本沒(méi)有血清。其他實(shí)施方案包括組合物，包含與表1-3中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特異性結(jié)合的分離的抗體，其中所述抗體對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力比所述抗體對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X。本發(fā)明的令人驚訝的一個(gè)方面包括具有抗體或其他定向生物制劑可及的“新”表面的某些切除蛋白，而全長(zhǎng)AARS “隱藏”或用其他序列或相鄰結(jié)構(gòu)域覆蓋這些表面。切除過(guò)程還能產(chǎn)生更大的水可及性，用于揭示之前未鑒定的生物性質(zhì)。一些實(shí)施方案包括組合物，包含與表1-3所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特異性結(jié)合的分離的抗體，其中所述抗體具有至少約IOnM的對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力，和至少約IOOnM的對(duì)相應(yīng)全長(zhǎng)AARS多肽的親和力。在某些實(shí)施方案中，抗體結(jié)合位于表1-3任一個(gè)中所列的AARS多肽獨(dú)特剪接點(diǎn)內(nèi)的表位，或者結(jié)合該剪接位點(diǎn)的C端氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，抗體拮抗AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。此類(lèi)拮抗劑可以任選地結(jié)合相應(yīng)的親本或全長(zhǎng)AARS。其他方面涉及生物測(cè)定系統(tǒng)，包含至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和結(jié)合所述AARS蛋白片段的結(jié)合配體，所述蛋白片段包含表1_3中所列的氨基酸序列。一方面，結(jié)合配體選自由以下組成的組:細(xì)胞表面受體蛋白、核酸、脂質(zhì)膜、細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄因子。任選地，此類(lèi)受體可以是細(xì)胞的部分，所述細(xì)胞優(yōu)選是與所揭示的切除蛋白生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞。

某些實(shí)施方案包括細(xì)胞組合物，包含:至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列；和工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼所述AARS蛋白片段的多核苷酸。一方面，所述細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。還包括檢測(cè)系統(tǒng)，包含:至少50或100個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列；包含與所述蛋白片段結(jié)合的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的細(xì)胞；和調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段和細(xì)胞外受體的結(jié)合或相互作用的小于約2000道爾頓的分子或第二多肽。特定實(shí)施方案包括診斷系統(tǒng)，包含:至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列；和包含與所述AARS蛋白片段結(jié)合的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的細(xì)胞，其中所述系統(tǒng)或細(xì)胞包含指示分子，所述指示分子允許檢測(cè)所述細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的水平或活性的變化。某些實(shí)施方案包括細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包含:至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列；工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼所述AARS蛋白片段的多核苷酸；至少約10升的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基；和無(wú)菌容器。在具體實(shí)施方案中，英語(yǔ)本文描述的方法或組合物的任何一種的細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基任選含有抗生素和誘導(dǎo)物。一些實(shí)施方案涉及反義或RNA干擾(RNAi)劑，包含靶向?qū)贡?_3中所列的AARS剪接變體的獨(dú)特剪接點(diǎn)的序列。還包括治療組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段特異性結(jié)合結(jié)合配體并且具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度。在一些方面，所述組合物可以具有小于IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。還包括組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，該蛋白片段與表1-3中所列的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度和小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)中，組合物可以包含就其表觀分子量而言是至少約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%單分散的AARS蛋白片段。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)的另一方面，組合物包含小于約10%(以蛋白基計(jì))高分子量聚集蛋白，或小于約5%高分子量聚集蛋白，或小于約4%高分子量聚集蛋白，或小于約3%高分子量聚集蛋白，或小于2%高分子量聚集蛋白，或小于約1%高分子量聚集蛋白。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)的另一方面，組合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于10%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于5%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于2%的聚集，或者在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于1%的聚集。某些實(shí)施方案包括組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和至少一個(gè)與之共價(jià)或非共價(jià)連接的部分，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述部分時(shí)可檢測(cè)的標(biāo)記物。在某些實(shí)施方案中，所述部分是水溶性聚合物。在某些實(shí)施方案中，所述部分是PEG。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)的一個(gè)方面，所述部分與所述蛋白片段的N端連接。在這些實(shí)施方案的任何一個(gè)的一個(gè)方面，所述部分與所述蛋白片段的C端連接。具體實(shí)施方案包括組合物，包含與至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段或其生物活性片段或變體連接的固體基底，所述蛋白片段包含表1-3中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度。還包括組合物，包含與表1-3中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段特異性結(jié)合的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合`劑具有至少約InM的對(duì)所述蛋白片段的親和力。一方面，所述結(jié)合劑結(jié)合位于表1-3任一個(gè)中所列的AARS多肽獨(dú)特剪接點(diǎn)內(nèi)的表位，或者結(jié)合該剪接位點(diǎn)的C端氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合劑拮抗AARS多肽的非規(guī)范活性。某些實(shí)施方案包括分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含本文所述的AARS蛋白片段的氨基酸序列、由本文所述的AARS多核苷酸編碼的氨基酸序列、或其變體或片段。某些AARS多肽包含與表1-3或表E2中公開(kāi)的AARS參照序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的氨基酸序列。某些AARS多肽基本上由與表1_3或表E2中公開(kāi)的AARS參照序列至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的氨基酸序列組成。在某些實(shí)施方案中，所述多肽包含非規(guī)范生物活性。在具體實(shí)施方案中，非規(guī)范生物活性選自:細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)(例如細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo))的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)、凋亡或細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細(xì)胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)、細(xì)胞攝取的調(diào)節(jié)、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、或分泌的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成或活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子受體活性的調(diào)節(jié)、和炎癥的調(diào)節(jié)。其他方面包括抗體和其他結(jié)合劑，其表現(xiàn)出本文描述的分離的AARS多肽、所述AARS多肽的結(jié)合配體或兩者復(fù)合物的結(jié)合特異性。在某些實(shí)施方案中，抗體或結(jié)合劑對(duì)AARS多肽的親和力比其對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X。在具體實(shí)施方案中，結(jié)合劑選自肽、肽模擬物、adnectin、適體和小分子。在某些實(shí)施方案中，抗體或結(jié)合劑拮抗AARS多肽的非規(guī)范活性。在其他實(shí)施方案中，抗體或結(jié)合劑激動(dòng)AARS多肽的非規(guī)范活性。某些實(shí)施方案包括分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含本文所述的AARS多核苷酸的核苷酸序列、編碼本文描述的AARS蛋白片段的核苷酸序列、或其變體、片段或互補(bǔ)物。某些AARS多核苷酸包含與表1-3或表E2中公開(kāi)的AARS參照多核苷酸至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的核苷酸序列或其互補(bǔ)物。在某些實(shí)施方案中，核苷酸序列是為細(xì)菌表達(dá)而密碼子優(yōu)化的。一方面，核苷酸序列與表E2中公開(kāi)的多核苷酸序列至少80%同一。具體的AARS多核苷酸由與表1-3或表E2中公開(kāi)的AARS參照多核苷酸至少80%、85%、90%、95%、98%或100%同一的核苷酸序列或其互補(bǔ)物組成。其他AARS多核苷酸包含與表1-3或表E2中公開(kāi)的AARS參照多核苷酸特異性雜交的核苷酸序列，或者基本由與表1_3或表E2中公開(kāi)的AARS參照多核苷酸特異性雜交的核苷酸序列組成。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸選自引物、探針和反義寡核苷酸。在具體實(shí)施方案中，引物、探針或反義寡核苷酸靶向AARS多核苷酸內(nèi)的特異性或獨(dú)特的剪接點(diǎn)、和/或該剪接位點(diǎn)的3'序列。某些實(shí)施方案包括測(cè)定樣品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性結(jié)合本文描述的AARS蛋白片段的一種或多種結(jié)合劑接觸，檢測(cè)所述結(jié)合劑的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS蛋白片段的存在或水平。其他實(shí)施方案包括測(cè)定樣品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括用能夠特異性鑒定本文描述的蛋白片段的檢測(cè)器分析所述樣品，并從而測(cè)定所述AARS蛋白片段的存在或水平。在具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)器是質(zhì)譜儀(MS)、流式細(xì)胞儀、蛋白成像設(shè)備、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或蛋白微陣列。某些實(shí)施方案包括將AARS蛋白片段的存在或水平與對(duì)照樣品或預(yù)定值相比較。某些實(shí)施方案包括表征樣品的狀態(tài)以使之與所述對(duì)照相區(qū)分。在具體實(shí)施方案中，樣品和對(duì)照包含細(xì)胞或組織，并且所述方法包括區(qū)分不同物種的細(xì)胞或組織、不同組織或器官的細(xì)胞、不同細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)的細(xì)胞、不同細(xì)胞分化狀態(tài)的細(xì)胞、不同生理狀態(tài)的細(xì)胞、或健康細(xì)胞與患病細(xì)胞。例如，選擇的切除蛋白可以在諸如應(yīng)激或刺激條件下更豐
