專(zhuān)利名稱(chēng)：具有趨化活性的分泌蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別地，本發(fā)明涉及具有多種功能的蛋白及編碼其的多核苷酸、包含多核苷酸的基因工程載體、以及相應(yīng)的藥物組合物，本發(fā)明還涉及所述蛋白和多核苷酸及其藥物組合物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子是由機(jī)體各種細(xì)胞合成分泌的具有多種生理活性和參與病理反應(yīng)的小分子可溶性蛋白質(zhì)。趨化因子是一類(lèi)具有趨化作用的細(xì)胞因子，在機(jī)體的病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血 壓、心衰等心血管疾病等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，趨化因子已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn) 之一。人類(lèi)基因組框架圖完成10周年，目前的任務(wù)是闡明數(shù)以萬(wàn)計(jì)的基因及其產(chǎn)物的功能，深入認(rèn)識(shí)疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)基因和分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)疾病易感基因、抗病基因、藥物敏感基因，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和新的生物技術(shù)藥物。這些工作將花費(fèi)遠(yuǎn)比基因序列分析更多的時(shí)間、更大的投入和更繁重的工作量，也更加具有挑戰(zhàn)性。趨化因子超家族成員具有一定的同源結(jié)構(gòu)，根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)中保守的4、6個(gè)Cys的前2個(gè)Cys的排列方式，可將趨化因子超家族分為CXC、CC、C和CX3C四個(gè)亞家族，它們的功能除趨化活性外，還具有細(xì)胞活化等多種生物學(xué)效應(yīng)。這些趨化因子與七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體特異結(jié)合，通過(guò)G蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其生物學(xué)活性。迄今為止，大約50種趨化因子和20種趨化因子受體被發(fā)現(xiàn)，其中多種趨化因子可以通過(guò)同一趨化因子受體發(fā)揮趨化作用，同一趨化因子還可通過(guò)作用于幾種趨化因子受體發(fā)揮趨化作用。近年來(lái)，免疫療法發(fā)生了變化，從基礎(chǔ)向臨床的轉(zhuǎn)化到藥物開(kāi)發(fā)成為更為重要的途徑。通過(guò)描述免疫系統(tǒng)相關(guān)趨化因子及其配體如何組織在生理和病理活動(dòng)中發(fā)揮作用，暗示趨化因子有強(qiáng)大的臨床應(yīng)用前景，可以用作免疫療法的治療靶或輔助治療劑或主要療法。本發(fā)明人利用人類(lèi)功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，生物信息學(xué)分析，分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)，從人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)掘具有重要生理、病理意義的新基因，為闡明疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)疾病標(biāo)志物、基因組藥物靶標(biāo)(開(kāi)發(fā)化合物、抗體、多肽藥物)或基因工程藥物提供基礎(chǔ)。基因表達(dá)及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)方法包括反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡、ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)等檢測(cè)方法?？梢詰?yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究以及臨床生理和病理疾病(病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病)中細(xì)胞和組織的基因表達(dá)及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測(cè)。
具有重要生理、病理意義的基因及其編碼產(chǎn)物蛋白質(zhì)，可以作為藥物靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)靶向這一分子本身及其相互作用分子的化合物、抗體、多肽藥物或基因工程藥物和商品化試齊U，應(yīng)用于發(fā)病機(jī)制研究，疾病標(biāo)志物的研究和臨床檢測(cè)，及研究和臨床的藥物的治療。

發(fā)明內(nèi)容
利用生物信息學(xué)技術(shù)，本發(fā)明從新基因中首次成功地篩選出了新的具有趨化活性的細(xì)胞因子，即 FAM19A5 (Family with sequence similarity 19, member A5),其核酸序列在 Gen-bank 的注冊(cè)登記號(hào)為 BC039396. I ；NM_001082967. I ;NM_015381. 5。其中，BC039396. I、NM_001082967. I 和 NM_015381. 5 分別編碼 114、132 和 125 個(gè)氨基酸，在體外具有趨化活性。本發(fā)明經(jīng)蛋白表達(dá)、純化、N端測(cè)序和趨化功能檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)證明FAM19A5具有趨化活性的分泌蛋白為其C端89個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明還包括在FAM19A5的基礎(chǔ)上陸續(xù)得到的其它一些新的蛋白。本發(fā)明在一方面提供了一種具有趨化活性的蛋白。

本發(fā)明在另一方面提供了一種編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸。本發(fā)明在另一方面提供了一種含有本發(fā)明的多核苷酸的基因工程載體。本發(fā)明在另一方面提供了一種藥物組合物，該藥物組合物含有本發(fā)明的蛋白、多核苷酸和/或基因工程載體，以及一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明在另一方面提供了本發(fā)明的蛋白或多核苷酸在制備預(yù)防和/或治療病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在另一方面提供了檢測(cè)待測(cè)樣品中本發(fā)明的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平是否變化的方法。本發(fā)明在另一方面了本發(fā)明的蛋白或多核苷酸在制備商品化試劑研究病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的應(yīng)用。本發(fā)明在另一方面提供了以本發(fā)明的蛋白或多核苷酸或本發(fā)明蛋白的相互作用分子作為靶開(kāi)發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種蛋白，該蛋白包含(I)如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白；或(2)具有(I)所述蛋白至少80%同源性的氨基酸序列，其功能與⑴所述蛋白的功能相同或相似或不同的生物學(xué)功能。其中，如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的蛋白，為FAM19A5蛋白的C末端89個(gè)氨基酸序列(FAM19A5蛋白的核酸序列在Gen-bank 的注冊(cè)登記號(hào)為BC039396. I ；NM_001082967. I ；NM_015381. 5);在本發(fā)明中稱(chēng)為 FAM19A5 分泌蛋白。本發(fā)明蛋白還包括具有與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列至少80%，優(yōu)選至少85%，更為優(yōu)選至少90%，更進(jìn)一步優(yōu)選至少95%，特別優(yōu)選至少98%，更為特別優(yōu)選至少99%同源性(序列匹配)的序列。這些序列可以與本發(fā)明的SEQ ID NO :1所示的序列具有相同、相似或不同的生物學(xué)功能，優(yōu)選具有相同或相似的功能。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白為(I)如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白；或(2)具有(I)所述蛋白至少90%同源性的氨基酸序列，其功能與(I)所述蛋白的功能相同或相似或不同的生物學(xué)功能。