專利名稱：金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin－BF的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF在制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Cathelicidin是一個(gè)具有多功能的抗菌肽家族，目前僅在哺乳類、鳥(niǎo)類和魚(yú)類中有發(fā)現(xiàn)。Cathelicidin具有廣譜的抗菌活性，不僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強(qiáng)的殺菌活性，而且對(duì)許多臨床耐藥細(xì)菌同樣具有作用。除此之外， cathelicidin還具有許多其他生物學(xué)活性，如對(duì)多種免疫細(xì)胞具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等。由于具有如此眾多的活性，cathelicidin —直是國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。針對(duì)cathelicidin的藥用開(kāi)發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當(dāng)使用，微生物對(duì)傳統(tǒng)抗生素產(chǎn)生了越來(lái)越強(qiáng)的耐受性，在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物， 已有的抗生素對(duì)這些病原微生物無(wú)能為力?？咕氖且环N新型的抗微生物多肽，大多數(shù)抗菌肽分子量小于lOOOODa，帶正電，富含疏水堿基，能夠形成兩親性的結(jié)構(gòu)?？咕牡臍⒕鷻C(jī)制主要是通過(guò)靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。而傳統(tǒng)抗生素主要是作用于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的一些酶類。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性。除此之外，越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道表明抗菌肽還具有其他的殺菌機(jī)制，如抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成、改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成等。目前，國(guó)外有許多公司正在進(jìn)行抗菌肽的研究開(kāi)發(fā)，已有多種抗菌肽進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。如來(lái)源于人Iactoferrin的hLF_l_l用于治療骨髓干細(xì)胞移植相關(guān)的感染，已進(jìn)入臨床II期。來(lái)源于非洲爪蟾magainin的MSI-78對(duì)糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段。來(lái)源于豬protegrin的IB-367用于治療腫瘤患者口腔潰蕩，已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)。除此之外，一些用于傷口愈合，內(nèi)毒素感染，腫瘤，病毒感染的抗菌肽也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。在中國(guó)的傳統(tǒng)中藥和民族醫(yī)藥中，許多蛇類被作為藥材而得到廣泛的應(yīng)用，如烏稍蛇，蟒蛇，蝮蛇，金環(huán)蛇，銀環(huán)蛇，眼鏡蛇，五步蛇等。蛇全身均可入藥，蛇肉具有強(qiáng)壯神經(jīng)、 延年益壽功效，可治療病后體弱、風(fēng)痹麻木、關(guān)節(jié)疼痛等癥。蛇膽具有祛風(fēng)、清熱、化痰、明目的功效，主治小兒疳積、痔瘡腫痛。蛇膽汁乙醇溶液能有效治療角膜炎、角膜潰瘍、角膜斑醫(yī)。以蛇膽汁、川貝母、杏仁為主要原料制成的“蛇膽川貝液”，是目前臨床使用方便、療效顯著的止咳祛痰良藥，蛇蛻具有祛風(fēng)定驚、殺蟲(chóng)、退翳消腫、清熱解毒的功能，可治目翳、瘡癤、 痔漏、痄腮、瘧疾、小兒驚癇、疥癬、瘰疬等癥。蛇毒是目前國(guó)際藥材市場(chǎng)上十分昂貴的珍奇藥材，利用蝮蛇毒制成的注射液，具有明顯的抗癌、抗血凝作用。
與此同時(shí)，傳統(tǒng)中藥藥物成分的復(fù)雜性及其炮制方法的局限性造成藥物活性成分不能更好的發(fā)揮作用，因而從這些傳統(tǒng)藥物中尋找特定的活性單體化合物是中藥現(xiàn)代化的重要內(nèi)容之一。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從蛇毒中分離出大量生物活性蛋白及多肽，其中的許多活性多肽具有很好的藥物開(kāi)發(fā)前景。金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF是由發(fā)明者從金環(huán)蛇毒液發(fā)現(xiàn)的由30個(gè)氨基酸組成的的抗微生物肽，含有三十個(gè)氨基酸殘基，分子量為3637. 54Da，等電點(diǎn)11. 79。