小口徑人造血管及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小口徑人造血管，本發(fā)明還涉及一種制造小口徑人造血管的方 法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工血管在替代大動(dòng)脈方面已取得滿意的效果，然而在中、小動(dòng)脈和靜脈外科上， 尚難以滿足臨床的要求。小動(dòng)脈和靜脈指直徑<6mm的血管。由于因其材料生物相容性不 佳導(dǎo)致的血栓形成和遠(yuǎn)期通暢率低等原因，離實(shí)際應(yīng)用還有很大的距離。
[0003] 血管壁的三層結(jié)構(gòu)中，鄰近管腔最內(nèi)層為內(nèi)膜，主要是內(nèi)皮細(xì)胞；它們不僅是介 于血管壁和血液之間的屏障結(jié)構(gòu)，而且是體內(nèi)一種代謝十分活躍的內(nèi)分泌器官，能合成和 分泌多種生物活性物質(zhì)，如分泌一氧化氮、前列環(huán)素等活性物質(zhì)，可有效防止血栓形成，維 持血管收縮與舒張、凝血與抗凝血等平衡，在血管腔的表面形成一個(gè)抗凝血和抗血栓系統(tǒng)， 另外內(nèi)皮細(xì)胞同血細(xì)胞一樣表面帶負(fù)電荷，因而具有抗血小板聚集、防止血液凝固和血栓 形成的作用，從而保持血液的正常流動(dòng)和血管的長(zhǎng)期通暢。人工血管與自體血管的主要區(qū) 別是無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯里，所以如何使人工血管內(nèi)皮化顯然尤為重要。人工血管內(nèi)表面不能自 發(fā)形成完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋層有關(guān)，當(dāng)血液與人造內(nèi)腔接觸時(shí)，會(huì)引發(fā)血小板富集型血栓。 因此，目前人們?cè)谠O(shè)想構(gòu)建人造血管時(shí)都主要考慮如何提高其內(nèi)皮覆蓋率或是直接使用可 塑性強(qiáng)的物質(zhì)作為內(nèi)膜。
[0004] 理想的人造血管應(yīng)有良好的組織相容性、抗血栓性、物理穩(wěn)定性、抗感染性和易使 用性，而優(yōu)良的力學(xué)性能和良好的血液組織相容性，則是人造血管技術(shù)突破的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)良的力學(xué)性能和良好的血液組織相容性并且通暢 性好的小口徑人造血管。
[0006] 為達(dá)到此目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] -種小口徑人造血管，其特征在于：所述小口徑人造血管采用魚鰾材料制成，其口 徑范圍是約
[0008] 優(yōu)選的，本發(fā)明的小口徑人造血管，還可以具有這樣的特征：
[0009] 其中，所述魚鰾取自鯉魚。
[0010] 另外，本發(fā)明的小口徑人造血管，還可以具有這樣的特征：
[0011] 其中，所述魚鰾取自鰱魚。
[0012] 另外，本發(fā)明的小口徑人造血管，還可以具有這樣的特征：
[0013] 其中，所述鯉魚的重量為4-4. 5kg。
[0014] 一種制備如權(quán)利要求1所述的人造血管的方法，其特征在于，包括以下步驟：原材 料預(yù)處理，取魚鰾，去除表面結(jié)締組織及血管，使用戊二醛溶液微壓固定；材料裁剪，將固定 后的材料裁剪成預(yù)定大??；縫合，將裁剪好的材料纏繞于支承件上，邊緣對(duì)齊并縫合，形成 所述人造血管。
[0015] 另外，本發(fā)明所提供的制備人造血的方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述戊 二醛溶液的濃度為0.625%。
[0016] 另外，本發(fā)明所提供的制備人造血的方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述預(yù) 定大小為1 5mm X 6mm 〇
[0017] 另外，本發(fā)明所提供的制備人造血的方法，還可以具有這樣的特征：其中，所述縫 合步驟采用8-0丙烯線進(jìn)行所述縫合，針距為1mm。
[0018] 發(fā)明作用與效果
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的小口徑人造血管，由于其采用了魚鰾材料作為制作材料，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn) 證明由其制成的小口徑人造血管與傳統(tǒng)的使用牛心包制成的人造血管相比，具有更好的力 學(xué)特性，更好的熱穩(wěn)定性，更好的血管新生內(nèi)膜覆蓋，更佳的通暢性，更好的血液相容性，無(wú) 鈣化，無(wú)血管瘤形成。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是新鮮及交聯(lián)處理后的魚鰾的周、縱向單抽拉伸試驗(yàn)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；
