專利名稱：T細(xì)胞粘附分子及其抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在來自骨髓的樹狀細(xì)胞上表達(dá)的T細(xì)胞粘附分子及其 基因、以及在T細(xì)胞上表達(dá)的、該粘附分子(受體)的配體及其基因。本 發(fā)明還涉及該粘附分子或該配體的抗體及其用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及 利用該粘附分子的篩選方法。
背景技術(shù)：
近年來，有人報道在T細(xì)胞上表達(dá)的作為樹狀細(xì)胞活化因子而 被克隆的分子是控制破骨細(xì)胞分化的重要的細(xì)胞因子(Yasuda， H.,等 人.(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597 ~ 3602),以此為代表，明確 了免疫系統(tǒng)與骨代謝的密切關(guān)系。
有關(guān)通過免疫系統(tǒng)控制分子來控制骨代謝的研究得到迅速進(jìn)展， 對于與破骨細(xì)胞分化控制相關(guān)的信號傳遞也進(jìn)一步得到了解。
例如，作為與破骨細(xì)胞分化相關(guān)的分子，已知有Oscar (破骨細(xì)胞 相關(guān)受體)。目前已報到Oscar是類免疫球蛋白受體，與FcRy鏈締合， 經(jīng)由FcRY鏈的ITAM基序向磷脂酶Oy傳遞信號(Kim,N.,等.(2002) J ExpMed 195:201 -209)。
作為在樹狀細(xì)胞上表達(dá)、與T細(xì)胞粘附、以致參與與T細(xì)胞和樹狀 細(xì)胞之間的免疫應(yīng)答有關(guān)的相互作用的分子，已報導(dǎo)有CD80-CD28、 CD40-CD40L、 ICAM1-LFA1等各種的相互作用。
發(fā)明概要
本發(fā)明人等通過扣除法，對于在來自骨髓的樹狀細(xì)胞上特異性表 達(dá)的基因進(jìn)行了鑒定。本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)該基因所編碼的蛋白質(zhì)與 IgE受體的FcR丫鏈結(jié)合；通過LPS刺激，該蛋白質(zhì)的表達(dá)增強；通過對該蛋白質(zhì)的抗體交聯(lián)刺激，樹狀細(xì)胞被活化；該蛋白質(zhì)具有與T細(xì)胞 粘附的功能；該蛋白質(zhì)的抗體對于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)疾病模型一膠原誘導(dǎo)關(guān) 節(jié)炎模型具有治療效果。本發(fā)明人等進(jìn)一步對于在T細(xì)胞上表達(dá)的、 該蛋白質(zhì)的配體基因進(jìn)行了鑒定。本發(fā)明基于上述認(rèn)識而完成。
本發(fā)明提供膜蛋白或分泌蛋白(以下稱為本發(fā)明的第一方案的新 型蛋白質(zhì))，該膜蛋白或分泌蛋白含有SEQIDN0.2、 SEQIDNO,4、 SEQIDN0.6、或SEQIDN0.8所示的氨基酸序列，或者具有l(wèi)或多個 保守性置換的SEQ ID N0.2、 SEQIDN0.4、 SEQ ID N0.6或SEQ ID N0.8所示的氨基酸序列。
本發(fā)明提供選自下述(i)、 (ii)、 (iii)和(iv)的膜蛋白或分泌蛋白(以下 稱為本發(fā)明的第二方案的新型蛋白質(zhì))
(i) 含有SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(ii) 含有在SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸的插 入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所得的 氨基酸序列，且與含有SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同 等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(iii) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID NO.IO所示氨基酸序列的多核苦 酸雜交的多核苷酸所編碼、且與含有SEQIDNO.IO所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(iv) 含有與SEQ ID NO. 10所示的氨基酸序列具有90%以上同 一性的氨 基酸序列，且與含有SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等 功能的膜蛋白或分泌蛋白。
本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的第一方案和第二方案的新型蛋白質(zhì)的 多核苷酸。
本發(fā)明還提供選自下述(v)、 (vi)、 (vii)和(viii)的多核苷酸
(v) 含有SEQIDN0.9所示核苷酸序列的多核苷酸；
(vi) 在含有SEQIDN0.9所示核苷酸序列的多核苷酸中，有l(wèi)或多個核 苷酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個核苦酸，且編碼與含有SEQIDNO.10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功 能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苦酸；
(vii) 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有SEQ IDN0.9所示核苷酸序列的多核普酸雜 交，且編碼與含有SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功 能的膜蛋白或分泌蛋白的多核普酸；和
(viii) 與含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苷酸具有90。/。以上 的同 一性，且編碼與含有SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有 同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明又提供選自下述(bc)、 (x)、 (xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白 (以下稱為TARM (骨髓細(xì)胞上的T細(xì)胞相互作用活化受體，T cell-interacting Activating Receptor on Myeloid cells)蛋白)的抗體及其 功能性片段(以下稱為本發(fā)明的第 一方案的抗體)。
(ix) 含有SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ IDN0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；
(x) 含有在SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列中，有l(wèi)或多個氨基 酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸 所得的氨基酸序列，且與含有SEQ IDN0.2、 SEQIDNO,4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列 的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDNO,8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID NO,12所示氨基酸序列 的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQIDN0.2、 SEQ ID NO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDNO,8、 SEQ ID NO. IO或SEQ ID NO. 12 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii) 含有與SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70。/。以上同一 性的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ IDN0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。本發(fā)明又提供選自下述(xiii)、 (xiv)、 (xv)和(xvi)、作為本發(fā)明的 新型蛋白質(zhì)的配體的新型配體蛋白(以下稱為本發(fā)明的新型配體蛋白， 或者稱為TARM-L (TARM配體)蛋白)(xiii) 含有SEQIDNO,14或SEQIDN0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(xiv) 含有在SEQIDN0.14或SEQIDN0.16所示的氨基酸序列中，有l(wèi) 或多個氨基酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或 多個氨基酸所得的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID NCU6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)；(xv) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基 酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQ ID NO. 14或 SEQIDN0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)；和(xvi) 含有與SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示的氨基酸序列具有 70%以上同一性的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的新型配體蛋白的多核苷酸。 本發(fā)明又提供選自下述(xvii)、 (xviii)、 (xix)和(xx)的多核苷酸(xvii) 含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷酸序列的多核苷 酸；(xviii) 在含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷酸序列的多核 苷酸中，有l(wèi)或多個核苷酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩 末端附加l或多個核苷酸，且編碼與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(xix) 在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷酸 序列的多核苦酸雜交，且編碼與含有SEQ ID NO,14或SEQ ID NO.16 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(xx) 與含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷酸序列的多核苷酸具有70%以上的同一性，且編碼與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基g^f列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
本發(fā)明提供本發(fā)明的新型配體蛋白的抗體及其功能性片段(以下 稱為本發(fā)明的第二方案的抗體)。
本發(fā)明又提供自身免疫疾病治療藥和T細(xì)胞粘附抑制劑，該自身 免疫疾病治療藥和T細(xì)胞粘附抑制劑含有本發(fā)明的第一方案和第二方 案的抗體(以下將它們統(tǒng)稱為"本發(fā)明的抗體")或它們的功能性片段作 為有效成分。
本發(fā)明提供以下所示的篩選方法。
根據(jù)本發(fā)明的第 一方案的篩選方法，提供抑制TARM蛋白與T細(xì) 胞粘附的物質(zhì)或其鹽或者它們的溶劑合物的篩選方法，該篩選方法包 含下述步驟
(a) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使TARM蛋白與T細(xì)胞接觸的步 驟；和
(b) 測定TARM蛋白與T纟田胞的粘附活性的步驟。 根據(jù)本發(fā)明的第二方案的篩選方法，還提供抑制樹狀細(xì)胞活化的
物質(zhì)或其鹽或者它們的溶劑合物的篩選方法，該篩選方法包含以下步 驟
(d) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使本發(fā)明的抗體或其功能性片 段與樹狀細(xì)胞接觸的步驟；和
(e) 測定上述樹狀細(xì)胞的活化程度的步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第三方案的篩選方法，提供抑制TARM蛋白與FcRy 鏈形成復(fù)合物的物質(zhì)或其鹽或者它們的溶劑合物的篩選方法，該篩選 方法包含下述步驟
(g) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使本發(fā)明的抗體或其功能性片 段與樹狀細(xì)胞接觸的步驟；和
(h) 測定上述樹狀細(xì)胞中FcRy鏈的表達(dá)量的步驟。附圖簡述圖l是表示小鼠TARM基因(ml 4和sl)的氨基酸序列的圖。下劃 線表示免疫球蛋白(IG)環(huán)結(jié)構(gòu)部分，粗字體表示跨膜部分。圖2是表示使用引物對l、通過實時PCR對小鼠組織中TARM的 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。圖3是表示使用引物對l、通過實時PCR對各種細(xì)胞中TARM的 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。圖4 A是表示在抗TARM蛋白抗體的制備中所使用的胞外域的結(jié) 構(gòu)和氨基酸編號的圖。B是表示對該抗體與TARM蛋白的特異性進(jìn)行 研究的結(jié)果圖。圖5是表示對來自骨髓的樹狀細(xì)胞中的小鼠蛋白的表達(dá)進(jìn)行分 析的結(jié)果圖。圖6是表示對來自正常小鼠的免疫組織細(xì)胞中的小鼠蛋白的表 達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。圖7是表示對在c-kit陽性腹腔肥大細(xì)胞中的小鼠蛋白的表達(dá)進(jìn)行 分析的結(jié)果圖。圖8是表示對LPS炎癥刺激導(dǎo)致的來自小鼠淋巴結(jié)的細(xì)胞中的小 鼠TARM蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。箭頭表示小鼠TARM蛋白的 表達(dá)。圖9 A是表示抗TARM蛋白抗體刺激誘導(dǎo)由成熟骨髓樹狀細(xì)胞生 成IL-6的圖。B是表示抗TARM蛋白抗體刺激誘導(dǎo)由未成熟骨髓樹狀細(xì) 胞生成MCP-1的圖。圖IO是表示伴隨小鼠TARM蛋白在細(xì)胞表面上的表達(dá)增加， FcRy鏈也增加的圖。圖ll是表示通過免疫沉淀法對小鼠TARM蛋白與FcRY鏈形成復(fù) 合物進(jìn)行分析的結(jié)果圖。

