體細胞基于小分子轉(zhuǎn)化為神經(jīng)嵴細胞的制作方法
【專利說明】體細胞基于小分子轉(zhuǎn)化為神經(jīng)嵴細胞 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及一種基于化學(xué)確定成分培養(yǎng)基誘導(dǎo)的關(guān)聯(lián)步驟，將體細胞分化成多能 神經(jīng)嵴細胞的方法。神經(jīng)嵴細胞能夠分化成眾多細胞類型如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細 胞或脂肪細胞。
[0002] 背景
[0003] 通過異位表達4種關(guān)鍵的發(fā)育基因 c-myc、Sox2、0ct4和Klf4,使體細胞再編 程成經(jīng)誘導(dǎo)的多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells)的贏得諾貝爾獎的方 法是獲得能夠分化成任何細胞類型的患者特異性多潛能細胞的有力工具（Takahashi和 Yamanaka，2006)。最近，不同研究已經(jīng)報告，細胞類型特異性基因還可以直接將一個體細胞 類型轉(zhuǎn)化成另一個體細胞類型，這是一種作為細胞轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)分化報道的方法（Vierbuchen 和Wernig，2011)。這種方法代表一種獲得多種確定的細胞用于臨床和研究的有前景策略， 從而避免潛在致腫瘤的多潛能階段。
[0004] 已知的細胞轉(zhuǎn)化或再編程策略的重大缺陷是要求引入異位基因，所述異位基因可 能對已轉(zhuǎn)化細胞的稍后應(yīng)用產(chǎn)生不利的影響。為了允許長期和穩(wěn)定表達，異位基因經(jīng)常不 得不穩(wěn)定整合入基因組中。盡管可能緊密控制異位基因表達，但整合的基因可以具有不利 的影響。例如，引入原癌基因 c-myc增加嵌合動物中腫瘤形成的風(fēng)險，原因在于c-myc再活 化（Okita等人，2007)。通常，基因組的復(fù)雜調(diào)節(jié)裝置導(dǎo)致很難預(yù)測基因修飾的長期效果。
[0005] 為了避免再編程方案中基因整合的缺點，新方法通過小分子更換關(guān)鍵再編程基 因。Li等人通過將某些基因更換為調(diào)節(jié)特定信號傳導(dǎo)途徑的小分子如Wnt或TGF- β，產(chǎn)生 IPS細胞（Li等人，2012)。通過基于小分子抑制BMP、TGF β和GSK3b信號傳導(dǎo)，基因介導(dǎo) 的成纖維細胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元的產(chǎn)率和效率大大增加（Ladewig等人，2012)。與這些結(jié)果相 符，也已經(jīng)證明小分子是指導(dǎo)干細胞分化的有價值工具。例如，對骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)和 TGF-β信號傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致高度有效的干細胞的神經(jīng)誘導(dǎo)（Chambers等人，2009)。
[0006] 并沒有徹底理解小分子影響細胞命運決策的機理。盡管小分子可能足以誘導(dǎo)分 化，但是誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化成多能性或另一個體細胞類型仍然需要異位基因表達。這可能歸因 于以下事實：與干細胞分化成體細胞相比，改變終末分化細胞的表型成為不同的細胞類型 是一種非生理學(xué)過程。
[0007] 本文中提供將體細胞轉(zhuǎn)化成多能神經(jīng)嵴細胞的新方法，所述新方法完全基于小分 子處理和確定的培養(yǎng)條件并且不需要通過引入基因來遺傳地修飾細胞。
[0008] 這種新方法利用將體細胞轉(zhuǎn)分化成增殖性神經(jīng)嵴樣階段的新型多激酶抑制物。神 經(jīng)嵴細胞可以分化成多種細胞類型如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。