再者，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明還提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含(I)編碼SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多核苷酸；或(2)具有⑴所述多核苷酸至少80%同源性的多核苷酸序列，其編碼的蛋白與(I) 所述多核苷酸編碼的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。如SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列為FAM19A5分泌蛋白89個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可以只編碼FAM19A5分泌蛋白，也可以在上述蛋白的編碼序列的基礎(chǔ)上，增加非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。本發(fā)明的多核苷酸序列最好是以分離形式提供的。本發(fā)明的多核苷酸是“分離”形式的，其不僅已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還包括具有與編碼FAM19A5分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70 %、優(yōu)選至少80 %、更為優(yōu)選至少85 %，更進(jìn)一步優(yōu)選至少90 %、特別優(yōu)選至少95%，更為特別優(yōu)選至少98%同源性的多核苷酸序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸為與編碼SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段具有至少80%同源性的多核苷酸，該多核苷酸編碼的蛋白與SEQ ID NO :1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。還有，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明還涉及一種基因工程載體，該基因工程載體含有編碼本發(fā)明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程載體可以是普通載體、表達(dá)載體等。另外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明還提供所述FAM19A5分泌蛋白在制備預(yù)防和/或治療病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白具有與趨化因子相當(dāng)?shù)内吇钚?，而其又?lái)源于人類(lèi)本身，所以FAM19A5分泌蛋白在多種疾病的預(yù)防和/或治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。另外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明還提供所述FAM19A5分泌蛋白在制備商品化試劑研究病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的應(yīng)用。另外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，本發(fā)明還提供一種體外檢測(cè)來(lái)自待測(cè)者的樣品中本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平的方法，該方法為反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡或ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。


圖I顯示利用Western Blotting檢測(cè)FAM19A5分泌蛋白的表達(dá)結(jié)果。加入Anti-c-myc抗體作用后，再加入IRDyeTM 800標(biāo)記的抗鼠IgG 二抗反應(yīng)，經(jīng)OdysseyImaging System 掃描。其中A 為 FAM19A5 (BC039396. l)-myc_his 過(guò)表達(dá)的上清，在 22kd處有兩條清晰條帶；B為FAM19A5(NM_001082967)-myc-his過(guò)表達(dá)的上清，在22kd處有兩條清晰條帶；C為FAM19A5 (NM_015381. 5) -myc-his過(guò)表達(dá)的上清，在22kd處有一條清晰條帶。圖2顯示FAM19A5分泌蛋白上清液的趨化作用。其中A_1、A_2和A_3分別顯示FAM19A5 (BC039396. I) ,FAM19A5 (NM_001082967. I)和 FAM19A5 (NM_015381. 5)對(duì) PBMC 趨化作用，而PcDB表達(dá)上清為對(duì)照，可見(jiàn)FAM19A5具有明顯的趨化作用；B顯示FAM19A5對(duì)豚鼠中性粒細(xì)胞趨化作用，而PcDB表達(dá)上清為對(duì)照，可見(jiàn)FAM19A5具有明顯的趨化作用；C顯示FAM19A5對(duì)U937趨化作用，pcDB表達(dá)上清為對(duì)照，F(xiàn)AM19A5具有明顯的趨化作用；D顯示FAM19A5對(duì)Jurkat趨化作用，pcDB表達(dá)上清為對(duì)照，F(xiàn)AM19A5具有明顯的趨化作用；E顯示FAM19A5對(duì)THP-I趨化作用，pcDB表達(dá)上清為對(duì)照，F(xiàn)AM19A5具有明顯的趨化作用。 圖3A顯示FAM19A5-myc_his6真核蛋白N端測(cè)序結(jié)果，具體地顯示FAM19A5 (BC039396. I)-myc_his在22kd處一條清晰條帶的N端測(cè)序的10個(gè)氨基酸的結(jié)果。圖3B1顯示FAM19A5-myc_his6真核蛋白N端測(cè)序結(jié)果，具體地顯示FAM19A5 (NM_001082967) -myc-his在22kd處兩條清晰條帶的N端測(cè)序的10個(gè)氨基酸的結(jié)果。圖3B2，與圖3B1 —起，也顯示FAM19A5-myc_his6真核蛋白N端測(cè)序結(jié)果，具體地顯示FAM19A5 (NM_001082967) -myc-his在22kd處兩條清晰條帶的N端測(cè)序的10個(gè)氨基酸
的結(jié)果。圖3C顯示FAM19A5(NM_015381.5)-myc-his在22kd處一條清晰條帶的N端測(cè)序的10個(gè)氨基酸的結(jié)果。圖4 顯不 RT-PCR 鑒定 PBMC 在不同濃度 LPS (Lipopolysaccharides)刺激下FAM19A5轉(zhuǎn)錄水平的變化。圖中，第I泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4、5、6、7、8泳道是分別以PBMC分別用LPS 10ng/ml, I u g/ml, 5 u g/ml分別刺激6h、24h的逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板。其中，A顯示以FAM19A5isoforml (Fl，Rl)為引物擴(kuò)增40輪的電泳結(jié)果，未見(jiàn)任何特異條帶；B顯示以FAM19A5isoform2(Fl，Rl)為引物擴(kuò)增35輪的電泳結(jié)果，在353bp處可見(jiàn)一條清晰帶；C顯示以GAPDH (FLRl)為引物擴(kuò)增22輪的電泳結(jié)果，在496bp處可見(jiàn)一條清晰帶，為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。圖5顯示純化后的FAM19A5原核蛋白樣品經(jīng)12. 5% SDS-PAGE電泳，直接考馬斯亮藍(lán)染色。圖中，箭頭所指為FAM19A5-his6原核蛋白。第I泳道為FAM19A5上樣30^1 ;第2泳道為BSA 100 U g ;第3泳道為BSA500 U g ;第4泳道為BSA 1000 U g ;第5泳道為FAM19A5上樣5 y I。圖6A和6B顯示FAM19A5原核蛋白對(duì)THP-I細(xì)胞的趨化作用。其中表明在FAM19A5原核蛋白100ng/ml趨化作用最為明顯。圖7顯示FAM19A5在人類(lèi)各組織的表達(dá)譜。圖中，第I泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17泳道分別是人的心、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎、
胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)。其中，A顯示以FAM19A5isoforml(Fl，Rl)為引物擴(kuò)增40輪的電泳結(jié)果，在311bp處可見(jiàn)一條清晰帶；B顯示以FAM19A5isoform2(Fl，Rl)為引物擴(kuò)增40輪的電泳結(jié)果，在353bp處可見(jiàn)一條清晰帶；C顯示以GAPDH (FLRl)為引物擴(kuò)增25輪的電泳結(jié)果，在496bp處可見(jiàn)一條清晰帶，為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果顯示FAM19A5iS0f0rml在腦、肺、肝、骨骼肌、腎、胸腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸中表達(dá)，余組織未見(jiàn)表達(dá)；FAM19A5iS0f0rm2在腦、腎、胰腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸中表達(dá)，余組織未見(jiàn)表達(dá)。圖8A和8B顯示FAM19A5在人乳腺癌細(xì)胞系MCF7中內(nèi)源性定位A、B為細(xì)胞免疫熒光染色的結(jié)果。C、D為細(xì)胞免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果。A顯示同型對(duì)照大鼠IgG檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5定位；B顯示FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位；C顯示為同型對(duì)照大鼠IgG檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位；D顯示FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位。 圖9A和9B顯示FAM19A5在大鼠主動(dòng)脈球囊損傷模型的主動(dòng)脈免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。A、B、C、D分別是4只不同的大鼠個(gè)體。圖注200X和400X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)，“ + ”表示球囊損傷組大鼠，表示未損傷對(duì)照組大鼠。圖10顯示FAM19A5在動(dòng)脈粥樣硬化患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。A、B分別是2個(gè)不同的病例。圖注200X和400X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)，RatIgG為抗體的同型對(duì)照，Rat anti 19A5表示用FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)FAM19A5在組織中的陽(yáng)性信號(hào)。圖IlA至IlD顯示FAM19A5在脂肪組織免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。圖片A是小鼠肺部組織的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。B是乳腺腫瘤免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。C是卵巢腫瘤免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。D是正常甲狀旁腺免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。圖注200X和400 X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)。
具體實(shí)施例方式以下針對(duì)前述的發(fā)明主題就一些具體實(shí)施方式
進(jìn)行較為詳細(xì)的說(shuō)明。然而應(yīng)該理解，這些說(shuō)明以及后面所列的實(shí)施例不是用來(lái)限制本發(fā)明權(quán)利要求的范圍。本發(fā)明構(gòu)建了FAM19A5 真核表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3. 1-FAM19A5 (BC039396. I ；NM_001082967. I ；NM_015381. 5)-MYC-HIS6以及293T真核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得分泌表達(dá)的FAM19A5重組蛋白。分泌表達(dá)的FAM19A5上清對(duì)人外周血單核細(xì)胞、豚鼠中性粒細(xì)胞及U937、Jurkat, THP-I細(xì)胞具有趨化作用。進(jìn)一步通過(guò)SDS-PAGE分離獲得FAM19A5蛋白條帶，進(jìn)行N端測(cè)序，得到一種FAM19A5分泌蛋白，為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)的FAM19A5分泌蛋白的成熟形式。同時(shí)，本發(fā)明構(gòu)建了該分泌蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行原核表達(dá)得到FAM19A5原核蛋白。該蛋白對(duì)對(duì)THP-I細(xì)胞具有趨化作用。在本發(fā)明所提供的蛋白中，SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的蛋白，為FAM19A5蛋白的C末端89個(gè)氨基酸序列(FAM19A5蛋白的核酸序列在Gen-bank 的注冊(cè)登記號(hào)為BC039396. I ；NM_001082967. I ；NM_015381. 5);在本發(fā)明中稱(chēng)為 FAM19A5 分泌蛋白。本發(fā)明蛋白還包括具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的同源性(序列匹配)超過(guò)80%，優(yōu)選超過(guò)85 %，更為優(yōu)選超過(guò)90 %，更進(jìn)一步優(yōu)選超過(guò)95 %，特別優(yōu)選超過(guò)98 %，更為特別優(yōu)選超過(guò)99%的序列。這些序列可以與本發(fā)明的SEQ ID NO :1所示的序列具有相同、相似或不同的生物學(xué)功能，優(yōu)選具有相同或相似的功能。本發(fā)明FAM19A5分泌蛋白或其片段可以是天然的、合成的、半合成的、或者重組產(chǎn)生。本發(fā)明 FAM19A5 分泌蛋白可按照 Steward 和 Young (Steward, J. M. andYoung, J. D.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd Ed. ， Pierce Chemical Company, Rockford， 111.，(1984))描述的方法用Applied Biosystem合成儀或Pioneer 肽合成儀按固相化學(xué)技術(shù)合成。一般，這些方法包括向成長(zhǎng)的肽鏈上依次添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)保護(hù)的氨基酸。通常，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)，然后將保護(hù)的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應(yīng)氨基或羧基被適當(dāng)保護(hù)的序列中的下一個(gè)氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護(hù)基，再加入必要時(shí)適當(dāng)保護(hù)的下一個(gè)氨基酸，如此重復(fù)操作。當(dāng)所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時(shí)除去任何剩余的保護(hù)基和固相支持物，得到最終的蛋白。通過(guò)簡(jiǎn)單修改此標(biāo)準(zhǔn)程序，可能一次向成長(zhǎng)鏈添加一個(gè)以上的氨基酸。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，使用自動(dòng)合成儀制備本發(fā)明的蛋白。其中使用a氨基被酸或堿敏感性基團(tuán)保護(hù)的氨基酸。這種保護(hù)基應(yīng)該在肽鍵形成條 件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞成長(zhǎng)的肽鏈、不會(huì)引起其中的任何手性中心外消旋。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的。也可按常規(guī)的生物工程方法由宿主細(xì)胞中的重組DNA序列編碼產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白(具體參見(jiàn)實(shí)施例1-4)。在實(shí)施例1-4中，將FAM19A5編碼序列插入表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得分泌表達(dá)的FAM19A5重組蛋白，進(jìn)一步通過(guò)SDS-PAGE分離獲得FAM19A5蛋白條帶，進(jìn)行N端測(cè)序，得到本發(fā)明的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知道，可以直接使用編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸序列產(chǎn)生本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白，例如將編碼本發(fā)明的蛋白的多核苷酸序列(如SEQ ID NO :1所示的序列或其片段)直接插入表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)表達(dá)、純化，獲得本發(fā)明的蛋白。或者可使用衍生于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的mRNA，在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生所需的蛋白。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠知道，本發(fā)明所述的蛋白或其片段可以同其它的蛋白或其片段形成融合蛋白。