與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結(jié)合的十二肽及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白（M評(píng)a)特異性結(jié)合的十二膚， 屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 支原體介于病毒與細(xì)菌之間，缺乏細(xì)胞壁、呈高度多型性，可通過除菌過濾器，可 在無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基中繁殖，在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)可成"油煎蛋"樣的獨(dú)特菌落，是廣泛 存在于自然界的條件致病微生物。生殖支原體（Mycoplasma genitalium，Mg)是支原體屬 中的一種，首次發(fā)現(xiàn)是從一名非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的。臨床調(diào)查研究 表明，女性Mg感染可引起宮頸炎，盆腔炎，不孕等；而男性感染則可引起急慢性非淋菌性尿 道炎（NGU)，不育等；更值得注意的是，隨著更深入的研究顯示，Mg感染與人類免疫缺陷疾 病化IV)的機(jī)會(huì)感染密切相關(guān)，能選擇性的激活CD4+T細(xì)胞促使HIV的復(fù)制，是HIV的協(xié)同 因子之一。
[0003] 病原體和宿主細(xì)胞膜上相應(yīng)受體的結(jié)合是病原體感染宿主的第一步，對(duì)其能否感 染宿主細(xì)胞至關(guān)重要。有研究表明，Mg必須先黏附于泌尿生殖道或呼吸道黏膜細(xì)胞才能感 染宿主并定植于感染部位或侵入細(xì)胞內(nèi)，失去黏附能力的突變株則缺乏感染能力。支原體 缺乏細(xì)胞壁，但Mg細(xì)胞膜上存在較多的外膜蛋白，Mg通過酷基錯(cuò)定在其細(xì)胞膜上的膜蛋白 介導(dǎo)Mg定植到宿主細(xì)胞表面而感染致病。Burgos等研究表明Mg膜蛋白能刺激機(jī)體發(fā)生 持續(xù)的免疫反應(yīng)。Mg通過粘附感染宿主細(xì)胞最主要的外膜蛋白為生殖支原體粘附素蛋白 (M評(píng)a)，而自發(fā)性的無(wú)細(xì)胞黏附活性的Mg突變株則缺乏M評(píng)a。M評(píng)a的基因編碼含有S個(gè) 操縱子分別為mgl90 (m甜A)，mgl91 (m甜B(yǎng))和mgl92 (m甜C)，其中編碼M評(píng)a的基因?yàn)閙甜B(yǎng)， 由其編碼的M評(píng)a蛋白主要集中在Mg燒瓶狀的頂尖部位，該一特殊位置對(duì)Mg的粘附感染宿 主起至關(guān)重要的作用。Mernau曲等研究表明Mg可憑借其尖形結(jié)構(gòu)主動(dòng)靠近并黏附于人胚 肺成纖維細(xì)胞表面，并通過微管將核酸、酶等輸入宿主細(xì)胞內(nèi)，將某些酶解產(chǎn)物吸入細(xì)胞內(nèi) 供Mg利用，由此影響宿主的代謝及生物合成。
[0004] 近年來(lái)，Mg感染率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但目前仍然沒有滿足臨床需要的藥物和疫苗可 供使用，臨床上也急需安全、有效、實(shí)用藥物W用于治療和預(yù)防Mg的感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決了【背景技術(shù)】中的不足，提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白M評(píng)a 特異性結(jié)合的十二膚，所述多膚為A或B中的任意一種：
[0006]A;由Asp-T;rp-Se;r-Se;r-T;rp-Val-His-Arg-Asp-P;r〇-Gln-T虹所不的氨基酸序列 組成的十二膚，如SEQIDN0;1所示。
[0007] B ;在A所述的氨基酸序列中經(jīng)過取代1-5個(gè)氨基酸且具有與生殖支原體M評(píng)a特 異性結(jié)合活性的由A所衍生的十二膚；具體的取代方式包括如下五種：第二位的Trp被Arg 取代，第四位的Ser被Gin取代，第六位的Val被Gly取代，第走位的His被Tyr取代，第 十二位的T虹被Ser取代。
[000引在B中，具體的十二膚包括W下五種，其氨基酸序列分別為；Asp-Arg-Ser-Ser-Tr p-Val-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-T虹，如沈Q ID NO ;2所示；Asp-Arg-Ser-Gln-T巧-Gly-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Ser，如沈Q ID NO ;3所不；Asp-T巧-Ser-Gln-T巧-Gly-Tyr-Arg-Asp-Pr 0-Gln-Ser，如沈Q ID NO ;4所示；Asp-T巧-Ser-Gln-T巧-Val-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Ser， 如SEQ ID NO ;5所示。