[0009] 例如，可以通過將特定培養(yǎng)基組合以基于小分子抑制確定的信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo) 神經(jīng)嵴細胞分化成施旺細胞。神經(jīng)成熟的施旺細胞代表外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS)的膠質(zhì)細胞。 施旺細胞執(zhí)行多種功能，如神經(jīng)元的免疫保護、養(yǎng)分供應(yīng)和髓鞘化。施旺細胞功能障礙是外 周神經(jīng)系統(tǒng)的許多神經(jīng)學(xué)病癥（例如多發(fā)性硬化或髓鞘化疾?。┑脑?。
[0010] 重要地，這種新的細胞轉(zhuǎn)化方法不需要表達任何異位基因，而僅基于化學(xué)處理。因 此，它代表有一種產(chǎn)生患者特異性神經(jīng)嵴細胞或分化細胞如施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細 胞或脂肪細胞的有前景方法。
[0011] 發(fā)明概沐
[0012] 本文中提供一種從體細胞產(chǎn)生神經(jīng)嵴細胞的方法，所述方法包括：
[0013] a)在補充有丙戊酸（valproic acid)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)體細胞，
[0014] b)在補充有N-{(3R，4R)-4-[4-(2-氟-6-羥基-3-甲氧基-苯甲酰基）-苯甲酰 氨基]-吖庚烷-3-基}-4-羥基-3, 5-二甲基-苯甲酰胺的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟（a) 中獲得的細胞。
[0015] 在一個實施方案中，該方法不包括通過引入基因遺傳修飾體細胞或步驟（a)中獲 得的細胞。
[0016] 在一個實施方案中，步驟b)包括以懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)細胞。
[0017] 在一個實施方案中，步驟b)的無血清培養(yǎng)基補充有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)的抑制 物。在一個實施方案中，BMP的抑制物是頭蛋白（noggin)。
[0018] 在一個實施方案中，步驟b)的無血清培養(yǎng)基補充有轉(zhuǎn)化生長因子β (TGFP)的小 分子抑制物。
[0019] 在一個實施方案中，TGFI3的小分子抑制物是SB431542。
[0020] 在一個實施方案中，步驟b)的無血清培養(yǎng)基補充有糖原合酶激酶3 (GSK3 β )的小 分子抑制物。
[0021] 在一個實施方案中，GSK3 0的抑制物是3-(3-氨基-苯基）-4-(1-甲基-IH-吲 哚-3-基）-吡咯-2, 5-二酮。
[0022] 在一個實施方案中，步驟a)包括將細胞培養(yǎng)2天。
[0023] 在一個實施方案中，步驟b)包括將細胞培養(yǎng)7天。
[0024] 在一個實施方案中，體細胞是成纖維細胞。
[0025] 在一個實施方案中，體細胞是人細胞。
[0026] 在一個實施方案中，體細胞從患有神經(jīng)疾病的受試者獲得。
[0027] 在一個實施方案中，提供了通過根據(jù)任一個以上實施方案的方法獲得的神經(jīng)嵴細 胞。
[0028] 在一個實施方案中，該方法還包括
[0029] c)在適于神經(jīng)嵴細胞分化成分化細胞的條件下溫育步驟b)的產(chǎn)物，所述的分化 細胞選自施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。
[0030] 在一個實施方案中，提供了通過根據(jù)任一個以上實施方案的方法獲得的施旺細 胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞。
[0031] 在一個實施方案中，提供神經(jīng)嵴細胞或分化的施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或 脂肪細胞的生物樣本庫（biobank)。
[0032] 在一個實施方案中，使用神經(jīng)嵴細胞或分化的施旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或 脂肪細胞作為神經(jīng)疾病的體外模型。
