一種玉米CCCH型鋅指蛋白及其編碼基因ZmC3H54與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，具體設(shè)及一種玉米CCCH型鋒指蛋白及其編碼基 因ZmC3冊(cè)4與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是重要的糧食作物和重要的飼料來(lái)源，也是全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物。 玉米是=大糧食作物中最適合作為工業(yè)原料的品種，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。但干 旱、高鹽等非生物脅迫嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量，因此發(fā)掘和創(chuàng)建抗逆性強(qiáng)，高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)玉米新 種質(zhì)和選育新品種已成為實(shí)現(xiàn)玉米生產(chǎn)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵所在。隨著分子生物學(xué)W及植物基 因工程育種技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)基因工程育種技術(shù)提高玉米在逆境條件下的生產(chǎn)力，培 育抗性較強(qiáng)的新品種，成為目前抗逆遺傳改良的一個(gè)研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。
[0003] 該種CCCH鋒指蛋白廣泛的存在于真核生物中，是一類重要的調(diào)控因子，在動(dòng)植物 的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)外界逆境的反應(yīng)過(guò)程中起到了不能忽視的作用，它們大多數(shù)都跟RNA的代 謝有關(guān)，通?？蒞在轉(zhuǎn)錄水平或者是轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。植物中CCCH家族 的基因眾多，近年來(lái)通過(guò)生物信息學(xué)的辦法，在擬南芥和水稻兩種模式植物中分別鑒定出 68和67個(gè)CCCH家族的基因，表達(dá)譜的分析還發(fā)現(xiàn)其中有一個(gè)亞家族中的大多數(shù)成員與擬 南芥的逆境脅迫相關(guān)，為在植物中廣泛研究該類蛋白走出了第一步卿angetal.，2008a)。
[0004] 一些CCCH鋒指蛋白通過(guò)超量或抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)分析等方法證明在 植物的發(fā)育、對(duì)環(huán)境壓力的應(yīng)答反應(yīng)等方面發(fā)揮作用。CCCH型鋒指蛋白是鋒指蛋白家族 中的一類，典型的CCCH鋒指蛋白至少含有一個(gè)或者更多的由3個(gè)切S和1個(gè)化S順序排 列組成的鋒指模體，該種結(jié)構(gòu)可W被歸納為：C-Xs_i4-C-X4_e-C-X3-H。X代表任意氨基酸殘 基，（Blackshear, 2002;Wangetal. , 2008a)。
[0005] 如OsDOS被發(fā)現(xiàn)與水稻葉片的衰老相關(guān)化ongetal.，2006) ;AtSZFl和AtSZ巧 被發(fā)現(xiàn)在擬南芥對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)中起作用（Sunetal.，2007);化ZFPl被發(fā)現(xiàn)參與煙草對(duì) 鹽和病原物的脅迫反應(yīng)佑UOetal.，2009)。AtTZFl是一個(gè)糖敏感的蛋白，參與赤霉素/ 脫落酸介導(dǎo)的植物發(fā)育過(guò)程和面對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)（Pomeranzetal.,2010)。該些CCCH 型鋒指蛋白相關(guān)抗逆基因的功能報(bào)道目前多在擬南芥，水稻，棉花中，玉米中很少。非生物 脅迫的研究已經(jīng)很多了，低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫一般會(huì)引起一些基因的變化或一些 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。
[0006] 目前，缺乏一種抗非生物逆境脅迫能力強(qiáng)的玉米CCCH型鋒指蛋白ZmC3冊(cè)4及其編 碼基因ZmC3冊(cè)4。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種抗非生物逆境脅迫能力強(qiáng)的玉米CCCH型鋒指蛋白及其 編碼基因ZmC3冊(cè)4與應(yīng)用。
[000引為了實(shí)現(xiàn)W上目的，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)；本發(fā)明的一種玉米CCCH型鋒 指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明所述的玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因ZmC3冊(cè)4,其核巧酸序列如序列表 SEQIDNO. 2 所示。
