Prss8檢測(cè)試劑在制備食管炎和胃炎診斷試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑 在制備食管炎和胃炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] PRSS8是絲氨酸蛋白酶家族的一個(gè)成員，最初于1994年在精液中發(fā)現(xiàn)，被證實(shí)由前 列腺分泌，所W又被稱(chēng)為pros化sin JRSS8在人體內(nèi)有兩種存在形式，一種是通過(guò)其簇基末 端的憐脂酷肌醇(GPI)結(jié)構(gòu)錯(cuò)定于細(xì)胞膜，另一種是W分泌蛋白的形式存在于細(xì)胞外?，F(xiàn)有 的研究大多數(shù)W前者為主，而分泌性PRSS8的功能則鮮有研究。
[0003] 食管炎和胃炎作為常見(jiàn)病，危害著人類(lèi)的健康，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，如果不能及 時(shí)治療，則病情可遷延惡化，進(jìn)而影響病人的生存質(zhì)量和存活期，因此通過(guò)檢查對(duì)食管炎和 胃炎進(jìn)行早期診斷有助于盡早的治療疾病，控制病情的發(fā)展，避免進(jìn)一步惡化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有食管炎和胃炎診斷技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是是開(kāi)發(fā)PRSS8在食管炎 和胃炎診斷中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑在制備食管 炎和胃炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0006] 其中，所述檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑包括實(shí)時(shí)巧光定量PCR引物對(duì)，在所述 PCR引物對(duì)中。
[0007] 上游引物序列為:5/-464664〔4了66了6了6了6口'6-3/;
[000引下游引物序列為:5'-6466口'66461'1'口'61^40：-3'。
[0009] 其中，所述檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑還包括本領(lǐng)域用于PRSS8檢測(cè)的已知和 未知的其他生物化學(xué)試劑，例如，為化ISA、PCR檢測(cè)試劑、抗體等。
[0010] -種食管炎和胃炎診斷試劑盒，所述試劑盒含有絲氨酸蛋白酶PRSS8編碼基因的 實(shí)時(shí)巧光定量PCR引物對(duì)，在所述PCR引物對(duì)中，
[0011] 上游引物序列為:5/-464664〔4了66了6了6了6口'6-3/; [001。下游引物序列為:5'-6466口'66461'1'口'61^40：-3'。
[0013] 該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的試劑和PCR反應(yīng)常用的酶。
[0014] 作為優(yōu)選，試劑盒包括:組織總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑W及定量PCR試劑。
[001引其中定量PCR試劑中還包括內(nèi)參GAP畑的特異引物：
[0016] 內(nèi)參GAPDH的特異引物包括：
[0017] 上游引物:5' -GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3'，如沈Q ID NO: 3所示；
[001 引下游引物：5' -AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'，如沈Q ID NO: 4所示。
[0019]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的應(yīng)用通過(guò)利用檢測(cè)試劑檢測(cè)患者血清中PRSS8 的水平，可W對(duì)胃炎、食管炎患者進(jìn)行早期診斷。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)和分子診斷領(lǐng)域有實(shí)際意義 和廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為PRSS8在食管炎病人和正常人的血清化ISA檢測(cè)情況；
[0021] 圖2為PRSS8在胃炎病人和正常人的血清化ISA檢測(cè)情況；
[0022] 圖3為PRSSE在食管炎病人、胃炎病人和正常人中mRNA表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)方法如無(wú)特 殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑 得到。運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具 體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。
[0024] 實(shí)施例1 PRSS8在食管炎病人和正常人的血清中水平 [002引1、一般資料
[0026] 本研究中共48例血清樣本，均來(lái)自于新鄉(xiāng)市中屯、醫(yī)院，其中食管炎血清樣本20例， 正常血清樣本28例。所有食管炎患者W及正常組皆通過(guò)胃鏡檢查確診。
[0027] 2、標(biāo)本收集
[00%]所有研究對(duì)象在抽血前均禁食化W上，采集空腹靜脈血約5ml，室溫靜置30min后 W3000r/min離屯、lOmin，收集血清，-20°C凍存用于PRSS8濃度監(jiān)測(cè)。
[00巧]3、試劑及主要儀器
[0030] 人prostasin(PRSS8化LISA試劑盒化ot:F10139905)購(gòu)自CUSABIO BIOTECH公司。 美國(guó)MD公司Specti'aMax飯Paradigm飯多功能酶標(biāo)儀。
[0031] 4、實(shí)驗(yàn)方法
[0032] 采用酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)檢測(cè)血清中PRSS8濃度，每組血清樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)， 在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)0D值，W3個(gè)重復(fù)的均值作為此組樣本的最終0D值。分別比較食管炎 組和胃炎組與正常組的PRSS8表達(dá)水平。
[0033] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0034] 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料W均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組樣本均數(shù) 間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有顯著意義。
[0035] 參見(jiàn)圖1，食管炎組血清PRSS8表達(dá)水平為4.58 ± 1.67ng/ml，正常組血清PRSS8表 達(dá)水平為3.52 ± 1.49ng/ml，食管炎患者組PRSS8表達(dá)水平高于正常組，P<0.05，差異顯著， 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0036] 實(shí)施例2 PRSS8在胃炎病人和正常人血清中的水平。
[0037] 1、一般資料