金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF全序列為賴氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-賴氨酸-亮氨酸-賴氨酸-賴氨酸-絲氨酸-纈氨酸-賴氨酸-賴氨酸-精氨酸-丙氨酸-賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-脯氨酸-精氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-纈氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸，具有顯著的抗菌活性，并且溶血活性和細(xì)胞毒性都很低(見(jiàn)文獻(xiàn)Wang Y, Hong J，Liu X，Yang H, Liu R,ffu J, Wang A, Lin D，Lai R.Snake cathel icidin from Bungarus fasciatusis a potent peptide antibiotics. PLoS One. 2008 ；3 (9) :e3217)。發(fā)明人將金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF作為制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用，未發(fā)現(xiàn)有任何相同應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF在制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案考察兩種常見(jiàn)細(xì)菌性陰道炎病原菌(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)對(duì) cathelicidin -BF 的敏感性采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定cathelicidin-BF對(duì)細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC)。取無(wú)菌試管(IOml) 12支，排成一排。每管加入無(wú)菌水lml，在第1管加入藥物原液(1280 μ g/ ml) Iml混勻，然后吸取Iml至第2管，混勻后再吸取Iml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第 12管，每稀釋前充分混勻。此時(shí)各管藥物濃度依次為640、320、160、80、40、20、10、5、2. 5、 1.25,0. 625,0. 313μ g/mL·然后將各濃度的溶液加至平皿中，lml/皿，再加入9ml的MH瓊脂培養(yǎng)基，邊加邊搖，使之充分混勻。此時(shí)各平皿藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0. 5、 0. 25,0. 125,0. 0625,0. 0313yg/mlo同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照。將制備好的接種物， 加入96孔板，250 μ 1/孔，用點(diǎn)樣器接種。將接種好的平皿倒置，37°C普通空氣孵箱中孵育 16h。檢查空白對(duì)照的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，以肉眼觀察，藥物最低濃度組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者， 即為受試菌的MIC。考察體外殺菌速度采用4倍于MIC的藥物濃度，將制備好的1 2 X 106CFU/ml的菌懸液與藥物混合， 使其濃度為105CFU/ml左右。在0、1、2、4、6、8、10、12和Mh時(shí)，吸取培養(yǎng)物，進(jìn)行系列稀釋， 活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，求平均值。最后以細(xì)菌濃度對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制殺菌曲線。考察對(duì)大鼠細(xì)菌性陰道炎的治療作用細(xì)菌性陰道炎模型的建立
首先用無(wú)菌較硬的棉拭子反復(fù)涂擦大鼠陰道內(nèi)壁15次，使陰道粘膜機(jī)械性損傷， 致使棉拭子粘有少許血性粘液為度，然后向大鼠陰道注入大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的菌液(約109CFU/ml)，注射菌液量為50μ l/200g，注入部位距陰道口 5mm，每日接種一次，共接種7次，每日觀察大鼠陰道粘膜，在接種首日后的第9天取陰道分泌物進(jìn)行鏡檢和細(xì)菌培養(yǎng)，并作菌株鑒定。病原體檢查為陽(yáng)性，且肉眼觀察陰道粘膜均發(fā)生充血、水腫、出血或浸潤(rùn)者為感染成功。將感染成功的大鼠隨機(jī)分組治療。動(dòng)物的分組與給藥將成功感染的SD大鼠隨機(jī)分成5組，10只/組。治療細(xì)菌性陰道炎模型的組別分別為高(0.8mg/kg)、中(O.^ig/kg)、低(0. 2mg/kg)劑量組、陽(yáng)性對(duì)照(環(huán)丙沙星0. 5mg/ kg)和模型組(給予同樣體積的生理鹽水)。各組大鼠每日陰道給藥一次，將BF-30用生理鹽水配成不同濃度的溶液，用200 μ 1的注射器由外陰道內(nèi)5mm處注入50 μ 1不同濃度的 cathe 1 i c i din-BF、陽(yáng)性對(duì)照組和模型組分別給予同等體積的環(huán)丙沙星和生理鹽水。組織菌落計(jì)數(shù)和組織切片連續(xù)給藥7天，停藥后取大鼠陰道分泌物進(jìn)行檢查，觀察陰道粘膜病變情況及病原體存活情況。用2支無(wú)菌棉簽棒伸入大鼠陰道0. 5cm轉(zhuǎn)動(dòng)，放置3ml無(wú)菌生理鹽水中浸泡，混勻后，進(jìn)行菌落數(shù)計(jì)算。