一種軟骨組織工程支架及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及軟骨修復(fù)領(lǐng)域，特別涉及一種軟骨組織工程支架及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]軟骨組織工程是一種采用組織工程學(xué)方法構(gòu)建軟骨復(fù)合組織的技術(shù)。軟骨組織工程中三大基本要素是:種子細(xì)胞，可降解的軟骨組織工程支架以及細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，其中，軟骨組織工程支架在軟骨修復(fù)過程中所起的作用至關(guān)重要。軟骨組織工程支架主要用來為構(gòu)建軟骨細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu)，利于細(xì)胞的黏附、增殖，為細(xì)胞的生長提供良好的生長環(huán)境。
[0003]目前，常用的軟骨組織工程支架主要采用天然生物支架材料制備而成，例如，絲素蛋白、纖維蛋白和膠原蛋白等蛋白質(zhì)類，瓊脂糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸和殼聚糖等糖類，采用上述天然生物支架材料制備的軟骨組織工程支架不僅能夠促進(jìn)正常細(xì)胞外基質(zhì)的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成軟骨分化(即軟骨誘導(dǎo)能力)方面具有不可比擬的優(yōu)勢。
[0004]在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問題:
[0005]現(xiàn)有技術(shù)采用上述蛋白質(zhì)類、糖類等材料制備軟骨組織工程支架，由于蛋白質(zhì)類、糖類等材料的力學(xué)強(qiáng)度較差，導(dǎo)致所制備的軟骨組織工程支架的力學(xué)強(qiáng)度較差，從而使現(xiàn)有技術(shù)軟骨組織工程支架在臨床應(yīng)用中的持久性較差。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)提供的軟骨組織工程支架募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能力有限，造成軟骨工程支架的成軟骨化效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供了一種力學(xué)強(qiáng)度高、且能特異性募集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨組織工程支架及其制備方法。具體技術(shù)方案如下:
[0007]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架，包括殼聚糖水凝膠外骨架，包覆在所述殼聚糖水凝膠外骨架中的至少一個(gè)表面修飾有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球；所述脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球的球徑為500-800 μ m。
[0008]具體地，作為優(yōu)選，所述殼聚糖水凝膠外骨架的彈性模量為6_8kPa。
[0009]具體地，作為優(yōu)選，每lmg所述脫鈣皮質(zhì)骨修飾有300-400ng所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽。
[0010]具體地，作為優(yōu)選，所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽為E7多肽。
[0011]具體地，作為優(yōu)選，每1ml所述殼聚糖水凝膠外骨架中，含有150-200mg的所述表面修飾有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球。
[0012]另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種軟骨組織工程支架的制備方法，所述方法包括:制備至少一個(gè)球徑為500-800 μ m的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球；將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾到所述至少一個(gè)脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球表面，并加入殼聚糖水凝膠溶液中，在32-38°C下進(jìn)行凝膠化反應(yīng)28-32min，得到軟骨組織工程支架。
[0013]具體地，作為優(yōu)選，所述脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球的制備方法如下:將股骨上附著的軟組織剔去，獲取股骨的皮質(zhì)骨，對所述皮質(zhì)骨進(jìn)行脫脂、脫鈣處理及清洗處理后，進(jìn)行粉碎，得到脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球，篩取球徑為500-800 μ m的所述脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球，冷凍干燥后備用Ο
[0014]具體地，作為優(yōu)選，所述將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾到所述至少一個(gè)脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球表面，具體為:將所述脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球置于1，6_已二胺溶液中浸泡l-2h，加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽以及交聯(lián)劑，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，獲得用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球。
[0015]具體地，作為優(yōu)選，所述交聯(lián)劑為琥珀酰亞胺-4- (N-馬來酰亞胺)環(huán)已烷-1-1羥酸酯。
[0016]具體地，作為優(yōu)選，所述殼聚糖水凝膠溶液通過如下方法配制:先配制殼聚糖的乙酸溶液，其中，每7.5g的殼聚糖溶于250-300ml的0.lmol/L的乙酸溶液中，高壓滅菌后于3-4°C保存；再配制質(zhì)量濃度為50%-60%的甘油磷酸鈉溶液，除菌后于3-4°C保存；在冰浴環(huán)境中，將所述甘油磷酸鈉溶液滴加到所述殼聚糖的乙酸溶液中，攪拌至澄清，得到所述殼聚糖水凝膠溶液，室溫保存。
[0017]本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:
