專利名稱：再生性組織支架的制備的制作方法
再生性組織支架的制備本申請(qǐng)要求于2010年3月25日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/317，443的優(yōu)先權(quán)。本披露涉及用于治療組織或器官缺損或損傷的裝置和方法，包括用于治療組織缺損的組織支架。人的、動(dòng)物的、以及合成的材料當(dāng)前被用于增進(jìn)組織修復(fù)或矯正組織缺損的醫(yī)療和外科手術(shù)中。為了某些目的，需要具有穩(wěn)定的預(yù)成型形狀的材料。例如，對(duì)于某些骨缺損和軟組織缺損，穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)裝置對(duì)于符合缺損部位以及允許具有所希望的結(jié)構(gòu)的組織的再生是必需的。然而，用于修復(fù)或矯正組織或器官缺損的各種裝置和方法已經(jīng)具有某些缺點(diǎn)。因此，對(duì)于用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用的具有更好穩(wěn)定性的改進(jìn)的裝置存在著需要。在某些實(shí)施方案中，提供了一種用于制造組織支架的方法。該方法包括將一種聚合物溶解在一種溶劑中以制成一種溶液；將該溶液與一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM)混合以產(chǎn)生一種混合物；將該混合物放入一個(gè)模具；將該混合物干燥以形成一種具有穩(wěn)定的三維形狀的組織支架，其中該組織支架當(dāng)植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，提供了一種組織支架。該組織支架包括一種顆粒狀A(yù)TM和一種聚合物，其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中當(dāng)該組織支架在植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，提供了一種用于治療一種組織缺損的方法。該方法包括選擇一種具有穩(wěn)定的三維形狀的組織支架`，該支架包括一種顆粒狀A(yù)TM ;以及一種聚合物，其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架；識(shí)別在一種組織或器官中的一種缺損；以及在該缺損中植入該組織支架。
附圖簡(jiǎn)要說明

圖1展示了根據(jù)某些實(shí)施方案的一種組織支架在一個(gè)缺損中的植入。圖2是顯示了根據(jù)某些實(shí)施方案的一種組織支架的生產(chǎn)工藝的流程圖。圖3是根據(jù)實(shí)例2的用有機(jī)溶劑處理的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(pADM)的差式掃描量熱法(DSC)數(shù)據(jù)的曲線圖。圖4是根據(jù)實(shí)例2的在聚合物存在下pADM的DSC數(shù)據(jù)的曲線圖。圖5A是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)的皮下外植體。圖5B是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和P4HB的皮下外植體。圖5C是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含P4HB的皮下外植體。圖是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和P4HB的皮下外植體。圖6A是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含P4HB的皮下外植體。圖6B是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和P4HB的皮下外植體。圖6C是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含P4HB的皮下外植體。圖6D是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和P4HB的皮下外植體。圖7A是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含聚己內(nèi)酯(PCL)的皮下外植體。圖7B是根據(jù)在實(shí)例2所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和PCL的皮下外植體。圖7C是根據(jù)在實(shí)例 2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含PCL的皮下外植體。圖7D是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和PCL的皮下外植體。圖8A是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PCL的皮下外植體。圖8B是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和PCL的皮下外植體。圖8C是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PCL的皮下外植體。圖8D是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和PCL的皮下外植體。圖9A是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含透明質(zhì)酸芐酯(BHA)的皮下外植體。圖9B是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和BHA的皮下外植體。圖9C是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含BHA的皮下外植體。圖9D是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含pADM和BHA的皮下外植體。圖1OA是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100 X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含BHA的皮下外植體。圖1OB是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100 X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和BHA的皮下外植體。圖1OC是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400 X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含BHA的皮下外植體。
圖1OD是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400 X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色十二周的包含PADM和BHA的皮下外植體。圖1lA是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含殼聚糖和pADM的皮下外植體。圖1lB是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在100X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色八周的包含殼聚糖和pADM的皮下外植體。圖1lC是根據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色四周的包含殼聚糖和pADM的皮下外植體。圖1lD是根 據(jù)在實(shí)例2中所述的方法在400X放大倍數(shù)下的蘇木精伊紅染色八周的包含殼聚糖和pADM的皮下外植體。