圖12是表示對與小鼠TARM蛋白結(jié)合的分子在活化T細(xì)胞中的 表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。圖13是表示活化T細(xì)胞與小鼠TARM蛋白的粘附能力的圖。
圖14是表示抗小鼠TARM蛋白抗體抑制Th2細(xì)胞與小鼠TARM蛋
白粘附的圖。
圖15是表示給予抗小鼠TARM蛋白抗體的膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型 的外觀觀察和體重隨時間變化的圖。
圖16是表示給予抗小鼠TARM蛋白抗體對于膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模 型血漿中的血清淀粉狀蛋白A濃度的效果的圖。
圖17是表示給予抗小鼠TARM蛋白抗體對于膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模 型血漿中的抗膠原抗體效價的效果的圖。
圖18是表示通過實時PCR對人組織中的TARM蛋白的mRNA表 達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果19是表示來自人的TARM蛋白的氨基酸序列圖。下劃線表示免 疫球蛋白(Ig)環(huán)結(jié)構(gòu)部分，粗字體表示跨膜部分?？蚱鸬牟糠直硎驹?hTARM和LOC441864之間不同的序列。
圖20是表示活化T細(xì)胞與人TARM蛋白的粘附能力、以及抗人 TARM蛋白抗體抑制T細(xì)胞與人TARM蛋白粘附的圖。
圖21 A是表示對與小鼠TARM蛋白結(jié)合的分子在小鼠細(xì)胞林中的 表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果圖。B是通過實時PCR對于小鼠細(xì)胞株中作為 mTARM-L侯選分子的ENSMUSG0000003 5095的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析 的結(jié)果圖。
圖22 A是表示小鼠TARM-AP嵌合蛋白與表達(dá)mTARM-L的 B300.19細(xì)胞的特異性結(jié)合的圖。B是表示表達(dá)mTARM-L的B300.19細(xì) 胞與小鼠TARM-AP嵌合蛋白特異性細(xì)胞粘附的圖。
圖23是表示對人和小鼠TARM-L蛋白同源性進(jìn)行分析的結(jié)果圖。 圖24是表示對人TARM蛋白和小鼠TARM蛋白(m3)的同源性進(jìn) 行分析的結(jié)果圖。
發(fā)明的具體說明以下，詳細(xì)說明本發(fā)明。以下的記述是用于說明本發(fā)明的列舉， 并不將本發(fā)明限定于所記述的實施方案中。本說明書中使用的所有的 技術(shù)術(shù)語、科學(xué)術(shù)語和專業(yè)術(shù)語與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的通常的技術(shù)人員所常規(guī)理解的具有相同的含義，其目的只是用于說明特定的方案 使用，并不用于限定。本發(fā)明只要不脫離其宗旨，可以以各種形式實 施。本說明書中引用的所有先^f亍技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報、專利公報等專 利文獻(xiàn)均作為參照引入本說明書中，可用于本發(fā)明的實施。[新型蛋白質(zhì)和多核苷酸]本發(fā)明中鑒定的、在來自骨髓的樹狀細(xì)胞上特異性表達(dá)的基因中，來自小鼠的基因中存在5種同種型。來自小鼠的基因的同種型有 膜結(jié)合型蛋白(膜蛋白)的基因有ml、 m2、 m3和m4,分泌型蛋白(分泌 蛋白)的基因有sl,各同種型的核苷酸序列和氨基酸序列與下述SEQ ID NO.對應(yīng)。ml: SEQIDNO,ll和12m2: SEQIDN0.1和2m3: SEQIDN0.3和4m4: SEQIDN0.5和6sl: SEQIDN0.7和8本發(fā)明中鑒定的、在來自骨髓的樹狀細(xì)胞上特異性表達(dá)的基因 中，來自人類的基因有一種膜蛋白的基因。該基因的核苷酸序列和由 其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基S1^列為SEQ ID N0.9和10。本發(fā)明中鑒定的基因的核苷酸序列編碼信號肽，因此，由該基因 所編碼的蛋白質(zhì)形成膜蛋白或分泌蛋白。本發(fā)明的膜蛋白通過改變其 C末端(例如通過除去跨膜部分)，可以制成分泌蛋白。本發(fā)明的分泌蛋 白通過改變其C末端(例如通過附加跨膜部分)，可以制成膜蛋白。本說明書中，"在氨基Sl/f列中，有l(wèi)或多個氨基酸的插入、置換 或缺失，或者向其一方或兩末端附加，，和"在多核苷酸中，有l(wèi)或多個核苷酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個核苷 酸，，是指通過位點定向誘變法等周知的技術(shù)，或者由于可天然產(chǎn)生的程 度的多個氨基酸或者核苷酸的置換等進(jìn)行變異。氨基酸和核苷酸的變
異個數(shù)例如為1 ~ 30個，優(yōu)選l ~ 20個，更優(yōu)選l ~ IO個，進(jìn)一步優(yōu)選l ~ 5個，特別優(yōu)選l-2個。
變異氨基酸序列可以優(yōu)選該氨基酸序列為具有1或多個(優(yōu)選1或 數(shù)個、或者l、 2、 3或4個)保守性置換的氨基酸序列。
變異核苷酸序列可以優(yōu)選為該核苦酸序列具有1或多個(例如1 個~數(shù)個、或者l、 2、 3或4個)對于含有SEQ ID NO.10所示氨基l^f 列的蛋白質(zhì)的功能沒有影響的變異。
本說明書中，"保守性置換"是指實質(zhì)上不改變蛋白質(zhì)的功能，將l 或多個氨基酸殘基用其它的化學(xué)性類似的氨基酸殘基置換。例如有 將某種疏水性殘基用其它的疏水性殘基置換的情況、用與某種極性殘 基具有相同電荷的其它極性殘基置換的情況等。可進(jìn)行上述置換的功 能性類似的氨基酸，其每種氨基酸都是該技術(shù)領(lǐng)域中所公知的。具體 列舉如下非極性(疏水性)氨基酸有丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、
亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸等。極性(中性)氨基 酸有甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半 胱氨酸等。具有正電荷(堿性)的氨基酸有精氨酸、組氨酸、賴氨酸 等。具有負(fù)電荷的(酸性)氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸等。
本說明書中，"雜交"是指在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與靶多核苷酸進(jìn)行雜交。 具體來說，有通過FASTA、 BLAST、 Smith-Waterman [Meth. Enzym.， 164, 765 (1988)]等同源性檢索軟件，使用缺省(初始設(shè)定)的參數(shù)計算 時，與靶核苷酸序列至少具有70%以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選85% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選90°/。以上、更進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98% 以上、最優(yōu)選99。/。以上的同源性的多核苷酸。另外，"嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下，， 可按照在本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？墒褂玫碾s交緩沖液中、在溫度40。C ~ 70°C、優(yōu)選60。C 65。C等下進(jìn)行反應(yīng)，在鹽濃度15 300mmol/L、優(yōu)選15~60 mmol/L等的清洗液中清洗的方法進(jìn)行。溫度、鹽濃度可根 據(jù)所使用的探針的長度適當(dāng)調(diào)節(jié)。并且，對雜交所得產(chǎn)物進(jìn)行清洗時 的條件可在0.2或2xSSC、 0.1%SDS、溫度20 68。C下進(jìn)行。是嚴(yán)謹(jǐn)(高 嚴(yán)謹(jǐn))條件還是溫和條件(低嚴(yán)謹(jǐn))，這可以通過清洗時的鹽濃度或溫度 設(shè)置其差異。通過鹽濃度設(shè)定雜交的差異時，"0.2xSSC、 0.1% SDS 作為嚴(yán)謹(jǐn)洗滌緩沖液(高嚴(yán)謹(jǐn)洗滌緩沖液)、以2xSSC、 0.1% SDS作為 溫和洗滌緩沖液(低嚴(yán)謹(jǐn)洗滌緩沖液)進(jìn)行。通過溫度設(shè)定雜交差異時， 嚴(yán)謹(jǐn)可以是在68。C下、中等程度(中等嚴(yán)謹(jǐn))可以是在42。C下、溫和可 以是在室溫(20 25。C)下、均以0.2xSSC、 0.1。/。SDS進(jìn)行。通常，實施預(yù)雜交時，可以在與雜交相同的條件下實施，但預(yù)雜 交和預(yù)備洗滌并不限于在相同條件下進(jìn)行。雜交可按照公知方法進(jìn)行。使用市售的文庫時，可按照所附的使 用說明書記載的方法進(jìn)行。本說明書中，對于氨基酸序列和核苷S臾序列的"同一性"(也稱為同 源性)是對于要進(jìn)行比較的序列間，在構(gòu)成各序列的氨基酸殘基或核苦 酸殘基的一致程度的含義中使用。此時考慮了缺口的存在和氨基酸的 性質(zhì)(Wilbur， Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 726 ~ 730 (1983》。同源性的計 算可使用市售的軟件BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403 -410 (1990》、FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183: 63 ~ 69 (1990))、 Smith-Waterman [Meth. Enzym.， 164, 765 (1988)]等同源性檢索軟件。"同 一性"的數(shù)值只要是均為使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的同源性 檢索程序計算的數(shù)值即可，例如，可在美國生物技術(shù)信息中心(NCBI) 的同源性算法BLAST (基本局部對比檢索工具(Basic local alignment search tool)) http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/BLAST中，使用缺省(初始設(shè) 定)的參數(shù)計算。在本發(fā)明的第二方案的新型蛋白質(zhì)中，與SEQIDNO.10所示氨基 酸序列具有90%以上同 一性的氨基酸序列可以是具有優(yōu)選95%以上、 特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99°/。以上同 一性的氨基酸序列。編碼本發(fā)明的第二方案的新型蛋白質(zhì)的多核苷酸中，與SEQ ID N0.9所示核苷酸序列具有90%以上同 一 性的核苷酸序列可以是具有 優(yōu)選95%以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99。/。以上同一性的核苷酸 序列。
本發(fā)明的第一方案的抗體中，與SEQ IDN0.2、 SEQ IDN0.4、 SEQ IDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ IDNO.10或SEQ IDN0.12所示氨基酸序 列具有70%以上同一性的氨基酸序列可以是具有優(yōu)選80%以上、更優(yōu) 選85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、更進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、特別優(yōu) 選98%以上、最優(yōu)選99%以上同一性的氨基酸序列。
本發(fā)明中，只要給出SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO，6、 SEQIDN0.8、 SEQIDNO.10或SEQIDNO.12所示氨基酸序列,則編 碼該序列的核苷S臾序列容易確定，可以選擇編碼SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDNO,8、 SEQ ID NO.l0或SEQ ID NO. 12 所示氨基酸序列的各種核苷酸序列。
因此，編碼含有SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.6、 SEQ ID NO.S、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的 多核苷酸是指除SEQIDNO.l、 SEQIDN0.3、 SEQIDN0.5、 SEQ ID N0.7、 SEQ ID N0.9或SEQ ID NO.l 1所示DNA序列的一部分或全部之 外，還具有編碼同一氨基酸的DNA序列、存在簡并關(guān)系的密碼子作為 DNA序列的序列。本發(fā)明中進(jìn)一步包含與它們相對應(yīng)的RNA序列。
編碼含有SEQ ID N0.2、 SEQIDN0.4、 SEQ ID NO,6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的多 核苷酸的優(yōu)選例子有含有SEQ ID NO.l 、 SEQ ID N0.3、 SEQ ID N0.5、 SEQ ID NO.7、 SEQ ID N0.9或SEQ ID NO.l l所示核苷酸序列的多核香 酸。
本說明書中，與含有SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.6、 SEQ ID NO,8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)是否具有同等功能，這可通過評價與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID
19N0.4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO. 10或SEQ ID NO. 12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的生物體現(xiàn)象或功能來確定，例 如，可通過基因重組技術(shù)使蛋白質(zhì)表達(dá)，評價是否可發(fā)揮樹狀細(xì)胞的 活化受體功能，由此確定。含有SEQIDNO,2、 SEQIDN0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列 的蛋白質(zhì)與T細(xì)胞相互作用，具有活化樹狀細(xì)胞的功能，因此評價時 可以以下述功能作為指標(biāo)一與T細(xì)胞的粘附功能(實施例5、 6、 lO和ll)、_通過抗體交聯(lián)刺激活化樹狀細(xì)胞的功能(實施例3)、一與FcRY鏈形成復(fù)合物的功能(實施例4)、或者一上述功能的一部分或全部的組合。[新型配體蛋白和多核苦酸]在本發(fā)明中鑒定的、作為TARM蛋白的配體在活化T細(xì)胞上特異 性表達(dá)的基因中，來自小鼠的基因有一種膜蛋白的基因。該基因的核 苷酸序列和由其所編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列記載于SEQ ID NO.13 和14。作為TARM蛋白的配體在活化的T細(xì)胞上特異性表達(dá)的基因中， 來自人的基因有一種膜蛋白的基因。該基因的核苷酸序列和其所編碼 的蛋白質(zhì)的氨基酸序列記載于SEQ ID N0.15和16。本發(fā)明的新型配體蛋白中，與SEQ ID N0.14和SEQ ID N0.16所示 的氨基酸序列具有70%以上同 一性的氨基酸序列可以是具有優(yōu)選80% 以上、更優(yōu)選85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90°/。以上、更進(jìn)一步優(yōu)選95%以 上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上同一性的氨基酸序列。編碼本發(fā)明的新型配體蛋白的多核苷酸中，與SEQ ID N0.13或 SEQ ID NO.15所示核苷酸序列具有70。/。同一性的核芬酸序列可以是 具有優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選85%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、更進(jìn)一 步優(yōu)選95°/。以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上同一性的核苷 酸序列。本發(fā)明中，如果給出SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16所示的氨基酸序列，則編碼該序列的核苷酸序列容易確定，可以選擇編碼SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16所示氨基酸序列的各種核苦酸序列。因此，編碼含有SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)的多核苷酸是指除SEQ ID NO,13或SEQ ID N0.15所示DNA 序列的一部分或全部之外，還具有編碼同一氨基酸的DNA序列、存在 簡并關(guān)系的密碼子作為DNA序列的序列。本發(fā)明中進(jìn)一步包含與它們 相對應(yīng)的RNA序列。編碼含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)的多核苷酸的優(yōu)選例子有含有SEQ ID NO. 13或SEQ ID NO. 15所示 核苷酸序列的多核苦酸。本說明書中，是否與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基 酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能，這可通過評價與含有SEQ ID NO. 14或 SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)的生物體現(xiàn)象或 功能來確定，例如，可通過基因重組技術(shù)使該蛋白質(zhì)表達(dá)，通過評價 其是否在T細(xì)胞上作為配體對樹狀細(xì)胞的活化受體發(fā)揮功能，由此來 確定。含有SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)與 TARM蛋白結(jié)合，因此在評價時，例如可以以與TARM蛋白結(jié)合的功 能(實施例12)作為指標(biāo)。本發(fā)明的新型配體蛋白是單跨膜蛋白，按照以N末端一側(cè)為細(xì)胞 外的方向在細(xì)胞表面表達(dá)。因此，利用該蛋白質(zhì)可以制備該蛋白質(zhì)的 抗體。本發(fā)明提供含有下述多肽的蛋白質(zhì)該多肽含有SEQ ID NO. 14所 示氨基酸序列的第1 ~第159號、或者SEQ ID NO. 16所示氨基酸序列的 第l ~第158號氨基酸序列的至少6個氨基酸殘基或全部。該蛋白質(zhì)含 有相當(dāng)于TARM-L蛋白的氨基酸序列的胞外域的部分，因此可作為用 于制備該蛋白質(zhì)的抗體的抗原使用。本發(fā)明還提供本發(fā)明的新型配體蛋白在制備本發(fā)明的新型配體蛋白的抗體中的應(yīng)用。 [抗體]本發(fā)明的抗體可特異性識別TARM蛋白或TARM-L蛋白。因此， 用于獲得本發(fā)明的抗體的TARM蛋白或TARM-L蛋白只要具有TARM 或TARM-L抗原性即可，包含在TARM蛋白或TARM-L蛋白的氨基酸 序列中具有l(wèi)或多個氨基酸殘基缺失、插入、置換或附加所得的氨基 酸序列的蛋白質(zhì)。上述蛋白質(zhì)與原有蛋白質(zhì)同樣，可保持生物學(xué)活性， 這是公知的(Mark等人.(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662 ~ 6; Zoller和Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487 ~ 500; Wang等 人.(1984) Science 224: 1431 —3; Dalbadie-McFarland等人.(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409 ~ 13)。在某種蛋白質(zhì)中，在保持原有蛋 白質(zhì)的抗原性的狀態(tài)下進(jìn)行l(wèi)或多個氨基酸缺失、插入、置換或附加 的方法是公知的。例如，可通過位點定向誘變法制備編碼變異蛋白質(zhì) 的多核苷酸，使其適當(dāng)表達(dá)獲得(Molecular Cloning (分子克隆)，A Laboratory Manual 2nd de (實驗指南第二版)，Cold Spring Harbor Press (冷泉港出版社出版)(1989); Current Protocols in Molecular Biology (分 子生物學(xué)實驗指南)，John Wiley & Sons, (1987 ~ 1997), Section8.1 -8.5; Hashimoto-Hoto等人.(1995) Gene 152: 271 ~ 5; Kinkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 ~ 92; Kramer和Fritz (1987) Method. Enzymol 154: 350 ~ 67; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763 ~ 6)。本發(fā)明的抗體也包含TARM蛋白或TARM-L蛋白的一部分的特異 性抗體。即，用于獲得本發(fā)明抗體的TARM蛋白或TARM-L蛋白中，除具 有TARM蛋白或TARM-L蛋白全長氨基酸序列的多肽之外，也包含與 TARM蛋白或TARM-L蛋白的至少6個氨基酸殘基以上(例如6、 8、 10、 12或15個氨基酸殘基以上)具有同 一序列的多肽片段。本說明書中， TARM蛋白或TARM-L蛋白的多肽片段只要具有TARM蛋白或TARM-L蛋白的抗原性即可，可以是任何片段。優(yōu)選的片段有TARM蛋白或TARM-L蛋白的氨基末端、羧基末 端等多肽片段。多肽的抗原決定部位可通過對蛋白質(zhì)的氨基酸序列上 的疏水性/親水性進(jìn)行分析的方法(Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105 ~ 22)、分析二級結(jié)構(gòu)的方法(Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 251 ~76)推定，并且可通過計算機(jī)程序(Ann. Biochem. 151: 540 ~ 6 (1985))或者合成短肽、確認(rèn)其抗原性的PEPSCAN法(曰本 特表昭60-500684號公報)等方法確認(rèn)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選是對TARM蛋白或TARM-L蛋白的功能產(chǎn)生影 響的抗體。對TARM蛋白的功能產(chǎn)生影響是指例如通過本發(fā)明的第 一方案的抗體對TARM蛋白的交聯(lián)刺激，活化樹狀細(xì)胞(實施例3);該 抗體與TARM蛋白結(jié)合，由此抑制TARM蛋白與T細(xì)胞的粘附(實施例6 和實施例ll);和通過該抗體與TARM蛋白結(jié)合，抑制TARM蛋白與 FcRy鏈形成復(fù)合物(實施例4)。對于TARM-L蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響是 指例如通過本發(fā)明的第二方案的抗體與TARM-L蛋白結(jié)合，抑制 TARM-L蛋白與TARM蛋白的結(jié)合。本發(fā)明的抗體包含以TARM蛋白或TARM-L蛋白作為抗原，使該 抗原對小鼠等哺乳動物免疫而得到的單克隆抗體；使用基因重組技術(shù) 制備的嵌合抗體和人源化抗體；以及使用生成人抗體的轉(zhuǎn)基因動物等 制備的人抗體。以本發(fā)明的抗體作為藥物給予人時，從副作用的角度 考慮優(yōu)選人抗體。"人抗體，，是指所有的區(qū)域均來自人的抗體。人抗體可將人抗體基 因?qū)胄∈笾苽?。例如可參照Nature Genetics, 7巻，13~21頁，1994、 Nature Genetics, 15巻，146- 156頁，1997、日本特表平4-504365號公報、 日本特表平7-509137號公報、W094/25585號公報、Nature, 368巻， 856 ~ 859頁，1994、和日本特表平6-500233號公報的方法制備。還可以 使用噬菌體展示法制備。例如可參照Marks， J. D.等人:J. Mol. Biol.， 222巻，581 ~ 597頁，1991的方法制備。"人源化抗體"是指只將小鼠抗體的抗原結(jié)合部位(CDR;互補決定 區(qū))的基因序列移植到人抗體基因中(CDR移植)的抗體。例如可參照曰 本特表平4-506458號公報和日本特開昭62-2968卯號公報的方法制備。"嵌合抗體"是指將小鼠抗體的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)連接得到 的抗體。具體來說，是將抗原對小鼠免疫，從該小鼠單克隆抗體的基 因中切取與抗原結(jié)合的抗體可變區(qū)(V區(qū))，與來自人骨髓的抗體恒定區(qū) (C區(qū))基因結(jié)合制備。例如可參照日本特公平3-73280號公報的方法制 備。本發(fā)明的單克隆抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法獲 得(例如"Current Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)實驗指 南)"(John Wiley & Sons, (1987》、Antibodies (抗體)A laboratory Manual (實-瞼指南)，Ed. Harlow和David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港實驗室)(1988))。免疫抗原可以使用TARM蛋白或TARM-L蛋白的片段?；蛘呖墒?用基于上述氨基酸序列合成的片段?？乖梢砸耘c載體蛋白的復(fù)合物 的形式使用?？乖c栽體蛋白復(fù)合物的制備中可以使用各種縮合劑， 可使用戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺活性酯等。載體蛋白質(zhì)可以是 牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等常用的載體蛋白，通常采 用以l -5倍量的比例偶聯(lián)的方法。被免疫的動物有小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉鼠等，接種方法有皮 下、肌肉或腹腔內(nèi)給予。給予時可以與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐 劑混合給予，給予通常是每隔2~5周進(jìn)行一次。由被免疫的動物的脾臟或淋巴結(jié)得到的抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以雜交瘤的形式分離。骨髓瘤細(xì)胞可使用來自小 鼠、大鼠、人等的骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選來自與抗體生成細(xì)胞同種，也可 以是不同種。細(xì)胞融合的操作方法可纟姿照已知的方法，例如Nature， 256, 495, 1975來實施。融合促進(jìn)劑有聚乙二醇或仙臺病毒等，通常可使用20 ~ 50%左右 濃度的聚乙二醇(平均分子量IOOO ~ 4000)，在20 ~ 40°C 、優(yōu)選30 ~ 37°C 的溫度下，在抗體生成細(xì)胞數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞數(shù)的比通常為l:l ~ IO:I左 右反應(yīng)約l ~ IO分鐘左右，由此實施細(xì)胞融合。
生成抗體的雜交瘤的篩選可以采用各種免疫化學(xué)方法。例如有 使用涂布TARM蛋白或TARM-L蛋白的微量板的ELISA法、使用涂布 抗免疫球蛋白抗體的微量板的EIA法、對含有TARM蛋白的樣本進(jìn)行 電泳然后使用硝化纖維素轉(zhuǎn)印膜的免疫印記法等。
生成抗體的雜交瘤的篩選可以通過確認(rèn)該抗體是否對TARM蛋白 或TARM-L蛋白的功能產(chǎn)生影響進(jìn)行篩選，由此代替上述免疫化學(xué)方 法。通過本發(fā)明的第一方案的抗體對TARM蛋白的功能的影響、例如 通過本發(fā)明的第 一方案的抗體對TARM蛋白的交聯(lián)刺激是否活化了樹 狀細(xì)胞(實施例3);該抗體與TARM蛋白的結(jié)合是否可抑制TARM蛋白 與T細(xì)胞的粘附功能(實施例6和實施例11);或者該抗體與TARM蛋白 的結(jié)合是否抑制了 TARM蛋白與FcRy鏈形成復(fù)合物(實施例4)，可以篩 選生成抗體的雜交瘤。通過本發(fā)明的第二方案的抗體對TARM-L蛋白 的功能的影響、例如通過本發(fā)明的抗體的第二方案與TARM-L蛋白的 結(jié)合是否可抑制TARM蛋白和TARM-L蛋白的結(jié)合功能，由此可篩選 生成抗體的雜交瘤。通過該篩選方法，可以選擇本發(fā)明的抗體的優(yōu)選 方案一對TARM蛋白或TARM-L蛋白的功能產(chǎn)生影響的抗體。另外， 該篩選可以在通過是否生成與TARM蛋白或TARM-L蛋白結(jié)合的抗體 進(jìn)行選擇的上述免疫化學(xué)方法篩選之后進(jìn)行，以二次篩選的形式進(jìn) 行。
