一種重組金環(huán)蛇抗菌肽Cath-BF34及其高效制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于多膚藥物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一種重組金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34 及其局效制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘦瘡是一種常見(jiàn)的毛囊皮脂腺炎癥性皮膚病，主要由厭氧性瘦瘡丙酸桿菌所致， 目前主要采用抗生素治療，但療效不理想，并且可導(dǎo)致抗性菌的產(chǎn)生和超敏反應(yīng)。新近研究 發(fā)現(xiàn)從金環(huán)蛇蛇毒中分離的抗菌膚化th-BF可在小鼠模型中有效抑制瘦瘡丙酸桿菌及其 它瘦瘡感染菌的生長(zhǎng)，并抑制相關(guān)炎性增生，因此在瘦瘡防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該從 金環(huán)蛇蛇毒中分離的抗菌膚化th-BF屬于第一個(gè)被報(bào)道的脊椎動(dòng)物來(lái)源抗菌膚，天然分離 的化th-BF為30個(gè)氨基酸殘基組成的多膚，因此可記作金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF30。
[0003] 但是，根據(jù)金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF的cDNA序列進(jìn)行編碼產(chǎn)物推斷，該抗菌膚在 N端應(yīng)該還有4個(gè)氨基酸殘基，即天然長(zhǎng)度應(yīng)該為34個(gè)氨基酸殘基，記作金環(huán)蛇抗菌膚 化th-BF34,但目前尚未有發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)形式的抗菌膚是否存在W及有無(wú)抑菌活性。
[0004] 在實(shí)際工作中，由于蛇毒來(lái)源有限，從中制備抗菌膚化th-BF30得率低，成本高， 更是未發(fā)現(xiàn)金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34的存在；而化學(xué)合成抗菌膚同樣存在成本高的問(wèn)題， 合成困難，價(jià)格昂貴，也難W推廣應(yīng)用。因此，開(kāi)展對(duì)于金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34的研究，探 索一種高效制備天然化th-BF34的方法，不僅能為金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF增加一個(gè)新成員， 對(duì)于化th-BF的推廣應(yīng)用也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF相關(guān)研究和制備技 術(shù)的不足，提供一種新的金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34及其高效制備方法，成功構(gòu)建了金環(huán)蛇 抗菌膚化th-BF34的畢赤酵母高效組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)產(chǎn)物分離純化方法，并實(shí)驗(yàn) 證明了制備所得34膚化th-BF具有瘦瘡桿菌抑制活性。
[0006] 本發(fā)明上述目的通過(guò)W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 一種重組金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 一種上述重組金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34的高效制備方法，是首先設(shè)計(jì)化th-BF34 基因序列如SEQIDNO. 2所示，再利用表達(dá)載體構(gòu)建重組工程菌，工程菌在抑低于5的 條件下進(jìn)行發(fā)酵后，經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子SPSe地aroseFF柱進(jìn)行分離純化，得到金環(huán)蛇抗菌膚 化th-BF34。
[000引上述高效制備方法的具體步驟如下： 51. 設(shè)計(jì)化th-BF34基因，序列如SEQIDNO. 2所示，并合成該基因片段；具體是采用 畢赤酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)化th-BF34的編碼序列，首尾分別加上酶切位點(diǎn)、終止密碼子等， 采用引物重疊延伸PCR法（OverlapextensionPCR)合成目的基因； 52. 構(gòu)建化th-BF34克隆載體；利用ZAoI與思aI雙酶切，將合成的化th-BF34基因 片段克隆入畢赤酵母系統(tǒng)pGAPZa載體(合成的化th-BF34目的基因與分泌信號(hào)膚MF-a融合后克隆于啟動(dòng)子GAP的下游，W便在葡萄糖做基礎(chǔ)碳源的條件下組成型分泌表達(dá)N端 為天然序列的抗菌膚)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa-Cath-BF34 ; 53. 構(gòu)建化th-BF34畢赤酵母工程菌；通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法，將重組表達(dá)質(zhì)粒 pGAPZa-Cath-BF34轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞，獲得工程菌SMD-pGAPZa-34 ; 54. 發(fā)酵；在抑低于5、30°C條件下，W葡萄糖為碳源的YTO培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，200rmp震 蕩培養(yǎng)7化； 55. 純化；發(fā)酵上清經(jīng)0.45ym濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)后，采用強(qiáng)陽(yáng)離子SPSe地aroseFF 柱進(jìn)行分離純化。
[0009] 其中，步驟S2構(gòu)建克隆載體過(guò)程中，化th-BF34基因片段與pGAPZa載體的雙酶 切產(chǎn)物是按照4:1的比例進(jìn)行連接，所述連接的條件為16°C連接9小時(shí)。
[0010] 作為一種可實(shí)施方案，步驟S3所述轉(zhuǎn)化是利用電轉(zhuǎn)化的方法，獲得的轉(zhuǎn)化子依次 進(jìn)行博來(lái)霉素篩選（由低濃度抗生素向高濃度抗生素畫線）和丙酸桿菌抑菌斑篩選，再經(jīng)過(guò) PCR鑒定陽(yáng)性，獲得工程菌SMD-pGAPZa-34。