邑O某些實(shí)施方案包括用于鑒定特異性結(jié)合本文描述的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體的一種或多種的化合物的發(fā)現(xiàn)方法和相關(guān)組合物，所述方法包括a)使所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體或兩者與至少一種測(cè)試化合物在適合條件下混合，并
b)檢測(cè)所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體或兩者與所述測(cè)試化合物的結(jié)合，從而鑒定特異性結(jié)合所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體或兩者的化合物。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物是多肽或肽、抗體或其抗原結(jié)合片段、肽模擬物或小分子。在某些實(shí)施方案中，測(cè)試化合物激動(dòng)所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體的非規(guī)范生物活性。在其他實(shí)施方案中，測(cè)試化合物拮抗所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配體的非規(guī)范生物活性。某些實(shí)施方案包括通過(guò)上述方法鑒定的化合物，例如激動(dòng)劑(例如，小分子、肽)。某些實(shí)施方案包括測(cè)定樣品中AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性雜交本文所述的AARS多核苷酸的一種或多種寡核苷酸接觸，檢測(cè)所述樣品中所述寡核苷酸的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平。其他實(shí)施方案包括測(cè)定樣品中AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性擴(kuò)增本文所述的AARS多核苷酸的至少兩種寡核苷酸接觸，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平。在具體實(shí)施方案中，所述寡核苷酸特異性雜交或特異性擴(kuò)增所述AARS剪接變體獨(dú)特的剪接點(diǎn)。某些實(shí)施方案包括將所述AARS蛋白片段或剪接變體的存在或水平與對(duì)照樣品或預(yù)定值相比較。某些實(shí)施方案包括表征所述樣品的狀態(tài)以使之與所述對(duì)照相區(qū)分。在具體實(shí)施方案中，所述樣品和對(duì)照包含細(xì)胞或組織，并且所述方法包括區(qū)分不同物種的細(xì)胞或組織、不同組織或器官的細(xì)胞、不同細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)的細(xì)胞、不同細(xì)胞分化狀態(tài)的細(xì)胞、或健康細(xì)胞與患病細(xì)胞。一些實(shí)施方案包括藥物組合物，包含本文所述的AARS多核苷酸、本文所述的AARS多肽、本文所述的結(jié)合劑或通過(guò)上述方法鑒定的或本文描述的化合物，和藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。某些實(shí)施方 案包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞活性的方法,所述方法包括使所述細(xì)胞與本文描述的AARS多核苷酸、本文描述的AARS多肽、本文描述的結(jié)合劑、上述方法或本文描述的化合物或本文描述的藥物組合物接觸。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞活性選自細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、凋亡或細(xì)胞死亡、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成、細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞攝取、細(xì)胞分泌、代謝、細(xì)胞因子生成或活性、細(xì)胞因子受體活性、基因轉(zhuǎn)錄和炎癥。一方面，所述細(xì)胞選自由以下組成的組:前脂肪細(xì)胞、骨髓、嗜中性粒細(xì)胞、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、充質(zhì)干細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在受試者中。某些實(shí)施方案包括治療受試者，其中所述受試者具有與腫瘤疾病相關(guān)的病癥、免疫系統(tǒng)疾病或病癥、感染性疾病、代謝疾病、炎性疾患、神經(jīng)元/神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肌肉/心血管疾病、與異常血細(xì)胞生成相關(guān)的疾病、與異常血管生成相關(guān)的疾病或與異常細(xì)胞存活相關(guān)的疾病。還包括制備藥物化合物的方法，包括:a)在包含表1-3中所列的氨基酸序列的至少120個(gè)氨基酸的AARS蛋白片段存在下進(jìn)行一種或多種候選化合物的體外篩選，以鑒定特異性結(jié)合所述AARS蛋白片段的化合物；b)使用步驟a)中鑒定的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的或生化或受體測(cè)定，以鑒定調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段的一種或多種非規(guī)范活性的化合物；c)任選地評(píng)估在步驟b)中鑒定的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)，以使其結(jié)構(gòu)與所述非規(guī)范活性的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)，并任選地衍生化所述化合物以改變其調(diào)節(jié)所述非規(guī)范活性的能力；和d)產(chǎn)生對(duì)于人類(lèi)使用而言足量的在步驟b)中鑒定的化合物或在步驟c)中衍生的化合物，從而制備所述藥物化合物。其他實(shí)施方案包括制備藥物化合物的方法，包括:a)在特異性結(jié)合表1-3的AARS蛋白片段的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分存在下進(jìn)行一種或多種候選化合物的體外篩選，以鑒定特異性結(jié)合所述細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的化合物；b)使用步驟a)中鑒定的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的或生化或受體測(cè)定，以鑒定調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段的一種或多種非規(guī)范活性的化合物；c)任選地評(píng)估在步驟b)中鑒定的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)，以使其結(jié)構(gòu)與所述非規(guī)范活性的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)，并任選地衍生化所述化合物以改變其調(diào)節(jié)所述非規(guī)范活性的能力；和d)產(chǎn)生對(duì)于人類(lèi)使用而言足量的在步驟b)中鑒定的化合物或在步驟C)中衍生的化合物，從而制備所述藥物化合物。一些實(shí)施方案包括細(xì)胞組合物，包含工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼異源全長(zhǎng)半胱氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白的多核苷酸，其中所述細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。一方面，所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含異源純化標(biāo)簽或表位標(biāo)簽以利于AARS蛋白片段的純化。另一方面，所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含異源蛋白水解位點(diǎn)以使AARS蛋白片段能夠在裂解時(shí)生成。一些實(shí)施方案包括在細(xì)胞內(nèi)原位生成表1-3或表E2所列的AARS多肽的方法，所述方法包括:i)在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源全長(zhǎng)半胱氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，其中所述細(xì)胞包含能夠裂解所述異源全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白以生成所述AARS多肽的蛋白酶。一些實(shí)施方案包括生成表1-3或表E2所列的AARS多肽的方法，所述方法包括使分離的全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白與能夠裂解所述異源全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白并產(chǎn)生AARS多肽的蛋白酶接觸。一些實(shí)施方案包括工程化的全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，包含能夠?qū)崿F(xiàn)表1-3或表E2任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段的蛋白水解生成的異源蛋白水解位點(diǎn)。一些實(shí)施方案包括組合物，包含分離的全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶蛋白，其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度，小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白，并且基本上沒(méi)有血清。一方面，所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶蛋白以至少10mg/mL的濃度存在,并且是至少90%單分散的。另一實(shí)施方案包括治療由tRNA合成酶的表達(dá)、活性或時(shí)空位置的異常調(diào)節(jié)介導(dǎo)的疾病或疾患的方法，所述方法通`過(guò)施用表1-3或表E2任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段或編碼所述ARRS蛋白片段的核酸。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，所述疾病選自癌癥、神經(jīng)病、糖尿病和炎性疾患。在特定實(shí)施方案中，所述疾病是腓骨肌萎縮癥2D型(CMT2D)或遠(yuǎn)端型脊肌萎縮癥5型(dSMA-V)。在特定實(shí)施方案中，所述疾病是CMT2D，并且所述至少一種癥狀包括降低的神經(jīng)傳導(dǎo)速度。在某些實(shí)施方案中，所述疾病是dSMA-V。在某些實(shí)施方案中，所述至少一種癥狀是肌肉無(wú)力。如上所述，還包括融合蛋白，包含表1-3任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段以及異源融合配體。在某些實(shí)施方案中，AARS融合蛋白基本上保留所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。在一些實(shí)施方案中，AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。在特定實(shí)施方案中，異源多肽連接所述AARS蛋白片段的N-端。在一些實(shí)施方案中，異源多肽連接所述AARS蛋白片段的C-端。在特定實(shí)施方案中，異源多肽選自由以下組成的組:純化標(biāo)簽、表位標(biāo)簽、靶向序列、信號(hào)肽、膜轉(zhuǎn)位序列和PK調(diào)節(jié)劑。還包括減輕或改善由酪氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)的突變、或不合適的子細(xì)胞締合、或過(guò)度表達(dá)、或子細(xì)胞分布介導(dǎo)的疾病癥狀的方法，包括向受試者施用特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分離的抗體或結(jié)合劑，其中所述抗體對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力比所述抗體對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X。在特定實(shí)施方案中，所述抗體或結(jié)合劑拮抗所述AARS多肽的非規(guī)范活性。發(fā)明詳述