進(jìn)一步通過例如極限稀釋法由上述孔進(jìn)行克隆，獲得克隆。雜交 瘤的篩選、培養(yǎng)通常是添加HAT (次黃噪呤、氨基喋呤、胸腺嘧咬核 苷)，在含有10 ~ 20%胎牛血清的動物細(xì)胞用培養(yǎng)基(例如RPMI 1640) 中進(jìn)行。這樣得到的克隆移植到預(yù)先給予了降植烷的SCID小鼠的腹腔 內(nèi)，10~ 14天后采集高濃度含有單克隆抗體的腹水，可得到純化抗體的原料。還可以培養(yǎng)該克隆，將該培養(yǎng)物作為純化抗體的原料。
單克隆抗體的純化可以采用作為免疫球蛋白的純化方法而已知 的方法，例如可通過硫酸銨分級分離法、PEG分級分離法、乙醇分級
分離法、陰離子交換體的利用、蛋白A柱、蛋白G柱y、以及使用TARM 蛋白的親和柱層析等的方法容易地實現(xiàn)。
本發(fā)明的"功能性片段"是指抗體的一部分(部分片段)，可特異性 識別本發(fā)明的蛋白質(zhì)的片段。具體有Fab、 Fab，、 F(ab，)2、可變區(qū)片 段(Fv)、 二硫鍵Fv、單鏈抗體(scFv)和它們的聚合物等。
本發(fā)明的第 一 方案的抗體的優(yōu)選例子有本發(fā)明的第 一 方案的新 型蛋白質(zhì)的抗體及其功能性片段。
本發(fā)明的第一方案的抗體的優(yōu)選例子進(jìn)一步有下述蛋白質(zhì)的抗體。
(ix，)含有SEQIDN0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白； (x，)含有在SEQ ID N0.12所示氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸插入、 置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所得的氨基 酸序列，且與含有SEQ ID NO. 12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功 能的膜蛋白或分泌蛋白；
(xi，)由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼、且與含有SEQIDN0.12所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和
(xii，)含有與SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有70。/。以上同一性的氨 基酸序列、且與含有SEQ ID NO. 12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等 功能的膜蛋白或分泌蛋白。
本發(fā)明的第 一方案的抗體的更優(yōu)選例子有含有SEQ ID NO. 12所 示氨基S吏序列或具有l(wèi)或多個保守性置換的SEQ ID NO,12所示氨基酸 序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
具體例子有保藏的FERM BP-10376雜交瘤所生產(chǎn)的單克隆抗體。因此，本發(fā)明提供在2005年7月15日保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技 術(shù)綜合研究所生物寄托中心(〒305-8566茨城縣筑波市東l丁目l番地l 中央第6)，保藏號FERM BP-10376的雜交瘤(@TARM#6,11)。
本發(fā)明的第 一方案的抗體的更優(yōu)選例子還有含有SEQ ID NO. 10 所示氨基酸序列或者具有1或多個保守性置換的SEQ ID NO.10所示氨 基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
本發(fā)明的第二方案的抗體的優(yōu)選例子有含有SEQ ID NO. 14所示 氨基酸序列或具有l(wèi)或多個保守性置換的SEQ ID N0.14所示氨基酸序 列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
本發(fā)明的第二方案的抗體的優(yōu)選例子還有含有SEQ ID NO. 16所 示氨基酸序列或具有l(wèi)或多個保守性置換的SEQ ID N0.16所示氨基酸 序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
本發(fā)明的第二方案的抗體的更優(yōu)選例子有識別TARM-L蛋白質(zhì) 在胞外表達(dá)的多肽部分的抗體或其功能性片段。上述抗體例如有含 有由SEQ ID N0.14所示氨基酸序列的第l-第159號、SEQ ID NO. 16 所示氨基酸序列的第l ~第158號氨基酸序列的至少6個氨基酸殘基或 全部形成的多肽的蛋白質(zhì)的抗體或其功能性片段。 自身免疫疾病
參與免疫應(yīng)答的淋巴結(jié)一T細(xì)胞通過與樹狀細(xì)胞的協(xié)同作用而擔(dān) 負(fù)各種免疫應(yīng)答，其中所述樹狀細(xì)胞作為對T細(xì)胞具有抗原呈遞功能 的細(xì)胞而已知(Kroczek, RA.,等人.(2004) Current Opinion in Immunology (免疫學(xué)新觀點)16: 321 -327)。如后述實施例所示，通過 炎癥刺激，TARM蛋白在樹狀細(xì)胞上的表達(dá)增強(實施例2);經(jīng)由TARM 蛋白，樹狀細(xì)胞與T細(xì)胞粘附(實施例5和實施例10)。還可確認(rèn)，樹狀 細(xì)胞被經(jīng)結(jié)合刺激的TARM蛋白活化，誘導(dǎo)IL-6的生成(實施例3)。有 人報道，IL-6的過量生產(chǎn)與自身免疫疾病有關(guān)(Ishihara，K.,等人.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13: 357 ~ 368)。并且，通過TARM 蛋白的抗體，T細(xì)胞與樹狀細(xì)胞的粘附得到顯著抑制(實施例6和實施例 11)。
在后述實施例中，在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中，可以確認(rèn)本發(fā)明的 抗體實際上具有治療效果(實施例7)。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型是自身免疫 疾病之一的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型。
因此，本發(fā)明的第一方案的抗體對于自身免疫疾病的治療有效。
自身免疫疾病例如有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
同樣，可以認(rèn)為通過TARM-L蛋白的抗體，T細(xì)胞與樹狀細(xì)胞的 粘附得到抑制。因此，本發(fā)明的第二方案的抗體對于自身免疫疾病的 治療有效。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的抗體在自身免疫疾病治療藥的制備中的 應(yīng)用。
本發(fā)明又提供自身免疫疾病的治療方法，該方法包含將治療上有 效量的本發(fā)明的抗體給予包括人的哺乳動物的步驟。
T細(xì)胞粘附抑制劑
如后述實施例中所示，通過TARM蛋白的抗體，T細(xì)胞與樹狀細(xì) 胞的粘附得到顯著抑制(實施例6和實施例11)。因此，本發(fā)明的第一方 案的抗體可用作T細(xì)胞粘附抑制劑。
同樣可以認(rèn)為，通過TARM-L蛋白的抗體，T細(xì)胞與樹狀細(xì)胞的 粘附得到抑制。因此，本發(fā)明的第二方案的抗體可用作T細(xì)胞粘附抑 制劑。
本說明書中，"T細(xì)胞粘附"是指樹狀細(xì)胞與T細(xì)胞的粘附，即，在 樹狀細(xì)胞上表達(dá)的TARM蛋白與在T細(xì)胞上表達(dá)的TARM-L蛋白的結(jié) 合。使用本發(fā)明的T細(xì)胞粘附抑制劑，通過抑制在樹狀細(xì)胞上表達(dá)的 TARM蛋白與在T細(xì)胞上表達(dá)的TARM-L蛋白的結(jié)合，可以抑制由于樹 狀細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用而產(chǎn)生的免疫應(yīng)答、例如樹狀細(xì)胞和T細(xì)胞的活化、增殖、分化、細(xì)胞因子/趨化因子的生成。 藥物組合物
對本發(fā)明的抗體的給予形式?jīng)]有特別限定，可以通過口服給予、 非口服給予(例如靜脈注射、肌肉注射、皮下給予、直腸給予、透皮給 予、局部給予)的任意給予途徑給予包括人在內(nèi)的哺乳類，優(yōu)選非口服 給予，特別是靜脈注射。
口服給予和非口服給予的劑型及其制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員 所周知的，通過將本發(fā)明的抗體與藥學(xué)上可接受的載體等混合等，可 按照常規(guī)方法進(jìn)行。
藥學(xué)上可接受的載體例如可使用在制劑領(lǐng)域中常用且不與本發(fā) 明的抗體反應(yīng)的物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的載體例如可使用通常所使用的 賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、矯味矯臭劑或根據(jù)需要
使用穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、pH調(diào)節(jié)劑、防腐劑、 抗氧化劑、增量劑、濕潤劑、表面活性劑、分散劑、緩沖劑、保存劑、 助溶劑、止痛劑等，可以配合通常作為藥物制劑原料使用的成分，按 照常規(guī)方法制成制劑。
非口服給予的劑型有注射用制劑(例如輸液注射劑、靜脈注射劑、 肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑)、外用劑(例如軟膏劑、泥敷 劑、洗劑)、栓劑、吸入劑、滴眼劑、眼軟膏劑、滴鼻劑、滴耳劑、脂 質(zhì)體劑等。
例如，注射用制劑通?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體溶解于注射用蒸餾水 中制備，也可以根據(jù)需要添加助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑、等滲劑、 止痛劑、保存劑、穩(wěn)定劑等。還可以制成在用時調(diào)制的凍干制劑。
用于口服給予的劑型有固體或液體的劑型，例如有片劑、包衣片 劑、丸劑、細(xì)粒劑、顆粒劑、散劑、膠嚢劑、糖漿劑、乳液劑、混懸 劑、注射劑、錠劑等。
本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步含有治療上有效的其它藥物，還可
29根據(jù)需要配合血液循環(huán)改善劑、滅菌劑、消炎劑、細(xì)胞活化劑、維生 素類、氨基酸、保濕劑、角質(zhì)溶解劑等成分。此時，有效成分與載體 的比例可在1 ~ 90%重量之間變動。
本發(fā)明的抗體的給予量例如可以根據(jù)給予途徑、疾病的種類、癥 狀的程度、患者的年齡、性別、體重、疾病的嚴(yán)重程度、藥物動力學(xué) 和毒物學(xué)特征等藥理學(xué)知識、是否利用了藥物輸送系統(tǒng)、以及是否作 為與其它藥物組合的一部分給予等各種因素由臨床醫(yī)生確定，通常成
人(體重60公斤)口服給予時為1 5000 mg/天，優(yōu)選10~2000 mg/天， 進(jìn)一步優(yōu)選50~2000 mg/天；注射給予時為1 ~ 5000 mg/天，優(yōu)選5 ~ 2000 mg/天，進(jìn)一步優(yōu)選50~2000 mg/天，可以分一次或多次給予。 給予幼兒時，用量可以比給予成人的量少。實際使用的給予方法根據(jù) 臨床醫(yī)生的判斷而有很大變化，可以脫離上述給予范圍。
抑制TARM蛋白與T細(xì)胞粘附的物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第一方案的篩選方法提供抑制TARM蛋白與T細(xì)胞粘附 的物質(zhì)的篩選方法。
TARM蛋白在樹狀細(xì)胞上表達(dá)，參與與樹狀細(xì)胞和T細(xì)胞之間免 疫應(yīng)答有關(guān)的相互作用。另外，通過對TARM蛋白增加結(jié)合刺激，可 誘導(dǎo)作為自身免疫疾病原因的IL-6的生成。因此，本發(fā)明的第一方案 的篩選方法可用于抑制TARM蛋白和T細(xì)胞粘附的物質(zhì)的篩選，可用 于優(yōu)選自身免疫疾病、更優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中有用的物質(zhì)的
篩選o
本發(fā)明的第 一 方案的篩選方法中，在步驟(b)之后可以進(jìn)一 步含有
進(jìn)行比較的步驟。
步驟(c)中，被檢物質(zhì)存在下的結(jié)合活性低于被檢物質(zhì)非存在下的 結(jié)合活性時、優(yōu)選為50%以下時，可以判定該被檢物質(zhì)抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與T細(xì)胞的結(jié)合。
步驟(a)中，"使其接觸，，只要是TARM蛋白與T細(xì)胞直接接觸的方 案即可，沒有特別限定，例如可通過在固定有TARM蛋白的板上添加 標(biāo)記的T細(xì)胞的方法，或者在含有T細(xì)胞的板上添加標(biāo)記的TARM蛋白 的方法實施。
T細(xì)胞優(yōu)選為活化T細(xì)胞，更優(yōu)選為活化Th2細(xì)胞。 步驟(b)中，結(jié)合活性的測定可通過公知的方法進(jìn)行。例如，在固 定有TARM蛋白的板上添加標(biāo)記的T細(xì)胞，培養(yǎng)一定時間后，通過洗 滌等除去未粘附的細(xì)胞，對粘附的細(xì)胞進(jìn)行測定，由此可測定結(jié)合活性。
上述標(biāo)記例如可使用放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)(包含熒光蛋 白)、發(fā)光物質(zhì)等。放射性同位素例如可使用卩H]、 [14C]、 [125I]、 [35S] 等。上述酶例如可使用(3-半乳^f唐普酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、焚 光素酶等。熒光物質(zhì)例如可使用熒光素異硫氰酸酯、BODIPY、 4丐黃 綠素-AM (同仁社制備)等，焚光蛋白例如可使用GFP等。這些酶和焚 光蛋白可以將基因?qū)氲郊?xì)胞中使其表達(dá)。發(fā)光物質(zhì)例如可使用安光 素、光澤精等。根據(jù)情況，為了使上述配體與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合，可以使 用生物素-抗生物素蛋白的體系。
還可以不標(biāo)記T細(xì)胞即進(jìn)4亍添加，通過T細(xì)胞特異性抗體、例如抗 CD3抗體，或者輔助T細(xì)胞特異性抗體、例如抗CD4抗體來檢測粘附的 T細(xì)胞。
結(jié)合活性可以預(yù)先對添加的細(xì)胞進(jìn)行測定，以粘附的細(xì)胞相對于 添加的細(xì)力包的比例表示。
抑制樹狀細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的第二方案的篩選方法提供抑制樹狀細(xì)胞活化的物質(zhì)的 篩選方法。