[0038] 本研究中共88例血清樣本，均來(lái)自于新鄉(xiāng)市中屯、醫(yī)院，胃炎血清樣本60例，正常血 清樣本28例。所有胃炎患者W及正常組皆通過(guò)胃鏡檢查確診。
[0039] 標(biāo)本收集、試劑及主要儀器、ELISA、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析等同實(shí)施例1。
[0040] 參見(jiàn)圖2,胃炎組血清PRSS8表達(dá)水平為5.39±1.04ng/ml ng/ml，正常組血清 PRSS8表達(dá)水平為3.52 ± 1.49ng/ml，胃炎患者組PRSS8表達(dá)水平高于正常組，P<0.05，差異 顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0041] 實(shí)施例3本實(shí)施例用于說(shuō)明利用本發(fā)明所提供的試劑盒對(duì)食管炎進(jìn)行檢測(cè)。
[0042] (1)標(biāo)本收集
[0043] 本研究中共60例血清樣本，均來(lái)自于新鄉(xiāng)市中屯、醫(yī)院，其中食管炎血清樣本20例， 胃炎血清樣本20例，正常血清樣本20例。所有食管炎患者、胃炎患者W及正常組皆通過(guò)胃鏡 檢查確診。樣本收集均經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會(huì)同意。所有研究對(duì)象在抽血前均禁食 化W上，采集空腹靜脈血，室溫靜置30min后W3000r/min離屯、lOmin，收集血清，進(jìn)行RNA提 取。
[0044] (2)試劑盒的組裝
[0045] mRNA定量的反應(yīng)體系：上游引物（20μπι)、下游引物（20ym)、cDNA、出0、巧光染料 SYB民 Green。
[0046] PRSS8實(shí)時(shí)巧光定量PCR的上游引物為5/ -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3/ ;下游引物為 5'-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3'。
[0047] 內(nèi)參GAPDH實(shí)時(shí)巧光定量PCR的上游引物為5^ -GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3/ ;下游引 物為5' -AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'。
[004引 3、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)巧光定量PCR
[0049]用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo SCIENTIFIC,USA)按 操作手冊(cè)對(duì)mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。
[00加]逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系：總RNA lyg，逆轉(zhuǎn)錄引物ΙμΙ,ΑΜΥ buffer化1，AMV 0.5μ1， lOmM dNTP 0.5yl，MgCl2化 1，總體積 10μ1;反應(yīng)條件：42°C60min，70°C10min，冰上放置 2min。
[0化1] 用步驟1組裝的試劑盒，通過(guò)實(shí)時(shí)巧光定量PCR(Applied Biosystems Inc.)對(duì) PRSS8進(jìn)行定量分析。
[0化2] mRNA定量的反應(yīng)體系：上游引物（20皿)0.1扣1，下游引物（20皿)0.1扣l，cDNA 0.7 μ1，出0 化1，巧光染料SYBR Green(2X) 10μ1;反應(yīng)條件：50°C2min，95°C2min;變性95°C15s， 退火/延伸60°C Imin，共40個(gè)循環(huán)。
[0053] PRSS8實(shí)時(shí)巧光定量PCR的上游引物為5^ -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3/ ;下游引物為 5'-GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3'。
[0054] 內(nèi)參GAPDH實(shí)時(shí)巧光定量PCR的上游引物為5^ -GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3/ ;下游引 物為5' -AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3'。
[0化日]結(jié)果顯示食管炎患者組和胃炎患者組PRSS8表達(dá)水平高于正常組，P<0.001及口< 0.05,差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(參見(jiàn)圖3)。
[0056]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、【具體實(shí)施方式】及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描 述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑在制備食管炎和胃炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑包括 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)，在所述PCR引物對(duì)中， 上游引物序列為：5' -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3'; 下游引物序列為:5~GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3\3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑包括 PRSS8的ELISA檢測(cè)試劑。4. 一種食管炎和胃炎診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有絲氨酸蛋白酶PRSS8編 碼基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物對(duì)，在所述PCR引物對(duì)中， 上游引物序列為：5' -AGAGGACATGGTGTGTGCTG-3'; 下游引物序列為:5~GAGGCTGGAGTTCTGTCACC-3\5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的試劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，提供了檢測(cè)絲氨酸蛋白酶PRSS8的試劑在制備食管炎和胃炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。還提供了一種食管炎和胃炎診斷試劑盒，本發(fā)明所提供的試劑盒能夠?qū)κ彻苎缀臀秆走M(jìn)行早期篩查具有操作簡(jiǎn)單、高特異性、高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1/68, G01N33/573
【公開(kāi)號(hào)】CN105506112
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511033229
【發(fā)明人】郭永臣, 楊萬(wàn)才, 鮑永華, 楊一瓊
【申請(qǐng)人】濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日