[0011] 優(yōu)選地，步驟S3構(gòu)建工程菌的具體方法如下： 531. 將重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa-Cath-BF34線性化后，電轉(zhuǎn)化蛋白酶缺陷型宿主畢赤酵 母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞； 532. 電轉(zhuǎn)化后，先篩選博來(lái)霉素高抗性轉(zhuǎn)化子，再取博來(lái)霉素高抗性轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)上 清進(jìn)行丙酸桿菌抑菌斑篩選，選取對(duì)丙酸桿菌的抑菌活性強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子； 533. 對(duì)S32篩選的抑菌活性強(qiáng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，鑒定其是否含有化th-BF34目 的基因片段，陽(yáng)性菌株即為工程菌SMD-pGAPZa-34。
[001引優(yōu)選地，步驟S4所述發(fā)酵的接種量為1~5v/v% ;所述發(fā)酵的條件為抑=4~5、 28~30°C，170~200rmp震蕩培養(yǎng)70~72h;所述YTO培養(yǎng)基是W葡萄糖為碳源的YTO培 養(yǎng)基。
[0013] 更優(yōu)選地，所述發(fā)酵的接種量為1%，所述發(fā)酵的抑為4,發(fā)酵溫度為30°C。
[0014] 步驟S5所述發(fā)酵上清需要先經(jīng)過(guò)4000~5000rmp離屯、20~30min后，取上清， 加水稀釋至與平衡液相同電導(dǎo)率，再用0. 45ym濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)；所述平衡液為平衡SP Se地aroseFF柱用的平衡液；所述SPSe地aroseFF柱為強(qiáng)陽(yáng)離子SPSe地aroseFF柱。
[0015] 另外，步驟S4發(fā)酵完成后，發(fā)酵上清用0.45ym濾膜過(guò)濾雜質(zhì)，冷凍抽真空干燥， 并用雙蒸水溶解凍干樣，得到抗菌膚化th-BF34粗樣品，96孔板法觀察粗樣品對(duì)瘦瘡丙酸 桿菌厭氧培養(yǎng)物的生長(zhǎng)抑制作用，即對(duì)所產(chǎn)生的抗菌膚化th-BF34進(jìn)行活性分析，確認(rèn)其 具有抑菌活性后，再進(jìn)行步驟S5的純化。該步驟在大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用時(shí)意義重大。
[0016] 優(yōu)選地，步驟S31所述重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZa-Cath-BF34利用公7/7I酶使其線性 化，并將完全線性化的質(zhì)粒進(jìn)行酪氯仿抽提，使其達(dá)到電轉(zhuǎn)化所需的濃度； 步驟S31所述電轉(zhuǎn)化的電擊條件為1.化v、25yF、200歐；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物溫育條件為30°C溫 育比。
[0017] 更優(yōu)選地，步驟S31所述電轉(zhuǎn)化的具體操作如下： 將線性化的pGAPZa-Cath-BF34質(zhì)粒加入畢赤酵母SMD1168感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻， 置于在冰上提前預(yù)冷的0. 2cm的石英轉(zhuǎn)化杯中l(wèi)Omin，轉(zhuǎn)化杯應(yīng)在做轉(zhuǎn)化前提前浸泡于75% 酒精，并于紫外燈下消毒半小時(shí)；擦干轉(zhuǎn)化杯外壁的水，放于電轉(zhuǎn)化儀槽中，1.5kv、25uF、 200歐，電擊，立即加入1血預(yù)冷的山梨醇混勻，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物置于30°C溫育比。
[0018] 另外，更具體地，步驟S4所述工程菌SMD-pGAPZ a -34大規(guī)模發(fā)酵的方法具體操作 如下： (1) 挑取工程菌SMD-pGAPZa-34的單菌落接種至YTO培養(yǎng)基中，30°C震蕩過(guò)夜，獲得種 子液； (2) WIv/v%接種量，將種子液接種于YPD培養(yǎng)基中，30°C震蕩過(guò)夜； (3) 進(jìn)行高密度發(fā)酵，工作體積為化，轉(zhuǎn)速，通氣量，溶氧，pH(最適pH4~5)W及補(bǔ)料 (監(jiān)控溶氧，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的糖消耗完時(shí)流加補(bǔ)料）都是由主控系統(tǒng)設(shè)置調(diào)節(jié)； (4) 每隔化測(cè)菌體濕重； (5) 7化收罐，離屯、取上清。
[0019] 本研究所構(gòu)建工程菌為組成型表達(dá)系統(tǒng)的畢赤酵母體系，在發(fā)酵過(guò)程中不用加甲 醇進(jìn)行誘導(dǎo)，只需流加葡萄糖，補(bǔ)料與溶氧相關(guān)聯(lián)，參數(shù)如附圖9所示，橫坐標(biāo)為發(fā)酵時(shí)間， 縱坐標(biāo)為相對(duì)數(shù)值，如溶氧最大為100%，轉(zhuǎn)速最大為700,在圖中用70表示，溫度為28~30°C 范圍內(nèi)，抑為4~5之間。當(dāng)溶氧開(kāi)始下降到一定程度開(kāi)始上升時(shí)，本次實(shí)驗(yàn)為第18個(gè)小時(shí)， 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的糖已經(jīng)消耗完，此時(shí)需要流加補(bǔ)料，控制溶氧在30%左右，每六個(gè)小時(shí)測(cè)一 次菌濕重，如附圖10所示，發(fā)酵至7化后收罐。
[0020] 根據(jù)上述高效制備方法制備得到的金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34也在本發(fā)明保護(hù)范 圍之內(nèi)。
[0021] 本發(fā)明首次證明了金環(huán)蛇抗菌膚化th-BF34的存在，并且首次采用基因工程手 段制備化th-BF34,并建立了高效的制備方法。采用畢赤酵母組成型分泌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 化th-BF34的高效表達(dá)工程菌。所用畢赤酵母（Pichiapastoris)系統(tǒng)是最成熟的外源基 因高效表達(dá)系統(tǒng)，遺傳背景清楚