經(jīng)結(jié)合刺激的TARM蛋白可以活化樹狀細(xì)胞(實施例3和4)。因此，使用用TARM抗體進(jìn)行交聯(lián)刺激的樹狀細(xì)胞體系，可以篩選抑制樹狀
細(xì)胞活化的物質(zhì)。
如上所述，有證據(jù)顯示樹狀細(xì)胞的活化引起自身免疫疾病。因 此，抑制本發(fā)明的樹狀細(xì)胞活化的物質(zhì)的篩選方法可用于優(yōu)選自身免 疫疾病、更優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中有用的物質(zhì)的篩選。
對在樹狀細(xì)胞上表達(dá)的TARM蛋白給予交聯(lián)刺激，則樹狀細(xì)胞被 活化，但此時TARM蛋白與作為信號傳遞分子已知的FcRy鏈形成復(fù)合
因子MCP-1的生成。因此，在本發(fā)明的第二方案的篩選方法的步驟(e) 中，可以以樹狀細(xì)胞中的IL-6和/或MCP-l的生成量作為指標(biāo)測定樹狀 細(xì)胞的活化程度，或者以樹狀細(xì)胞中FcRy鏈的表達(dá)量作為指標(biāo)測定樹 狀細(xì)胞的活化程度。
本發(fā)明的第二方案的篩選方法中，在以樹狀細(xì)胞中的IL-6和/或 MCP-1的生成量為指標(biāo)測定樹狀細(xì)胞的活化程度時，可以在步驟(e)之 后進(jìn)一步含有(f-l)將被檢物質(zhì)存在下的IL-6和/或MCP-l的生成量與 被檢物質(zhì)非存在下的IL-6和/或MCP-l生成量進(jìn)行比較的步驟。在步驟 (f-l)中，如果被檢物質(zhì)存在下的IL-6和/或MCP-l的生成量低于被檢物 質(zhì)非存在下的IL-6和/或MCP-l的生成量、優(yōu)選為50%以下時，可以判 定該被檢物質(zhì)抑制樹狀細(xì)胞的活化。
本發(fā)明的第二方案的篩選方法中，在以樹狀細(xì)胞中FcRy鏈的表達(dá) 量為指標(biāo)測定樹狀細(xì)胞的活化程度時，可以在步驟(e)之后進(jìn)一步含有 (f-2)將被檢物質(zhì)存在下的FcRY鏈的表達(dá)量與被檢物質(zhì)非存在下的 FcRY鏈的表達(dá)量進(jìn)行比較的步驟。
步驟(f-2)中，如果^皮^r物質(zhì)存在下的FcRy鏈的表達(dá)量低于被檢物 質(zhì)非存在下的FcRy鏈的表達(dá)量、優(yōu)選為50°/。以下時，可以判定該被檢 物質(zhì)抑制樹狀細(xì)胞的活化。
步驟(d)中，"使其接觸"只要是樹狀細(xì)胞上的TARM蛋白通過本發(fā) 明的抗體進(jìn)行交聯(lián)刺激的方案即可，沒有特別限定，例如可通過在含有本發(fā)明抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)樹狀細(xì)胞來進(jìn)行。
步驟(e)中，蛋白質(zhì)的生成量或表達(dá)量的測定可按照公知的方法進(jìn)
行，也可以使用市售的試劑盒。
抑制TARM蛋白與FcRy鏈形成復(fù)合物的物質(zhì)的篩選方法。
本發(fā)明的第三方案的篩選方法提供抑制TARM蛋白與FcR討連形 成復(fù)合物的物質(zhì)的篩選方法。
TARM蛋白在樹狀細(xì)胞上表達(dá)，與作為信號傳遞分子而已知的 FcRy鏈形成復(fù)合物。另外，F(xiàn)cRy鏈通過與TARM蛋白形成復(fù)合物，顯 示在細(xì)胞表面上的表達(dá)增加。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用于抑制 TARM蛋白與FcRy鏈形成復(fù)合物的物質(zhì)的篩選，可用于優(yōu)選自身免疫 疾病、更優(yōu)選類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療中有用的物質(zhì)的篩選。
本發(fā)明的篩選方法中，在步驟(h)之后可以進(jìn)一步含有(i)將被檢 物質(zhì)存在下的FcRy鏈的表達(dá)量與被檢物質(zhì)非存在下的FcRy鏈的表達(dá) 量進(jìn)行比較的步驟。
步驟(i)中，如果被檢物質(zhì)存在下的FcRy鏈的表達(dá)量低于被檢物質(zhì) 非存在下的FcRY鏈的表達(dá)量、優(yōu)選為50%以下時，可以判定該被檢物 質(zhì)抑制本發(fā)明的蛋白質(zhì)與FcRY鏈形成復(fù)合物。
步驟(g)中，"使其接觸"只要是表達(dá)TARM蛋白和FcRY鏈的樹狀細(xì) 胞與本發(fā)明的抗體直接接觸的方案即可，沒有特別限定，例如可通過 在含有本發(fā)明抗體的培養(yǎng)基中培養(yǎng)樹狀細(xì)胞來進(jìn)行。
步驟(h)中，表達(dá)量的測定可通過公知的方法進(jìn)行，例如可使用流 式細(xì)胞^[義測定。
本說明書中，"被檢物質(zhì)"有合成低分子化合物、蛋白質(zhì)、合成 肽、純化或部分純化的多肽、抗體、細(xì)菌釋放物質(zhì)(包括細(xì)菌代謝產(chǎn)物)、 核酸(反義、核酶、RNAi等)等，優(yōu)選化合物或其鹽或者它們的溶劑合 物(例如水合物)，但并不限于此。"被檢物質(zhì)"可以是新型物質(zhì)，也可 以是公知的物質(zhì)。實施例
以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但下述實施例并不限定本發(fā)明
的范圍。實施例中，"TARM蛋白"可簡稱為"TARM"， "TARM-L蛋白" 可簡稱為"TARM-L"。另外，來自小鼠的TARM蛋白可簡稱為 "mTARM，，，來自人的TARM蛋白可簡稱為"hTARM，，。
「實施例ll小鼠TARM基因的分離和表達(dá)分析 (l)mTARM基因的分離
將由小鼠脾臟分離的CD4 T細(xì)胞通過體外培養(yǎng)分化成Thl或Th2， 分別由Thl或Th2制備用于驅(qū)動(driver)和測試(tester)的cDNA片段，使 用在進(jìn)行高靈敏度扣除(N-RDA)法的過程中得到的cDNA片段的序列 進(jìn)行Blast檢索。結(jié)果得到了編碼功能未知的膜蛋白的基因(Genbank 檢索號NM—177363)。
以GenBankTM的序列(NM一177363)的序列為基礎(chǔ)，如下設(shè)計PCR
用引物，研究小鼠各器官中mTARM基因的表達(dá)。
mTARM Fl: GTGACTTTGCAGTGCCAGAA (SEQ ID NO. 17) mTARM Rl: TGCACAGGAG丌GAGTGTCC (SEQ ID NO. 18)
使用RNA PCR試劑盒(TAKARA公司制備)，由各器官的總RNA
(Promega公司制備)合成單鏈cDNA，以此作為模板，通過ABI7700
(Applied Biosystems公司制備)進(jìn)行實時PCR。 PCR在以下的反應(yīng)液組
成(12.5 〃1 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN公司制
備)、0.25 〃l尿嘧咬DNA糖基化酶(Invitrogen公司制備)、0.125 100
mTARMF引物、0.125 〃1 100//M mTARM R引物、2.5/d模板cDNA (稀
釋10倍)、7.25,l蒸餾水)中進(jìn)行。PCR是在94。C下處理10分鐘，然后將
94°C 30秒、60°C l分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。結(jié)果，mTARM在腎臟
中表達(dá)。
使用腎臟的總RNA，進(jìn)行5，-RACE (cDNA末端快速擴(kuò)增)和 3'-RACE，嘗試確定mTARM的全長基因序列。首先，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA公司制備)，由小鼠腎臟的 總RNA合成雙鏈cDNA，使用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司 制備)純化cDNA。接著附加ad29接頭(使ad29S: acatcactccgt (SEQ ID NO. 19)和 ad29A: acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct (SEQIDNO.20)退火所得)，作為RACE的模板。
rtpCR是在以下的反應(yīng)液組成(5pl 10xExTaq緩沖液、4/d 2.5 mM dNTP、 0.25/dExTaq、 0.5100//M引物(5，PCR4)、 0.5〃1100//M基因 特異性引物、1 pl附加有ad29接頭的cDNA (稀釋25倍)、38.75 ,l蒸餾水) 進(jìn)行。
引物使用下述序列。
5'PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO. 21) mTARM—RACE—5'—4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO. 22),或
mTARM—RACE—3'—4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO. 23)
PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C30秒、65°C l分鐘、72°C 5分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72'C下反應(yīng)5分鐘。
2nd PCR是在以下的反應(yīng)液組成(5 10xExTaq緩沖液、4 /d 2.5 mMdNTP、 0.25^1ExT叫、0.5IOO,M引物(5，PCR1)、 基因特異性引物、lstpCR產(chǎn)物(稀釋lOO倍)、38.75 pl蒸餾水)中進(jìn) 行。
引物使用下述序列。
5'PCR1: GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG (SEQ ID NO. 24) mTARM_RACE_5，—3: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO. 25),或
mTARM—RACE—3'—3: CTACAGAAAAGCATCCCCCCACATCCTTTC (SEQ ID NO. 2.6)
PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5
分鐘的反應(yīng)進(jìn)行25個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)5分鐘。將擴(kuò)增的cDNA
片段克隆到pCR2.1 (Invitrogen公司制備)后，使用ABI3100測序儀(Applied Biosystems7^司制備)確定核苦酸序列。
結(jié)果，5'RACE中得到2種、3'RAGE中得到3種cDNA，明確了剪 接同種型的存在。
使用RACE所得的核普酸序列信息，進(jìn)行擴(kuò)增各剪接同種型的引 物的設(shè)計。使用cDNA合成試劑盒(TAKARA公司制備)，由小鼠骨髓的 總RNA合成雙鏈cDNA，使用Qiaquick PCR純化試劑盒(QIAGEN公司 制備)純化cDNA。 PCR在以下的反應(yīng)液組成(510xExTaq緩沖液、4/d 2.5mMdNTP、 0.25 #1 ExTaq、 0.5 ,1 lOO^M 5，引物、0.5^1100/^13， 引物、1cDNA (稀釋25倍)、38.75/d蒸餾水)中進(jìn)行。
引物使用下述序列。 mTARM—5'UTR:GCTGATAGTAGACCTGCTGAAGAC (SEQ ID NO. 27) mTARM一3'UTR-l:G丁CCAGATATGTCCAGGCCTCTG (SEQ ID NO. 28) ,或
mTARM—3'眼-2:丌CAGTTATnTACCAGGGTTTA (SEQ ID NO. 29)
PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5 分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)5分鐘。通過兩種引物 對可以確認(rèn)6種剪接同種型。結(jié)果，在6種剪接同種型的組合中，5種 可得到擴(kuò)增產(chǎn)物，因此，將擴(kuò)增的cDNA片段克隆到pCR2.1 (Invitrogen 公司制備)上，然后使用ABI3100測序儀確定核苷酸序列。
結(jié)果了解到，存在編碼4種膜結(jié)合型TARM基因(ml、 m2、 m3、 m斗)和一種分泌型TARM基因(sl)的剪接同種型(圖1)。
(2) mTARM基因的表達(dá)分析
對mTARM基因在小鼠正常組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。如上所述，
由于存在剪接同種型，因此設(shè)計了3組引物對。
對l (設(shè)計為特異性擴(kuò)增ml、 n^同種型)
mTA既qF2: TCTGTGATAGACAACCATCT (SEQ ID NO. 30) mTARM—qR2: GTCATTGTACCCGGGGTC丌(SEQ ID NO. 31)
對2(設(shè)計為特異性擴(kuò)增m3、 1114同種型)mTARM—qF4: ATGACAGAAGGCTACACTGTGGATAA (SEQIDNO.32) mTARM—qR3: TCATTTTTCTCCTGGGGCAC (SEQ ID NO. 33)
對3 (設(shè)計為特異性擴(kuò)增sl同種型)
mTARM_qF3: GATCTCTGTGATAGATGCAAG (SEQ ID NO. 34) mTA既qR2: GTCATTGTACCCGGGGTC丌(SEQ ID NO. 35)
使用RNeasy mini試劑盒(QIAGEN公司制備)，由小鼠器官制備總 RNA,或者使用RNAPCR試劑盒(TAKARA公司制備)，由購入的各器 官的總RNA(Promega公司制備)合成單鏈cDNA，以此作為模板，通過 ABI7700進(jìn)行實時PCR。 PCR在以下反應(yīng)液組成(12.5 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN公司制備)、0,25 ^尿嘧咬DNA 糖基化酶(Invitrogen公司制備)、0.125 100 F引物、0.125 100 Z^MR引物、2.5pl模板cDNA(稀釋10倍)、7.25/J蒸餾水)中進(jìn)行。
PCR在94。C下處理10分鐘，然后將94。C 30秒、60°C l分鐘的反應(yīng) 進(jìn)行35個循環(huán)。
結(jié)果表明，mTARM在骨髓中強烈表達(dá)(圖2)。
接著，進(jìn)行mTARM在各種細(xì)胞中的表達(dá)分析。
使用RNeasy mini試劑盒(QIAGEN公司制備)，由從小鼠脾臟分離 純化的細(xì)胞、體外培養(yǎng)的細(xì)胞和各種細(xì)胞林中制備總RNA，使用RNA PCR試劑盒(TAKARA公司制備)，合成單鏈cDNA，以此作為模板，通 過ABI7700，與小鼠正常組織中的表達(dá)分析同樣地進(jìn)行實時PCR。
結(jié)果表明，mTARM在來自骨髓的樹狀細(xì)胞中強烈表達(dá)(圖3)。
「實施例21小鼠TARM抗體的制備和表達(dá)分析 (1)表達(dá)mTARM基因的細(xì)胞的制備
mTARM基因表達(dá)載體的制備如下進(jìn)行。