目錄1.概述15I1.定義16II1.純化的AARS蛋白片段和變體28IV.AARS 多核苷酸61V.抗體74V1.抗體替代物和其他結(jié)合劑79VI1.生物測(cè)定和分析測(cè)定84VII1.表達(dá)和純化系統(tǒng)86IX.診斷方法和組合物99X.反義劑和RNAi劑115A.反義劑116B.RNA 干擾劑124X1.藥物發(fā)現(xiàn)132XI1.使用方法141XII1.藥物制劑、施用和藥盒148XIV.實(shí)施例1571.概述本發(fā)明至少部分涉及新的AARS多肽的發(fā)現(xiàn)，及其制備和使用方法，這代表天然野生型蛋白轉(zhuǎn)化成與天然存在的全長(zhǎng)酪氨酰tRNA合成酶基因相比表現(xiàn)出明顯不同特性的新形式。此類(lèi)AARS多肽的鑒定是基于廣泛序列和在不同組織中表達(dá)的酪氨酰tRNA合成酶的質(zhì)譜分析，隨后系統(tǒng)生成并測(cè)試每個(gè)潛在AARS多肽以鑒定代表穩(wěn)定且可溶的蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，其表現(xiàn)出新的生物活性和有利的治療藥物特性。基于該分析，已經(jīng)鑒定了源自酪氨酰tRNA合成酶的AARS多肽的至少兩個(gè)新家族。一方面，此類(lèi)酪氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含酪氨酰tRNA合成酶的氨基酸303-528的多肽序列。第二方面，此類(lèi)酪氨酰tRNA合成酶衍生的AARS多肽包括包含酪氨酰tRNA合成酶的氨基酸1-19+171-528的可選擇剪接的序列。這些新的AARS多肽家族代表了新的之前未知的蛋白產(chǎn)物，尤其表現(xiàn)出i)新的生物活性，ii)有利的蛋白穩(wěn)定性和聚集特性，和iii)在原核表達(dá)系統(tǒng)中以高水平表達(dá)和生成的能力，這些是未在完整的野生型蛋白中發(fā)現(xiàn)的顯著不同的特性。
I1.定義除非另外指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的含義相同的含義。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可以使用與本文所述的相似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了優(yōu)選的方法和材料。出于本發(fā)明的目的，下文定義了以下術(shù)語(yǔ)。本文使用冠詞“a (—個(gè))”和“an (—個(gè))”指一個(gè)或多于一個(gè)(即，指至少一個(gè))的該冠詞的語(yǔ)法對(duì)象。舉例來(lái)說(shuō)，“一個(gè)元件”表示一個(gè)元件或多于一個(gè)的元件?！凹s”表示與參照的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度相比，改變多達(dá)30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%的量、水平、值、數(shù)、頻率、百分比、尺
度、尺寸、數(shù)額、重量或長(zhǎng)度?！凹?dòng)劑”是指增強(qiáng)或模擬活性的分子。例如，AARS或另一蛋白的非規(guī)范生物活性。激動(dòng)劑可以包括蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或組合物，這些激動(dòng)劑通過(guò)與AARS或其結(jié)合配體直接相互作用或通過(guò)對(duì)AARS參與的生物途徑中的成分起作用來(lái)調(diào)節(jié)AARS的活性。包括部分激動(dòng)劑和完全激動(dòng)劑。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”意圖表示天然存在的和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類(lèi)似物和模擬物。天然存在的氨基酸包括蛋白生物合成中使用的20種(L)-氨基酸以及其他氨基酸，例如4-羥脯氨酸、羥賴(lài)氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鳥(niǎo)氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如(D)-氨基酸、正亮氨酸、正纈氨酸、P-氟苯丙氨酸、乙基硫氨酸等，其是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。氨基酸類(lèi)似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修飾形式。這種修飾可以包括例如取代或替代氨基酸上的化學(xué)基團(tuán)和部分，或者通過(guò)氨基酸的衍生化。氨 基酸模擬物包括例如表現(xiàn)出功能上類(lèi)似性質(zhì)的有機(jī)結(jié)構(gòu)，所述性質(zhì)例如參照氨基酸的電荷和電荷空間特性。例如，模擬精氨酸(Arg或R)的有機(jī)結(jié)構(gòu)具有位于類(lèi)似分子空間并且具有與天然存在的Arg氨基酸的側(cè)鏈的e-氨基相同程度的移動(dòng)性的正電荷部分。模擬物還包括約束結(jié)構(gòu)以維持氨基酸或氨基酸官能團(tuán)的最佳空間和電荷相互作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道或者可以確定什么結(jié)構(gòu)構(gòu)成功能上等效的氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物。在某些方面，非天然氨基酸的使用可用于修飾(例如增加)AARS蛋白片段的選定的非規(guī)范活性，或者改變蛋白的體內(nèi)或體外半衰期。可以使用非天然氨基酸來(lái)促進(jìn)AARS蛋白的(選擇性)化學(xué)修飾(例如，聚乙二醇化)。例如，某些非天然氨基酸允許聚合物例如PEG與給定蛋白連接，從而改善其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。氨基酸類(lèi)似物和模擬物的具體實(shí)例可以參見(jiàn)例如Roberts和Vellaccio, The Piptides:Analysis, Synthesis, Biology,編輯 Gross 和 Meinhofer,第 5 卷，ρ.341, AcademicPress, Inc., New York, N.Y.(1983),其全卷通過(guò)引用并入本文。其他實(shí)例包括全燒基化氨基酸，特別是全甲基化氨基酸。參見(jiàn)例如Combinatorial Chemistry,編輯WiIson 和 Czarnik, Ch.11，p.235，John Wiley& Sons Inc., New York, N.Y.(1997),其全書(shū)通過(guò)引用并入本文。而其他實(shí)例包括其酰胺部分(和因此，得到的肽的酰胺骨架)已經(jīng)被例如糖環(huán)、類(lèi)固醇、苯并二氮雜環(huán)庚烷或碳環(huán)所替代的氨基酸。參見(jiàn)例如，Burger’ s MedicinalChemistry and Drug Discovery,編輯 Manfred E.Wolff,Ch.15, pp.619-620, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y.(1995),其全書(shū)通過(guò)引用并入本文。用于合成肽、多肽、肽模擬物和蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5，420，109 ;M.Bodanzsky, Principles of Peptide Synthesis (第 I 版 & 第 2 修訂版)，Springer-Verlag, New York, N.Y.(1984 & 1993),見(jiàn)第 7 章;Stewart 和 Young, SolidPhase Peptide Synthesis,(第 2 版)，Pierce Chemical C0., Rockford, 111.(1984),其各自通過(guò)引用并入本文)。因此，本發(fā)明的AARS多肽可以由天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸類(lèi)似物和模擬物構(gòu)成。術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”指減小或減弱一種活性的分子。例如，AARS或另一蛋白的非規(guī)范活性生物活性。拮抗劑可以包括諸如抗體的蛋白、核酸、碳水化合物、小分子或任何其他化合物或組合物，這些拮抗劑通過(guò)與AARS或其結(jié)合配體直接相互作用或通過(guò)對(duì)AARS參與的生物途徑中的組分起作用來(lái)調(diào)節(jié)AARS或其結(jié)合配體的活性。包括部分和完全拮抗劑。術(shù)語(yǔ)“氨酰-tRNA合成酶”(AARS) —般指以其天然或野生型形式能夠催化特定氨基酸或其前體酯化成所有其相容的相關(guān)tRNA之一以形成氨酰-tRNA的酶。在這種“規(guī)范”活性中，氨酰-tRNA合成酶催化一個(gè)兩步驟反應(yīng):首先，它們通過(guò)形成氨酰-腺苷酸而活化其各自的氨基酸，其中氨基酸的羧基通過(guò)替代焦磷酸而與ATP的α -磷酸連接，然后，當(dāng)結(jié)合正確的tRNA時(shí)，氨酰-腺苷酸的氨酰基被轉(zhuǎn)移至tRNA的2’或3’末端0H。I類(lèi)氨酰-tRNA合成酶通常具有兩個(gè)高度保守的序列基序。這些酶在腺苷核苷酸的2’ -OH處氨基酰化，并且通常是單體或二聚體。II類(lèi)氨酰-tRNA合成酶通常具有三個(gè)高度保守的序列基序。這些酶在同一腺苷的3’ -OH處氨基酰化，并且通常是二聚體或四聚體。II類(lèi)酶的活性位點(diǎn)主要由側(cè)翼為α-螺旋的七鏈反平行β-片層構(gòu)成。盡管苯丙氨酸-tRNA合成酶是II類(lèi)，但是它在2’ -OH處氨基?；ARS多肽包括酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)、色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)、谷氨酰胺酰-tRNA合成酶(GlnRS)、甘氨酰-tRNA合成酶(GlyRS)、組氨酰-tRNA合成酶(HisRS)、絲氨酰-tRNA合成酶(SerRS)、苯丙氨酰-tRNA合成酶(PheRS)、丙氨酰-tRNA合成酶(AlaRS)、天冬酰胺酰-tRNA合成酶(AsnRS)、天冬氨酰-tRNA合成酶(AspRS)、半胱氨酰-tRNA合成酶(CysRS)、谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS)、脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)、精氨酰-tRNA合成酶(ArgRS)、異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)、亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)、賴(lài)氨酰-tRNA合成酶(LysRS)、蘇氨酰-tRNA合成酶(ThrRS)、甲硫氨酰-tRNA合成酶(MetRS)或纈氨酰-tRNA合成酶(ValRS)的線粒體和胞質(zhì)形式。這些AARS多肽的野生型或親本序列是本領(lǐng)域已知的?！熬幋a序列”表示負(fù)責(zé)編碼基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。與之相反，術(shù)語(yǔ)“非編碼序列”是指并非負(fù)責(zé)編碼基因的多肽產(chǎn)物的任何核酸序列。
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整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，除非上下文另外要求，詞語(yǔ)“包含(comprise) ”、“包含(comprises) ”和“包含(comprising) ”應(yīng)理解為意指包括陳述的步驟或元素或者步驟或元素的組，但不排除任何其他的步驟或元素或者步驟或元素的組。“由...組成”表示包括且限于跟隨在短語(yǔ)“由...組成”后的任何內(nèi)容。因此，短語(yǔ)“由...組成”表明所列出的元素是必需的或強(qiáng)制性的，并且可以不存在其他元素?！盎旧嫌?..組成”表示包括列在該短語(yǔ)后所列的任何元素，并限于不妨礙或不促進(jìn)在所列元素的公開(kāi)內(nèi)容中指明的活性或作用的其他元素。因此，短語(yǔ)“基本上由...組成”表明所列元素是必需的或強(qiáng)制性的，但其他元素是任選的，可以存在或可以不存在，這取決于它們是否實(shí)質(zhì)影響所列元素的活性或作用?！安缓瑑?nèi)毒素”或“基本不含內(nèi)毒素”的表述一般涉及含有至多痕量(例如，對(duì)受試者沒(méi)有臨床上不良的生理效應(yīng)的量)內(nèi)毒素并且優(yōu)選不可檢測(cè)的量的內(nèi)毒素的組合物、溶劑和/或容器。內(nèi)毒素是與某些細(xì)菌、通常是革蘭氏陰性細(xì)菌有關(guān)的毒素，但是內(nèi)毒素也可存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，例如產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌。最普遍的內(nèi)毒素是存在于各種革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，并且其代表了這些細(xì)菌引起疾病的能力的主要致病特征。人類(lèi)中的小量?jī)?nèi)毒素可以產(chǎn)生發(fā)熱、血壓降低和炎癥和凝血的激活，以及其他不良的生理效應(yīng)。