[0010] 本發(fā)明含有所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0011] 本發(fā)明所述的玉米CCCH型鋒指蛋白或者所述的玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因 ZmC3冊(cè)4在培育抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0012] 進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻或擬南芥。
[0013] 本發(fā)明的一種所述的抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括如下步 驟：
[0014] (1)獲得玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因ZmC3冊(cè)4的核巧酸序列及氨基酸序列； [00巧](2)用PCR獲得玉米ZmC3冊(cè)4基因片段；
[0016] 用巧光定量PCR的方法分析玉米基因ZmC3冊(cè)4在逆境脅迫時(shí)的表達(dá)譜，將ZmC3冊(cè)4 基因片段構(gòu)建到質(zhì)粒載體中；
[0017] 做將步驟似得到的帶有ZmC3冊(cè)4的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；
[0018] 將帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物；
[0019] (4)目標(biāo)植物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選與鑒定；轉(zhuǎn)基因純合植株的抗非生物逆境脅迫 分析。
[0020] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，將含ZmC3冊(cè)4基因的克隆載體質(zhì)粒經(jīng)BamHI+甜al雙酶 切后，利用DNA回收試劑盒回收1119bp的SEQIDNO. 2的DNA片段，將此片段與相應(yīng)酶切 pCAMBIA1301a載體相連，獲得的載體命名為pl301a-ZmC3冊(cè)4重組載體；
[002U 用從玉米cDNA為模板PCR克隆出該基因的引物序列，該擴(kuò)增ZmC3冊(cè)4基因的引物 為分為上游引物和下游引物；所述上游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 5所示，所述 下游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO.6所示；
[0022] 在步驟（3)中，所述的目標(biāo)植物是水稻或擬南芥。
[0023] 在步驟（4)中，抗非生物逆境脅迫分析包括耐旱分析和植物種子萌發(fā)對(duì)植物激素 ABA的敏感性分析。
[0024] 本發(fā)明的一種用于體外檢測(cè)ZmC3冊(cè)4基因在誘導(dǎo)后植物中表達(dá)量W及在植物中 各組織中表達(dá)量差異的方法，包括如下步驟：
[0025](1)取植物相應(yīng)誘導(dǎo)后各時(shí)間段的葉片處理樣及植物幾種不同的組織樣；
[0026] (2)用Trizol法提取各個(gè)樣的RNA;
[0027] 做用Dnasel消化DNA,然后反轉(zhuǎn)錄形成cDNA,W其為模板；
[002引 （4)用巧光定量PCR進(jìn)行分析，巧光定量PCR的檢測(cè)引物序列，所述引物為分為上 游引物和下游引物；
[0029] 所述上游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 3所示，所述下游引物的核巧酸 序列如序列表SEQIDNO. 4所示。
[0030] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，所述植物為玉米；
[0031] 脅迫處理取樣：植物材料為玉米B73自交系，待玉米幼苗長(zhǎng)至=葉期時(shí)，W正常灌 水的植株作對(duì)照，分別進(jìn)行10%PEG溶液，lOOuM的ABA溶液和200mmol/L化C1溶液脅迫 處理，處理不同時(shí)間段后取樣，時(shí)間分別為化，比，化，6h，12h，2化；用剪刀分別剪取試驗(yàn)組 和對(duì)照組玉米幼苗相同部位葉片，每個(gè)處理階段取樣=份；采樣完畢后，樣品用液氮冷凍保 存于-80°C;
[0032] 組織取樣；為了分析玉米ZmC3冊(cè)4基因在各個(gè)組織中的表達(dá)水平差異，選取玉米 的8個(gè)代表性的組織，所述代表性的組織分別為根，莖，幼葉，花絲，雄穗，未授粉前果穗，巷 葉，胚和胚乳，取樣后用液氮冷凍保存于-80°C;
[003引在步驟（4)中，總RNA純度和含量的檢測(cè)；取1yL總RNA樣品加到微量分光光度 計(jì)探頭上，檢測(cè)總RNA純度和含量；
[0034] 取正常的玉米作對(duì)照，玉米內(nèi)參基因Actin引物，所述引物為分為上游引物和下 游引物；所述上游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 7所示，所述下游引物的核巧酸序 列如序列表SEQIDNO.8所示。