引物基于同種型ml的核苷酸序列設(shè)計。mTARM F2: cgcgtcgacgccaccATGATCTCTAGGCTCCTTTCCCTT (SEQ ID NO, 36)
mTARM R2: gcgggcggccgcTTACCAGGGTTTATTTGGAGACAG (SEQ ID NO， 37)
使用RNA PCR試劑盒(TAKARA公司制備)，由骨髓的總RNA合成 單鏈cDNA，用作模板。PCR在以下反應(yīng)液組成(5 一l 10x緩沖液、4/d2.5 mM dNTP、 0.5 〃1 Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制備)、各0.5 //1 100 引物、1〃lcDNA、 2.5plDMSO、 36〃l蒸餾水)中進(jìn)行。PCR是在94。C 下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5分鐘的反應(yīng)進(jìn)行 35個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)2分鐘。將擴(kuò)增的cDNA克隆到 pBlueScriptII SK(+) (Stratagene公司制備)中，用ABI3100測序儀確認(rèn)核 苷酸序列。將所得cDNA片段插入到表達(dá)載體pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050~ 3058)中，制備mTARM基因表達(dá)載 體。
重組反轉(zhuǎn)錄病毒的制備如下進(jìn)行。
將3xl(^個293/EBNA-l細(xì)胞林(Invitrogen公司制備)懸浮于培養(yǎng)基 (D-MEM/10。/。FBS)中，接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，在(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24小時。第二天更換培養(yǎng)基，加入如下制備的轉(zhuǎn)染溶液，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染溶液是在5 ml的管中加入600 OPTI-MEM (GIBCO BRL公司制 備)和24/d TransITLTl (TaKaRa公司制備)，混合，在室溫下靜置5分 鐘，然后加入9 pg表達(dá)載體和9 ,g包裝載體pCL-Eco (Imgenex公司制 備)，在室溫下靜置5分鐘。48小時后回收培養(yǎng)上清，進(jìn)行0.45;/m的濾 器過濾，得到重組病毒液。
將該重組病毒如下感染B300.19細(xì)胞林(EMBO J. (1984) 3: 1209 ~ 1219)，制備mTARM基因表達(dá)細(xì)胞。將lxl()6個B300.19細(xì)胞加入到15 ml的管中，在1200rpm、 25。C下離心5分鐘，然后吸引除去培養(yǎng)上清。 向2 ml重組病毒液中加入2 W polybrene (10 mg/ml)和2 一 55 2-巰基 乙醇，混合，將所得溶液加入到細(xì)胞中，在2500 rpm、 30。C下離心2 小時，進(jìn)行感染，感染后除去重組病毒液，加入培養(yǎng)基(RPMI-1640/10%FBS/55 ,M 2-巰基乙醇)，進(jìn)行培養(yǎng)。將EGFP陽性細(xì) 胞通過細(xì)胞分選儀分離，獲得mTARM表達(dá)細(xì)胞。
(2) mTARM的胞外域和SEAP以及Fc嵌合蛋白的制備
首先，如下制備pcDNA3.1 (+)-SEAP(His), 。-Neo載體。 pcDNA3.1(+)-Neo載體(Invitrogen公司制備)的內(nèi)源性SalI位點是 用SalI消化，然后使進(jìn)行平滑化，由此使其缺損。SEAP(His)K)的cDNA 片段是以pDREF陽SEAP His6-Hyg (J. Biol. Chem., 1996, 271, 21514 ~ 21521)為模板，使用附加有HindlII的5，引物和附加有XhoI的3，引物， 通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。將所得cDNA片段用HindIII和XhoI消化，然后插 入到使SalI位點缺損的pcDNA3.1 (+)-Neo載體中。
接著，mTARM的胞外域是以mTARM全長cDNA為模板，使用附 加有SalI的5，引物(mTARM—F2: (SEQ ID NO,36))和附加有Notl的3，引 物(mTARM一R3: cgcggcggccgcattatccacagtgtagccttctgtcat (SEQ ID N0.38)),通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR在以下的反應(yīng)液組成(510x緩沖 液、4 2.5 mM dNTP、 0.5 〃1 Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制備)、各 0.5^1100//M引物、1/dcDNA、 2.5〃1DMSO、 36〃l蒸餾水)中進(jìn)行。 PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5分 鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)2分鐘。將擴(kuò)增的cDNA克 隆到pBlueScriptII SK(+) (Stratagene公司制備)上，使用ABI3100測序儀 確認(rèn)核苷酸序列。將所得cDNA片段用SalI和Notl進(jìn)行消化，然后插入 到上述pcDNA3.1(+)-SEAP(His)K)-Neo載體中，制備mTARM-AP表達(dá)載 體。
由此，mTARM的胞外域與分泌型人胎盤性堿性磷酸酶通過3個氨 基酸接頭(Ala-Ala-Ala)結(jié)合，并且可表達(dá)C末端有10個組胺酸標(biāo)志物 (His),o的分泌嵌合蛋白(以下稱為AP嵌合蛋白)。所得AP嵌合蛋白表達(dá) 載體是使用TransIT LT1 (TAKARA公司制備)，導(dǎo)入到2W/EBNA-1細(xì) 胞抹中，培養(yǎng)4-5天。分泌到培養(yǎng)上清中的AP嵌合蛋白通過離心回收
39培養(yǎng)上清，用0.22/mi的濾器過濾，然后分別加入Hepes(pH7.4)和疊氮 化鈉，終濃度為20mM、 0.02%，在4。C下保存。AP嵌合蛋白的濃度是 4吏用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay (ICN公司制備)觀'J 定堿性磷酸酶活性計算。
(3) mTARM單克隆抗體的制備
為了用作免疫的抗原，首先進(jìn)行mTARM-AP嵌合蛋白的純化。
純化是利用存在于AP嵌合蛋白C末端的組胺酸標(biāo)志物，使用His Trap試劑盒(Amersham Biosciences公司制備)進(jìn)行。將含有mTARM-AP 嵌合蛋白質(zhì)的培養(yǎng)上清添加到1 ml的HiTrap chelating HP柱(Amersham Biosciences公司制備)中，通過IO mM咪唑溶液進(jìn)行洗滌，然后用500 mM咪唑溶液由柱中洗脫mTARM-AP嵌合蛋白。mTARM-AP嵌合蛋白 的濃度通過4吏用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay (ICN 公司制備)的酶活性測定和使用蛋白質(zhì)測試試劑盒II (BIO-RAD公司制 備)的蛋白質(zhì)定量計算。
所得mTARM-AP嵌合蛋白與TiterMax混合，免疫WKY大鼠(購自 日本SLC公司)。由^L免疫的大鼠中分離淋巴細(xì)胞，將P3骨髓瘤細(xì)胞 (ATCC)和淋巴細(xì)胞4安照比例1:5混合，使用PEG1500溶液(Boehringer 公司制備)進(jìn)行細(xì)胞融合。通過HAT培養(yǎng)基(Invitrogen公司制備)選擇雜 交瘤，所得雜交瘤的培養(yǎng)上清通過使用mTARM-Fc嵌合蛋白的夾層 ELISA進(jìn)行篩選。由陽性孔進(jìn)行克隆，得到3種克隆(弁6、 #21、 #37)。 使制備的抗mTARM抗體與導(dǎo)入了 mTARM-IRES-EGFP的B300.19細(xì) 胞反應(yīng)，通過FACS進(jìn)行分析，結(jié)果，制備的抗體只與表達(dá)EGFP的 B300.19細(xì)胞反應(yīng)(圖4B)，可以確認(rèn)抗mTARM抗體的特異性。
將生產(chǎn)所得抗mTARM單克隆抗體弁6、 #21、 #37的雜交瘤接種于 棵鼠的腹腔，得到腹水，使用蛋白G柱純化抗體。生產(chǎn)抗mTARM單克 隆抗體#6的雜交瘤以FERM BP-10376保藏于獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù) 綜合研究所特許生物寄托中心。(4)來自骨髓的培養(yǎng)樹狀細(xì)胞中TARM蛋白的表達(dá)
使用所得單克隆抗體(mAb),研究mTARM蛋白在來自骨髓的培養(yǎng) 樹狀細(xì)胞表面上的表達(dá)。
來自骨髓的培養(yǎng)樹狀細(xì)胞按以下方法制備。將C57BL/6雄性小鼠 (購自日本SLC公司)的骨髓細(xì)胞懸浮于含有小鼠GM-CSF (20 ng/ml) (R&D系統(tǒng)公司制備)的培養(yǎng)基(RPMI 1640/10% FBS/1 mM丙酮酸鈉/55 ^M2-巰基乙醇)中，使其濃度為2xl(^個/10ml，接種于未處理的10cm 培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。3天后，加入IO ml含有小鼠GM-CSF (20 ng/ml)的 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。并且，在3天后回收10 ml培養(yǎng)液，離心，然后將 細(xì)胞塊用IO ml含有新鮮的小鼠GM-CSF (20 ng/ml)的培養(yǎng)基懸浮，返 回到原來的未處理的10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2天。上述所得的未成熟樹 狀細(xì)胞懸浮于含有LPS (100 ng/ml) (Sigma公司制備)的培養(yǎng)基中，使其 濃度為lxlO 個/10ml，細(xì)胞培養(yǎng)處理完畢后接種于10cm的培養(yǎng)皿中培 養(yǎng)1天，獲得成熟樹狀細(xì)胞。
將來自骨髓的未成熟樹狀細(xì)胞懸浮于含有5%小鼠血清的FACS緩 沖液(PBS/10/。 FBS/1 mM EDTA)中，與抗體#6或抗體#21 (10 ^g/ml)反 應(yīng)，然后與PE標(biāo)記驢抗大鼠IgG二次抗體(Jackson公司制備)反應(yīng)，使 用FACSCalibur (Becton Dickinson公司制備)測定。結(jié)果，抗體#6、抗 體#21與陰性對照的大鼠IgG相比，均可見強的陽性反應(yīng)。
因此，為了對mTARM表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)分析，使用Alexa 647單 克隆抗體標(biāo)記試劑盒(Molecular Probe公司制備)對抗體#6進(jìn)行熒光標(biāo) 記。接著，將未成熟的樹狀細(xì)胞或經(jīng)LPS刺激得到的成熟樹狀細(xì)胞懸 浮于含有5%小鼠血清、5。/。大鼠血清的FACS緩沖液(PBS/1。/。 FBS/1 mM EDTA)中，加入FcR封閉;容液(BD Pharmingen公司制備)，在水上 反應(yīng)IO分鐘，然后使熒光標(biāo)記抗mTARM抗體和抗CDl lc樹狀細(xì)胞標(biāo) 記抗體以及抗CD40活化標(biāo)記抗體在冰上反應(yīng)30分鐘，使用 FACSCalibur測定。結(jié)果了解到，mTARM蛋白在未成熟和成熟樹狀細(xì)胞中表達(dá)；在 成熟骨髓樹狀細(xì)胞中與在未成熟樹狀細(xì)胞中相比，mTARM蛋白的表 達(dá)增強；表達(dá)活化標(biāo)志CD40的細(xì)胞中，mTARM蛋白的表達(dá)強(圖5)。
(5) 正常小鼠中TARM蛋白的表達(dá)
在來自骨髓的樹狀細(xì)胞中可見mTARM的表達(dá)，由此對mTARM蛋 白在正常小鼠免疫組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。
從C57BL/6雄性小鼠的骨髓、末梢血、脾臟、腸道淋巴結(jié)、淋巴 集結(jié)中制備細(xì)胞，懸浮于含有5%小鼠血清、5。/。大鼠血清的FACS緩沖 液(PBS/10/。 FBS/1 mMEDTA)中，加入FcR封閉溶液，在水上反應(yīng)IO 分鐘。接著將熒光標(biāo)記抗mTARM抗體和各種熒光標(biāo)記細(xì)胞系列標(biāo)記 抗體在水上反應(yīng)30分鐘，然后使用FACSCalibur測定。
結(jié)果，在正常小鼠的免疫組織中，在脾臟(SP)中的CD3陽性T細(xì)胞、 DX5陽性NK細(xì)胞、CDllb陽性骨髓系細(xì)胞、CD1 lc陽性樹狀細(xì)胞或末 梢血(PBL)中的B220陽性B細(xì)胞、F4/80陽性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、高 SSC/Grl陽性嗜中性粒細(xì)胞、高SSC/F4/80陽性嗜酸性粒細(xì)胞中均未見 mTARM蛋白的表達(dá)(圖6)。
因此，使用由腹腔制備的細(xì)胞，對正常小鼠末梢組織中的表達(dá)進(jìn) 行分析。
結(jié)果，mTARM蛋白在腹腔的CD3陽性T細(xì)胞、DX5陽性NK細(xì)胞、 CD 11 c陽性樹狀細(xì)胞，B220陽性B細(xì)胞、F4/80陽性單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、 高SSC/Grl陽性嗜中性粒細(xì)胞中未見表達(dá)，但在CD 11 b陽性骨髓系細(xì)胞 的一部分中可見表達(dá)，對其進(jìn)行進(jìn)一步的分析，結(jié)果可知，mTARM 蛋白在c-kit陽性肥大細(xì)胞中表達(dá)(圖7)。
(6) 通過LPS炎癥刺激的樹狀細(xì)胞中TARM蛋白的表達(dá)
mTARM蛋白在培養(yǎng)樹狀細(xì)胞中表達(dá)，但在小鼠免疫和末梢組織 的樹狀細(xì)胞中未見表達(dá)，因此可以認(rèn)為是在體內(nèi)通過炎癥刺激誘導(dǎo)表達(dá)。因此，將100^gLPS腹腔內(nèi)給予C57BL/6雄性小鼠，在14小時-18 小時后從腸系膜淋巴結(jié)中回收細(xì)胞，分析mTARM蛋白的表達(dá)。
結(jié)果，通過LPS炎癥刺激，可見mTARM蛋白在轉(zhuǎn)移到腸系膜淋巴 結(jié)中的CD 11 c陽性/CD 11 b+陽性骨髓系樹狀細(xì)胞中表達(dá)(圖8)。因此， mTARM蛋白在體內(nèi)的正常時的樹狀細(xì)胞中不在細(xì)胞表面上表達(dá)，但 是在炎癥時，在樹狀細(xì)胞、尤其是骨髓系樹狀細(xì)胞中選擇性地表達(dá)。 由此顯示，mTARM蛋白在炎癥時通過樹狀細(xì)胞發(fā)揮功能。
「實施例31抗TARM抗體對來自骨髓的培養(yǎng)樹狀細(xì)胞的活化
mTARM在樹狀細(xì)胞中選擇性地表達(dá)，由此對mTARM交聯(lián)刺激對 樹狀細(xì)胞的活化進(jìn)行研究。