其它蛋白或其片段一般是已知的，有些可以以載體形式購(gòu)買(mǎi)得到，或者可以按常規(guī)方法合成或從已知生物體中克隆得到。如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列為FAM19A5分泌蛋白89個(gè)氨基酸序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可以只編碼FAM19A5分泌蛋白，也可以在上述蛋白的編碼序列的基礎(chǔ)上，增加非編碼序列，例如內(nèi)含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。本發(fā)明的多核苷酸序列最好是以分離形式提供的。本發(fā)明的多核苷酸是“分離”形式的，其不僅已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)，而且已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)。本發(fā)明還包括具有與編碼FAM19A5分泌蛋白或其片段的多核苷酸至少70%、優(yōu)選至少80%、更為優(yōu)選至少85%，更進(jìn)一步優(yōu)選至少90%、特別優(yōu)選至少95%，更為特別優(yōu)選至少98%同源性的多核苷酸序列。特別涉及在嚴(yán)格條件下與FAM19A5分泌蛋白的多核苷酸雜交的多核苷酸，所說(shuō)的“嚴(yán)格條件”意指發(fā)生雜交的前提是序列間至少具備FAM19A5的95%的同源性。這樣的序列可以是天然存在或人工產(chǎn)生的，可以包括FAM19A5分泌蛋白的多核苷酸序列的等位基因變異體、也可以包括FAM19A5分泌蛋白多核苷酸序列中堿基的缺失、插入及置換。這樣的序列編碼的蛋白可以在功能上與本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白相同、相似、或不同，但最好是編碼與FAM19A5分泌蛋白的生物學(xué)活性基本相同的蛋白。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸為具有與編碼SEQ IDNO 1所示氨基酸序列的多核苷酸序列或其片段至少80%同源性的多核苷酸，該多核苷酸編碼的蛋白與SEQ ID NO :1所示的蛋白具有相同或相似或不同的生物學(xué)功能。本發(fā)明的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明所述的反義鏈可以為如SEQ ID NO :1所示的序列的互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，反義鏈或者其一部分(反義寡核苷酸)可用于抑制細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明FAM19A5分泌蛋白的表達(dá)。本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白的核苷酸序列可以來(lái)自任何物種，特別是哺乳動(dòng)物，包括牛、羊、豬、鼠、馬，優(yōu)選人類(lèi)。如SEQ ID NO :1所示的多核苷酸序列為一種編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸，其來(lái)自 人類(lèi)。所以，優(yōu)選本發(fā)明的多核苷酸包含如SEQ ID NO: I所示的多核苷酸或其互補(bǔ)序列。本發(fā)明所涉及的基因工程載體含有編碼本發(fā)明的分泌蛋白的多核苷酸。所述基因工程載體可以是普通載體、表達(dá)載體等。其中普通載體主要用于各種基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的建立，它們通常含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的標(biāo)記基因，其中一個(gè)基因用于選擇轉(zhuǎn)化體(transformant),另一基因則是用于檢查載體中是否有外源DNA插入。表達(dá)載體主要用于研究基因的表達(dá)或是用于大量生產(chǎn)一些有用的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)，有的也可用于cDNA文庫(kù)的建立。這類(lèi)載體除具有普通型載體的特征外，還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等。為了便于表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中定位，在蛋白編碼序列上游可加入適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列。合適載體和啟動(dòng)子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該知道用于構(gòu)建含有本發(fā)明的多核苷酸以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件之載體的方法。具體地說(shuō)，適用于原核細(xì)胞的市售表達(dá)載體一般均帶有可選擇標(biāo)志和細(xì)胞復(fù)制原點(diǎn)，帶有l(wèi)acl、T7、APL和trp等細(xì)菌啟動(dòng)子，以及已知克隆載體pBR322(ATCC 37017)的其他遺傳元件。這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223_3 (Pharmacia)?？筛鶕?jù)所選用的適當(dāng)啟動(dòng)子和待表達(dá)的結(jié)構(gòu)基因序列來(lái)選擇衍生于PBR322的適當(dāng)載體。GST原核表達(dá)系統(tǒng)也可用于本發(fā)明。適用于真核細(xì)胞的載體帶有真核細(xì)胞啟動(dòng)子如CMV、SV40等，這樣的載體包括pMT-hIL-3(馬大龍，狄春輝，龐健等，高技術(shù)通訊 11 :26-29(1991))、pQE-9 (Qiagen)、pD10、pNH18A (Stratagene)、pKK233_3、pDR540、pRIT5 (Pharmacia)，以及 pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG (Stratagene)、pSVL (Pharmacia)。在本發(fā)明的實(shí)施例I中FAM19A5編碼序列插入pCDNA3. l-myc-his6 (Invitrogen 公司)表達(dá)載體，構(gòu)建 pCDNA3. l-FAM19A5-myc_his6 表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明所提供的藥物組合物，可以包含本發(fā)明的蛋白、編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸的基因工程載體和/或宿主細(xì)胞，另外，除了上述活性成分之外，還可以包含一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這些藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的選用取決于，例如藥物的施用途徑。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白能夠用于制備預(yù)防和/或治療病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的藥物。早期研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子和趨化因子受體在介導(dǎo)急慢性驗(yàn)證過(guò)程中起重要作用。近期研究表明趨化因子和趨化因子受體在生長(zhǎng)發(fā)育；穩(wěn)態(tài)的維持；骨質(zhì)疏松癥；肥胖和胰島素抵抗；動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾?。徊《靖腥?；免疫應(yīng)答；骨髓主細(xì)胞的遷移以及自身免疫病等病理生理過(guò)程中發(fā)生重要的作用。晚近的研究也表明，趨化因子和趨化因子受體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的過(guò)程中扮演重要的角色。病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病或腫瘤轉(zhuǎn)移、骨質(zhì) 疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管系統(tǒng)疾病與趨化因子及其受體密切相關(guān)，激動(dòng)劑的脫敏作用，中和抗體等是針對(duì)藥物靶標(biāo)的主要治療手段。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白具有與趨化因子相當(dāng)?shù)内吇钚?，而其又?lái)源于人類(lèi)本身，所以FAM19A5分泌蛋白在多種疾病的預(yù)防和/或治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明還提供本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白在制備商品化試劑研究病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種體外檢測(cè)來(lái)自待測(cè)者的樣品中本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平的方法，該方法為反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印跡或ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。