示例性實(shí)施方案的說明在本申請(qǐng)中，單數(shù)的使用包括復(fù)數(shù)，除非另外特別說明。在本申請(qǐng)中，“或”(“or”)的使用表示“和/或”(“and/or”)，除非另外說明。此外，術(shù)語“包括”(“including”)，以及其他術(shù)語，如“包括”(“includes”)以及“包括”(“included”)的使用，是非限制性的。在此使用的節(jié)標(biāo)題僅是為了組織目的并且不應(yīng)該被解釋為對(duì)所述主題的限制。在本申請(qǐng)中所引用的所有文件、或文件的部分(包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書籍、以及論文)出于任何目的特此通過引用以其全文清楚地結(jié)合。應(yīng)當(dāng)理解的是，以上說明的益處和優(yōu)點(diǎn)可以涉及一個(gè)實(shí)施方案或可以涉及若干實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，提及“一個(gè)/ 一種”元件指的是這些元件的一個(gè)/ 一種或多個(gè)/多種。在此所述的方法的步驟可以按任何適合的順序進(jìn)行，或在適當(dāng)情況下同時(shí)進(jìn)行。在適當(dāng)情況下，任何以上所述的實(shí)施方案的方面可以與任何所述的其他實(shí)施方案的方面相組合，從而形成具有可比較的特性或不同特性的并且著手解決同樣或不同問題的其他實(shí)例。應(yīng)當(dāng)理解的是，以上優(yōu)選實(shí)施方案的說明僅僅是通過舉例而給出的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以作出不同的修改。以上說明書、實(shí)例以及數(shù)據(jù)提供了本發(fā)明的示例性實(shí)施方案的結(jié)構(gòu)和用途的完整說明。雖然以一定的詳細(xì)程度或參考一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案已經(jīng)說明了本發(fā)明的不同實(shí)施方案，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠針對(duì)所披露的實(shí)施方案做出許多變更，而不背離本發(fā)明的范圍。如在此使用的術(shù)語“脫細(xì)胞組織基質(zhì)”通常是指基本上沒有細(xì)胞和/或細(xì)胞組分的任何組織基質(zhì)。皮膚、皮膚的部分(如真皮)、以及其他組織如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨、以及神經(jīng)結(jié)締組織，可以用來產(chǎn)生在本披露的范圍之內(nèi)的脫細(xì)胞基質(zhì)。可以通過許多方式測(cè)試或評(píng)估脫細(xì)胞基質(zhì)以確定它們是否基本上沒有細(xì)胞和/或細(xì)胞組分。例如，可以用光學(xué)顯微鏡來檢查處理的組織以確定是否殘留有細(xì)胞(活的或死的)和/或細(xì)胞組分。另夕卜，可以使用某些分析來鑒定細(xì)胞或細(xì)胞組分的存在。例如，可以使用DNA或其他核酸分析對(duì)在這些組織基質(zhì)之內(nèi)的殘余核酸物質(zhì)定量。通常，殘余DNA或其他核酸的缺乏將指示完全脫細(xì)胞(即去除了細(xì)胞和/或細(xì)胞組分)。最后，可以使用其他鑒定細(xì)胞特異性組分(如表面抗原)的分析來確定這些組織基質(zhì)是否無細(xì)胞。本披露提供了用來治療在組織或器官中的缺損的三維組織支架。這些組織支架可以包括一種具有用來支持組織再生的生物學(xué)能力的ATM。在一些實(shí)施方案中，這些組織支架可以支持細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)和分化。例如，該支架可被用于組織向內(nèi)生長(zhǎng)、矯形外科、牙周應(yīng)用、組織重塑、組織恢復(fù)、整形外科、整容外科、以及如乳房腫瘤切除術(shù)(lumpectomy)、腮腺切除術(shù)、或腫瘤切除中的缺失組織的代替，如以下進(jìn)一步所述。在一個(gè)實(shí)施方案中，正如成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和血管的存在所證明的，這些組織支架產(chǎn)生了一種再生性組織反應(yīng)。另外，這些組織支架可以包括一種或多種聚合物材料，如以下進(jìn)一步所述。在某些實(shí)施方案中，本披露的這些組織支架可以通過弱化或降低免疫或炎癥應(yīng)答來增加該聚合物組分的可接受性。如在此所使用的，這些聚合物組分可以包括合成聚合物和/或天然存在的聚合物。在某些實(shí)施方案中，這些組織支架中的聚合物材料可以為ATM提供一種穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，這增加了植入物的整合性和生物相容性。如在此所使用的，該穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)將被理解為是指一種當(dāng)在靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)傾向于保持一種預(yù)定形狀(例如成形為與一個(gè)植入部位一致)的材料。在不同的實(shí)施方案中，本披露的這些組織支架可以用于在很多不同解剖部位上的治療。根據(jù)不同的實(shí)施方案，這些組織支架可以用于一系列廣泛的應(yīng)用中。某些示例性的應(yīng)用包括，但不限于:吸收性敷料、真皮再生(例如用于治療所有類型的潰瘍和燒傷)、神經(jīng)再生、軟骨再生、結(jié)締組織再生或修復(fù)(例如肌腱/韌帶套)、骨再生、牙周應(yīng)用、傷口 /泡沫襯料、整合的繃帶敷料、用于皮膚移植物的基質(zhì)或基底、血管再生、整容外科、金屬和/或聚合物植入物的涂層(例如,增加植入物的整合性和生物相容性)、以及缺失組織的代替(如在創(chuàng)傷、乳房縮小術(shù)、乳房切除術(shù)、乳房腫瘤切除術(shù)、腮腺切除術(shù)、或腫瘤切除之后)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了包含一種顆粒狀無細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM)以及一種聚合物的組織支架；其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中當(dāng)該組織支架在植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答，用于至少一種以下用途:吸收性敷料、真皮再生、神經(jīng)再生、軟骨再生、結(jié)締組織再生或修復(fù)、骨再生、牙周應(yīng)用、傷口 /泡沫襯料、整合的繃帶敷料、作為一種用于皮膚移植物的基質(zhì)或基底、血管再生、整容外科、金屬和/或聚合物植入物的涂層、以及缺失組織的代替。該組織支架當(dāng)植入人體中`時(shí)相比于單獨(dú)用來生產(chǎn)該支架的該聚合物或多種聚合物引出降低的免疫或炎癥應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，可以使用許多方法來檢測(cè)該組織支架在宿主中的作用。在一些實(shí)施方案中，可以通過測(cè)量對(duì)該植入支架的免疫或炎癥應(yīng)答來檢測(cè)該組織支架在宿主中的作用。在一些實(shí)施方案中，可以通過許多方法測(cè)量對(duì)該組織支架的免疫或炎癥應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，可以使用組織學(xué)方法測(cè)量該免疫或炎癥應(yīng)答。例如，外植支架可以染色并在顯微鏡下觀察以用于組織學(xué)評(píng)估，如以下進(jìn)一步所述。在一些實(shí)施方案中，可以通過測(cè)量炎癥細(xì)胞(如白細(xì)胞)的數(shù)目證明對(duì)該支架的免疫或炎癥應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，可以通過減少的炎癥細(xì)胞數(shù)目證明對(duì)該支架的弱化的免疫或炎癥應(yīng)答，如以下進(jìn)一步所述。例如，可以通過被設(shè)計(jì)為識(shí)別淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞的免疫組化染色方法來測(cè)量炎癥細(xì)胞。