將lxl()S個來自骨髓的未成熟樹狀細(xì)胞或成熟樹狀細(xì)胞懸浮于350 /d的MACS緩沖液(PBS/10/0 FBS/2 mM EDTA)中，加入50 //1 FcR封閉溶 液(Miltenyi公司制備)，在4。C下反應(yīng)10分鐘，然后加入IOO CDllc 微珠(Miltenyi公司制備)，在4。C下反應(yīng)30分鐘，然后使用Auto MACS (Miltenyi公司制備),分離純化CD1 lc陽性細(xì)胞。在37。C下、將F(ab)'2 抗大鼠IgG抗體(10^g/ml) (Jackson公司制備)在96孔板上固定2小時，用 PBS清洗，然后在37。C下將抗mTARM抗體弁6、 #21或陰性對照的大鼠 IgG(10/^g/ml)固定l小時。將板用PBS清洗，然后將純化的CDllc陽性 樹狀細(xì)胞在培養(yǎng)基或含有終濃度為2 ^g/ml的抗CD40活化抗體(DB Pharmingen公司制備)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在24小時或48小時后回收培養(yǎng) 上清，使用DuoSet ELISA Development試劑盒(R&D公司制備)進(jìn)行細(xì) 胞因子的檢測。
結(jié)果，抗mTARM抗體與抗CD40抗體同等程度地誘導(dǎo)由來自骨髓 的成熟樹狀細(xì)胞生成IL-6，并且與抗CD40抗體具有協(xié)同效果(圖9A)。 同樣，在未成熟樹狀細(xì)胞中也可見誘導(dǎo)IL-6的生成的傾向。并且，抗 mTARM抗體誘導(dǎo)未成熟骨髓樹狀細(xì)胞生成MCP-l,但在抗CD40抗體 中未見誘導(dǎo)(圖9B)?？筸TARM抗體對MCP-l生成的誘導(dǎo)在成熟骨髓樹狀細(xì)胞中未見。除此之外，也對IL-12、 TNFa、 IL-1(3、 IL-IO、 KC的 生成誘導(dǎo)進(jìn)行了分析，但抗mTARM抗體對于未成熟樹狀細(xì)胞和成熟 樹狀細(xì)胞均未見顯著的影響。
由以上結(jié)果表明，樹狀細(xì)胞上的mTARM與特定的細(xì)胞因子或趨 化因子(例如IL-6或MCP-1)的生成有關(guān)。
「實施例41 TARM與FcRY鏈的復(fù)合物形成
已了解到，mTARM可發(fā)揮樹狀細(xì)胞活化受體的功能，因此，嘗 試了解信號傳遞分子。mTARM與參與破骨細(xì)胞分化的Oscar的跨膜部 位相似。已知Oscar與作為IgE受體而周知的信號傳遞分子FcRy鏈形成 復(fù)合物，可以認(rèn)為該締合與Oscar的跨膜區(qū)的堿性氨基酸和FcRy鏈的酸 性氨基酸的相互作用有關(guān)。mTARM在跨膜區(qū)也具有堿性氨基酸。另 一方面，作為與FcRy鏈同樣地在跨膜區(qū)具有酸性氨基酸的活化信號傳 遞分子已知有DAPIO、 DAP12。因此，對FcRy鏈、DAP10或DAP12是 否與mTARM形成復(fù)合物進(jìn)行研究。
FcRy鏈、DAPIO、 DAP12的表達(dá)載體如下制備分別使用根據(jù) GenBankTM的NM—010185、 AF072846、 NM—011662所示的核苷酸序列 設(shè)計的下述引物進(jìn)行擴(kuò)增，
FcRy F: cgcctcgagCTGGGAGAGCCGCAGCTCTGCTAT (SEQ ID NO, 39) FcRy R: gcgggcggccgcCTACTGGGGTGGTTTCTCATGCTT (SEQ ID NO. 40) DAPIO F: cgcgtcgacCAGACATCGGCAGGTTCCTGCTCC (SEQ ID NO. 41) DAPIO R: gcgggcggccgcTCAGCCTCTGCCAGGCATGTTGAT (SEQ ID NO. 42) DAP12 F: cgcgtcgacTTAAGTCCCGTACAGGCCCAGAGT (SEQ ID NO. 43) DAP12 R: gcgggcggccgcTCATCTGTAATA丌GCCTCTGTGT (SEQ ID NO. 44)
將所得cDNA片段插入設(shè)計成以Flag標(biāo)志序列附加在N末端的形式在 細(xì)胞表面上表達(dá)的表達(dá)載體pMIXII IRES-Puro。按照與mTARM表達(dá)細(xì) 胞的制備同樣的方法制備重組反轉(zhuǎn)錄病毒，感染表達(dá)mTARM的 B300.19細(xì)胞，在嘌呤霉素存在下進(jìn)行培養(yǎng)，選擇感染細(xì)胞。將所得的 B300.19強制表達(dá)細(xì)胞懸浮于FACS緩沖液(PBS/1。/。 FBS/1 mM EDTA) 中，與終濃度IO ^g/ml的抗體弁6和小鼠抗Flag抗體(Sigma公司制備)反應(yīng)，然后與PE標(biāo)記驢抗大鼠IgG二次抗體(Jackson公司制備)和Cy5標(biāo)記 驢抗小鼠IgG二次抗體(Jackson公司制備)反應(yīng)，使用FACSCalibur (Becton Dickinson公司制備)測定。
結(jié)果，在同時表達(dá)mTARM和FcRy鏈時，F(xiàn)cRy鏈在細(xì)胞表面上的 表達(dá)伴隨著mTARM在細(xì)胞表面上的表達(dá)量而增加。DAP10和DAP12 在細(xì)胞表面上的表達(dá)與mTARM的表達(dá)量無關(guān)。因此，F(xiàn)cRy鏈通過與 mTARM鏈形成復(fù)合物，顯示在細(xì)胞表面的表達(dá)增力口(圖10)。
接著，對mTARM的結(jié)合蛋白進(jìn)行生物化學(xué)分析。
將B300.19強制表達(dá)細(xì)胞用含有1% digtonin的細(xì)胞溶解液(1。/。 digtonin/50 mM Tris-HCl (pH 7.5)/150 mM NaCl/5 mM NaF/1 mM原釩 酸鹽/Complete (Roche公司制備))溶解，通過抗Flag抗體進(jìn)行免疫沉 降，通過抗mTARM抗體存6進(jìn)行免疫印記分析。
結(jié)果，mTARM與FcRy鏈一起發(fā)生免疫沉淀，而DAP10和DAP12 與mTARM并不一起免疫沉淀(圖IIA)。在抗Flag抗體中，F(xiàn)cRy鏈、 DAPIO、 DAP12分別免疫沉淀，這可通過抗Flag抗體的免疫印記分析 確認(rèn)。在B300.19強制表達(dá)細(xì)胞中的mTARM和附加有Flag標(biāo)志的FcRy 鏈、DAP 1 O和DAP 12的表達(dá)通過將細(xì)胞溶解液進(jìn)行抗mTARM抗體弁6 或抗Flag抗體的免疫印記來確i人。因此可以了解到，在B300.19強制表 達(dá)細(xì)胞中，F(xiàn)cRy鏈與mTARM形成復(fù)合物。
并且，將來自骨髓的成熟樹狀細(xì)胞用含有1% digtonin的細(xì)胞溶解 液溶解，通過陰性對照的大鼠IgG、抗mTARM抗體Wl、抗CD54抗體 和抗FcRy鏈抗體進(jìn)行免疫沉淀，通過抗FcRy鏈抗體進(jìn)行免疫印記。
結(jié)果，F(xiàn)cRy鏈與mTARM—起免疫沉淀，其它的細(xì)胞膜蛋白的 CD54并不與FcRy鏈一起免疫沉淀(圖llB)。因此，可以了解到，在成 熟樹狀細(xì)胞中，F(xiàn)cRy鏈與mTARM也形成復(fù)合物。
由這些結(jié)果顯示，mTARM的交聯(lián)刺激對樹狀細(xì)胞的活化是經(jīng)由 來自FcRY鏈的信號傳遞進(jìn)行?！笇嵤├?1活化的淋巴細(xì)胞與固定的TARM的粘附 (1) mTARM結(jié)合分子在活化T細(xì)胞上的表達(dá)
已知樹狀細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用。因此，與 mTARM結(jié)合的分子在T細(xì)胞上表達(dá)，經(jīng)由該分子控制樹狀細(xì)胞的活 化。因此，對于mTARM結(jié)合分子是否存在于T細(xì)胞上進(jìn)行研究。
將4xl(f個C57BL/6雄性小鼠的脾臟細(xì)胞懸浮于70 MACS緩沖 液(PBS/l。/。FBS/2mMEDTA)中，加入10^1 FcR封閉溶液，在4。C下反 應(yīng)10分鐘，再加入100/aCD4微珠(Miltenyi公司制備)，在4。C下反應(yīng)15 分鐘，然后使用Auto MACS,得到休止期CD4陽性T細(xì)胞。用MACS 純化的CD4陽性細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基(RPMI1640/10。/。 FBS/1 mM丙酮酸 鈉/55 //M 2-巰基乙醇)中，加入到以l ^g/ml抗CD3抗體(eBioscience公 司制備)溶液在37。C下固定了2小時的板中，在2 ^g/ml抗CD28抗體 (Pharmingen公司制備)存在下進(jìn)行刺激。在分化為Thl時，在IO ng/ml 小鼠IL-12 (Peprotech公司制備)和IO ^g/ml抗小鼠IL-4抗體(MP4-25D2， Pharmingen公司制備)存在下進(jìn)行抗CD3抗體刺激；分化為Th2時，在 15 ng/ml小鼠IL-4 (Genzyme公司制備)和15 ^g/ml抗小鼠IL-12抗體 (24910.1， Pharmingen公司制備)存在下進(jìn)行抗CD3抗體刺激。刺激2天 后，在Thl條件下加入20 ng/ml小鼠IL-2 (Genzyme公司制備)和IO ng/ml 小鼠IL-12，在Th2條件下加入20 ng/ml小鼠IL-2和15 ng/ml小鼠IL-4進(jìn) 行培養(yǎng)?？梢源_認(rèn)，Thl細(xì)胞通過IFN-y的生成、Th2細(xì)胞通過IL-4的生 成而分別分化。
后的活化CD4陽性T細(xì)胞，研究mTARM-AP嵌合蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面上 的結(jié)合活性。細(xì)胞懸浮于FACS緩沖液(PBS/1。/。 FBS)中，與終濃度為 30 Ag/ml的mTARM-AP嵌合蛋白或作為陰性對照的AP蛋白在冰上反 應(yīng)30分鐘，加入兔抗PLAP抗體(稀釋6000倍)(COSMO BIO公司制備)， 在冰上反應(yīng)30分鐘，然后再加入PE標(biāo)記驢抗兔IgG (H+L)抗體(稀釋50 倍)(Jackson公司制備)，在冰上反應(yīng)30分鐘。mTARM-AP嵌合蛋白的結(jié)合使用FACSCalibur測定。
結(jié)果，mTARM結(jié)合分子在休止期的CD4陽性T細(xì)胞中不表達(dá)，但 在活化CD4陽性T細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)(圖12)。 mTARM結(jié)合分子在刺激2 天后已經(jīng)表達(dá)，即使在8天后仍可維持表達(dá)。在Thl、 Th2的任何分化 條件下都可見mTARM結(jié)合分子的表達(dá)，但在8天后，在Th2細(xì)胞中的 表達(dá)與在TM細(xì)月包中比較更強(圖12)。
(2)活化T細(xì)胞與mTARM重組蛋白的粘附
接著，對mTARM是否可發(fā)揮活化T細(xì)胞的粘附分子的功能進(jìn)行研咒。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制備)上各加入50 /d抗石咸性磷酸 酶抗體(10^g/ml) (Seradyn公司制備)，在37。C下靜置30分鐘，進(jìn)行固定。 用PBS清洗，然后通過Block Ace (大日本制藥公司制備)封閉非特異性 結(jié)合部位。將10nM AP嵌合蛋白加入到各孔中，在室溫下靜置30分鐘， 進(jìn)行固定。刺激6 ~ 9天后的活化T細(xì)胞懸浮于細(xì)胞粘附緩沖液 (RPMI1640/0.5。/。 BSA/20 mM HEPES (pH 7.4))中，通過4丐黃綠素-AM (同仁社制備)進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后每孔中分別加入lxl()S個細(xì)胞，在 37。C下反應(yīng)l小時。清洗未粘附的細(xì)胞并除去，加入細(xì)胞溶解液(10mM Tris陽HCl (pH 8.0)/1% Triton X-IOO)，然后使用Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer公司制備)，以激發(fā)波長485 nm、檢測波長535 nm進(jìn)行測定，對粘附細(xì)胞進(jìn)行定量。細(xì)胞粘附的程 度以粘附細(xì)胞相對于所添加的細(xì)胞的比例、以百分?jǐn)?shù)表示。
結(jié)果表明，mTARM發(fā)揮活化T細(xì)胞的粘附分子的功能(圖13)。 Thl 細(xì)月包、Th2細(xì)胞均顯示與mTARM的粘附活性，但Th2細(xì)胞與mTARM 的粘附活性與Thl細(xì)胞相比，可見高的傾向。
「實施例61抗TARM抗體抑制細(xì)胞粘附的活性
對經(jīng)由mTARM的與Th2細(xì)胞的細(xì)胞粘附有關(guān)的抗TARM抗體的效果進(jìn)行研究。
向Th2細(xì)胞中加入10 ^g/ml抗mTARM抗體，在室溫下進(jìn)行10分鐘 的前處理，然后將其加入到固定有mTARM-AP嵌合蛋白的板中，在抗 體的存在下研究細(xì)胞粘附活性。
結(jié)果，Th2細(xì)胞與mTARM-AP嵌合蛋白的粘附在抗mTARM抗體 #6、 #21、 #37中均受到顯著抑制(圖14)。
f實施例71膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型中抗TARM抗體的治療效果
膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型(CIA)是自身免疫性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病 模型，可檢測出與II型膠原反應(yīng)的CD4陽性T細(xì)胞和抗體，因此可以認(rèn) 為兩者協(xié)同引發(fā)關(guān)節(jié)炎。另外，在CIA模型中，可認(rèn)為受MHCII型限 制。TARM是在樹狀細(xì)胞中表達(dá)的活化分子，經(jīng)由TARM結(jié)合分子誘 導(dǎo)活化T細(xì)胞的細(xì)胞粘附。因此，通過抗TARM抗體抑制樹狀細(xì)胞和 活化T細(xì)胞的相互作用，可能^^制與樹狀細(xì)胞或活化T細(xì)胞有關(guān)的免疫 應(yīng)答。因此，對CIA模型中的抗TARM抗體的治療效果進(jìn)行了研究。
弗氏佐劑(Difco公司制備)等量混合，制備乳液，對5周齡的DBA/1J小 鼠(購自Charles River公司)每只以100^1 (150 ^g/只)、在第-21天(初次免 疫)和第O天(追加免疫)、在臀部皮內(nèi)免疫?？筸TARM抗體弁6是由追加 免疫起以500 —g/l次、每周2次尾靜脈給予。追加免疫第3天開始進(jìn)行 體重測定和外觀評價，第13天殺死。外觀觀察可如下進(jìn)行評分評價。 0:未發(fā)病，1:紅斑以及跗骨或踝的關(guān)節(jié)輕度肺脹，2:紅斑以及由 踝到跗骨的關(guān)節(jié)輕度腫脹，3:紅斑以及由踝至跖骨的關(guān)節(jié)中度肺脹, 4:紅斑以及踝、足、腳趾全體重度腫脹。
結(jié)果，通過給予抗mTARM抗體，肉眼所見中可見明顯的癥狀減 輕和抑制體重減輕(圖15)。
由殺死的小鼠下腔靜脈進(jìn)行肝素采血，測定血漿中中血清淀粉狀 蛋白A (SAA)濃度和對膠原的抗體滴度。SAA是通過由炎癥刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子的作用，在肝細(xì)胞中生成的血漿蛋白，血漿中的SAA濃度