可以采用本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)本發(fā)明所述的蛋白或多核苷酸的表達(dá)水平。優(yōu)選利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)所述多核苷酸在核酸水平的表達(dá)水平；或利用特異性單克隆或多克隆抗體檢測(cè)所述多核苷酸在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)水平，例如或蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)或ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。所述待測(cè)樣品可以從來(lái)自受試者的各種細(xì)胞或體液獲得，如來(lái)自血液、尿、唾液、胃液、頭發(fā)，活組織檢查和尸體解剖材料的細(xì)胞。PT-PCR主要包括以下步驟提取總RNA，加入一個(gè)與mRNA3’端互補(bǔ)的引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA ;以及以cDNA為模板，再加入與cDNA互補(bǔ)的另一引物(兩引物位于不同的外顯子上，以避免基因組DNA污染)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。蛋白質(zhì)印跡主要分三階段第一階段為抗原等蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；第二階段為電轉(zhuǎn)移將在凝膠中已分離的條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；第三階段為顯色檢測(cè)硝酸纖維素膜(相當(dāng)于包被了抗原的固相載體)，依次與特異性抗體和酶標(biāo)第二抗體作用后，加入能形成顯色物的酶反應(yīng)底物，使條帶染色。標(biāo)記二抗的酶包括辣根過(guò)氧化物酶(horseradish Peroxidase,HRP)和喊性憐酸酶(alkaline phosphatease,AP)。也可以使用葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，采用辣根過(guò)氧化物酶作為標(biāo)記二抗的酶。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，針對(duì)不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于臨苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。堿性磷酸酶的底物一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)，AP也有發(fā)熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)。常用的酶標(biāo)第二抗體已有市售。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的FAM19A5分泌蛋白在或多核苷酸或FAM19A5的相互作用分子作為靶開(kāi)發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。實(shí)施例實(shí)施例I、構(gòu)建pcDNA3. l-FAM19A5-myc_his6融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建pcDNA3. l-FAM19A5-myc_his6 質(zhì)粒，用于表達(dá) FAM19A5-myc_his6 融合蛋白。一、方法將FAM19A5 編碼序列(SEQ ID NO 2 ；3 ；4)分別插入pcDNA3. l-myc-his6 (Invitrogen 公司)表達(dá)載體，構(gòu)建 pcDNA3. l-FAM19A5-myc_his6 表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性后，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，用Axygen公司質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

二、結(jié)果經(jīng)DNA測(cè)序編碼區(qū)序列正確。實(shí)施例2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得FAM19A5表達(dá)上清一、方法HEK 293T細(xì)胞調(diào)成6X IO5細(xì)胞/2ml濃度在6孔板中37°C 5% CO2培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，pcDNA3. 1-FAM19A5 (BC039396. I ;或 ΝΜ_001082967. I ;或匪_015381· 5)-myc_his6DNA2μ g，vigofect (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)2 μ 1，混合液慢慢滴入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)pcDNA3. l-myC-his6空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照，6小時(shí)后換無(wú)血清培養(yǎng)基HEKG，37°C培養(yǎng)48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染后的上清。利用Western Blotting檢查目的蛋白的表達(dá)經(jīng)12. 5% SDS-PAGE電泳，用Tris-甘氨酸電轉(zhuǎn)液將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，加入Anti-c-myc抗體(MBL公司)作用后，再加入IRDyeTM 800標(biāo)記的抗鼠IgG(LIC0RBioscience),采用 Odyssey Imaging System 檢測(cè)系統(tǒng)直接檢測(cè)。二、結(jié)果利用Western Blot檢查目的蛋白的表達(dá)結(jié)果請(qǐng)參見(jiàn)圖I所示。加入Anti-c-myc抗體作用后，再加入IRDyeTM 800標(biāo)記的抗鼠IgG 二抗反應(yīng),經(jīng)Odyssey Imaging System掃描,在22kd處有清晰的條帶(圖I,A-C)。實(shí)施例3、人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離一、方法濃縮白細(xì)胞由北京市血液中心提供，采用淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司)獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞。用含10%熱滅活的胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素的 RPMI 1640 (Life Technologies, Inc.)培養(yǎng)。二、結(jié)果獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)備用。實(shí)施例4、豚鼠嗜中性粒細(xì)胞的制備一、方法取成年豚鼠I只，腹腔注射含0. 17%糖原的生理鹽水，13小時(shí)后，用PBS緩沖液沖洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min lOmin，棄上清。用3_5ml PH 7. 2的37°C預(yù)溫的(Tris-NH4Cl)紅細(xì)胞溶解液裂紅，再加入serum-free RPMI1640，離洗兩次。將純化后的嗜中性粒細(xì)胞溶在serum-free RPMI 1640中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 X 105/ml，備用。二、結(jié)果得到豚鼠嗜中性粒細(xì)胞，純度可達(dá)97%以上。實(shí)施例5、FAM19A5上清的趨化功能一、方法FAM19A5上清的趨化功能檢測(cè)趨化實(shí)驗(yàn)在48孔的趨化小室(Neutroprobe ；Cabin John, MD，U. S. A.)里進(jìn)行。用作趨化檢測(cè)的上清加到小室的下孔里(28 μ I/孔)，然后用!fepes RPMI 1640稀釋后同樣的培養(yǎng)基重懸為I X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，加到小室的上孔中(55μ I/孔)，上下孔用無(wú)聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜相隔，PBMC和豚鼠中性粒細(xì)胞使用濾膜孔徑為3 μ m, U937、Jurkat, THP-I使用濾膜孔徑為5 μ m。將小室放入培養(yǎng)箱 37°C,5% CO2，孵育3h。趨化結(jié)束時(shí)PBMC、U937、Jurkat, THP-I吸取小室下孔的細(xì)胞使用Iuc if erase-containing reagent Cell-Titer Glo (Promega)測(cè)量其化學(xué)發(fā)光值反應(yīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)值。