[0033] 一個實施方案包括治療性組合物，所述治療性組合物包含神經(jīng)嵴細胞或分化的施 旺細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞或脂肪細胞或包含這些細胞的生物樣本庫。
[0034] 一個實施方案包括N- {(3R，4R) -4- [4- (2-氟-6-羥基-3-甲氧基-苯甲酰基）-苯 甲酰氨基]-吖庚烷-3-基} -4-羥基-3, 5-二甲基-苯甲酰胺在從體細胞產(chǎn)生神經(jīng)嵴細胞 的方法中的用途。
[0035] 一個實施方案包括3- (3-氨基-苯基）-4- (1-甲基-IH-吲哚-3-基）-吡 咯-2, 5-二酮在從體細胞產(chǎn)生神經(jīng)嵴細胞的方法中的用途。
[0036] 以上實施方案的任一個實施方案可以單獨或組合地存在。
[0037] 附圖簡沐
[0038] 圖1 :鑒定增強神經(jīng)干細胞（NSC)增殖并使成纖維細胞能轉(zhuǎn)化為神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)的 小分子。A :化合物B以劑量依賴性方式促進ESC-NSC增殖。通過ATP測定法分析增殖并且 顯示2次實驗的均數(shù)。B :用化合物B處理的成纖維細胞在懸浮培養(yǎng)時形成球狀體樣結(jié)構(gòu)。 比例尺：200 μ m。C :化合物B的激酶選擇性譜。橙色圖標(biāo)代表受抑制超過80%的激酶。D : 通過其他化合物單一或聯(lián)合抑制化合物B靶（化合物靶在圖注中括號內(nèi)顯示）對成纖維細 胞的球狀體形成沒有影響或具有更小影響。圖中將增殖速率顯示為懸浮培養(yǎng)第3日初始細 胞數(shù)目（左）和平均球狀體直徑（右）的倍數(shù)變化。條柱顯示三次獨立實驗的均數(shù)+/-SD。 使用Student t檢驗評價數(shù)據(jù)。* :與DMSO對照相比，p〈0. 05。+ :化合物B與單一抑制物 相比，p〈〇. 05。E :使人成纖維細胞轉(zhuǎn)化成經(jīng)誘導(dǎo)的施旺細胞（iSC)的實驗設(shè)計的示意圖。
[0039] 圖2 :人成纖維細胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)嵴樣階段。A-D :在轉(zhuǎn)化第11日的次生球狀體，同時 雙極細胞從球狀體長出并表達早期神經(jīng)板標(biāo)志物Soxl和巢蛋白（Nestin)。比例尺：50 μ m。 E :轉(zhuǎn)化的神經(jīng)嵴細胞（第18日）和成纖維細胞（第0日）的流式細胞術(shù)揭示出成纖維細 胞標(biāo)志物⑶29下調(diào)和神經(jīng)嵴標(biāo)志物⑶271上調(diào)。下半小圖顯示平均熒光強度（MFI)的定 量。條柱顯示三次獨立實驗的均數(shù)+/-SD并且使用Student t檢驗評價數(shù)據(jù)。F-I :在轉(zhuǎn) 化第18日，細胞已經(jīng)從球狀體迀出并表達神經(jīng)嵴標(biāo)志物Snail、SoxlO、FoxD3和AN2。比例 尺：100 μm。J-M :神經(jīng)嵴樣細胞的非神經(jīng)分化。在特定分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)導(dǎo)致脂肪細胞 (J)、平滑肌細胞（K)和軟骨細胞（UM)的形成。比例尺：50 μm(J)，100 μm(K).
[0040] 圖3 :過渡性前體細胞分化成經(jīng)誘導(dǎo)的施旺細胞（iSC)。（A-D) iSC表達施旺細胞標(biāo) 記蛋白。比例尺：50μπι。（E)轉(zhuǎn)化效率。在第31日時PLP陽性細胞的定量。因背景信號 所致少量PLP陽性成纖維細胞。條柱顯示均數(shù)+/-SD (η = 3)。使用Student t檢驗分析數(shù) 據(jù)。（F)來自第0日（成纖維細胞）、第7日（早期tP)、第11日（早期tP)、第18日（晚 期tP)、第39日（iSC)時的細胞和原代施旺細胞（pSC)的全轉(zhuǎn)錄組表達譜的主成分分析。 主成分l(x_軸）占數(shù)據(jù)集合變異的27. 4%并且主成分2 (y-軸）占據(jù)集合變異的16. 