因此，在AARS多肽的藥物生產(chǎn)中，經(jīng)常希望從藥物產(chǎn)品和/或藥物容器去除大部分或所有痕量的內(nèi)毒素，因?yàn)榧词剐×恳部赡芤鹑祟?lèi)的不良反應(yīng)。除熱源的烘箱可用于該目的，因?yàn)槌^(guò)300°C的溫度通常是分解大多數(shù)內(nèi)毒素所需要的。例如，基于主要的包裝材料，例如注射器或管形瓶，250°C的玻璃溫度與30分鐘的維持時(shí)間的組合經(jīng)常足以實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素水平減少3個(gè)數(shù)量級(jí)?？紤]去除內(nèi)毒素的其他方法，包括例如色譜和過(guò)濾方法，如本文所述和本領(lǐng)域已知的。還包括在真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生AARS多肽并從中分離它們的方法，以減少(如果不是消除)本發(fā)明組合物中存在的內(nèi)毒素的風(fēng)險(xiǎn)。在無(wú)血清細(xì)胞中產(chǎn)生AARS多肽并從中分離它們的方法是優(yōu)選的。這種包含AARS多肽的組合物代表了新制劑，表現(xiàn)出污染了血清或內(nèi)毒素的AARS多肽組合物所沒(méi)有的新穎的生物和治療特性，血清或內(nèi)毒素具有結(jié)合AARS多肽并改變AARS多肽的新穎生物性質(zhì)的潛力?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的規(guī)范技術(shù)檢測(cè)內(nèi)毒素。例如,利用了鱟的血液的鱟變形細(xì)胞溶解物測(cè)定是用于測(cè)定內(nèi)毒素存在的非常靈敏的測(cè)定，并且基于該測(cè)定檢測(cè)內(nèi)毒素的試劑、試劑盒和儀器可商業(yè)途徑獲自例如LonzaGroup。在該測(cè)試中，非常低水平的LPS可以引起可檢測(cè)的鱟溶解物的凝結(jié)，這歸因于放大該反應(yīng)的強(qiáng)大的酶促級(jí)聯(lián)。還可以通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)定量?jī)?nèi)毒素。要成為基本上無(wú)內(nèi)毒素的，內(nèi)毒素水平可以小于約0.001、0.005、0.0U0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.08,0.09,0.U0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、
4、5、6、7、8、9或10EU/mg蛋白。通常，Ing脂多糖(LPS)對(duì)應(yīng)于約1-1OEU0在某些實(shí)施方案中，組合物中任何給定劑(例如，AARS蛋白片段)的“純度”可以是具體限定的。例如，某些組合物可以包含至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%純的劑，包括其間所有小數(shù)，例如但不限于通過(guò)高效液相色譜(HPLC)所測(cè)量的，高效液相色譜(HPLC)是生物化學(xué)和分析化學(xué)中用于分離、鑒定和定量化合物的常用公知形式的柱色譜。如本文所使用的，“功能”和“功能的”等術(shù)語(yǔ)是指生物學(xué)功能、酶血功能或治療功倉(cāng)泛。`“基因”表示可以占據(jù)染色體上的特定基因座的遺傳單元，并且由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和/或翻譯調(diào)節(jié)序列、和/或編碼區(qū)、和/或非翻譯序列(即，內(nèi)含子、5'和3'非翻譯序列)組成。“同源性”是指同一的或組成型保守取代的氨基酸的百分?jǐn)?shù)。同源性可以利用諸如GAP (Deveraux等人，1984，Nucleic acids Research 12，387-395)的序列比較程序來(lái)確定，其通過(guò)引用并入本文。通過(guò)這種方式，可以通過(guò)在比對(duì)中插入空位來(lái)比較與本文中所引用的序列相似或明顯不同長(zhǎng)度的序列，這種空位可以通過(guò)例如利用GAP的比較算法來(lái)確定。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括個(gè)體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是本發(fā)明的任何重組載體或分離的多核苷酸的接受者。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的子代，且由于天然的、偶然的或有意的突變和/或改變，該子代可以不必與原始的親代細(xì)胞完全一致(在形態(tài)學(xué)上或在總DNA互補(bǔ)物中)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的重組載體或多核苷酸在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)染或感染的細(xì)胞。包含本發(fā)明的重組載體的宿主細(xì)胞是重組宿主細(xì)胞?！胺蛛x的”表示基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含在其天然狀態(tài)下通常伴隨它的組分的物質(zhì)。例如，本文使用的“分離的多核苷酸”包括已經(jīng)從天然存在狀態(tài)中位于其側(cè)翼的序列中純化的多核苷酸，例如，從通常鄰近DNA片段的序列中移出所述片段。可選地，本文所用的“分離的肽”或“分離的多肽”等包括從其天然的細(xì)胞環(huán)境中以及從與細(xì)胞的其他組分的結(jié)合中體外分離和/或純化的肽或多肽分子，即，它明顯不與體內(nèi)物質(zhì)結(jié)合。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“mRNA”或有時(shí)稱(chēng)為“mRNA轉(zhuǎn)錄物”包括但不限于:前mRNA轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄加工中間體、準(zhǔn)備用于翻譯的成熟mRNA以及一個(gè)或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄物，或來(lái)源于mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酸。轉(zhuǎn)錄物加工可以包括剪接、編輯和降解。如本文所使用的，來(lái)源于mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酸是指所述mRNA轉(zhuǎn)錄物或其子序列被最終用作模板所合成的核酸。從mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，從該cDNA轉(zhuǎn)錄的RNA，從該cDNA擴(kuò)增的DNA，從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA等都是來(lái)源于該mRNA的轉(zhuǎn)錄物，并且多這種來(lái)源的產(chǎn)物的檢測(cè)能指示樣品中原始轉(zhuǎn)錄物的存在和/或豐度。因此，mRNA來(lái)源的樣品包括但不限于，一個(gè)或多個(gè)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物、從該mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA、從該cDNA轉(zhuǎn)錄的cRNA、從基因擴(kuò)增的DNA、從擴(kuò)增的DNA轉(zhuǎn)錄的RNA 等。本文使用的“非規(guī)范的”活性通常是指i)本發(fā)明的AARS多肽所具有的新活性，而在任何顯著程度上，完整的全長(zhǎng)親本蛋白不具有該活性，或ii)完整的天然全長(zhǎng)親本蛋白所具有的活性，其中AARS多肽與完整的天然全長(zhǎng)親本蛋白相比表現(xiàn)出顯著更高(即，至少大20%)的比活性，或者表現(xiàn)出新環(huán)境中的活性；例如，與完整的天然全長(zhǎng)親本蛋白具有的其他活性相獨(dú)立的活 性。在AARS多肽的情況下，非規(guī)范活性的非限制性實(shí)例包括細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)、RNA結(jié)合、氨基酸結(jié)合、細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)(例如血細(xì)胞生成、神經(jīng)發(fā)生、肌發(fā)生、骨發(fā)生和脂肪生成)、基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡或其它形式的細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞攝取或分泌的調(diào)節(jié)、血管生成的調(diào)節(jié)、細(xì)胞結(jié)合的調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子產(chǎn)生或活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子受體活性的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)等。術(shù)語(yǔ)“半數(shù)有效濃度”或“EC5(I”指本文所述的AARS蛋白片段、抗體或其他劑在一段指定的暴露時(shí)間之后誘導(dǎo)介于基線和最大值中間的響應(yīng)的濃度；因此，分級(jí)劑量響應(yīng)曲線的EC5tl代表觀察到其最大效應(yīng)的50%時(shí)的化合物濃度。在某些實(shí)施方案中，本文提供的劑的EC5tl是與如上所述的“非規(guī)范”活性相關(guān)的。EC5tl還代表在體內(nèi)獲得最大效應(yīng)的50%所需的血漿濃度。類(lèi)似地，“EC9(I”指觀察到其最大效應(yīng)的90%時(shí)的劑或化合物的濃度?！癊C9Q”可以從“EC5(I”和Hill斜率計(jì)算，或者可以使用本領(lǐng)域的規(guī)范知識(shí)從數(shù)據(jù)直接確定。在一些實(shí)施方案中，AARS蛋白片段、抗體或其他劑的EC5tl小于約0.01,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4、0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、
40、50、60、70、80、90或ΙΟΟηΜ。優(yōu)選地，生物治療組合物將具有約InM或更小的EC5tl值。術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”包括與對(duì)照相比，通常以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著或生理上顯著的量“增加”或“刺激”，以及“減少”或“降低”。因此，根據(jù)使用條件，“調(diào)節(jié)劑”可以是激動(dòng)劑、拮抗劑或其任何混合物?！霸黾拥摹被颉疤岣叩摹绷客ǔＪ恰敖y(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”量，并且可以包括沒(méi)有組合物(缺乏試劑或化合物)或有對(duì)照組合物時(shí)所產(chǎn)生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
15、20、30或更大倍數(shù)(例如，500、1000倍)(包括其間大于I的所有整數(shù)和小數(shù)，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加?！皽p少的”或降低的量通常是“統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”量，并且可以包括沒(méi)有組合物(缺乏試劑或化合物)或有對(duì)照組合物時(shí)所產(chǎn)生的量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的降低，包括其間所有整數(shù)。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，比較規(guī)范和非規(guī)范活性時(shí)的對(duì)照可能包括與其相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS相比感興趣的AARS蛋白片段，或者具有與其相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS相當(dāng)?shù)囊?guī)范活性的片段AARS?！敖y(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的”量的其他實(shí)例在下文描述?！矮@自”表示諸如例如，多核苷酸提取物或多肽提取物的樣品分離自或源自受試者的特定來(lái)源。例如，提取物可以獲自從受試者直接分離的組織或生物流體。“源自”或“獲自”還可以指多肽或多核苷酸序列的來(lái)源。例如，本發(fā)明的AARS序列可以“源自”AARS蛋白水解片段或AARS剪接變體或其部分的序列信息，不管它們是天然存在的還是人工產(chǎn)生的，并因此可以包括該序列，基本上由該序列組成，或者由該序列組成。術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成的和天然存在的類(lèi)似物。因此，這些術(shù)語(yǔ)適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸(諸如相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類(lèi)似物)的氨基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化學(xué)衍生物。