免疫組化方法也可以用來確定炎癥細(xì)胞因子(包括白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α (TNF-α )、以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β))的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了當(dāng)被植入體內(nèi)時(shí)降低一種聚合物材料的免疫應(yīng)答的ATM的用途。該聚合物組織可以包括合成或天然存在的聚合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了產(chǎn)生再生性組織反應(yīng)的一種組織支架。該支架可以包括一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM);以及一種聚合物；其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中當(dāng)該組織支架在植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。通過成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和血管的存在而證明該再生性組織反應(yīng)。在不同的實(shí)施方案中，本披露的這些組織支架可以被用來治療廣泛的任何失調(diào)。組織缺損可起因于多樣的醫(yī)學(xué)病癥，包括，例如先天畸形、跌打損傷、感染、以及腫瘤切除。因此，這些組織支架可以被用來修復(fù)任何軟組織中的缺損，如，連接、支持、或圍繞其他結(jié)構(gòu)的組織以及身體器官。這些組織支架還可以用來治療骨缺損，例如，作為一種關(guān)節(jié)移植物以支持軟骨再生。軟組織可以是任何非骨組織。這些組織支架可以被用來治療許多不同器官系統(tǒng)中的軟組織。這些器官系統(tǒng)可以包括，但不限于，肌肉系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)(gastroenterological system)、皮膚系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、以及呼吸系統(tǒng)。這些組織支架對(duì)于胸部和腹壁的結(jié)締組織(包括筋膜、一種圍繞肌肉、骨以及關(guān)節(jié)的特殊層)的治療，以及用于在泌尿?qū)W的、婦科學(xué)的以及腸胃病學(xué)的解剖學(xué)方面的組織薄弱的修復(fù)和增強(qiáng)也是有用的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該組織或器官缺損選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心肌、骨膜、動(dòng)脈、靜脈、胃、小腸、大腸、膈、肌腱、韌帶、神經(jīng)組織、橫紋肌、平滑肌、膀胱、尿道、輸尿管、以及牙齦。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了包含一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM)以及一種聚合物的組織支架；其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中當(dāng)該組織支架在植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答，用于再生、修復(fù)、和/或一種缺損的代替，這種缺損存在于皮膚、骨、軟骨、半月板、真皮、心肌、骨膜、動(dòng)脈、靜脈、胃、小腸、大腸、膈、肌腱、韌帶、神經(jīng)組織、橫紋肌、平滑肌、膀胱、尿道、輸尿管、以及牙齦中的至少一種。例如，圖1展示了根據(jù)某些實(shí)施方案的一種組織支架在軟骨缺損中的植入。如圖所示，一種組織支架180可以被用來治療在一種長(zhǎng)骨500 (如股骨或肱骨)中的軟骨缺損。在不同的實(shí)施方案中，一種支架180可以被用來治療任何關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)表面或軟骨510。在不同的實(shí)施方案中，組織支架180可以置于關(guān)節(jié)表面或軟骨510中的缺損或切除區(qū)中。正如前面提到的，組織支架180包含一種ATM和一種聚合物。在一些實(shí)施方案中，該ATM包含來自兩種不同組織來源的組織，例如，軟骨190和脫礦骨200。在一些實(shí)施方案中，組織支架180可以被用來修復(fù)其他組織或器官缺損。在一些實(shí)施方案中，組織支架180可以包括真皮和軟骨。在一些實(shí)施方案中，該組織支架包括軟骨190，不包括脫礦骨200。在一些實(shí)施方案中，組織支架180可以包括脫礦骨200，不包括軟骨190。在一些實(shí)施方案中，組織支架180可以包括真皮。在某些實(shí)施方案中，一種制造組織支架的方法包括將一種聚合物溶解于一種溶液中；將該溶液與一種顆粒狀A(yù)TM混合以形成一種混合物；將該混合物放入一種模具；并且通過去除該溶劑將該組織支架成型并且成形以形成一種穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。
圖2展示了一種三維組織支架的制備。該支架可以包括一種ATM (步驟100)。在一些實(shí)施方案中，該ATM可衍生自，例如，真皮、軟骨、骨、脫礦骨、血管、心臟瓣膜、筋膜、或神經(jīng)結(jié)締組織。在一些實(shí)施方案中，該顆粒狀A(yù)TM包含大小均勻的顆粒。在一些實(shí)施方案中，該顆粒狀A(yù)TM包含一種真皮ATM。在一些實(shí)施方案中，該真皮ATM是一種人組織基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該真皮ATM是一種豬組織基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該顆粒狀A(yù)TM是一種可以衍生自人軟骨的軟骨組織基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該軟骨組織基質(zhì)衍生自豬軟骨。在一些實(shí)施方案中，該顆粒狀A(yù)TM包含一種骨組織基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該骨組織基質(zhì)衍生自人骨。在一些實(shí)施方案中，該骨組織基質(zhì)衍生自豬骨?？梢赃x擇該ATM以提供多種不同的生物學(xué)或力學(xué)性能。例如，可以選擇該ATM以允許組織向內(nèi)生長(zhǎng)和重塑以便允許通常發(fā)現(xiàn)于基質(zhì)植入部位處的組織的再生。例如，該ATM，當(dāng)植在軟骨上或內(nèi)部時(shí)，可以被選擇為允許沒有過度纖維化或沒有疤痕形成的軟骨再生。另外，該ATM不應(yīng)當(dāng)引出一種過度的炎癥反應(yīng)，并且應(yīng)當(dāng)最終被重塑以產(chǎn)生與原始宿主組織相似的組織。在一些實(shí)施方案中，該ATM包含膠原、彈性蛋白、以及血管溝。在某些實(shí)施方案中，該ATM可以包括ALLODERMli'或Strattice ，分別為人和豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
