上的表型；CMS+0. 4ABA培養(yǎng)基上的表型；D 個(gè)板上的萌發(fā) 率.
[0048] 圖8為本發(fā)明所設(shè)及的改造前PCAMBIA1301載體與改造后pCAMBIA1301a載體的 對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)該理解，該些實(shí)施例僅用于說(shuō)明 目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0化0] 實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用引物均由上海生工生物有 限公司合成；測(cè)序由Invitrogen公司進(jìn)行；實(shí)驗(yàn)中用到的各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA Marker、化qDNA聚合酶、dNTPs等購(gòu)自Takara公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Promega公司；質(zhì) 粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均W及基因組提取試劑盒購(gòu)于全式金生物技術(shù)有限公司，方 法均參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0化1] 本發(fā)明的一種玉米CCCH型鋒指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO. 1所示。
[0化2] 所述序列表SEQIDNO. 1自氨基端第44-95位氨基酸殘基序列是兩個(gè)比較典型的CCCH型鋒指CXsCXsCXsH和CX5CX4CX3H的保守結(jié)構(gòu)。
[0化3] 所述的玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因，其核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 2所 示。本發(fā)明提供了一個(gè)新的玉米鋒指蛋白編碼基因的核巧酸序列，它編碼一個(gè)受干旱和ABA誘導(dǎo)表達(dá)的ZmC3冊(cè)4基因，GRMZM2G117007,主要表現(xiàn)是其相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因種子萌發(fā)對(duì)ABA有 較高的敏感性，植株有一定的抗旱性。玉米C3H54基因，GRMZM2G117007全長(zhǎng)1466bp，cDNA 編碼區(qū)序列長(zhǎng)1119bp，如SEQIDNO. 2所示，本基因編碼372個(gè)氨基酸，且含有兩個(gè)比較典 型的CCCH型鋒指結(jié)構(gòu)CXsCXsCXsH和CX5CX4CX3H，如SEQIDNO. 1 所示。
[0化4] 本發(fā)明所述的玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因ZmC3冊(cè)4,其核巧酸序列如序列表 SEQIDNO. 2 所示。
[0化5] 本發(fā)明含有所述編碼基因ZmC3冊(cè)4的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0化6] 本發(fā)明所述的玉米CCCH型鋒指蛋白或者所述的玉米CCCH型鋒指蛋白的編碼基因 ZmC3冊(cè)4在培育抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0化7] 所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻或擬南芥。
[005引實(shí)施例1
[0化9]玉米ZmC3冊(cè)4基因的獲得
[0060] 待玉米幼苗長(zhǎng)至S葉期后，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。檢索MIZEGENOME和 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得ZmC3冊(cè)4的推測(cè)編碼序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，弓I 物由生工生物公司合成。引物序列如下：
[006UZmC3冊(cè)4-F -CGGGATCCATGTACAACTTCAAAGTGAAGC-3'沈QIDNO. 5
[0062] BamHI
[0063] ZmC3冊(cè)4-R 5 f -GCTCTAGATCAGGCCACCATCTGCTC-3'沈Q ID NO. 6
[0064] 甜al
[00化]W上述獲得玉米總CDNA為模板，通過(guò)PCR得到一個(gè)包含有完整開(kāi)放閱讀框的編碼 區(qū)，長(zhǎng)度為1119bp，回收，連接到祀ASY-T1載體上，進(jìn)行測(cè)序。所得序列為玉米ZmC3冊(cè)4基 因。
[0066] 植物表達(dá)載體PCAMBIA1301的改造
[0067] 將植物表達(dá)載體PCAMBIA1301改造成pCAMBIA1301a載體，圖8為本發(fā)明所設(shè)及的 改造前PCAMBIA1301載體與改造后pCAMBIA1301a載體的圖譜。
[0068] 如圖8所示，具體步驟如下；
[0069] (1)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SacI雙酶切再T4連接酶連接，在PCAMBIA1301載體 的多克隆位點(diǎn)處加上一個(gè)35S片段，方向與GUS方向一致，構(gòu)建成PCAMBIA1301-35S載體；
[0070] (2)接著通過(guò)PstI和Hindlll雙酶切，再用T4連接酶連接，緊接著35S片段后面 加上一小段polyA，構(gòu)建成pCAMBIA1301-35S-polyA載體（后面簡(jiǎn)稱pCAMBIA1301a載體）。
[0071] 玉米ZmC3冊(cè)4表達(dá)載體的構(gòu)建
[007引 將獲得的ZmC3冊(cè)4+pEASY-Tl載體與pCAMBIA1301a載體同時(shí)用BamHI和甜al雙 酶切，酶切體系如表1所示：
[007引表1
[0074]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米CCCH型鋅指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的玉米CCCH型鋅指蛋白的編碼基因 ZmC3H54,其核苷酸序列如序列 表 SEQ ID NO. 2 所示。
3. 含有權(quán)利要求2中所述編碼基因 ZmC3H54的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
4. 權(quán)利要求1所述的玉米CCCH型鋅指蛋白或者權(quán)利要求2所述的玉米CCCH型鋅指蛋 白的編碼基因 ZmC3H54在培育抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻或擬南芥。