此類(lèi)衍生物包括例如翻譯后修飾和降解產(chǎn)物，包括AARS參照片段的焦谷氨酰、異天冬氨酰、蛋白水解的、磷酸化的、糖基化的、氧化的、異構(gòu)化的和脫氨基化的變體。本文所用的表述“序列同一性”或者例如包含“與...50%同一的序列”指序列在比較窗內(nèi)在逐個(gè)核苷酸基礎(chǔ)或逐個(gè)氨基酸基礎(chǔ)上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可以通過(guò)以下來(lái)計(jì)算:在比較窗中比較兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列，確定兩條序列中出現(xiàn)的相同的核酸堿基(例如A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe> Tyr> Trp> Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys 和 Met)的位置數(shù)量以得到匹配位置數(shù)，將該匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)(即，窗大小)，并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。用于描述兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸或多肽間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“參照序列”、“比較窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”?！皡⒄招蛄小钡拈L(zhǎng)度為至少12個(gè)，但通常是15至18個(gè)，經(jīng)常是至少25個(gè)單體單元(包括核苷酸和氨基酸殘基)。因?yàn)閮蓚€(gè)多核苷酸各自可以`包含(I)在兩個(gè)多核苷酸間相似的序列(即，完整多核苷酸序列的僅一部分)和(2)在兩個(gè)多核苷酸間不同的序列，兩個(gè)(或更多個(gè))多核苷酸間的序列比較通常通過(guò)比較“比較窗”中的兩個(gè)多核苷酸的序列來(lái)進(jìn)行以鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域?！氨容^窗”指至少6個(gè)連續(xù)位置、通常為約50至約100個(gè)、更通常約100至150個(gè)的連續(xù)位置的概念節(jié)段，其中在一序列與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參照序列最優(yōu)比對(duì)后，將該序列與參照序列比較。比較窗可以包含與參照序列(其不包含添加或缺失)相比約20%或更少的添加或缺失(即空位)用于兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)。用于比對(duì)比較窗的序列的最優(yōu)比對(duì)可以通過(guò)算法的計(jì)算機(jī)運(yùn)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包發(fā)行版 7.0 (Genetics Software Package Release 7.0)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison,WI,USA)或通過(guò)目視檢查以及選擇的各種方法的任一種產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即，產(chǎn)生整個(gè)比較窗的最高同源性百分比)來(lái)實(shí)施。例如Altschul等人，1997, Nucl.Acids Res.25:3389公開(kāi)的BLAST程序家族也可以作為參考?？梢栽?Ausubel 等人，“Current Protocols in Molecular Biology, ^John Wiley &Sonslnc, 1994-1998,第15章的19.3單元中找到序列分析的詳細(xì)討論。兩序列間的序列相似性或序列同一性(術(shù)語(yǔ)在本文可互換使用)的計(jì)算如下實(shí)施。為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸序列的同一性百分比，出于最優(yōu)比較的目的，將序列比對(duì)(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一個(gè)或兩者中引入空位以用于最優(yōu)比對(duì)，出于比較目的，可以不管非同源性序列)。在某些實(shí)施方案中，出于比較目的比對(duì)的參照序列的長(zhǎng)度是參照序列的長(zhǎng)度的至少30%，優(yōu)選至少40%，更優(yōu)選至少50%、60%和甚至更優(yōu)選至少70%、80%、90%、100%ο然后比較在對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)在第一序列的一個(gè)位置被與在第二序列的對(duì)應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置是同一的。兩序列間的同一性百分比是被所述序列共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，將空位數(shù)和每一空位的長(zhǎng)度考慮在內(nèi)，其需要被引入用于兩序列的最優(yōu)比對(duì)。兩序列間的序列比較和同一性百分比的確定可以利用數(shù)學(xué)算法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩氨基酸序列間的同一性百分比利用已并入GCG軟件包(可以在http://www.gcg.com 得到)的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch 算法(1970, J.Mo1.Biol.48:444-453)來(lái)確定，利用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，空位權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4以及長(zhǎng)度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩核苷酸序列間的同一'I"生百分比利用GCG軟件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序來(lái)確定，利用NWSgapdna.CMP矩陣和40、50、60、70或80的空位權(quán)重以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重。特別優(yōu)選組的參數(shù)(除非特別指明，應(yīng)該利用的一組)是Blossum 62得分矩陣，空位罰分為12，空位延伸罰分為4，以及移碼空位罰分為5。兩氨基酸或核苷酸序列之間的同一性百分比可以利用E.Meyers和ff.Miller (1989, Cabios,4:11-17)的算法來(lái)確定，該算法并入ALIGN程序(2.0版)中，利用PAM120權(quán)重殘基表，空位長(zhǎng)度罰分為12，空位罰分為4。本文描述的核酸和蛋白序列可以用作“查詢(xún)序列”以進(jìn)行對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，例如，以鑒定其他家族成員或相關(guān)序列?？梢岳肁ltschul，等人，(1990，J.Mol.Biol, 215:403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)進(jìn)行這類(lèi)檢索?？梢岳肗BLAST程序，得分=100，字長(zhǎng)=12來(lái)進(jìn)行BLAST核苷酸檢索以獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢岳肵BLAST程`序，得分=50，字長(zhǎng)=3來(lái)進(jìn)行BLAST蛋白檢索以獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的帶空位的比對(duì)，可以利用Altschul 等人，(1997，Nucleic acids Res, 25:3389-3402)中描述的帶空位的 BLAST。當(dāng)利用BLAST和帶空位的BLAST程序時(shí)，可以利用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)中的缺省參數(shù)。術(shù)語(yǔ)“溶解度”指本文提供的劑在液體溶劑中溶解并形成均質(zhì)溶液的性質(zhì)。溶解度通常表示為濃度，借助每單位體積溶劑的溶質(zhì)質(zhì)量(g溶質(zhì)/kg溶劑、g/dL (IOOmL) >mg/ml等)、摩爾濃度、重量克分子濃度、摩爾分?jǐn)?shù)或其他類(lèi)似的濃度描述。在指定條件下，單位量的溶劑可以溶解的溶質(zhì)的最大平衡量是該溶質(zhì)在該溶劑中的溶解度，所述指定條件包括溫度、壓力、pH和溶劑性質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，在生理pH下測(cè)量溶解度。在某些實(shí)施方案中，在水或生理緩沖液例如PBS中測(cè)量溶解度。在某些實(shí)施方案中，在諸如血液或血清的生物液體(溶劑)中測(cè)量溶解度。在某些實(shí)施方案中，溫度可以是約室溫(例如，約20、21、
22、23、24、25°C )或約體溫(37°C )。在某些實(shí)施方案中，諸如AARS蛋白片段的劑在室溫或37°C 下具有至少約 0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25 或 30mg/ml 的溶解度。本文所使用的“剪接點(diǎn)”包括成熟mRNA轉(zhuǎn)錄物或所編碼的多肽中第一個(gè)外顯子的3’端與第二個(gè)外顯子的5’端連接的區(qū)域。該區(qū)域的大小可以變化，并在一個(gè)外顯子的3’端與另一個(gè)外顯子的5’端連接處的確切殘基的任一端可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或
更多個(gè)(包括其間所有整數(shù))核苷酸或氨基酸殘基?！巴怙@子”指已經(jīng)通過(guò)順式剪接移除前體RNA的一部分(內(nèi)含子)或已經(jīng)通過(guò)反式剪接將兩個(gè)或更多個(gè)前體RNA分子連接在一起后，在成熟形式的RNA分子中呈現(xiàn)的核酸序列。成熟RNA分子可以是信使RNA或諸如rRNA或tRNA的非編碼RNA的功能形式。取決于上下文，外顯子可以指DNA或其RNA轉(zhuǎn)錄物中的序列?！皟?nèi)含子”指基因中不翻譯成蛋白的非編碼核酸區(qū)域。非編碼的內(nèi)含子節(jié)段被轉(zhuǎn)錄到前體mRNA(前mRNA)和某些其他RNA(例如長(zhǎng)的非編碼RNA)中，并隨后在加工為成熟RNA的過(guò)程中通過(guò)剪接去除。

“剪接變體”指通過(guò)選擇性剪接產(chǎn)生的成熟mRNA或其編碼的蛋白，所述選擇性剪接是指在RNA剪接期間，RNA(初級(jí)基因轉(zhuǎn)錄物或前mRNA)的外顯子以多種途徑重新連接的過(guò)程。所得的不同mRNA可以翻譯成不同的蛋白異構(gòu)體，從而允許單一基因編碼多種蛋白。本文所用的“受試者”包括呈現(xiàn)能夠用本發(fā)明的AARS多核苷酸或多肽治療或診斷的癥狀或處于呈現(xiàn)該癥狀風(fēng)險(xiǎn)中的任何動(dòng)物。還包括為診斷或其他目的需要描繪本發(fā)明AARS多肽和/或多核苷酸水平的受試者。合適的受試者(患者)包括實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物(諸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、和家養(yǎng)動(dòng)物或?qū)櫸?諸如貓或狗)。包括非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和優(yōu)選人類(lèi)患者。如本文所用的治療(treatment) ”或“治療(treating) ”包括對(duì)能夠被本文所述的AARS多核苷酸或多肽的非規(guī)范活性影響的疾病或病癥的癥狀或病理產(chǎn)生的任何期望的效應(yīng)，并且可以包括被治療的疾病或病癥的一個(gè)或多個(gè)可測(cè)量的標(biāo)志物的甚至極小的變化或改善。還包括與非AARS療法相關(guān)的治療,其中本文所述的AARS序列提供治療的臨床標(biāo)志物?！爸委?treatment) ”或“治療(treating) ”并不必然表示疾病或病癥或其相關(guān)癥狀的徹底根除或治愈。接受該治療的受試者是有相應(yīng)需要的任何受試者。臨床改善的示例性標(biāo)志物對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。除非文中有明確相反指示，本發(fā)明的實(shí)施可利用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的規(guī)范分子生物學(xué)方法和重組DNA技術(shù)，為了說(shuō)明的目的，其中很多方法和技術(shù)在下文進(jìn)行了描述。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有充分的講解。