[0021] 圖2是新鮮及交聯(lián)處理魚鰾與牛心包的周、縱向力學(xué)指標(biāo)比較結(jié)果；
[0022] 圖3是戊二醛交聯(lián)處理后的魚鰾周、縱向和牛心包ε f值比較結(jié)果；
[0023] 圖4是新鮮及交聯(lián)后魚鰾DSC曲線；
[0024] 圖5是使用魚鰾材料制備好的人造血管；
[0025] 圖6是人造血管植入之后的后續(xù)實(shí)驗(yàn)的總實(shí)驗(yàn)流程圖；
[0026] 圖7是魚鰾和牛心包增厚的對(duì)比圖；
[0027] 圖8是掃描電鏡觀察結(jié)果的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋情況圖；
[0028] 圖9是人造血管Von Kossa染色結(jié)果；以及
[0029] 圖10是通暢人造血管管腔中段HE、VB染色結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下結(jié)合附圖來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0031] 實(shí)施例中所使用的試劑的配制
[0032] 1、0· 01mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS) :NaC18. 00g, KC10. 20g, Na2HP04. 12g, H203. 2 2g, KH2P0 40. 20g溶于900ml去離子水內(nèi)，PH值調(diào)整至7. 35,加入去離子水，體積調(diào)整至 1000 ml后，過(guò)濾消毒，分裝后4°C保存。
[0033] 2、0. 625%戊二醛溶液：量取25%戊二醛溶液25ml，溶于975mlPBS緩沖液中，過(guò)濾 消毒，分裝后4°C保存。
[0034] 3、0. 2%戊二醛溶液：量取25%戊二醛溶液8ml，溶于992mlPBS緩沖液中，過(guò)濾消 毒，分裝后4°C保存。
[0035] 4、肝素溶液：肝素鈉1支（12500U)加之250ml生理鹽水。4°C冰箱保存。
[0036] 5、0. 3%戊巴比妥鈉溶液：1. 2g戊巴比妥鈉粉，生理鹽水定容至40ml。4°C冰箱保 存?zhèn)溆谩?br>[0037] 6、1 %硝酸銀溶液：硝酸銀Ig加蒸餾水至100mL。
[0038] 7、3%硫代硫酸鈉溶液：硫代硫酸鈉 3g，蒸饋水加至100ml。
[0039] 8、0.0 lM檸檬酸緩沖液（pH6. 0±0.1 ) :A液：0.1 M檸檬酸：取21. Olg檸檬酸加水至 lOOOmL，B液：0.1 M檸檬酸三鈉：2. 94g檸檬酸三鈉加水至1000ml，取A液9ml和B液41ml 加 450ml蒸饋水（調(diào)pH至6· 0±0· 1)。
[0040] 9、DSC 溶液：4% 甲醛溶液 40ml，22 % 乙醇溶液 220ml，tween-80 試劑 12ml，用 ddH20 定容至 1000ml。
[0041] 一、取材
[0042] 1.實(shí)驗(yàn)組取材
[0043] 蘇州市陽(yáng)澄湖漁場(chǎng)挑選重量4-4. 5kg的野生活鯉魚，敲擊處死，立即剖開(kāi)腹部；獲 取魚鰾并迅速置于無(wú)菌冰生理鹽水中；取魚鰾前部分并仔細(xì)除去表面附著脂肪及血管組 織；冰生理鹽水漂洗3次，每次10分鐘；冰生理鹽水中保存立即送至實(shí)驗(yàn)室；將新鮮魚鰾平 鋪固定完全浸沒(méi)于新鮮配置0.625%戊二醛溶液中，室溫下，48小時(shí)；按周向、縱向裁剪成 中間部分長(zhǎng)lcm、寬0. 7cm的啞鈴形狀；0. 2 %戊二醛溶液中室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 2.對(duì)照組取材：戊二醛交聯(lián)處理的小牛心包拉力樣本
[0045] 蘇州市陽(yáng)澄湖小牛屠宰場(chǎng)獲得初生小牛；放血處死；立即開(kāi)胸；獲取完整心包膜 并迅速置于無(wú)菌冰生理鹽水中；仔細(xì)除去表面附著脂肪結(jié)締組織；魚鰾作為新型心血管外 科手術(shù)生物材料的試驗(yàn)研究；冰生理鹽水漂洗3次，每次10分鐘；冰生理鹽水中保存立即 送至實(shí)驗(yàn)室；與魚鰾同法固定，完全浸沒(méi)于新鮮配置0. 625%戊二醛溶液中，室溫，48小時(shí)； 向心方向裁剪成中間部分長(zhǎng)lcm、寬0. 7cm的啞鈴形狀；0. 2%戊二醛溶液中室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0046] 以上樣本均留取新鮮樣本并裁剪成相同形狀作為參照組。
[0047] 二、檢測(cè)物理性能
[0048] (一）單軸拉伸試驗(yàn)