轉(zhuǎn)染pcDNA3. I空載體轉(zhuǎn)染上清作為陰性對(duì)照。豚鼠中性粒細(xì)胞趨化結(jié)束時(shí)從小室上移去濾膜，用3步染色試劑盒洗滌，固定，染色。每孔遷移的細(xì)胞隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)。轉(zhuǎn)染pcDNA3. I空載體轉(zhuǎn)染上清作為對(duì)照。趨化指數(shù)Cl為遷移細(xì)胞數(shù)除以對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。Cl > 2有顯著性意義。二、結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)AM19A5培養(yǎng)上清對(duì)PBMC (A-1至A-3)、豚鼠中性粒細(xì)胞⑶、U937 (C)、Jurkat (D)、THP-I (E)均具有趨化作用。實(shí)施例6、FAM19A5-myc-his6蛋白質(zhì)的純化與N端測(cè)序一、方法將HEK 293T細(xì)胞消化離心后調(diào)成I. 5X IO7細(xì)胞密度接種在直徑為150mm平皿中，同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。pcDNA3. l-FAM19A5-myc-his6DNA 12. 5 μ g，PEI (威格拉斯生物技術(shù)有限公司)50μ g,混合液慢慢滴入準(zhǔn)備好的細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)pcDNA3. l-myc_his6空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)照，16小時(shí)后換無(wú)血清培養(yǎng)基HEKG，37°C 5% CO2培養(yǎng)48小時(shí)，收獲轉(zhuǎn)染后的上清。2000rpm/min, 10 分鐘,O. 22 μ m 濾膜過(guò)濾。取 Ni Sepharose 6Fast Flow (GE healthcare)柱料，20倍體積水平衡，5mM咪唑200mM NaCl平衡液平衡，上清過(guò)柱后先用雜蛋白洗液洗柱，再用含IM咪唑的蛋白洗液洗脫。經(jīng)過(guò)純化，洗脫后樣品經(jīng)12. 5% SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用考馬斯亮蘭染色，甲醇/冰乙酸脫色后裁下與Western blot檢測(cè)陽(yáng)性位置相同的帶進(jìn)行蛋白質(zhì)的N端測(cè)序(委托上?；瞪锛夹g(shù)有限公司測(cè)序)。二、結(jié)果如圖3A-3C所示，純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12. 5 % SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜后做 N 端測(cè)序。FAM19A5 (BC039396. l)-myc_his 在 22kd 處有一條清晰條帶；FAM19A5(NM_001082967)-myc-hi s在22kd處有兩條清晰條帶；FAM19A5 (NM_015381. 5)-myc-his在22kd處有一條清晰條帶。全部送至上海基康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行N端測(cè)序。蛋白質(zhì)的N端測(cè)序結(jié)果均為T(mén)-C-E-I-V-T-L-D-R-D。
實(shí)施例7、PBMC在不同濃度LPS (Lipopolysaccharides)刺激下FAM19A5轉(zhuǎn)錄水平的變化一、方法實(shí)施例3中獲得PBMC分別用LPS 10ng/ml，I μ g/ml，5 μ g/ml分別刺激6h、24h后，利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR。以 FAM19A5 isoforml 上游 Fl (5，GCC CTG CCC AGC ATG TCC TC 3’ (SEQID NO :5))，下游 Rl (5，GTC CAG CCT GAC CGG TTG AT 3，(SEQ ID NO :6))為引物，擴(kuò)增 40輪。以 FAM19A5 18(^01'1112上游？1(5，060 TCT GGG CAC TGGCAG G 3，(SEQ ID NO :7))，下游 Rl (5，CGT GGT GGT CTT TAT CCT CCCGC 3，(SEQ ID NO :8))，擴(kuò)增 35 輪。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖膠電泳后EB染色通過(guò)UV拍攝。二、結(jié)果如圖4所示第I泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2、3、4、5、6、7、8泳道是分別以 PBMC分別用LPS 10ng/ml, I μ g/ml，5 μ g/ml分別刺激6h、24h的逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以(A)FAM19A5 isoforml (FI, Rl) ； (B) FAM19A5isoform2 (FI, Rl) ； (C) G3PDH 的Fl(5’ACCACAGTCCATGCCATCAC 3，(SEQ ID NO :9))，R2 (5，TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，(SEQID NO 10))為引物進(jìn)行的RT-PCR。RT-PCR結(jié)果顯示FAM19A5 isoforml在PBMC中沒(méi)有表達(dá)，而FAM19A5 isoform2在PBMC中低表達(dá)，在LPS刺激后表達(dá)增加，其中在I μ g/ml LPS刺激24小時(shí)表達(dá)達(dá)到高峰。實(shí)施例8、構(gòu)建pET32a-FAM19A5-his6融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建pET32a-FAM19A5-his6融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，用于表達(dá)FAM19A5_his6原核蛋白?！⒎椒▽AM19A5編碼序列(SEQ ID NO 11)插入pET32a (Novagen公司)表達(dá)載體，構(gòu)建pET32a-FAM19A5-his6原核表達(dá)質(zhì)粒。測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的正確性后，進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，用維格拉斯小提試劑盒提取質(zhì)粒，用于后續(xù)原核表達(dá)宿主菌轉(zhuǎn)染。二、結(jié)果經(jīng)DNA測(cè)序編碼區(qū)序列正確。實(shí)施例9、FAM19A5_his6原核蛋白表達(dá)以及純化一、方法將pET32a_FAM19A5_his6 原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 Origami B 宿主菌后，280rpm/min37°C LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌生長(zhǎng)至OD O. 6時(shí)，加入IPTG終濃度為25 μ M 250rpm/min 25°C誘導(dǎo)過(guò)夜后，離心后棄去培養(yǎng)基，PBS 7. 4重懸，超聲破碎菌體。收獲破碎菌體后上清液，離心 12000rpm/min, 10 分鐘，O. 22 μ m 濾膜過(guò)濾。取 Ni Sepharose 6HP (GE healthcare)柱料，20倍體積水平衡，20mM咪唑500mM NaCl平衡液平衡，上清過(guò)柱后先用雜蛋白洗液洗柱，再用含500mM咪唑的蛋白洗液洗脫。經(jīng)過(guò)純化，洗脫后樣品經(jīng)超濾管(milipore 3000D)超濾后濃縮。最后過(guò)DEAE(GE healthcare)除內(nèi)毒素,BCA定量后凍存于_80°C用于后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。二、結(jié)果如圖5所示，純化后的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12. 5% SDS-PAGE電泳，直接考馬斯亮藍(lán)染色。圖中用箭頭指示的FAM19A5-his6為目的蛋白條帶。BCA定量結(jié)果示純化后的FAM19A5_his6濃度為500 μ g/ml。實(shí)施例10、FAM19A5-his6原核蛋白的趨化作用一、方法人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)同實(shí)施例3，細(xì)胞貼壁過(guò)夜后，人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)和單核細(xì)胞(Monocyte)得以分離，PBL懸浮生長(zhǎng)，吸出培養(yǎng)基離心后繼續(xù)趨化實(shí)驗(yàn)；加入新鮮培養(yǎng)基，單核細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用細(xì)胞刮刮下離心后繼續(xù)趨化實(shí)驗(yàn)。