[0009] 將本發(fā)明中篩選到的陽(yáng)性瞻菌體擴(kuò)增后用ELISA測(cè)定其能否與M評(píng)a發(fā)生特異結(jié) 合。ELISA結(jié)果說明；表達(dá)有A或B中所述氨基酸序列的瞻菌體與M評(píng)a的結(jié)合能力均較高 (〇〇45。值大于1. 5)，說明W上五種瞻菌體表面插入的十二膚能特異性識(shí)別M評(píng)a重組蛋白， 為與M評(píng)a重組蛋白特異結(jié)合的十二膚。
[0010] 為進(jìn)一步證實(shí)W上五種陽(yáng)性瞻菌體克隆能與M評(píng)a重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，將 陽(yáng)性瞻菌體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制性化ISA試驗(yàn)。結(jié)果表明W上五種瞻菌體與M評(píng)a重組蛋白發(fā)生 的特異性結(jié)合能不同程度的被不同稀釋度的抗M評(píng)a抗體抑制，且隨著抗體稀釋比例的升 高其抑制效果相應(yīng)的下降。該些結(jié)果說明上述陽(yáng)性瞻菌體與M評(píng)a重組蛋白的特異結(jié)合能 被M評(píng)a的抗體所抑制，進(jìn)一步說明了陽(yáng)性瞻菌體克隆能與M評(píng)a重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。
[0011] 為更進(jìn)一步證明W上五種陽(yáng)性瞻菌體克隆能與M評(píng)a重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合， 取經(jīng)擴(kuò)增后的陽(yáng)性瞻菌體于硝酸纖維素膜上，分別與M評(píng)a重組蛋白及其抗M評(píng)a抗體解育 后，采用常規(guī)斑點(diǎn)印跡法進(jìn)行陽(yáng)性瞻菌體克隆的鑒定。斑點(diǎn)印跡圖表明，W上五種陽(yáng)性瞻菌 體克隆顯示有明顯的斑點(diǎn)，而在陰性對(duì)照處無(wú)明顯斑點(diǎn)。說明篩選出來(lái)的陽(yáng)性瞻菌體能與 M評(píng)a蛋白發(fā)生特異結(jié)合。
[001引因此，本發(fā)明中所提供的十二膚能夠與生殖支原體M評(píng)a特異性結(jié)合，能夠用于制 備預(yù)防生殖支原體感染的疫苗及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中， 具有顯著的效果。
【附圖說明】
[0013] 圖1和圖2為本發(fā)明中瓊脂糖電泳分析瞻菌體單鏈DNA結(jié)果圖；
[0014] 圖3為本發(fā)明中瞻菌體克隆與M評(píng)a蛋白及牛血清白蛋白的化ISA反應(yīng)性結(jié)果圖；
[0015] 圖4為本發(fā)明中抗M評(píng)a抗體與陽(yáng)性瞻菌體的競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0016] 圖5為本發(fā)明中陽(yáng)性瞻菌體克隆斑點(diǎn)印跡鑒定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局 限于W下實(shí)施例。
[001引本實(shí)施例中所提供的五種十二膚為評(píng)a為祀分子，從瞻菌體展示膚庫(kù)中篩選 而得，具體的篩選方法本發(fā)明中不需進(jìn)行過多闡述，現(xiàn)針對(duì)所篩選得到的瞻菌體進(jìn)行鑒定 及分析。
[0019] 1、瞻菌體膚庫(kù)滴度測(cè)定
[0020] 瞻菌體膚庫(kù)用無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基從1〇7稀釋至10M后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瞻菌 體菌株邸2738與每個(gè)稀釋度的瞻菌體混勻后鋪于含IPTG和X-gal的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，由 于瞻菌體展示庫(kù)中的瞻菌體含特有的lacZa基因，因此當(dāng)瞻菌斑生長(zhǎng)在含有IPTG和X-gal 的培養(yǎng)平板上時(shí)，顏色呈現(xiàn)出藍(lán)色，而外界污染的瞻菌斑并無(wú)特定的lacZa基因，顏色則 為白色。
[0021] 2、瞻菌體特異性結(jié)合的富集分析