這樣的材料的實(shí)例可以在美國專利號(hào)6，933，326和7，358，284中找到?？商娲兀梢允褂闷渌m合的脫細(xì)胞組織基質(zhì)，如下進(jìn)一步所述。可以通過低溫球磨ATM制備一種顆粒狀A(yù)TM (步驟110)。該顆粒狀A(yù)TM可以衍生自許多不同的組織來源。 這些組織來源可以是，例如，真皮、軟骨、骨、血管、心臟瓣膜、筋膜、以及神經(jīng)結(jié)締組織。將它們?cè)敿?xì)描述如下。在一些實(shí)施方案中，可以使用兩種或更多種不同類型的組織來制備顆粒狀A(yù)TM。另外，這些組織支架可包括一種或多種聚合物材料。在一些實(shí)施方案中，這些聚合物材料可以選自許多聚合物。在某些實(shí)施方案中，這些聚合物可以選自，例如，殼聚糖、透明質(zhì)酸的芐酯(BHA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、或聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)。在一些實(shí)施方案中，可以將該聚合物溶解于一種適合的溶劑中(步驟120)，該溶劑選自許多溶劑。在一些實(shí)施方案中，該溶劑可以選自，例如，二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、DMSO或乙酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，將PCL溶解于二噁烷中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在組織支架制備中所使用的在二噁烷或NMP溶劑中的PCL可以大約為5%-30% (w/v)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，在組織支架制備中所使用的在二噁烷或NMP溶劑中的PCL可以大約為5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、或30% (w/v)，5%至30% (w/v)、10%至30% (w/v)以及它們之間的任何值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將P4HB溶解于二噁烷或NMP中。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，在組織支架的制備中所使用的在二噁烷或NMP溶劑中的P4HB可以大約為5%-40% (w/v)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，在組織支架的制備中所使用的在二噁烷或NMP溶劑中的P4HB可以大約為5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30% 或 40% (w/v),或 5% 至 40% (w/v)、10% 至 30% (w/v)以及它們之間的任何值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將BHA溶解于DMSO中。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，在組織支架的制備中所使用的在DMSO中的BHA可以大約為5%-50% (w/v)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，在組織支架的制備中所使用的在DMSO中的BHA可以大約為5%、8%、10%、12%、15%、18%、20%、25%、30%、40%、或 50% (w/v)，5% 至 50% (w/v)、或 10% 至 40% (w/v)、以及它們之間的任何值。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，將殼聚糖溶解于乙酸中。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，該乙酸濃度為0.1-0.5M (pH范圍2.53-2.88)。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，該殼聚糖和乙酸混合物的PH可以為4.0-5.5。在又另一個(gè)實(shí)施方案中，在組織支架的制備中所使用的在乙酸中的殼聚糖可以大約為1%、2%、3%、4%、或5% (w/v)、以及它們之間的任何值?？紤]到體內(nèi)更新/持久性、生物力學(xué)性能、以及全面生物反應(yīng)的操縱，這些支架材料中的每一種可以對(duì)終產(chǎn)物賦予不同的特性。這些聚合物溶液可以與顆粒狀A(yù)TM混合(步驟130)。然后這些ATM和聚合物/溶劑混合物被置于或填充進(jìn)模具或其他容器中以產(chǎn)生所希望的三維形狀(步驟140)。在一些實(shí)施方案中，模具可選自許多模具。在一些實(shí)施方案中，模具可以選自eppendorf管、金屬管、金屬管、注射管、或具有組織或器官缺損(該組織支架被設(shè)計(jì)為對(duì)其進(jìn)行修復(fù))的形狀的一種模具?？梢酝ㄟ^干燥方法去除該溶劑(步驟150)。在一些實(shí)施方案中，可以通過許多干燥方法去除該溶劑。在一些實(shí)施方案中，該干燥方法可以選自冷凍干燥、風(fēng)干、加熱干燥、在氬氣或氮?dú)庵懈稍?、或真空輔助干燥。生成的組織支架包括包裹在一種聚合物/合成支持支架中的再生性組織顆粒，并且在機(jī)械應(yīng)力下是穩(wěn)定的。另外，干燥方法可包括被動(dòng)干燥，其中該溶劑蒸發(fā)入標(biāo)準(zhǔn)大氣中。在某些實(shí)施方案中，該組織支架的形狀和穩(wěn)定性是重要的。在一些實(shí)施方案中，所希望的或完成的生成的組織支架的形狀和大小是由用來生產(chǎn)該支架的模具的形狀和大小決定的。在一些實(shí)施方案中，所希望的或完成的該組織支架的形狀是一種穩(wěn)定的三維形狀。在一些實(shí)施方案中，用來制備該穩(wěn)定的三維組織支架的模具可以是一種eppendorf管、一種金屬管、一種注射管、或具有組織或器官缺損(該組織支架將被植入其中)的形狀的一種模具。在一些實(shí)施方案中，該組織支架呈一種圓柱形。在一些實(shí)施方案中，該組織支架呈一種管狀。在一些實(shí)施方案中，該組織支架的形狀與組織或器官缺損或損傷的形狀相符合。在一些實(shí)施方案中，通過控制凍結(jié)速度、冰點(diǎn)、以及成型容器的構(gòu)成來控制機(jī)械強(qiáng)度、孔隙率、水合作用以及流體電導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，該組織支架的大小或形狀被確定為使得它能與組織或器官缺損的形狀相符合。在一些 實(shí)施方案中，可以使用兩種或更多種不同類型的組織來制備該組織支架。例如，在該組織支架中的一種組織可以是軟骨并且第二種組織可以是脫礦骨。在一些實(shí)施方案中，軟骨/脫礦骨支架可以用來修復(fù)骨軟骨缺損(圖1)。
脫細(xì)胞組織基質(zhì)術(shù)語“脫細(xì)胞組織基質(zhì)”，如在此所使用的，通常是指基本上沒有細(xì)胞和/或細(xì)胞組分的任何組織基質(zhì)。可以使用皮膚、皮膚的部分(如真皮)、以及其他組織(如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨以及神經(jīng)結(jié)締組織)來產(chǎn)生在本披露范圍之內(nèi)的脫細(xì)胞基質(zhì)?？梢酝ㄟ^許多方式測(cè)試或評(píng)估脫細(xì)胞基質(zhì)以確定它們是否基本上沒有細(xì)胞和/或細(xì)胞組分。例如，可以使用光學(xué)顯微鏡檢查處理的組織以確定是否殘留有細(xì)胞(活的或死的)和/或細(xì)胞組分。另外，可以使用某些分析來鑒定細(xì)胞或細(xì)胞組分的存在。例如，可以使用DNA或其他核酸分析來對(duì)在這些組織基質(zhì)之內(nèi)的殘余核酸物質(zhì)定量。通常，殘余DNA或其他核酸的缺乏將指示完全脫細(xì)胞(即去除了細(xì)胞和/或細(xì)胞組分)。最后，可以使用其他鑒定細(xì)胞特異性組分(如表面抗原)的分析來確定這些組織基質(zhì)是否無細(xì)胞?？梢允褂闷つw、皮膚的部分(如真皮)、以及其他組織(如血管、心臟瓣膜、筋膜、軟骨、骨以及神經(jīng)結(jié)締組織)來產(chǎn)生在本披露范圍之內(nèi)的脫細(xì)胞基質(zhì)。通常，在生產(chǎn)ATM中涉及的步驟包括從一個(gè)供體(如人的尸體或動(dòng)物來源)收獲組織，以及在保存生物和結(jié)構(gòu)功能的條件下去除細(xì)胞。例如，所希望的生物和結(jié)構(gòu)功能包括支持細(xì)胞向內(nèi)生長(zhǎng)和組織再生、提供機(jī)械支持(如為一個(gè)手術(shù)部位或缺損)、預(yù)防過度免疫應(yīng)答、炎癥、纖維化、和/或瘢痕形成的能力。在某些實(shí)施方案中，該方法包括與去除細(xì)胞一起或在去除細(xì)胞之前進(jìn)行化學(xué)處理，以穩(wěn)定組織并且避免生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)退化。