趨化實(shí)驗(yàn)在48孔的趨化小室(Neutroprobe ； Cab in John, MD, U. S. A.)里進(jìn)行。用作趨化檢測(cè)的蛋白經(jīng)Hepes RPMI 1640加或不加O. I % BSA稀釋至lng/ml、10ng/ml、IOOng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml 加到小室的下孔里(27 μ I/孔)，然后用!fepes RPMI 1640 加或 不加O. 1% BSA稀釋后同樣的培養(yǎng)基重懸為4X IO6個(gè)細(xì)胞/ml，加到小室的上孔中(55 μ I/孔)，在check board實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞預(yù)先通過(guò)與FAM19A5原核蛋白500ng/ml孵育后再加入到趨化小室的上孔中。上下孔用無(wú)聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜相隔，PBL和單核細(xì)胞使用濾膜孔徑為3 μ m, THP-I細(xì)胞使用濾膜孔徑為5 μ m。將小室放入培養(yǎng)箱37°C ,5% CO2,孵育3h。趨化結(jié)束時(shí)從小室上移去濾膜，用3步染色試劑盒洗滌，固定，染色。每孔遷移的細(xì)胞隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)。Ifepes RPMI 1640加或不加0. 1% BSA作為對(duì)照。趨化指數(shù)Cl為遷移細(xì)胞數(shù)除以對(duì)照組細(xì)胞數(shù)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。Cl > 2有顯著性意義。二、結(jié)果如圖6A及6B所示，其中A顯示FAM19A5原核蛋白和真核蛋白對(duì)PBMC具有趨化作用。B顯示FAM19A5原核蛋白與PBMC預(yù)孵育后封閉掉FAM19A5原核蛋白對(duì)PBMC的趨化作用，說(shuō)明FAM19A5原核蛋白對(duì)于PBMC的趨化作用是特異的。C和D分別為FAM19A5原核蛋白對(duì)PBL和單核細(xì)胞具有趨化作用。E顯示FAM19A5原核蛋白對(duì)THP-I具有趨化作用并且在100ng/ml作用最為明顯。實(shí)施例11、FAM19A5在人類(lèi)各組織的表達(dá)譜—、方法人類(lèi)各組織cDNA文庫(kù)購(gòu)自Clontech公司。以FAM19A5isoforml上游Fl (5，GCCCTG CCC AGC ATG TCC TC 3，(SEQ ID NO :5))，下游 Rl (5，GTC CAG CCT GAC CGG TTG AT3’ (SEQ ID NO :6))為引物，擴(kuò)增 40 輪。以 FAM19A5isoform2 上游 Fl (5，CGC TCT GGG CACTGGCAG G 3，(SEQ ID NO :7))，下游 Rl (5，CGT GGT GGT CTT TAT CCT CCCGC 3，(SEQ IDNO 8))，擴(kuò)增40輪。PCR產(chǎn)物進(jìn)行I %的瓊脂糖膠電泳后EB染色通過(guò)UV拍攝。二、結(jié)果如圖7 所示第 I 泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)；第 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17泳道分別是人的心、腦、胎盤(pán)、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血淋巴細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，分別是以(A)FAM19A5isoforml(Fl, Rl) ； (B)FAM19A5 isoform2(F1,R1) ； (C)G3PDH 的 Fl (5，ACCACAGTCCATGCCATCAC 3’ (SEQ IDNO :9))，R2(5’ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3，(SEQ ID NO :10))為引物進(jìn)行的 RT-PCR。結(jié)果顯示FAM19A5isoforml在腦、肺、肝、骨骼肌、腎、胸腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸中表達(dá)，余組織未見(jiàn)表達(dá)；FAM19A5iS0f0rm2在腦、腎、胰腺、睪丸、卵巢、小腸、結(jié)腸中表達(dá)，余組織未見(jiàn)表達(dá)。實(shí)施例12、FAM19A5在人乳腺癌細(xì)胞系MCF7中內(nèi)源性表達(dá)和定位一、方法將MCF7細(xì)胞用含10% FBS, lmg/ml牛胰島素(sigma公司)的MEM培養(yǎng)基在5%CO2, 370C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，消化MCF7細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)成2 X IO5鋪入24孔板中，孔中事先放有直徑為12mm的細(xì)胞爬片(Fisher Coverglass)。讓細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng)48小時(shí)后固定細(xì)胞(室溫15分鐘，1%多聚甲醛)，滲透化(10分鐘，O. 1% NP-40)，封閉(5%山羊血清)。所有溶液用PBS制備。依次用FAM19A5單克隆抗體(R&D公司)、大鼠IgG(sigma公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG染色。最后用Hochest33342染細(xì)胞核。激光共聚焦顯微鏡觀察。在另一實(shí)驗(yàn)中，讓細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng)48小時(shí)后固定細(xì)胞(室溫15分鐘，1%多聚 甲醛)，滲透化(10分鐘，O. 1^^-40),3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。封閉(5%山羊血清)。所有溶液用PBS制備。依次用FAM19A5單克隆抗體(R&D公司)、大鼠IgG (sigma公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG染色。DAKO顯色試劑盒顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察拍照。二、結(jié)果如圖8A及8B所示A、B為細(xì)胞免疫突光染色的結(jié)果。C、D為細(xì)胞免疫化學(xué)染色的結(jié)果。A顯示同型對(duì)照大鼠IgG檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5定位；B顯示FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位；C顯示為同型對(duì)照大鼠IgG檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位；D顯示FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)內(nèi)源性FAM19A5在MCF7細(xì)胞的定位。結(jié)果顯示FAM19A5在MCF7細(xì)胞中細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均有表達(dá)。在細(xì)胞膜與細(xì)胞核中表達(dá)豐度較高。實(shí)施例13、FAM19A5在大鼠主動(dòng)脈球囊損傷模型的主動(dòng)脈表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色一、方法Sprague-Dawley大鼠體重250±50g,雄性，動(dòng)物按照取材時(shí)間隨機(jī)分組,行右側(cè)頸總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張術(shù)。用水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定在動(dòng)物專(zhuān)用固定架上；在頸前作一正中切口，I. 5cm 球囊(Maverick, Boston Scientific Corporation),純性分離左頸總動(dòng)脈，緩慢插入球囊導(dǎo)管，插入深度為4cm。向球囊內(nèi)注入肝素生理鹽水使其膨脹，重復(fù)3次造成內(nèi)膜完全損傷，退出導(dǎo)管，結(jié)扎動(dòng)脈。對(duì)照組進(jìn)行同樣的操作，但并不進(jìn)行球囊損傷操作。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在術(shù)后7天處死，取損傷組與未損傷對(duì)照組的動(dòng)脈血管，4%甲醛固定，梯度酒精逐級(jí)脫水后，包埋、3um切片，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)染色方法如下梯度酒精下行水化，高壓法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，封閉(5%山羊血清)。依次用FAM19A5單克隆抗體(R&D公司)、大鼠IgG(sigma公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG染色。