參見(jiàn)，例如Sambrook,等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第 3 版，2000) ；DNA Cloning:A Practical Approach,第I & II 卷(D.Glover 編輯)；01igonucleotide Synthesis (N.Gait 編輯，1984)；Oligonucleotide Synthesis:Methods and Applications(P.Herdewijn 編輯,2004)；Nucleic acidHybridization(B.Hames & S.Higgins 編輯,1985) ；Nucleic acidHybridization:Modern Applications (Buzdin and Lukyanov編輯，2009) !TranscriptionandTranslation(B.Hames & S.Higgins 編輯,1984) ；Animal Cell Culture(R.Freshney, ed.,1986) ；Freshney,R.1.(2005)Culture of Animal Cells, a ManualofBasic Technique,第 5 版.Hoboken NJ, John Wiley & Sons ；B.Perbal, APracticalGuide to Molecular Cloning (第 3 版 2010) ；Farrell, R., RNAMethodologies:ALaboratory Guide for Isolation and Characterization(第 3 版 2005)，Methodsof Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and PhysicalAnalysis ofDNA Methods in Enzymology, Academic Press ；Using Antibodies: A LaboratoryManual:PortabIe Protocol N0.1, Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow(1999, ColdSpring Harbor Laboratory Press, ISBN0-87969-544-7) ；Antibodies:A LaboratoryManual, Ed Harlow (編輯)，DavidLane (編輯)(1988，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, ISBN 0-87969-3, 4-2), 1855.Handbook of Drug Screening,RamakrishnaSeethala, Prabhavathi B.Fernandes 編輯(2001，New York, N.Y., Marcel Dekker, ISBN0-8247-0562-9);和 Lab Ref:A Handbook of Recipes, Reagents, and Other ReferenceTools forUse at the Bench,編輯 Jane Roskams 和 Linda Rodgers, (2002, ColdSpringHarbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3)。本文引用的所有出版物 、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文。II1.用于治療劑和其他應(yīng)用的純化的AARS蛋白片段和變體令人驚訝地，不同于僅知道其氨?；钚缘钠淙L(zhǎng)親本序列，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AARS片段具有對(duì)于生物治療、發(fā)現(xiàn)和診斷應(yīng)用重要的生物活性。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括氨酰-tRNA合成酶(AARS)的全長(zhǎng)蛋白、成熟蛋白同種型和蛋白片段及其生物活性變體和片段。在某些實(shí)施方案中，蛋白和片段可以通過(guò)內(nèi)源性蛋白水解、體外蛋白水解、剪接變化或計(jì)算機(jī)模擬預(yù)測(cè)以及其他機(jī)制產(chǎn)生。本文描述的AARS蛋白片段及其變體可以具有至少一種“非規(guī)范”生物活性。本發(fā)明的AARS蛋白片段在本文還稱(chēng)為“AARS多肽”或“AARS參照多肽”。在某些實(shí)施方案中，本文提供的AARS多肽包括以下或主要由以下組成:以下表1-3列出的AARS多肽“參照序列”的全部或一部分，其代表各種酪氨酰tRNA合成酶片段的氨基酸序列。小鼠和人AARS蛋白序列是高度相關(guān)的，通常在完整序列、特定結(jié)構(gòu)域或特定蛋白片段內(nèi)相差不超過(guò)幾個(gè)氨基酸。
權(quán)利要求
1.一種組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度，小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白，并且基本上沒(méi)有血清。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段包含與選自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
3.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段包含非規(guī)范生物活性。
4.權(quán)利要求3所述的組合物，其中所述非規(guī)范生物活性選自:細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、嗜中性粒細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附或趨化的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成或活性的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)、和細(xì)胞因子受體活性的調(diào)節(jié)。
5.權(quán)利要求4所述的組合物，其中所述非規(guī)范生物活性是基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段與異源多肽融合。
7.權(quán)利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
8.權(quán)利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
9.權(quán)利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的N端連接。
10.權(quán)利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的C端連接。
11.權(quán)利要求6所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽選自:純化標(biāo)簽、表位標(biāo)簽、靶向序列、信號(hào)肽、膜易位序列、和PK調(diào)節(jié)物。
12.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物包含濃度為最少約10mg/mL的AARS蛋白片段。
13.權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%單分散的。
14.權(quán)利要求12或13所述的組合物，其中所述組合物包含小于約3%的高分子量聚集蛋白。
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述組合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集。
16.一種組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段與表1_3任一個(gè)中所列的氨基酸序列相差約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11個(gè)氨基酸的置換、缺失和/或添加，其中改變的蛋白片段基本上保持未改變的蛋白的非規(guī)范活性，其中所述蛋白片段具有至少約10mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度，小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白，并且基本上沒(méi)有血清污染。
17.—種組合物，包含特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分離的抗體，其中所述抗體對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力比所述抗體對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X，并且其中所述抗體拮抗所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
18.—種組合物，包含特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分離的抗體，其中所述抗體具有至少約IOnM的對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力，和至少約IOOnM的對(duì)相應(yīng)全長(zhǎng)AARS多肽的親和力。
19.權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗體結(jié)合位于表1-3任一個(gè)中所列的AARS多肽獨(dú)特剪接點(diǎn)內(nèi)的表位，或者結(jié)合該剪接位點(diǎn)的C端氨基酸序列。
20.權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗體結(jié)合包含選自以下的至少 5 個(gè)連續(xù)氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.48,SEQ.1D.N0.50,SEQ.1D.N0.52,SEQ.1D.N0.54、和SEQ.1D.N0.56。
21.權(quán)利要求17或18中任一項(xiàng)所述的組合物，其拮抗所述AARS多肽的非規(guī)范活性。
22.—種生物測(cè)定系統(tǒng)，包含至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和結(jié)合所述AARS蛋白片段的結(jié)合配偶體，所述蛋白片段包含表1_3任一個(gè)中所列的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22所述的生物測(cè)定系統(tǒng)，其中所述結(jié)合配偶體選自:細(xì)胞表面受體蛋白、核酸、脂質(zhì)膜、細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄因子。
24.權(quán)利要求22所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段包含與選自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
25.—種細(xì)胞組合物，包含:至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列；和工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼 所述AARS蛋白片段的多核苷酸，其中所述細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
26.—種檢測(cè)系統(tǒng)，包含:至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列；包含結(jié)合所述蛋白片段的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的細(xì)胞；和調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段和細(xì)胞外受體的結(jié)合或相互作用的小于約2000道爾頓的分子或第二多肽。
27.—種診斷系統(tǒng)，包含:至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列；和包含特異性結(jié)合所述AARS蛋白片段的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的細(xì)胞,其中所述細(xì)胞包含指示分子,所述指示分子允許檢測(cè)所述細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的水平或活性的變化。
28.—種細(xì)胞生長(zhǎng)裝置，包含:至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列；工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼所述AARS蛋白片段的多核苷酸；至少約10升的無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基；和無(wú)菌容器。
29.一種反義或RNA干擾(RNAi)劑，包含靶向?qū)贡?_3任一個(gè)中所列的AARS剪接變體的獨(dú)特剪接點(diǎn)的序列。
30.一種治療組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段特異性結(jié)合結(jié)合配偶體以發(fā)揮生理效應(yīng)并且具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度和小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。