5%。 每種階段由衍生自獨立實驗的至少兩個數(shù)據(jù)點代表。在第39日聚類的轉(zhuǎn)錄組學(xué)概況顯示 方案的穩(wěn)健性。（G)與第0日細胞（成纖維細胞）相比，第39日細胞（iSC)中的基因集合 富集圖（反應(yīng)組學(xué)/R0NET)。紅色節(jié)點代表iSC富集的基因集合，而藍色節(jié)點代表成纖維 細胞富集的基因集合。將節(jié)點分組并且根據(jù)相關(guān)的基因集合按照它們的相似性注釋；將共 有的基因表示為節(jié)點之間的綠線。將功能相關(guān)節(jié)點的聚類匯總并使用WordCloud注釋。分 析來自至少兩個獨立測定法的數(shù)據(jù)。（H) iSC的全膜片鉗分析。在從保持電位Vh =-80mV 起IOmV漸增階式方案中從-70mV至+40mV獲得電壓依賴性電流。早期內(nèi)向電流的不存在 證實電壓依賴性Na+通道的缺乏，而外向組分與電壓依賴性K +通道的存在相符。（I)在iSC 中，最大電壓依賴性K+流比成纖維細胞中顯著更高。條柱顯示兩個獨立實驗中測量的不同 細胞的均數(shù)+/ -SD(FB :n = 12 ;iSC :n = 7)。使用Student t檢驗分析數(shù)據(jù)。
[0041] 圖4 :與神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)時iSC的功能。（A-C)在POL(A)、在細胞示蹤物標(biāo)記的 成纖維細胞（B)和iSC (C)上分別培養(yǎng)NSC衍生的神經(jīng)元。比例尺：100 μ m。通過MAP2染色 區(qū)域（D)、神經(jīng)突數(shù)目（E)和總神經(jīng)突長度（F)分析，用iSC培養(yǎng)的NSC神經(jīng)元形成更致密 和分支的網(wǎng)絡(luò)。條柱顯示均數(shù)+/-SD(η = 3)。使用Student t檢驗分析數(shù)據(jù)。*:p〈0. 05。 (G) iSC與原代大鼠 DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)。一些iSC形成通過MB染色（黃色）和神經(jīng)絲（NF) 染色（品紅）的共定位檢測到的單個有髓鞘片段（箭頭）。比例尺：20 μ m。
[0042] 圖5 :表征用于生成iSC的人成纖維細胞。（A-C)人成纖維細胞不表達神經(jīng)嵴細 胞標(biāo)志物或施旺細胞標(biāo)志物。（A)成纖維細胞的相差圖像。比例尺：50 μm。（B)成纖維細 胞的流式細胞分析顯示初始成纖維細胞群體不含有表達神經(jīng)嵴標(biāo)志物CD271的細胞。（C) 神經(jīng)嵴細胞標(biāo)志物和施旺細胞標(biāo)志物的免疫染色。胞核用Hoechst染色可視化。比例尺： 50 μm。（D、E)成纖維細胞培養(yǎng)物和誘導(dǎo)的過渡性前體細胞不含有間充質(zhì)干細胞（MSC)。通 過免疫染色（D)和流式細胞術(shù)（E)分析MSC標(biāo)志物⑶146。使用衍生自胚胎干細胞的MSC 作為陽性對照。D中的比例尺：50 μm。
[0043] 圖6 :化合物B處理介導(dǎo)球狀體貼壁至層粘連蛋白基材。在POL上鋪種兩小時后 用化合物B或單一化合物B靶的抑制物生成的次生球狀體。僅化合物B處理的球狀體（上 部中間）已經(jīng)貼壁并開始移行。在對照（DMSO)條件和單一抑制物條件下，漂浮的球狀體已 經(jīng)在孔的中心聚集。比例尺：200 μ m。
[0044] 圖7 :(A、B)轉(zhuǎn)化方案不產(chǎn)生神經(jīng)元，如通過第31日時的陰性Map2染色所示。胞 核用Hoechst染色可視化。比例尺：100μπι。（C、D)轉(zhuǎn)化過程期間的全基因表達譜。（C)相 對于第0日（成纖維細胞），在第11日（早期tP)、第18日（晚期tP)和第39日（iSC)時 差異性表達的基因（在至少1個時間點期間倍數(shù)變化>10)的熱圖。使用平均連鎖和歐氏 距離，生成總體下調(diào)的基因（藍色）和總體上調(diào)基因（紅色）的聚類。生物學(xué)過程GO術(shù)語 用于聚類注釋。對于每個階段，分析來自至少兩個獨立測定法的數(shù)據(jù)。（D)顯示神經(jīng)營養(yǎng)因 子差異性表達的熱圖。Lo