在不同的實(shí)施方案中，該穩(wěn)定溶液阻止并且預(yù)防滲透的、缺氧的、自溶的、以及蛋白質(zhì)分解的退化，使免受微生物污染，以及減輕可能伴隨在含有例如平滑肌組分(例如血管)的組織中的機(jī)械損傷。該穩(wěn)定溶液可以含有一種適當(dāng)?shù)木彌_劑、一種或多種抗氧化劑、一種或多種腫脹劑、一種或多種抗生素、一種或多種蛋白酶抑制劑、和/或一種或多種平滑肌松弛劑。然后將該組織置于一種脫細(xì)胞溶液中以從結(jié)構(gòu)基質(zhì)中去除活細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、以及成纖維細(xì)胞)，而不損壞膠原基質(zhì)的生物學(xué)和結(jié)構(gòu)完整性?？梢酝ㄟ^多種方法測(cè)試該膠原基質(zhì)的完整性。例如，可以使用差示掃描量熱法來鑒定熱轉(zhuǎn)變溫度的變化，這些變化指示交聯(lián)(轉(zhuǎn)變溫度的升高)或膠原降解(轉(zhuǎn)變溫度的降低)。另外，電子顯微鏡可以證明正常膠原模式(collagen pattern)的變化，并且酶消化分析可以證明膠原損壞。此外，各種糖胺聚糖(如硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸)的丟失可能指示組織基質(zhì)中的不良變化。該脫細(xì)胞溶液可以含有一種適當(dāng)?shù)木彌_劑、鹽、一種抗生素、一種或多種清潔劑(如曲拉通TRITON X-100 (TRITON X-lOO )、去氧膽酸鈉、聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)、預(yù)防交聯(lián)的一種或多種試劑、一種或多種蛋白酶抑制劑、和/或一種或多種酶。用于生產(chǎn)ATM的適合的方法描述于，例如，H.Xu等人，衍生自豬的支持軟組織再生的脫細(xì)胞真皮支架:末端半乳糖-a-(1,3)-半乳糖的去除以及基質(zhì)結(jié)構(gòu)的保留(A Porcine-DerivedAcellular Dermal Scaffold That Supports SoftTissue Regeneration:Removal ofTerminal Galactose-a-(1，3)-Galactose andRetention of Matrix Structure)，TissueEng.Part A 15:1807(2009)。在脫細(xì)胞過程之后，將組織樣品用鹽水徹底洗滌。在一些示例性的實(shí)施方案中，例如，當(dāng)使用異種材料時(shí)，然后將該脫細(xì)胞組織在室溫下用脫氧核糖核酸酶(DNase)溶液處理過夜。在一些實(shí)施方案中，將該組織樣品用制備在DNA酶緩沖液(20mM HEPES (4-(2-羥乙基)-1_哌嗪乙磺酸)、20mM CaCl2以及20mM MgC)中的DNA酶溶液處理。任選地，可以將一種抗生素溶液(例如慶大霉素)添加至DNA酶溶液中。只要該緩沖劑提供了適合的DNA酶活性，可以使用任何適合的緩沖劑。

雖然一種ATM可以由與該組織支架的受體相同種類的一個(gè)或多個(gè)個(gè)體制成，但這不是必然如此。因此，例如，在該組織支架中的一種ATM可以由豬組織制成。可以作為ATM受體以及用于生產(chǎn)ATM的組織或器官的供體用的種類包括，但不限于:哺乳動(dòng)物，例如人、非人靈長(zhǎng)類(如猴子、狒狒、或黑猩猩)、豬、牛、馬、山羊、綿羊、狗、貓、兔、豚鼠、沙鼠、倉鼠、大鼠、或小鼠。α-半乳糖表位從含膠原材料中的消除可以降低針對(duì)含膠原材料的免疫應(yīng)答。α-半乳糖表位表達(dá)在非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物中以及新世界猴(南美猴)中，在大分子如細(xì)胞外組分的糖蛋白上，U.Galili 等人，J.Biol.Chem.263:17755 (1988)。
然而，在舊世界靈長(zhǎng)類(亞洲和非洲猴以及猿)以及人類中缺乏這個(gè)表位?？拱肴樘强贵w是由于在胃腸道細(xì)菌上的α-半乳糖表位碳水化合物結(jié)構(gòu)的免疫應(yīng)答而在人以及靈長(zhǎng)類體內(nèi)產(chǎn)生的，U.Galili 等人,Infect.Tmmun.56:1730 (1988) ; R.M.Hamadeh 等人,J.Clin.1nvest.89:1223(1992)。由于非靈長(zhǎng)類哺乳動(dòng)物(如豬)產(chǎn)生α-半乳糖表位，將含膠原材料從這些哺乳動(dòng)物異種移植至靈長(zhǎng)類中常常會(huì)導(dǎo)致排斥反應(yīng)，這是因?yàn)殪`長(zhǎng)類抗半乳糖結(jié)合含膠原材料上的這些表位的緣故。通過補(bǔ)體結(jié)合并且通過抗體依賴性細(xì)胞細(xì)胞毒作用，這種結(jié)合導(dǎo)致了含膠原材料的破壞。U.Galili等人，Immunology Today 14:480 (1993) ;M.Sandrin 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:11391 (1993) ;Η.Good 等人，Transplant.Proc.24:559(1992) ;B.H.Collins 等人，J.1mmunol.154:5500(1995)。此外，異種移植導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的主要激活而產(chǎn)生增加量的高親和力抗半乳糖抗體。因此，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用產(chǎn)生α -半乳糖表位的動(dòng)物作為組織來源時(shí)，來自細(xì)胞和來自含膠原材料的細(xì)胞外組分的α-半乳糖表位的實(shí)質(zhì)性消除、以及細(xì)胞α-半乳糖表位的再表達(dá)的預(yù)防可以減少針對(duì)與結(jié)合在α-半乳糖表位上的抗半乳糖抗體相關(guān)聯(lián)的含膠原材料的免疫應(yīng)答。為了去除α -半乳糖表位，在徹底用鹽水洗滌組織以去除DNA酶溶液之后，該組織樣品可以經(jīng)受一次或多次酶處理以去除某些免疫原性抗原(如果在該樣品中存在的話)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以用一種α-半乳糖苷酶處理該組織樣品以消除α-半乳糖表位(如果在該組織中存在的話)。在一些實(shí)施方案中，用一種制備在pH為6.0的IOOmM磷酸鹽緩沖液中的濃度為300U/L的α-半乳糖苷酶處理該組織樣品。在其他實(shí)施方案中，為了從收獲組織充分去除α-半乳糖表位，α-半乳糖苷酶的濃度增加至400U/L。只要實(shí)現(xiàn)抗原的充分去除，可以使用任何適合的酶濃度和緩沖劑?？商娲?，可以選擇已經(jīng)基因修飾為缺乏一種或更多種抗原表位的動(dòng)物作為組織來源，而不是用酶處理組織。例如，可以選擇已經(jīng)通過基因工程化為缺乏末端α-半乳糖部分的動(dòng)物(如豬)作為組織來源。對(duì)適當(dāng)動(dòng)物的描述參見共同未決的美國申請(qǐng)序列號(hào)10/896，594以及美國專利號(hào)6，166，288，這些披露以其全文通過引用的方式結(jié)合在此。