31.權(quán)利要求29所述的治療組合物，其中所述AARS蛋白片段包含與選自以下的序列至少 90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12,SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32,SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
32.權(quán)利要求29或30所述的治療組合物，其中所述結(jié)合配偶體選自:細(xì)胞表面受體、核酸、脂質(zhì)膜、調(diào)節(jié)蛋白、酶和轉(zhuǎn)錄因子。
33.權(quán)利要求29或30所述的治療組合物，其中所述AARS蛋白片段與異源多肽融合。
34.權(quán)利要求32所述的治療組合物，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
35.權(quán)利要求32所述的治療組合物，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
36.權(quán)利要求32所述的治療組合物，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的N端連接。
37.權(quán)利要求32所述的治療組合物，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的C端連接。
38.權(quán)利要求32所述的治療組合物，其中所述異源多肽選自:純化標(biāo)簽、表位標(biāo)簽、靶向序列、信號(hào)肽、膜易位序列、和PK調(diào)節(jié)物。
39.權(quán)利要求29-30中任一`項(xiàng)所述的治療組合物，其中所述組合物包含濃度為最少約10mg/mL的AARS蛋白片段。
40.權(quán)利要求29-30中任一項(xiàng)所述的治療組合物，其中所述AARS蛋白片段是至少90%單分散的。
41.權(quán)利要求39所述的治療組合物，其中所述組合物包含小于約3%的高分子量聚集蛋白。
42.權(quán)利要求39所述的治療組合物，其中所述組合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集。
43.一種組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段，所述蛋白片段與表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度和小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白。
44.一種組合物，包含至少120個(gè)氨基酸的基本上純的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段和至少一個(gè)與之共價(jià)或非共價(jià)連接的部分，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列。
45.權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述AARS蛋白片段包含與選自以下的序列至少90% 同一的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
46.權(quán)利要求42或43所述的組合物，其中所述部分是可檢測(cè)的標(biāo)記物。
47.權(quán)利要求42或43所述的組合物，其中所述部分是水溶性聚合物。
48.權(quán)利要求42或43所述的組合物，其中所述水溶性聚合物是PEG。
49.權(quán)利要求42或43所述的組合物，其中所述部分與所述蛋白片段的N端連接。
50.權(quán)利要求42或43所述的組合物，其中所述部分與所述蛋白片段的C端連接。
51.—種組合物，包含與至少120個(gè)氨基酸的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段連接的固體基底，所述蛋白片段包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列，其中所述蛋白片段具有至少約5mg/mL的溶解度，并且所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度。
52.—種組合物，包含特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的結(jié)合劑，其中所述結(jié)合劑具有至少約InM的對(duì)所述蛋白片段的親和力。
53.權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述結(jié)合劑結(jié)合位于表1-3任一個(gè)中所列的AARS多肽獨(dú)特剪接點(diǎn)內(nèi)的表位，或者結(jié)合該剪接位點(diǎn)的C端氨基酸序列。
54.權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述結(jié)合劑結(jié)合包含選自以下的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.48、SEQ.1D.N0.50、SEQ.1D.N0.52、SEQ.1D.N0.54、和 SEQ.1D.N0.56。
55.權(quán)利要求52所述的組合物，其拮抗所述AARS多肽的非規(guī)范活性。
56.一種分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，包含表1_3任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段的氨基酸序列。
57.權(quán)利要求56所述的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽包含選自以下的氨基酸序列:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
58.一種分離的氨酰 -tRNA合成酶(AARS)多肽，包含與表1_3任一個(gè)中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或 100% 同一的氨基酸序列。
59.權(quán)利要求58所述的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽選自:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
60.一種分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，基本上由與表1_3任一個(gè)中的序列至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的氨基酸序列組成。
61.權(quán)利要求60所述的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽，其中所述AARS多肽選自:SEQ.1D.N0.12、SEQ.1D.N0.14、SEQ.1D.N0.32、SEQ.1D.N0.34、SEQ.1D.N0.36、和 SEQ.1D.N0.38。
62.權(quán)利要求61所述的多肽，其中所述多肽包含非規(guī)范生物活性。
63.權(quán)利要求62所述的多肽，其中所述非規(guī)范生物活性選自:細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、嗜中性粒細(xì)胞活化的調(diào)節(jié)、細(xì)胞粘附或趨化的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子生成或活性的調(diào)節(jié)、炎癥的調(diào)節(jié)、和細(xì)胞因子受體活性的調(diào)節(jié)。
64.權(quán)利要求63所述的多肽，其中所述非規(guī)范生物活性是轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。
65.權(quán)利要求62所述的多肽，其中所述AARS蛋白片段與異源多肽融合。
66.權(quán)利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白基本上保持所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
67.權(quán)利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述AARS融合蛋白抑制所述AARS蛋白片段的非規(guī)范活性。
68.權(quán)利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的N端連接。
69.權(quán)利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽與所述AARS蛋白片段的C端連接。
70.權(quán)利要求65所述的AARS融合蛋白，其中所述異源多肽選自:純化標(biāo)簽、表位標(biāo)簽、靶向序列、信號(hào)肽、膜易位序列、和PK調(diào)節(jié)物。
71.權(quán)利要求62所述的組合物，其中所述組合物包含濃度為最少約10mg/mL的AARS蛋白片段。
72.權(quán)利要求62所述的組合物，其中所述組合物包含至少90%單分散的AARS蛋白片段。
73.權(quán)利要求62所述的組合物，其中所述組合物包含小于約3%的高分子量聚集蛋白。
74.權(quán)利要求62所述的治療組合物，其中所述組合物在4°C下在PBS中以至少10mg/mL的濃度保存I周時(shí)表現(xiàn)出小于3%的聚集。
75.一種抗體，其表現(xiàn)出對(duì)權(quán)利要求60所述的分離的AARS多肽、所述AARS多肽的結(jié)合配偶體、或兩者的結(jié)合特異性，其中所述抗體對(duì)所述AARS多肽的親和力比所述抗體對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X。
76.權(quán)利要求75所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合位于表1-3任一個(gè)中所列的AARS多肽獨(dú)特剪接點(diǎn)內(nèi)的表位，或者結(jié)合該剪接位點(diǎn)的C端氨基酸序列。
77.權(quán)利要求75或76中任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合包含選自以下的至少5 個(gè)連續(xù)氨基酸的表位:SEQ.1D.N0.48、SEQ.1D.N0.50、SEQ.1D.N0.52、SEQ.1D.N0.54、和SEQ.1D.N0.56。
78.一種抗體，其與權(quán)利要求75至77中任一項(xiàng)所述的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分離的AARS多肽。
79.—種結(jié)合劑，其表現(xiàn)出對(duì)權(quán)利要求62所述的分離的AARS多肽或所述AARS多肽的結(jié)合配偶體的結(jié)合特異性。
80.權(quán)利要求79所述的結(jié)合劑,選自肽、可溶性受體、adnectin、小分子、和適配體。
81.權(quán)利要求75-80中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合劑，其拮抗所述AARS多肽的非規(guī)范活性。
82.權(quán)利要求75-80中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合劑，其激動(dòng)所述AARS多肽的非規(guī)范活性。
83.一種分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含編碼表1_3任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段的核苷酸序列，其具有至少80%序列同一性的變體，其片段，或互補(bǔ)物。
84.權(quán)利要求83所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列與選自以下的序列至少80%同一:SEQ.1D.N0.13、SEQ.1D.N0.15、SEQ.1D.N0.33、SEQ.1D.N0.35、SEQ.1D.N0.37、和 SEQ.1D.N0.39。
85.權(quán)利要求83所述的多核苷酸，其中所述核苷酸序列是為細(xì)菌表達(dá)而密碼子優(yōu)化的。
86.權(quán)利要求85所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸與選自以下的序列至少80%同一:SEQ.1D.N0.66、SEQ.1D.N0.67、SEQ.1D.N0.68、和 SEQ.1D.N0.69。
87.權(quán)利要求83所述的多核苷酸，包含與之至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的核苷酸序列，或其互補(bǔ)物。
88.權(quán)利要求83所述的多核苷酸，基本上由與之至少80%、85%、90%、95%、98%、或100%同一的核苷酸序列或其互補(bǔ)物組成。
89.—種分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多核苷酸，包含與權(quán)利要求83所述的多核苷酸特異性雜交的核苷酸序列。
90.權(quán)利要求89所述的多核苷酸，選自引物、探針、和反義寡核苷酸。
91.權(quán)利要求90所述的多核苷酸，其與所述AARS多核苷酸的獨(dú)特剪接點(diǎn)特異性雜交。
92.一種測(cè)定樣品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段的一種或多種結(jié)合劑接觸，檢測(cè)所述結(jié)合劑的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS蛋白片段的存在或水平。