于給藥7天后處死大鼠，解剖，取陰道約1cm，放置10%的甲醛中固定。常規(guī)固定，HE染色，然后進(jìn)行光鏡組織學(xué)觀察。本發(fā)明的有益效果在于化學(xué)合成金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF，在體外對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有強(qiáng)殺菌作用、殺菌迅速的有益特點(diǎn)。cathelicidin-BF對(duì)大腸桿菌感染的陰道炎的作用與其對(duì)金黃色葡萄球菌感染的陰道炎的結(jié)果基本相同，其對(duì)陰道內(nèi)的金黃色葡萄球菌或者大腸桿菌明顯抑制，cathelicidin-BF具有明顯的減輕炎癥的作用，能夠作為制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。


圖1為cathelicidin-BF對(duì)金黃色葡萄球菌(ATCC25923)的殺菌曲線(MIC = 16 μ g/ml)ο圖 2 為 cathelicidin-BF對(duì)大腸桿菌(ATCC25922)的殺菌曲線(MIC = 2 μ g/ml)。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此?！?、考察兩種常見(jiàn)細(xì)菌性陰道炎病原菌(金黃色葡萄球菌和大腸桿菌)對(duì) cathelicidin-BF 的敏感性1.材料1. 1菌株臨床分離的細(xì)菌性陰道炎感染者的金黃色葡萄球菌(11株)和大腸桿菌(10株)。1. 2培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂、肉湯、Mueller-Hint0n(MH)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌)、沙堡瓊脂
培養(yǎng)基。
1. 3藥物化學(xué)合成金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF、桿菌肽、環(huán)丙沙星、氨芐青霉
素和阿奇霉素等。2考察耐藥菌對(duì)cathelicidin-BF的敏感性2. 1采用瓊脂平板稀釋法測(cè)定cathelicidin-BF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的 MIC0取無(wú)菌試管(IOml) 12支，排成一排。每管加入無(wú)菌水lml，在第1管加入藥物原液 (1280 μ g/ml) Iml混勻，然后吸取Iml至第2管，混勻后再吸取Iml至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第12管，每稀釋前充分混勻。此時(shí)各管藥物濃度依次為640、320、160、80、40、20、10、 5、2. 5,1. 25,0. 625,0. 313 μ g/ml。然后將各濃度的溶液加至平皿中，lml/皿，再加入9ml的 MH瓊脂培養(yǎng)基，邊加邊搖，使之充分混勻。此時(shí)各平皿藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、 0. 5,0. 25,0. 125,0. 0625,0. 0313 μ g/ml。同時(shí)，設(shè)空白對(duì)照和陰性對(duì)照。將制備好的接種物，加入96孔板，250μ 1/孔，用點(diǎn)樣器接種。將接種好的平皿倒置，37°C普通空氣孵箱中孵育16h。檢查空白對(duì)照的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，以肉眼觀察，藥物最低濃度組無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC。結(jié)果如表1所示。表1 cathelicidin-BF對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性
權(quán)利要求
1.金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF的應(yīng)用，其特征在于金環(huán)蛇抗菌肽 cathelicidin-BF對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有明顯抑制、快速殺菌以及明顯減輕炎癥的作用，能作為制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF在制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的金環(huán)蛇抗菌肽cathelicidin-BF，在體外對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有強(qiáng)殺菌作用、殺菌迅速的有益特點(diǎn)；cathelicidin-BF對(duì)大腸桿菌感染的陰道炎的作用與其對(duì)金黃色葡萄球菌感染的陰道炎的結(jié)果基本相同，其對(duì)陰道內(nèi)的金黃色葡萄球菌或者大腸桿菌明顯抑制，cathelicidin-BF具有明顯的減輕炎癥的作用；能夠作為制備治療細(xì)菌性陰道炎藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102294019SQ20111026501
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者劉蕊, 張治業(yè), 李東升, 賴仞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所