另外，處理組織以產(chǎn)生具有或不具有減少量的或缺乏α-1，3_半乳糖部分的脫細(xì)胞基質(zhì)的某些示例性方法描述于Xu，Hui等人的“一種支持軟組織再生的衍生自豬的脫細(xì)胞真皮支架:末端半乳糖-α-(1，3)-半乳糖的去除以及基質(zhì)結(jié)構(gòu)的保留”，Tissue Engineering,第 15 卷，第 1-13 頁(2009) (〃A Porcine-Derived AcellularDermal Scaffold that Supports Soft TissueRegeneration:Removal of TerminalGalactose-a-(1，3)-Galactose a`ndRetention of Matrix Structure,^TissueEngineering, Vol.15, 1-13 (2009))中,通過引用將其全文結(jié)合。在形成ATM之后，可以任選地將組織相容性活細(xì)胞種在該ATM中，以產(chǎn)生可以被宿主進(jìn)一步重塑的一種移植物。在一些實(shí)施方案中，通過在移植之前的標(biāo)準(zhǔn)體外細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)或通過移植后的體內(nèi)再增殖(r印opulation)可以將組織相容性活細(xì)胞添加至基質(zhì)。體內(nèi)再增殖可以是將受體自身的細(xì)胞遷移至ATM中，或?qū)碜允荏w的細(xì)胞或從另一個(gè)供體獲得的組織相容性細(xì)胞注入或注射至原位ATM中?？梢允褂酶鞣N細(xì)胞類型，包括胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)、和/或神經(jīng)元細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中，可以剛好在移植之前或之后將這些細(xì)胞直接施用于ATM的內(nèi)部部分。在某些實(shí)施方案中，可以將這些細(xì)胞置于待植入的ATM之內(nèi)，并且在移植之前培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在移植之前將活細(xì)胞添加至組織支架。在一個(gè)實(shí)施方案中，在支架被植入在一個(gè)所希望的解剖學(xué)部位之后將活細(xì)胞添加至該組織支架。
顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)可以采用下列程序使用ALLODERVP(Strattice 生命細(xì)胞公司STRATTICE LifeCell Corporation,布蘭奇伯格，新澤西)、或其他適合的脫細(xì)胞組織基質(zhì)來制造顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)。在去除包裝之后，用裝有非中斷“連續(xù)”切割輪的Zimmer網(wǎng)格器(Zimmer mesher)將ATM切成條。將所生成的ATM長(zhǎng)條切成在長(zhǎng)度上大約I厘米至大約2厘米的長(zhǎng)度。裝配一種均質(zhì)器以及滅菌的均質(zhì)器探頭(如一種從OMNI國際、Warrenton Va.可獲得的一種LabTeck Macro均質(zhì)器)并且使用灌入均質(zhì)器塔中的無菌液氮將其冷卻至深冷溫度。一旦該均質(zhì)器達(dá)到深冷溫度，將先前制備成如以上所述的條的ATM添加至含有無菌液氮的均質(zhì)器塔。然后起動(dòng)該均質(zhì)器從而將這些ATM條深低溫破碎。低溫分餾步驟的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間將取決于所使用的均質(zhì)器、均質(zhì)器室的大小、均質(zhì)器操作的速度和次數(shù)，并且應(yīng)當(dāng)能夠由本領(lǐng)域的一位技術(shù)人員通過參數(shù)的簡(jiǎn)單變化來確定，從而實(shí)現(xiàn)所希望的結(jié)果。通過用液氮將均質(zhì)器的產(chǎn)物洗滌通過一系列也已冷卻至液氮溫度的金屬絲網(wǎng)，將該低溫破碎的顆粒狀A(yù)TM材料根據(jù)粒徑進(jìn)行分類。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用在以上所述類型的均質(zhì)塔之內(nèi)的絲網(wǎng)的一種組合是特別有用的，在均質(zhì)塔中將這些顆粒洗滌并且首先被分類以排除尺寸過大的顆粒， 然后排除尺寸過小的顆粒。一旦分離，移除該顆粒狀A(yù)TM，并且一旦該無菌液氮已經(jīng)蒸發(fā)，將其置于用于冷凍干燥的小瓶中。這個(gè)最后的步驟是為了確保去除在以上程序中已經(jīng)吸收的任何殘余水分。最終產(chǎn)物可以是一種具有粒徑大約I微米至大約900微米或粒徑大約30微米至大約750微米的粉末。這些顆粒大約分布在大約150-300微米的均值。通過將該材料懸浮在生理鹽水或其他相似的適合的再水合試劑中易于將其再水合。該再水合的ATM可以再懸浮于生理鹽水或其他適合的藥學(xué)上相容的載體中。提供了下列實(shí)例以更好地解釋不同的實(shí)施方案，這些實(shí)例不應(yīng)當(dāng)以任何方式被理解為限制本披露的范圍。
實(shí)例
實(shí)例I再生性組織支架的制備圖2展示了合成ATM再生性組織支架的制備方法。使用聚合物支架材料從顆粒狀A(yù)TM制造三維再生性組織支架。從豬真皮組織制備ATM并且將其冷凍干燥。將干燥的ATM切成約Icm2的塊并且置于適當(dāng)大小的低溫球磨小瓶中。然后將該小瓶置于已經(jīng)用液氮預(yù)冷的SPEX6800冷凍研磨機(jī)中，并且使其經(jīng)受低溫破碎規(guī)程。然后將該顆粒狀A(yù)TM從小瓶中移除并且保持在干燥儲(chǔ)存條件下。將透明質(zhì)酸的100%的芐酯衍生物以40% (w/v)的濃度溶解在二甲亞砜(DMSO)中。然后將Iml的這種溶液與如以上所制備的300mg的微粒脫細(xì)胞真皮基質(zhì)混合，并且將該混合物轉(zhuǎn)移至一個(gè)2ml的小eppendorf管。然后通過一種冷凍干燥方法將該DMSO去除,剩下一種保留著eppendorf管的形狀(圓柱形)的組織支架(按重量計(jì)40%的透明質(zhì)酸節(jié)酯,60%的脫細(xì)胞真皮基質(zhì))，將其干燥(步驟150)。
實(shí)例2組織支架的功能研究
有機(jī)溶劑對(duì)組織基質(zhì)完整性的影響的暈熱分析正如通過炎癥細(xì)胞減少的數(shù)目所證明的，體內(nèi)結(jié)果表明再生性組織支架的存在弱化了對(duì)該支架材料的免疫或炎癥應(yīng)答。將這些如在實(shí)例I中所述制備的pADM用包括二噁烷、NMP>以及DMSO的過量的不同溶劑處理2小時(shí)。使用差示掃描量熱計(jì)(DSC)評(píng)估處理的材料以評(píng)定組織基質(zhì)的完整性。圖3是用有機(jī)溶劑處理的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(pADM)的DSC數(shù)據(jù)的曲線圖。同樣，這些pADM用不同的聚合物(例如在二噁烷中的聚-4-羧基丁酸酯或在二噁烷或NMP中的聚己內(nèi)酯)處理，并且通過DSC評(píng)估組織基質(zhì)的完整性。圖4是根據(jù)實(shí)例2在聚合物存在下的pADM的DSC數(shù)據(jù)的曲線圖。DSC分析(圖4)顯示出聚合物和pADM的熱分析圖是累加的。
組織學(xué)評(píng)估在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在聚-4-羧基丁酸酯(P4HB)的存在下測(cè)試了pADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/P4HB組織支架或P4HB聚合物支架。這個(gè)模型允許測(cè)定針對(duì)植入的測(cè)試材料的細(xì)胞和免疫應(yīng)答。通過在具有免疫能力的大鼠(褐家鼠；路易鼠)的背側(cè)面上的小切口將測(cè)試材料植入皮下位置。在植入之后4周(圖5A-D)和12周(圖6A-D)，收集外植體并用PBS洗滌并固定在10%的福爾馬林中。將固定的組織包埋在石蠟中，使用標(biāo)準(zhǔn)程序用蘇木精和伊紅(H和E)將組織基質(zhì)樣品的切片染色。
見 D.C.Sheehan 和 B.B.Hrapchak, Theory and Practice ofHistotechnology,第二版，Columbus, OH, Battelle Press (1987)。然后在 IOOX 放大倍數(shù)(圖 5A-B 和圖 6A-B)和400X放大倍數(shù)(圖5C-D和圖6C-D)的顯微鏡下觀察樣品。外植體(圖5A-D和圖6A-D)的組織學(xué)分析顯示，在pADM存在下的P4HB相比于單獨(dú)的P4HB的外植體具有弱化的炎癥應(yīng)答。圖7A-D和圖8A-D顯示了 4周和12周的聚己內(nèi)酯外植體的組織學(xué)評(píng)估。在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在聚己內(nèi)酯(PCL)的存在下測(cè)試了 pADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/PCL組織支架或PCL聚合物支架。如上所述，在植入之后4周(圖7A-D)和12周(圖8A-D)收集外植體并處理以用于組織學(xué)評(píng)估。