93.一種測(cè)定樣品中AARS蛋白片段的存在或水平的方法，所述方法包括用能夠特異性鑒定表1-3任一個(gè)中所列的蛋白片段的檢測(cè)器分析所述樣品，并從而測(cè)定所述AARS蛋白片段的存在或水平。
94.權(quán)利要求93所述的方法，其中所述檢測(cè)器是質(zhì)譜儀(MS)、流式細(xì)胞儀、蛋白成像設(shè)備、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、或蛋白微陣列。
95.一種測(cè)定樣品中AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性雜交權(quán)利要求83所述的AARS多核苷酸的一種或多種寡核苷酸接觸，檢測(cè)所述樣品中所述寡核苷酸的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平。
96.一種測(cè)定樣品中AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平的方法，所述方法包括使所述樣品與特異性擴(kuò)增權(quán)利要求83所述的AARS多核苷酸的至少兩種寡核苷酸接觸，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在或不存在，并從而測(cè)定所述AARS剪接變體的多核苷酸序列的存在或水平。`
97.權(quán)利要求95或96所述的方法，其中所述寡核苷酸特異性雜交或特異性擴(kuò)增所述AARS剪接變體獨(dú)特的剪接點(diǎn)。
98.權(quán)利要求95-97中任一項(xiàng)所述的方法，還包括將所述AARS蛋白片段或剪接變體的存在或水平與對(duì)照樣品或預(yù)定值相比較。
99.權(quán)利要求98所述的方法，還包括表征所述樣品的狀態(tài)以使之與所述對(duì)照相區(qū)分。
100.權(quán)利要求98所述的方法，其中所述樣品和對(duì)照包括細(xì)胞或組織，并且所述方法包括區(qū)分不同物種的細(xì)胞或組織、不同組織或器官的細(xì)胞、不同細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)的細(xì)胞、不同細(xì)胞分化狀態(tài)的細(xì)胞、或健康細(xì)胞與患病細(xì)胞。
101.一種鑒定特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)中所列的氨酰-tRNA合成酶(AARS)多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體的一種或多種的化合物的方法，所述方法包括:a)使所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體或兩者與至少一種測(cè)試化合物在適合條件下混合，并b)檢測(cè)所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體或兩者與所述測(cè)試化合物的結(jié)合，從而鑒定特異性結(jié)合所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體或兩者的化合物。
102.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述測(cè)試化合物是多肽或肽、抗體或其抗原結(jié)合片段、肽模擬物、或小分子。
103.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述測(cè)試化合物完全或部分激動(dòng)所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體的非規(guī)范生物活性。
104.權(quán)利要求101所述的方法，其中所述測(cè)試化合物完全或部分拮抗所述AARS多肽或其細(xì)胞結(jié)合配偶體的非規(guī)范生物活性。
105.—種由權(quán)利要求101-104中任一項(xiàng)所述的方法鑒定的化合物。
106.—種藥物 組合物，包含權(quán)利要求56-74中任一項(xiàng)所述的AARS多肽、權(quán)利要求75-82中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合劑、權(quán)利要求83-91中任一項(xiàng)所述的AARS多核苷酸、或權(quán)利要求105所述的化合物，和藥學(xué)上可接受的載體。
107.權(quán)利要求106所述的藥物組合物，其不刺激受試者的免疫應(yīng)答。
108.權(quán)利要求106所述的藥物組合物，包含刺激受試者的免疫應(yīng)答的至少一種佐劑。
109.一種調(diào)節(jié)細(xì)胞或蛋白的細(xì)胞活性的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或蛋白與權(quán)利要求56-74中任一項(xiàng)所述的AARS多肽、權(quán)利要求75-82中任一項(xiàng)所述的抗體或結(jié)合劑、權(quán)利要求83-91中任一項(xiàng)所述的AARS多核苷酸、權(quán)利要求105所述的化合物、或權(quán)利要求108所述的藥物組合物接觸。
110.權(quán)利要求109所述的方法，其中所述細(xì)胞活性選自:細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、血管生成、細(xì)胞結(jié)合、代謝、細(xì)胞因子生成或活性、細(xì)胞因子受體活性、和炎癥。
111.權(quán)利要求110所述的方法，其中所述細(xì)胞類(lèi)型選自:前脂肪細(xì)胞、骨髓、嗜中性粒細(xì)胞、血細(xì)胞、肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、充質(zhì)干細(xì)胞、和骨骼肌細(xì)胞。
112.權(quán)利要求111所述的方法，其中所述細(xì)胞在受試者中。
113.權(quán)利要求112所述的方法，包括治療受試者，其中所述受試者具有與腫瘤疾病相關(guān)的病癥、免疫系統(tǒng)疾病或病癥、炎性障礙、感染性疾病、代謝疾病、神經(jīng)元/神經(jīng)疾病、肌肉/心血管疾病、與異常血細(xì)胞生成相關(guān)的疾病、與異常血管生成相關(guān)的疾病、或與異常細(xì)胞存活相關(guān)的疾病。
114.一種用于制備藥物化合物的方法，所述方法包括: a)在包含表1-3任一個(gè)中所列的氨基酸序列的至少120個(gè)氨基酸的AARS蛋白片段存在下進(jìn)行一種或多種候選化合物的體外篩選，以鑒定特異性結(jié)合所述AARS蛋白片段的化合物； b)使用在步驟a)中鑒定的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定，以鑒定調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段的一種或多種非規(guī)范活性的化合物； c)任選地評(píng)估在步驟b)中鑒定的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)，以使其結(jié)構(gòu)與所述非規(guī)范活性的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)，并任選地衍生化所述化合物以改變其調(diào)節(jié)所述非規(guī)范活性的能力；和 d)產(chǎn)生對(duì)于人類(lèi)使用而言足量的在步驟b)中鑒定的化合物或在步驟c)中衍生的化合物，從而制備所述藥物化合物。
115.一種用于制備藥物化合物的方法，所述方法包括: a)在特異性結(jié)合表1-3任一個(gè)的AARS蛋白片段的細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分存在下進(jìn)行一種或多種候選化合物的體外篩選，以鑒定特異性結(jié)合所述細(xì)胞表面受體或其細(xì)胞外部分的化合物； b)使用在步驟a)中鑒定的化合物進(jìn)行基于細(xì)胞的測(cè)定，以鑒定調(diào)節(jié)所述AARS蛋白片段的一種或多種非規(guī)范活性的化合物； c)任選地評(píng)估在步驟b)中鑒定的化合物的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(SAR)，以使其結(jié)構(gòu)與所述非規(guī)范活性的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)，并任選地衍生化所述化合物以改變其調(diào)節(jié)所述非規(guī)范活性的能力；和 d)產(chǎn)生對(duì)于人類(lèi)使用而言足量的在步驟b)中鑒定的化合物或在步驟C)中衍生的化合物，從而制備所述藥物化合物。
116.一種細(xì)胞組合物，包含工程化的細(xì)胞群，其中至少一個(gè)細(xì)胞包含編碼異源全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白的多核苷酸，其中所述細(xì)胞能夠在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
117.權(quán)利要求116所述的細(xì)胞組合物，其中所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含異源純化或表位標(biāo)簽以利于AARS蛋白片段的純化。
118.權(quán)利要求116或117所述的細(xì)胞組合物，其中所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白包含異源蛋白水解位點(diǎn)以使所述AARS蛋白片段能夠在切割時(shí)生成。
119.一種用于在細(xì)胞內(nèi)原位生成權(quán)利要求56-74中任一項(xiàng)所述的AARS多肽的方法,所述方法包括:i)在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)異源全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，其中所述細(xì)胞包含能夠切割所述異源全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白以生成所述AARS多肽的蛋白酶。
120.—種用于生成權(quán)利要求56-74中任一項(xiàng)所述的AARS多肽的方法,所述方法包括使分離的全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白與能夠切割所述全長(zhǎng)氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白并產(chǎn)生AARS多肽的蛋白酶接觸。
121.—種工程化的全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白，包含使表1_3任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段能夠蛋白水解生成的異源蛋白水解位點(diǎn)。
122.—種組合物，包含分離的全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶蛋白，其中所述組合物以蛋白基計(jì)具有至少約95%的純度，小于約IOEU內(nèi)毒素/mg蛋白，并且基本上沒(méi)有血清。
123.權(quán)利要求122所述的組合物，其中所述全長(zhǎng)酪氨酰-tRNA合成酶蛋白以至少10mg/mL的濃度存在，并且是至少90%單分散的。
124.—種治療由tRNA合成酶的表達(dá)、活性或時(shí)空位置的異常調(diào)節(jié)介導(dǎo)的疾病或障礙的方法，所述方法通過(guò)施用表1-3、或表E2任一個(gè)中所列的AARS蛋白片段或編碼所述ARRS蛋白片段的核酸。
125.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述疾病選自:癌癥、神經(jīng)病、糖尿病、和炎性障礙。
126.權(quán)利要求124所述的方法，其中所述疾病是腓骨肌萎縮癥2D型(CMT2D)或遠(yuǎn)端型脊肌萎縮癥5型(dSMA-V)。
127.權(quán)利要求126所述的方法，其中所述疾病是CMT2D。
128.權(quán)利要求127所述的方法，其中至少一種癥狀是降低的神經(jīng)傳導(dǎo)速度。
129.權(quán)利要求128所述的方法，其中所述疾病是dSMA-V。
130.權(quán)利要求129所述的方法，其中至少一種癥狀是肌肉無(wú)力。
131.一種減輕或改善由酪氨酰-tRNA合成酶(TyrRS)的突變、不合適的亞細(xì)胞締合、過(guò)度表達(dá)、或亞細(xì)胞分布介導(dǎo)的疾病癥狀的方法，所述方法包括向受試者施用特異性結(jié)合表1-3、或表E2任一個(gè)中所列的分離的氨酰-tRNA合成酶(AARS)蛋白片段的分離的抗體或結(jié)合劑，其中所述抗體對(duì)所述AARS蛋白片段的親和力比所述抗體對(duì)相應(yīng)的全長(zhǎng)AARS多肽的親和力強(qiáng)約10X。
132.權(quán)利 要求131所述的方法，其中所述抗體或結(jié)合劑拮抗所述AARS多肽的非規(guī)范活 性。
全文摘要
本文提供了包含氨酰-tRNA合成酶的新鑒定的蛋白片段的組合物、編碼所述蛋白片段的多核苷酸及其互補(bǔ)物、相關(guān)劑、及其在診斷、藥物發(fā)現(xiàn)、研究和治療應(yīng)用中的使用方法。
文檔編號(hào)A61K38/10GK103108650SQ201180032668
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者萊斯利·安·格林尼, 凱爾·P·基昂格, 洪非, 阿蘭·P·瓦瑟洛特, 羅詠詩(shī), 杰弗里·D·沃特金斯, 謝麗爾·L·奎恩, 約翰·D·門(mén)德萊恩 申請(qǐng)人:Atyr 醫(yī)藥公司, 盤(pán)古生物制藥有限公司