DAKO顯色試劑盒顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀察拍照。二、結(jié)果圖9A及9B為FAM19A5在大鼠主動(dòng)脈球囊損傷模型的主動(dòng)脈表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。A、B、C、D分別是4只不同的大鼠個(gè)體。圖注200X和400X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)，+表示球囊損傷組大鼠，-表示未損傷對(duì)照組大鼠。結(jié)果顯示FAM19A5在球囊損傷組大鼠的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，而在未損傷對(duì)照組大鼠的主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞呈陰性表達(dá)。這樣的差異表達(dá)說(shuō)明FAM19A5與血管平滑肌細(xì)胞活化和增生有關(guān)。實(shí)施例14、FAM19A5在人動(dòng)脈粥樣硬化患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色一、方法標(biāo)本采集人動(dòng)脈粥樣硬化患者外周動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)時(shí)取動(dòng)脈粥樣斑塊。4%甲醛固定，梯度酒精逐級(jí)脫水后，包埋、3 μ m切片，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。免疫組織化學(xué)染色方法同實(shí)施例13。 二、結(jié)果圖10為FAM19A5在人動(dòng)脈粥樣硬化患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。A、B分別是2個(gè)不同的病例。圖注200X和400X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)，Rat IgG為抗體的同型對(duì)照，Rat anti 19A5表示用FAM19A5單克隆抗體檢測(cè)FAM19A5在組織中的陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果顯示FAM19A5在人動(dòng)脈粥樣硬化患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊組織呈陽(yáng)性表達(dá)，而抗體同型對(duì)照Rat IgG無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。說(shuō)明FAM19A5與動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病有關(guān)，可能參與此類(lèi)疾病的發(fā)生與發(fā)展。實(shí)施例15、FAM19A5在脂肪組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色一、方法標(biāo)本采集取正常小鼠C57BL/6J肺組織，乳腺腫瘤和卵巢腫瘤分別在患者行切除術(shù)時(shí)采集的腫瘤標(biāo)本。4%甲醛固定，梯度酒精逐級(jí)脫水后，包埋、3 μ m切片，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。人多器官正常組織組合芯片購(gòu)自陜西超英生物科技有限公司，編號(hào)為FDA999。免疫組織化學(xué)染色方法同實(shí)施例13。二、結(jié)果圖IlA至IlD為FAM19A5在脂肪組織表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。A是小鼠肺部組織表達(dá)的免疫化學(xué)染色結(jié)果。B是乳腺腫瘤表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。C是卵巢腫瘤表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。D是正常甲狀旁腺表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果。圖注100 X，200 X，400 X分別為光學(xué)顯微鏡放大倍數(shù)。結(jié)果顯示FAM19A5在小鼠肺部脂肪組織，人乳腺腫瘤脂肪組織，人卵巢腫瘤脂肪組織，人正常甲狀旁腺脂肪組織中呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。說(shuō)明FAM19A5可能與脂肪代謝有關(guān)，可能是一個(gè)新的脂肪因子。本文通過(guò)一些具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，而且為了描述的目的還針對(duì)許多細(xì)節(jié)進(jìn)行了描述。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以包括一些其它的具體實(shí)施方式
，也可以在不偏離本發(fā)明主旨的情況下針對(duì)所披露的發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和變化。
權(quán)利要求
1.一種蛋白，其包含 (1)具有SEQID NO 1所不氣基酸序列的蛋白；或 (2)具有⑴所述蛋白至少80%同源性的氨基酸序列，其功能與⑴所述蛋白的功能相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
2.如權(quán)利要求I所述的蛋白，其為 (1)具有SEQID NO I所不氣基酸序列的蛋白；或 (2)具有⑴所述蛋白至少90%同源性的氨基酸序列，其功能與⑴所述蛋白的功能相同或相似或不同的生物學(xué)功能。
3.一種多核苷酸，其包含 (1)編碼SEQID NO :I所示氨基酸序列的多核苷酸；或 (2)具有與(I)所述多核苷酸至少80%同源性的多核苷酸序列，其編碼的蛋白與(I)所述多核苷酸編碼的蛋白具有相同的功能或相似或不同的生物學(xué)功能。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其包含具有SEQID NO:I所示的序列或其互補(bǔ)序列。
5.一種基因工程載體，其含有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求I或2所述的蛋白、編碼所述蛋白的多核苷酸和/或含有所述多核苷酸的基因工程載體，以及一種或多種藥物可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.一種使用如權(quán)利要求I或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備預(yù)防和/或治療病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的藥物中的應(yīng)用。
8.—種體外檢測(cè)來(lái)自待測(cè)者的樣品中權(quán)利要求I或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸表達(dá)水平的方法。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，所述方法為反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或蛋白質(zhì)印跡、ELISA、FACS、免疫熒光、免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)方法。
10.一種如權(quán)利要求I或2所述的蛋白或編碼所述蛋白的多核苷酸在制備商品化試劑研究病毒感染、過(guò)敏性疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化、心肌缺血-再灌注損傷、高血壓、心衰等心血管疾病的應(yīng)用。
11.一種如權(quán)利要求I或2所述的蛋白或編碼所述蛋白及其相互作用分子作為靶開(kāi)發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了趨化白細(xì)胞和腫瘤的SEQ ID NO1所示氨基酸序列的FAM19A5分泌蛋白，編碼該蛋白的多核苷酸，及含有多核苷酸的基因工程載體。還涉及藥物組合物，含有所述蛋白或多核苷酸、基因工程載體和/或宿主細(xì)胞，及藥物可接受的鹽、載體或賦形劑。還涉及體外檢測(cè)所述蛋白或多核苷酸表達(dá)水平變化的方法。還有所述蛋白或多核苷酸能用于預(yù)防和/或治療病毒感染、過(guò)敏疾病、炎癥反應(yīng)、移植排斥、腦部疾病、自身免疫病、腫瘤轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、干細(xì)胞增殖分化、骨質(zhì)疏松癥、肥胖和胰島素抵抗、動(dòng)脈硬化、血管鈣化等心血管病，及用于商品化試劑研究上述病狀。還涉及以所述蛋白或多核苷酸作為靶開(kāi)發(fā)化合物、抗體、多肽藥物和商品化試劑。
文檔編號(hào)A61P37/02GK102775490SQ20111041868
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者張文娟, 張焱, 張穎妹, 王平章, 王應(yīng), 石太平, 鄭奕, 郭嫦媛, 郭帥, 馬大龍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)