然后在IOOX放大倍數(shù)(圖7A-B和圖`8A-B)和400 X放大倍數(shù)(圖7C-D和圖8C-D)的顯微鏡下觀察樣品。外植體的組織學(xué)分析(圖7A-D和圖8A-D)顯示，在pADM存在下的PCL相比于單獨(dú)的PCL的外植體具有弱化的炎癥應(yīng)答。圖9A-D和圖10A-D顯示了 4周和12周的透明質(zhì)酸芐酯(BHA)外植體的組織學(xué)評(píng)估。在具有皮下免疫能力的大鼠模型中在BHA的存在下測(cè)試了 pADM的移植效果。
具有免疫能力的大鼠被植入pADM/BHA組織支架或BHA聚合物支架。如上所述，在植入之后4周(圖9A-D)和12周(圖10A-D)收集外植體并處理以用于組織學(xué)評(píng)估。
然后在100X放大倍數(shù)(圖9A-B和圖10A-B)和400 X放大倍數(shù)(圖9C-D和圖10C-D)的顯微鏡下觀察樣品。外植體的組織學(xué)分析(圖9A-D和圖10A-D)顯示，在pADM存在下的BHA相比于單獨(dú)的BHA的外植體具有弱化的炎癥應(yīng)答。圖1lA-D顯示了 4周和8周的殼聚糖/pADM外植體的組織學(xué)評(píng)估。在具有免疫能力的皮下大鼠模型中在殼聚糖的存在下測(cè)試了 PADM的移植效果。具有免疫能力的大鼠被植入pADM/殼聚糖支架。如上所述，在植入之后4周(圖11A，C)和8周(圖11B，D)收集外植體并處理以用于組織學(xué)評(píng)估。然后在100X放大倍數(shù)(圖11A-B)和400X放大倍數(shù)(圖11C-D)的顯微鏡下觀察樣品。正如通過成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和血管的存在所證明的，這些結(jié)果顯示存在著一種再生性組織反應(yīng)。如上所述，將再生性組織基質(zhì)成型和成形為穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的能力將允許開發(fā)新穎的產(chǎn)品，這些新穎的產(chǎn)品可以被用于遍及廣泛范圍的再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。這些支架材料中的每一種可以對(duì)終產(chǎn)物賦予不同的特性，從而允許操縱體內(nèi)更新/持久、生物力學(xué)性能、以及總生物學(xué)反應(yīng)。另外，如上面所示，該再生性組織支架組分降低/弱化了對(duì)支架材料的總炎
癥 應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.一種用于制造組織支架的方法，該方法包括: 將一種聚合物溶解在一種溶劑中以制成一種溶液； 將該溶液與一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM)混合以產(chǎn)生一種混合物； 將該混合物放入一個(gè)模具中；并且 將該混合物干燥以形成一種具有穩(wěn)定的三維形狀的組織支架，其中當(dāng)該組織支架被植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該聚合物包括一種聚己內(nèi)酯。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該溶劑包括二噁烷。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該溶劑包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該聚己內(nèi)酯在溶劑中是以范圍從大約5%至30%(w/V)的量存在的。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中該聚己內(nèi)酯在溶劑中是以范圍從大約10%至30%(w/V)的量存在的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該聚合物是一種聚-4-羧基丁酸酯。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該溶劑包括二噁烷。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該溶劑包括N-甲基-2-吡咯烷酮。
10.如權(quán)利要求7所 述的方法，其中該聚-4-羧基丁酸酯在溶劑中是以范圍從大約5%至40% (w/v)的量存在的。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該聚-4-羧基丁酸酯在溶劑中是以范圍從大約10%至30% (w/v)的量存在的。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該聚合物包括一種透明質(zhì)酸的芐酯衍生物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該溶劑包括DMSO。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該透明質(zhì)酸的芐酯衍生物在溶劑中是以范圍從大約5%至50% (w/v)的量存在的。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該透明質(zhì)酸的芐酯衍生物在溶劑中是以范圍從大約10%至40% (w/v)的量存在的。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該聚合物包括殼聚糖。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該溶劑包括乙酸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中該乙酸為0.1-0.5M。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該殼聚糖是以范圍從大約1%至5%(w/v)的量存在的。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括大小均勻的顆粒。
21.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括一種真皮ATM。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該真皮ATM是一種人組織基質(zhì)。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該真皮ATM是一種豬組織基質(zhì)。
24.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM是一種軟骨組織基質(zhì)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該軟骨組織基質(zhì)包括一種人軟骨基質(zhì)。
26.如權(quán)利要求24所述的方法，其中該軟骨組織基質(zhì)包括一種豬軟骨基質(zhì)。
27.權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括一種骨組織基質(zhì)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該骨組織基質(zhì)包括一種人骨。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中該骨組織基質(zhì)包括一種豬骨。
30.如權(quán)利要求1所述的方法，其中將該混合物放入一種模具包括注射成型。
31.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括來自兩種或更多種不同類型的組織的ATM。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這兩種或更多種不同類型的組織包括真皮和軟骨。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這兩種或更多種不同類型的組織包括軟骨和骨。