[0018]本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架，用殼聚糖水凝膠包覆表面修飾有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球，一方面，通過殼聚糖水凝膠外骨架賦予該支架良好的流變性和易塑性，以便于使該支架適用于形狀各異的軟骨缺損區(qū)；另一方面，通過脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球賦予該支架良好的力學(xué)支撐，使其具有適宜的生物力學(xué)強(qiáng)度，提高該支架的持久性；再一方面，通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾于脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球表面，利于該支架在軟骨缺損區(qū)特異性地富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)而獲得更多的分化軟骨細(xì)胞。可見，本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架具有較強(qiáng)的軟骨組織修復(fù)能力，便于規(guī)?；茝V應(yīng)用。
【附圖說明】
[0019]為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0020]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的用羅丹明熒光劑標(biāo)記的E7多肽在脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球上修飾狀態(tài)示意圖；
[0022]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1提供的軟骨組織工程支架的掃描電鏡圖；
[0023]圖4是本發(fā)明實(shí)施例2提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架的生物降解率對比示意圖；
[0024]圖5是本發(fā)明實(shí)施例2提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架的平衡膨脹率對比示意圖；
[0025]圖6-1是本發(fā)明實(shí)施例3提供的，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在第一支架、第一對比支架和第二對比支架上的增殖量結(jié)果示意圖；
[0026]圖6-2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架上DNA測定結(jié)果示意圖；
[0027]圖6-3是本發(fā)明實(shí)施例3提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架上GAG測定結(jié)果示意圖；
[0028]圖7-1是本發(fā)明實(shí)施例4提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架上蛋白聚糖基因表達(dá)的對比示意圖；
[0029]圖7-2是本發(fā)明實(shí)施例4提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架上II型膠原基因表達(dá)的對比示意圖；
[0030]圖8是本發(fā)明實(shí)施例5提供的，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在第一支架、第一對比支架和第二對比支架上的增殖狀態(tài)示意圖；
[0031]圖9是本發(fā)明實(shí)施例6提供的，第一支架在裸鼠皮下形成的軟骨的形態(tài)結(jié)構(gòu)示意圖；
[0032]圖10是本發(fā)明實(shí)施例6提供的，第一支架、第一對比支架和第二對比支架進(jìn)行HE染色、甲苯胺藍(lán)染色和II型膠原免疫組化染色后的對比示意圖。
[0033]附圖標(biāo)記分別表示:
[0034]1 殼聚糖水凝膠外骨架；
[0035]2 脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球；
[0036]3 第一對比支架；
[0037]4 第二對比支架；
[0038]5 第一支架。
【具體實(shí)施方式】
[0039]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。
[0040]—方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種軟骨組織工程支架，如圖1所示，該支架包括殼聚糖水凝膠外骨架1，包覆在殼聚糖水凝膠外骨架1中的至少一個(gè)表面修飾有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球2。其中，脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球的球徑為500-800 μ m。
[0041]本發(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架，用殼聚糖水凝膠包覆表面修飾有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽的脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球2，一方面，通過殼聚糖水凝膠外骨架1賦予該支架良好的流變性和易塑性，以便于使該支架適用于形狀各異的軟骨缺損區(qū)；另一方面，通過脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球2賦予該支架良好的力學(xué)支撐，使其具有適宜的生物力學(xué)強(qiáng)度，提高該支架的持久性；再一方面，通過將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞親和肽修飾于脫鈣皮質(zhì)骨基質(zhì)微球2表面，利于該支架在軟骨缺損區(qū)特異性地富集骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)而獲得更多的分化軟骨細(xì)胞?？梢姡景l(fā)明實(shí)施例提供的軟骨組織工程支架具有較強(qiáng)的軟骨組織修復(fù)能力，便于規(guī)?；茝V應(yīng)用。
[0042]具體地，在該支架中，殼聚糖水凝膠外骨架1可以理解為已經(jīng)發(fā)生了凝膠化反應(yīng)，在未發(fā)生凝膠化反應(yīng)之前，該殼聚糖水凝膠外骨架1的粘度為300-400cP，通過使其粘度在如上范圍內(nèi)，以保證軟骨組織支架具有適宜的流變性和易塑性，使該支架能適應(yīng)不規(guī)則的軟骨缺損區(qū)域，