6. -種權(quán)利要求4所述的抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，其特征在于包 括如下步驟： (1) 獲得玉米CCCH型鋅指蛋白的編碼基因 ZmC3H54的核苷酸序列及氨基酸序列； (2) 用PCR獲得玉米ZmC3H54基因片段； 用熒光定量PCR的方法分析玉米基因 ZmC3H54在逆境脅迫時(shí)的表達(dá)譜，將ZmC3H54基 因片段構(gòu)建到質(zhì)粒載體中； (3) 將步驟（2)得到的帶有ZmC3H54的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌；將帶有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn) 化目標(biāo)植物； (4) 目標(biāo)植物轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選與鑒定；轉(zhuǎn)基因純合植株的抗非生物逆境脅迫分 析。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗非生物逆境脅迫的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，其特征在于： 在步驟（1)中，將含ZmC3H54基因的克隆載體質(zhì)粒經(jīng)BamHI與XbaI雙酶切后，利用DNA回 收試劑盒回收1119bp的SEQ ID NO. 2的DNA片段，將此片段與相應(yīng)酶切pCAMBIA1301a載 體相連，獲得的載體命名為pl301a-ZmC3H54重組載體； 用從玉米cDNA為模板PCR克隆出該基因的引物序列，該擴(kuò)增ZmC3H54基因的引物為分 為上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示，所述上游 引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 6所示； 在步驟（3)中，所述的目標(biāo)植物是水稻或擬南芥。 在步驟（4)中，抗非生物逆境脅迫分析包括耐旱分析和植物種子萌發(fā)對(duì)植物激素 ABA 的敏感性分析。
8. -種用于體外檢測(cè)ZmC3H54基因在誘導(dǎo)后植物中表達(dá)量以及在植物中各組織中表 達(dá)量差異的方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 取植物相應(yīng)誘導(dǎo)后各時(shí)間段的葉片處理樣及植物幾種不同的組織樣； (2) 用Trizol法提取各個(gè)樣的RNA ; (3) 用DnaseI消化DNA，然后反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，以其為模板； (4) 用熒光定量PCR進(jìn)行分析，熒光定量PCR的檢測(cè)引物序列，所述引物為分為上游引 物和下游引物； 所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 3所示，所述上游引物的核苷酸序列 如序列表SEQ ID NO. 4所示。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于體外檢測(cè)ZmC3H54基因在誘導(dǎo)后植物中表達(dá)量以及在植 物中各組織中表達(dá)量差異的方法，其特征在于：在步驟（1)中，所述植物為玉米； 脅迫處理取樣：植物材料為玉米B73自交系，待玉米幼苗長(zhǎng)至三葉期時(shí)，以正常灌水 的植株作對(duì)照，分別進(jìn)行10% PEG溶液，IOOuM的ABA溶液和200mmol/L NaCl溶液脅迫處 理，處理不同時(shí)間段后取樣，時(shí)間分別為〇h，lh，3h，6h，12h，24h ;用剪刀分別剪取試驗(yàn)組和 對(duì)照組玉米幼苗相同部位葉片，每個(gè)處理階段取樣三份；采樣完畢后，樣品用液氮冷凍保存 于-80。。； 組織取樣：為了分析玉米ZmC3H54基因在各個(gè)組織中的表達(dá)水平差異，選取玉米的8個(gè) 代表性的組織，所述代表性的組織分別為根，莖，幼葉，花絲，雄穗，未授粉前果穗，苞葉，胚 和胚乳，取樣后用液氮冷凍保存于_80°C ; 在步驟⑷中，總RNA純度和含量的檢測(cè)：取1 μ L總RNA樣品加到微量分光光度計(jì)探 頭上，檢測(cè)總RNA純度和含量； 取正常的玉米作對(duì)照，玉米內(nèi)參基因 Actin引物，所述引物為分為上游引物和下游引 物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 7所示，所述上游引物的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO. 8所示。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于體外檢測(cè)ZmC3H54基因在誘導(dǎo)后植物中表達(dá)量以及在 植物中各組織中表達(dá)量差異的方法，其特征在于： 在步驟（4)中，取正常的擬南芥作對(duì)照，擬南芥內(nèi)參基因 Actin引物，所述引物為分為 上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 9所示，所述上游引 物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 10所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米CCCH型鋅指蛋白及其編碼基因ZmC3H54與應(yīng)用，本發(fā)明的一種玉米CCCH型鋅指蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明所述的玉米CCCH型鋅指蛋白的編碼基因ZmC3H54，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明含有所述編碼基因ZmC3H54的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或表達(dá)盒。本發(fā)明ZmC3H54基因參與了脅迫應(yīng)答，可以提高植物的抗非生物逆境脅迫能力。轉(zhuǎn)基因植物對(duì)ABA都有較高的敏感性，轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱的耐受性提高，本發(fā)明從玉米中分離克隆該家族基因并鑒定它在提高目的植物抗逆性方面所發(fā)揮的功能。
【IPC分類】C12N1-21, C12N15-29, C12N1-19, A01H5-00, C12Q1-68, C12N15-82, C12N15-63, C07K14-415, C12N1-15
【公開(kāi)號(hào)】CN104829700
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510236703
【發(fā)明人】朱蘇文, 徐倩倩, 趙陽(yáng), 彭元成, 彭曉劍
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月11日