[0035] 進(jìn)一步地，在步驟（4)中，取正常的擬南芥作對(duì)照，擬南芥內(nèi)參基因Actin引物，所 述引物為分為上游引物和下游引物；所述上游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 9所 示，所述下游引物的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 10所示。
[0036] 有益效果；本發(fā)明ZmC3冊(cè)4基因參與了脅迫應(yīng)答，可W提高植物的抗非生物逆境 脅迫能力。轉(zhuǎn)基因水稻與轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)ABA都有較高的敏感性，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱的耐 受性提高，本發(fā)明從玉米中分離克隆該家族基因并鑒定它在提高目的植物抗逆性方面所發(fā) 揮的功能，對(duì)于培育抗逆新型作物品種具有十分重要的意義。
[0037] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[003引 （1)本發(fā)明從玉米中分離、克隆得到ZmC3冊(cè)4基因，誘導(dǎo)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)ZmC3冊(cè)4的 表達(dá)受到外源ABA、PEG和高鹽的誘導(dǎo)，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法分別將其導(dǎo)入水稻和擬南 芥，并獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的敏感性提高且在耐旱方面的能力增強(qiáng)。
[0039] 似本發(fā)明W生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ)，根據(jù)其進(jìn)化關(guān)系和脅迫誘導(dǎo)表達(dá)模式，篩選 了一個(gè)受干旱與ABA強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的一個(gè)CCCH型鋒指蛋白的編碼基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)調(diào) 節(jié)其在植物體內(nèi)的表達(dá)水平，可W改良植物的抗逆性。本發(fā)明中可W用半定量PCR的方法 分析轉(zhuǎn)基因擬南芥中ZmC3冊(cè)4基因的表達(dá)量情況。具體是根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子ZmC3冊(cè)4基因序列 設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)從玉米自交系B73總cDNA中擴(kuò)增得到ZmC3冊(cè)4基因。誘導(dǎo)表達(dá)分 析發(fā)現(xiàn)ZmC3冊(cè)4的表達(dá)受到外源ABA、PEG和高鹽的誘導(dǎo)。
[0040] (3)本發(fā)明為植物抗逆基因工程提供了重要的基因資源，有利于抗逆新品種的研 究，對(duì)提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0041] 圖1為本發(fā)明的ZmC3冊(cè)4與其他物種CCCH家族鋒指蛋白保守區(qū)的氨基酸序列同 源性比對(duì)圖；
[0042] 圖2為本發(fā)明的ZmC3冊(cè)4與擬南芥W及其他植物中已報(bào)道功能的CCCH鋒指蛋白 家族氨基酸序列比對(duì)后的進(jìn)化樹；
[0043] 圖3為本發(fā)明的ZmC3冊(cè)4基因在ABA、干旱、高鹽逆境處理時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)模式分析 W及ZmC3冊(cè)4基因的組織表達(dá)模式圖；A;10%PEG溶液處理；BaOOuM的ABA溶液處理；C; 200mmol/L化C1溶液處理；
[0044] 圖4為本發(fā)明的轉(zhuǎn)ZmC3冊(cè)4基因水稻對(duì)干旱的耐受性的提高對(duì)比圖；A:干旱處理 15天；B:干旱處理30天；C;恢復(fù)誘水20天；D;恢復(fù)生長(zhǎng)20天后野生型與轉(zhuǎn)基因植株的存 活率；
[0045] 圖5為本發(fā)明的轉(zhuǎn)ZmC3冊(cè)4基因水稻對(duì)ABA的敏感性的提高對(duì)比圖；A-C:野生型 和轉(zhuǎn)基因幼苗在不同濃度ABA的MS培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)表型、幼苗高度和根的長(zhǎng)度；
[0046] 圖6為本發(fā)明的ZmC3冊(cè)4在野生型（WT)擬南芥和T1代轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)分析 圖；A:巧光定量分析；B:半定量分析；
[0047] 圖7為本發(fā)明的轉(zhuǎn)ZmC3冊(cè)4基因擬南芥對(duì)ABA敏感性的提高對(duì)比圖；A;MS培養(yǎng)基 上表型；B;MS+0. 2ABA培養(yǎng)基