[0049] 試驗(yàn)?zāi)康?br>[0050] (1)由預(yù)試驗(yàn)中新鮮魚鰾組織學(xué)染色、透射電鏡結(jié)果表明，魚鰾是由豐富的膠原纖 維和彈力纖維組成的膜性結(jié)構(gòu)。Victoria blue-van Gieson(維多利亞藍(lán)-苦味酸酸性復(fù) 紅）染色可見(jiàn)魚鰾膠原纖維排列規(guī)則有序，較致密，其中分布彈力纖維，排列致密。透射電 鏡顯示膠原纖維主要呈周向排列，并可見(jiàn)完整彈力纖維及斷端，推測(cè)彈力纖維在周向和縱 向均有分布。戊二醛交聯(lián)劑主要通過(guò)對(duì)膠原纖維進(jìn)行交聯(lián)固定，提高其力學(xué)強(qiáng)度，但無(wú)法交 聯(lián)彈力纖維，單軸拉伸試驗(yàn)即通過(guò)比較新鮮及交聯(lián)后魚鰾各項(xiàng)力學(xué)指標(biāo)，驗(yàn)證膠原纖維分 布特點(diǎn)。
[0051] (2)戊二醛處理后的牛心包已作為目前臨床應(yīng)用的主要生物瓣膜材料，本試驗(yàn)也 通過(guò)單軸拉伸試驗(yàn)測(cè)定戊二醛交聯(lián)后的牛心包力學(xué)參數(shù)，并與同樣處理的魚鰾進(jìn)行比較。
[0052] (二）主要力學(xué)參數(shù)的定義和計(jì)算原理
[0053] (1)阿爾曼西應(yīng)變（Almansi strain, ε ):該參數(shù)為如圖IA所示的應(yīng)力-應(yīng)變曲 線中橫軸的讀數(shù)。通過(guò)相對(duì)拉伸比（stretch ratio) λ經(jīng)由公式ε =〇·5*(1_λ 2)計(jì)算 得來(lái)，其中，λ = 1/1。，表示某一時(shí)刻試樣的拉伸長(zhǎng)度相對(duì)于其無(wú)張力下的初始長(zhǎng)度的相對(duì) 位移比率。上述公式中，1為拉伸試驗(yàn)過(guò)程中某個(gè)時(shí)間點(diǎn)試樣的瞬時(shí)長(zhǎng)度,1。為試樣的初始 長(zhǎng)度。
[0054] (2)柯西應(yīng)力（Cauchy stress, 〇 ):該參數(shù)為如圖IA所示的應(yīng)變-應(yīng)力曲線中縱 軸的讀數(shù)。表示拉伸過(guò)程中某一時(shí)刻力學(xué)試樣單位截面積上所承受的載荷大小（N/cm2)，經(jīng) 由拉壓力傳感器記錄到的某時(shí)刻瞬時(shí)應(yīng)力載荷乘以此時(shí)的相對(duì)位移。比率λ =1/1。(1為 拉伸試驗(yàn)過(guò)程中某個(gè)時(shí)間點(diǎn)試樣的瞬時(shí)長(zhǎng)度，Ic為試樣的初始長(zhǎng)度），再除以試樣的初始厚 度和寬度的乘積獲得，計(jì)算公式為σ = (F* λ)八￥。襯。)。其中，F(xiàn)為瞬時(shí)應(yīng)力載荷，《。和、 分別為試樣的初始寬度和厚度。由于本實(shí)驗(yàn)材料是變形材料，所以在拉伸過(guò)程中，沿拉力方 向顯著拉長(zhǎng)變形的同時(shí)橫截面積隨拉長(zhǎng)而減少。如假設(shè)泊松比為0.5,管壁在拉伸過(guò)程中體 積相對(duì)恒定，因此某一時(shí)刻試樣對(duì)應(yīng)的瞬時(shí)橫截面積應(yīng)為S = (?。襯。*1。)/1，簡(jiǎn)化得到3 = (w0*t(j)A。因此，σ = (F*X)/(W()*t。）=FzT(Wt^ttJ)A] =F/S，即某一時(shí)刻試樣所承受 的瞬時(shí)應(yīng)力大小。
[0055] ⑶彈性模量（Elastic modulus，M):該參數(shù)為如圖IA所示的應(yīng)變-應(yīng)力曲線中， 具體某一點(diǎn)對(duì)應(yīng)的斜率值，以及圖1-3的彈性模量-應(yīng)力曲線中縱軸的讀數(shù)。M表示在該 應(yīng)變程度時(shí)，單位應(yīng)變所對(duì)應(yīng)的單位面積所承受應(yīng)力變化。
[0056] (4)屈服點(diǎn)（Yield point):即組織毀損點(diǎn)（Failure point):在如圖IB所示的 正常生物材料的應(yīng)力-彈性模量曲線上，我們可以發(fā)現(xiàn)該曲線由兩部分組成，前面一部分 其X和y軸數(shù)據(jù)呈線性關(guān)系，表示在單位面積在承受該范圍內(nèi)的載荷時(shí)，等量應(yīng)力的增加將 伴隨等量彈性模量的增加，二者呈線性正比關(guān)系，提示在材料拉伸并承受載荷的初始階段， 其主要表現(xiàn)出的力學(xué)特性是組織微觀結(jié)構(gòu)完好的情況下所具有的正常拉伸-彈性模量關(guān) 系。而在該曲線的后半部分，應(yīng)力和彈性模量的增加不再呈現(xiàn)線性的增長(zhǎng)關(guān)系，具體表現(xiàn) 為：應(yīng)力即使再進(jìn)