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這兩種或更多種不同類型的組織包括人組織基質(zhì)。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這兩種或更多種不同類型的組織包括豬組織基質(zhì)。
36.如權(quán)利要求31所述的方法，其中這兩種或更多種不同類型的組織包括人組織基質(zhì)和豬組織基質(zhì)。
37.一種組織支架，包括: 一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM);以及 一種聚合物； 其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中該組織支架當(dāng)植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。
38.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該聚合物包括一種合成聚合物。
39.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該聚合物包括一種聚己內(nèi)酯。
40.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該聚合物是一種聚-4-羧基丁酸酯。
41.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該聚合體包括一種透明質(zhì)酸的芐酯衍生物。
42.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該聚合物包括殼聚糖。
43.如權(quán)利要求37 所述的組織支架，其中該顆粒狀A(yù)TM包括一種真皮ATM。
44.如權(quán)利要求43所述的組織支架，其中該真皮ATM是一種人組織基質(zhì)。
45.如權(quán)利要求43所述的組織支架，其中該真皮ATM是一種豬組織基質(zhì)。
46.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該ATM是一種軟骨組織基質(zhì)。
47.如權(quán)利要求46所述的組織支架，其中該軟骨組織基質(zhì)包括一種人軟骨。
48.如權(quán)利要求46所述的組織支架，其中該軟骨組織基質(zhì)包括一種豬軟骨。
49.如權(quán)利要求37所述的組織支架，其中該ATM是一種骨組織基質(zhì)。
50.如權(quán)利要求49所述的組織支架，其中該骨組織基質(zhì)包括一種人骨。
51.如權(quán)利要求49所述的組織支架，其中該骨組織基質(zhì)包括一種豬骨。
52.一種治療方法，包括:(a)選擇一種具有穩(wěn)定的三維形狀的組織支架，該組織支架包括: (i)一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM);以及 ( ) 一種聚合物； 其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中該組織支架當(dāng)植入人體中時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答；(b)識(shí)別在一種組織或器官中的一種缺損；并且 (c)將該組織支架植入該缺損中。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中該缺損是在一種骨之中。
54.如權(quán)利要求52所述的方法，其中該缺損是在一種軟骨組織之中。
55.如權(quán)利要求52所述的方法，其中該缺損是在一種乳房組織之中。
56.如權(quán)利要求37所述的組織支架用于治療組織中的一種缺損的用途，這種組織是選自骨、軟骨、以及乳房。
57.一種再生性組織支架，該再生性組織支架是根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制造的。
58.一種用于制造組織支架的方法，該方法包括: 將一種聚合物溶解在一種溶劑中以制成一種溶液； 將該溶液與一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM)混合以產(chǎn)生一種混合物； 將該混合物放入一個(gè)模具中；并且 將該混合物干燥以形成一種具有穩(wěn)定的三維形狀的組織支架，其中該組織支架當(dāng)植入人體時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中該溶劑包括二噁烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、DMSO或乙酸。
60.如權(quán)利要求58至59所述的方法，其中該溶劑是以范圍從大約5%至50%(w/v)的量存在的。
61.如權(quán)利要求58至60所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括一種真皮ATM、一種軟骨組織基質(zhì)、或一種骨組織基質(zhì)、或它們的組合。
62.如權(quán)利要求58至61所述的方法，其中該基質(zhì)是選自一種人組織基質(zhì)以及一種豬組織基質(zhì)或它們的組合。
63.如權(quán)利要求58至62所述的方法，其中將該混合物放入一種模具包括注射成型。
64.一種組織支架，包括: 一種顆粒狀脫細(xì)胞組織基質(zhì)(ATM);以及 一種聚合物； 其中該ATM被包裹在該聚合物中以形成一種用于組織再生的穩(wěn)定的三維組織支架，并且其中該組織支架當(dāng)植入人體時(shí)相比于單獨(dú)的該聚合物具有降低的免疫或炎癥應(yīng)答。
65.如權(quán)利要求58至64所述的組織支架或方法，其中該聚合物包括一種聚己內(nèi)酯、一種聚-4-羧基丁酸酯、一種透明質(zhì)酸的芐酯衍生物、或殼聚糖、或它們的組合。
66.如權(quán)利要求58至65所述的組織支架或方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括一種真皮ATM、一種軟骨組織基質(zhì)、或一種骨組織基質(zhì)、或它們的組合。
67.如權(quán)利要求58至66所述的組織支架或方法，其中該基質(zhì)是選自一種人組織基質(zhì)以及一種豬組織基質(zhì)或它們的組合。
68.如權(quán)利要求58至67所述的組織支架或方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括來自兩種或更多種不同類型的組織，如真皮和軟骨，或軟骨和骨的ATM。
69.如權(quán)利要求58至68所述的方法，其中該顆粒狀A(yù)TM包括大小均勻的顆粒。
70.如權(quán)利要求58至69所述的組織支架用于治療組織中的一種缺損的用途，這種組織是選自骨、軟骨、以及乳房。
71.根據(jù)權(quán)利要求64至70中任一項(xiàng)所述的組織支架用于以下一項(xiàng)或多項(xiàng)中的用途，即:吸收性敷料、真皮再生、神經(jīng)再生、軟骨再生、結(jié)締組織再生或修復(fù)、骨再生、牙周應(yīng)用、傷口 /泡沫襯料、整合的繃帶敷料、作為一種用于皮膚移植物的基質(zhì)或基底、血管再生、整容外科、金屬和/或聚合物植入物涂層以及缺失組織的替換。
72.—種再生性組織支架，該再生性組織支架是通過如權(quán)利要求58至63所述的方法獲得的或可獲得的。
73.一種脫細(xì)胞組織基質(zhì)，該基質(zhì)用于在一個(gè)解剖學(xué)部位植入時(shí)降低一種聚合材料的免疫應(yīng)答。
74.如權(quán)利要求7 3所述的脫細(xì)胞組織基質(zhì)，其中該基質(zhì)包括真皮組織、骨、軟骨、或它們的組合。
全文摘要
在此提供了用于治療或修復(fù)組織或器官缺損或損傷的裝置和方法。這些裝置可以包括從一種細(xì)胞組織基質(zhì)和聚合物制成的組織支架，這些組織支架具有一種穩(wěn)定的三維形狀并且引出一種有限的免疫或炎癥應(yīng)答。
文檔編號(hào)A61L27/36GK103108661SQ201180023774
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月25日
發(fā)明者里克·T·歐文斯, 溫德爾·孫, 劉米克, 勇·馬奧 申請(qǐng)人:生命細(xì)胞公司