[0022]W純化濃縮好的M評(píng)a重組蛋白為祀分子，對(duì)瞻菌體隨機(jī)12膚庫(kù)進(jìn)行3輪淘選。在 淘選過程中，為得到與M評(píng)a重組蛋白能特異性結(jié)合的瞻菌體，在淘選時(shí)逐一降低了祀蛋白 的包被量（100yg/mL、60yg/mL、30yg/mL)，同時(shí)提高了TBST中Tween-20的濃度（第一輪 為0. 1%、第二；輪0.5%)，另外，在后面兩輪的淘選中增加了洗漆次數(shù)、減少了祀分子與 瞻菌體的解育時(shí)間。測(cè)滴度時(shí)，每一個(gè)稀釋度取20y1，做兩個(gè)平板，計(jì)算少于100個(gè)的瞻菌 斑平板，取兩平行平板的平均值。在計(jì)算產(chǎn)率（Ratio)時(shí)，W每一輪生物淘選時(shí)加入瞻菌體 的量作為投入量（Input),洗脫后測(cè)滴度的平板上藍(lán)色瞻菌斑的量為產(chǎn)出的量（Ou化ut)， 產(chǎn)率的計(jì)算=產(chǎn)出量/投入量X100%。
[0023] 由表1可知，第1輪淘洗時(shí)其產(chǎn)率僅為1. 78X1(T6,而第3輪淘洗時(shí)其產(chǎn)率達(dá)到了 7. 30Xl(r5,說明具有特異性結(jié)合活性的瞻菌體克隆得到明顯富集。
[0024] 表1親和篩選的產(chǎn)出與投入比
[0025]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結(jié)合的十二肽，其特征在于：所述十二肽為A 或B中的任意一種： A :由 Asp-Trp-Ser-Ser-Trp-Val-His-Arg-Asp-Pro-Gln-Thr 所不的氨基酸序列組成 的十二肽； B :在A所述的氨基酸序列中經(jīng)過取代1-5個(gè)氨基酸且具有與生殖支原體MgPa特異性 結(jié)合活性的由A所衍生的十二肽；具體的取代方式包括如下五種：第二位的Trp被Arg取 代，第四位的Ser被Gln取代，第六位的Val被Gly取代，第七位的His被Tyr取代，第十二 位的Thr被Ser取代。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合的十二肽，其特征在于：所述 十二肽為 Asp-Arg-Ser-Ser-Trp-Val-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Thr 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合的十二肽，其特征在于：所述 十二肽為 Asp-Arg-Ser-Gln-Trp-Gly-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Ser 〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合的十二肽，其特征在于：所述 十二肽為 Asp-Trp-Ser-Gln-Trp-Gly-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Ser 〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合的十二肽，其特征在于：所述 十二肽為 Asp-Trp-Ser-Gln-Trp-Val-Tyr-Arg-Asp-Pro-Gln-Ser 〇
6. 權(quán)利要求1-5中任一所述的十二肽的用途，其特征在于：用于制備預(yù)防生殖支原體 感染的疫苗及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結(jié)合的十二肽，所述多肽為A或B中的任意一種，A：如SEQ ID NO：1所示的十二肽。B：在A所述的氨基酸序列中經(jīng)過取代1-5個(gè)氨基酸且具有與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合活性的由A所衍生的十二肽；具體的取代方式包括如下五種：第二位的Trp被Arg取代，第四位的Ser被Gln取代，第六位的Val被Gly取代，第七位的His被Tyr取代，第十二位的Thr被Ser取代。本發(fā)明中所提供的五種十二肽能夠與生殖支原體MgPa特異性結(jié)合，能夠用于制備預(yù)防生殖支原體感染的疫苗及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中，具有顯著的效果。
【IPC分類】A61K38-10, C07K7-08, A61P31-04
【公開號(hào)】CN104829692
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510278998
【發(fā)明人】游曉星, 朱有蔥, 曾焱華, 何軍, 王麗
【申請(qǐng)人】南華大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月27日