是炎癥的指標(biāo)。對膠原的抗體滴度是抗原特異性免疫應(yīng)答的指標(biāo)。
血漿中SAA的濃度是將血漿稀釋8000倍，使用ELISA試劑盒 (BioSource公司制備)測定。
血漿中對膠原的抗體滴度測定如下進(jìn)行。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制備)中分別加入50 〃1 5 〃g/ml來 自牛關(guān)節(jié)的II型膠原溶液，在《C下靜置過夜，進(jìn)行固定。用T-PBS (0.02。/。吐溫20/PBS)清洗，然后用1。/。BSA/PBS封閉非特異性結(jié)合部位。 用T-PBS清洗3次，然后向各孔中各加入50^1用T-PBS稀釋10萬倍的血 漿，在室溫下靜置2小時。用T-PBS清洗3次，然后將生物素化抗小鼠 IgGl (BD公司制備)、生物素化抗小鼠lgG2a (BD公司制備)用T-PBS稀 釋1000倍，向各孔中各加入50W,在室溫下靜置2小時。用T-PBS清洗 3次，然后將HRP標(biāo)記鏈霉抗生物素(Pierce公司制備)用T-PBS稀釋5000 倍，向各孔中各加入50/d，在室溫下靜置30分鐘。然后使用顯色底物 進(jìn)行顯色。
結(jié)果，血漿中的SAA濃度由于給予抗mTARM抗體而減少(圖16)。 血漿中抗膠原抗體滴度未見由于給予抗mTARM抗體而變化(圖17)。
「實施例81人TARM全長基因序列的確定
為了鑒定人TARM基因，使用小鼠TARM基因序列進(jìn)行BLAST檢 索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與小鼠TARM cDNA序列的同源性高的序列Genbank 檢索號XM—497642。但是，在XM—497642所編碼的氨基酸序列 (LOC441864)中不存在信號序列，無法認(rèn)定其可發(fā)揮細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的 功能。XM一497642是推定的序列，由基因組序列推定cDNA序列可能 出現(xiàn)錯誤。因此，嘗試確定人TARM的全長基因序列。鑒定TARM的 表達(dá)組織，進(jìn)行5，-、 3'-RACE,推定TARM cDNA的全長序列，然后 以編碼TARM蛋白的區(qū)域的序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，進(jìn)行全長cDNA的 分離。(1) 人TARM基因的表達(dá)分析。
首先，進(jìn)行hTARM在人組織中的表達(dá)分析。以GenBank檢索號 XM一497642的序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物。
hTARM Fl: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO. 45) hTARM Rl: TCCACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO. 46)
使用RNA PCR試劑盒(TAKARA公司制備)，由人各器官的總RNA (Clontech公司制備)合成單鏈cDNA,以此為模板，通過ABI7700進(jìn)行 實時PCR。 PCR在以下的反應(yīng)液組成(12.5 pi QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (QIAGEN公司制備)、0.25 〃1尿嘧咬DNA糖基化酶 (Invitrogen公司制備)、0.125 〃1 100^MF引物、0.125 〃1 100/^MR引物、 2.5W模板cDNA(稀釋10倍)、7.25/d蒸餾水)中進(jìn)行。PCR是在94。C下 處理10分鐘，然后將94。C30秒、60°C l分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)。
結(jié)果可知，hTARM基因也與mTARM基因同樣，在骨髓中強烈表 達(dá)(圖18)。
(2) 人TARM^因的分離
hTARM基因可見在骨髓中表達(dá)，因此，使用骨髓的總RNA,嘗 試通過5 ，-RACE和3 ，-RACE確定hTARM的全長基因序列。
首先，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA公司制備)，由骨髓的總 RNA合成雙鏈cDNA,使用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen公司制備) 純化cDNA。接著，附加ad29接頭，制作RACE的模板。1"PCR在以下 的反應(yīng)液組成(5 ,1 10xExTaq緩沖液、4 //1 2.5 mM dNTP、 0.25 ExTaq、 0.5 〃1 100 ^t/M引物(5，PCR4)、 0.5 100 ^M基因特異性引物、1 W附加有ad29接頭的cDNA (稀釋25倍)、38.75 〃l蒸餾水)中進(jìn)行。
引物使用如下5'PCR4: AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG (SEQ ID NO. 21) hTARM—RACE—5;'—4: CTTCTGGCACTGCAGAGTCACCCT (SEQ ID NO. 47),或
hTARM—RACE—3'_4: GGAGAGTACACCTGTGAATACTAC (SEQ ID NO. 48) 。
PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C30秒、65°C l分鐘、72°C 5分鐘的反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，最后在72r下反應(yīng)5分鐘。
2ndpCR在以下的反應(yīng)液組成(5 ,1 10xExTaq緩沖液、4 W 2.5 mM dNTP、 0.25一ExTaq、 0.5 100 〃M引物(5，PCR1)、 0.5/^1100一I基因 特異性引物、1lstpCR產(chǎn)物(稀釋lOO倍)、38.75//l蒸餾水)中進(jìn)行。
引物使用以下的序列。 5'PCR1: (SEQ ID N。. 24),
h29已140 Fl: TGTGAATACTACAGAAAAGCATCC (SEQ ID NO. 49),或 h29B140 fU: TC:CACCTGCGGTCACTGTACCCCT (SEQ ID NO. 50)
PCR是在94。C下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5 分鐘的反應(yīng)進(jìn)行25個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)5分鐘。將擴(kuò)增的cDNA 片段克隆到pCR2.1 (Invitrogen公司制備)，然后使用ABI3100測序儀確
定核苷酸序列。
結(jié)果，得到了與XM—497642的序列完全不同的5'和3'的核苦酸序
列(SEQ ID N0.9)。
使用由RACE得到的核苷酸序列信息設(shè)計的引物， h29B140—Sal卜Kozac一F:
cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTAAGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID NO. 51) h29B140—Notl-R:
cgcgcggccgcCTAGCGCATGCTACCCTTGGCAGC (SEQ ID NO. 52)
和使用RNA PCR試劑盒(TAKARA公司制備)，由骨髓的總RNA合成單 鏈cDNA,以此為模板，進(jìn)行PCR。 PCR在以下的反應(yīng)液組成(5 一 10x 緩沖液、42.5 mM dNTP、 0.5 //1 Pyrobest聚合酶(TAKARA公司制備)、 各0.5〃1100/zM引物、1WcDNA、 2.5/dDMSO、 36/d蒸餾水)中進(jìn)行。 PCR^在94。C下處理5分鐘，然后將94。C 30秒、65°C 30秒、72°C 5分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)2分鐘。將擴(kuò)增的cDNA克 隆到pBlueScriptII SK(+) (Stratagene公司制備)中，使用ABI3100測序儀 確定核苷酸序列。所得hTARM cDNA的核普酸序列與通過RACE確定 的序列一致(SEQ ID N0.9)。 hTARM cDNA所編碼的氨基酸序列(SEQ IDNO.10)中，在N末端存在為了發(fā)揮細(xì)胞膜蛋白的功能而必須的信號 序列。hTARC和XM—497642所編碼的氨基酸序列(LOC441864)中，N 末端與C末端不同。因此，由基因組序列的推定cDNA序列XM一497642 實際上并不存在，是hTARM cDNA編碼細(xì)胞膜蛋白hTARM的實際存 在的基因(圖19)。
「實施例91人TARM抗體的制備 (1)人TARM基因表達(dá)細(xì)胞的制備
人TARM基因表達(dá)載體是將實施例8所得的hTARM cDNA插入到 表達(dá)載體pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19 (27): 3050 ~ 3058)中制備。
重組反轉(zhuǎn)錄病毒的制備如下進(jìn)行。
將3x 106個293/EBNA-1細(xì)胞抹(Invitrogen公司制備)懸浮于培養(yǎng)基 (D-MEM/10。/。FBS)中，接種于10cm培養(yǎng)亞中，在(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 小時。第二天更換培養(yǎng)基，加入以下制備的轉(zhuǎn)染溶液，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn) 染溶液是在5 ml的管中加入600 ^ OPTI-MEM (GIBCO BRL公司制備) 和24/dTransITLTl (TaKaRa公司制備)，混合，在室溫下靜置5分鐘， 然后加入9 //g表達(dá)載體和9 〃g作為包裝載體的pCL-Eco (Imgenex公司 制備)，在室溫下靜置5分鐘。48小時后回收培養(yǎng)上清，進(jìn)行0.45/mi的 濾器過濾，得到重組病毒液。
將該重組病毒如下感染B300.19細(xì)胞林，制備hTARM基因表達(dá)細(xì) 胞。將lxl()6個B300.19細(xì)胞加入到15 ml的管中，以1200rpm、 25。C下 離心5分鐘，然后吸引除去培養(yǎng)上清。在2ml重組病毒液中加入2 ^ polybrene( 10 mg/ml)和255 /^M 2畫巰基乙醇，制成混合溶液，將該混合溶液加入到細(xì)胞中，在2500rpm、 30。C下離心2小時，進(jìn)行感染。感 染后除去重組病毒液，加入培養(yǎng)基(RPMI-1640/10。/。 FBS/55 〃M 2-巰基 乙醇)，進(jìn)行培養(yǎng)。通過細(xì)胞分選儀分離EGFP陽性細(xì)胞，得到hTARM 表達(dá)細(xì)月包。
(2) hTARM的胞外域和SEAP以及Fc嵌合蛋白的制備
hTARM的胞外域是以hTARM總長cDNA為模板，使用附加有SalI 的5，引物(h29B140—Sall-Kozac—F: cgcgtcgacGCCACCATGATCCCTA AGCTGCTTTCCCTC (SEQ ID N0.51))和附加有Notl的3，引物 (h29B 140—Notl—SEAP—R: gcgggcggccgcACCCAGGGAGTAGTTGCTC GATGT (SEQ ID N0.53))通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。PCR在以下的反應(yīng)液組 成(5 //1 10x緩沖液、42.5 mM dNTP、 0.5 Pyrobest聚合酶(TAKARA 7>司制備)、各0.5〃1100〃M引物、1/dcDNA、 2.5 W DMSO、 36 蒸餾水)中進(jìn)行。PCR在94。C下處理5分鐘，然后將94。C30秒、65°C 30 秒、72°C 5分鐘的反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，最后在72。C下反應(yīng)2分鐘。將擴(kuò) 增的cDNA克隆到pBlueScriptII SK(+) (Stratagene公司制備)中，使用 ABI3IOO測序儀確認(rèn)核苷酸序列。將所得cDNA片段用SalI和NotI消化， 然后插入到實施例2記載的pcDNA3.1(+)-SEAP(His),o-Neo載體中，制 備hTARM-AP表達(dá)載體。
由此，hTARM的胞外域與分泌型人胎盤性堿性磷酸酶通過3個氨 基酸接頭(Ala-Ala-Ala)結(jié)合，并可表達(dá)在C末端有IO個組胺酸標(biāo)志物 (His),o的分泌嵌合蛋白(以下稱為AP嵌合蛋白)。所得的AP嵌合蛋白表 達(dá)載體是使用TransIT LT1 (TAKARA公司制備)，導(dǎo)入293/EBNA-l細(xì) 胞林，培養(yǎng)4 5天。分泌到培養(yǎng)上清中的AP嵌合蛋白通過離心回收培 養(yǎng)上清，用0.22〃m的濾器過濾，然后分別加入Hepes(pH7.4)和疊氮化 鈉，使終濃度為20mM、 0.02%,在《C下保存。AP嵌合蛋白的濃度是 4吏用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay (ICN公司制備)測 定并計算》咸性磷酸酶活性。(3) hTARM的單克隆抗體的制備
為了制備作為免疫用的抗原，首先進(jìn)行hTARM-AP嵌合蛋白的純化。
純化是利用存在于AP嵌合蛋白C末端的組氨酸標(biāo)志，使用His Trap試劑盒(Amersham Biosciences公司制備)進(jìn)行。將含有hTARM-AP 嵌合蛋白的培養(yǎng)上清添加到l ml的HiTrap chelating HP柱(Amersham Biosciences公司制備)中，用10 mM咪唑溶液洗滌，然后用500 mM咪唑 溶液從柱中洗脫hTARM-AP嵌合蛋白。hTARM-AP嵌合蛋白的濃度是 通過4吏用Aurora AP chemiluminescent reporter gene assay (ICN,i^司制 備)的酶活性測定和使用蛋白質(zhì)測定試劑盒II (BIO-RAD公司制備)的 蛋白質(zhì)定量來計算。
接著，委托Kohjin Bio林式會社，以所得hTARM-AP嵌合蛋白作 為抗原，對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫。由免疫的小鼠中分離淋巴細(xì)胞，將 P3U1骨髓瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞混合，通過PEG法進(jìn)行細(xì)胞融合。使用所 得雜交瘤的培養(yǎng)上清、通過使用hTARM-Fc嵌合蛋白的ELISA進(jìn)行篩 選。由陽性孔進(jìn)行克隆，得到6種克隆(#11、 #18、 #19、 #22、 #26、 #40)。 通過FACS進(jìn)行特異性研究，結(jié)果，各克隆均只與表達(dá)hTARM的 B300.19細(xì)胞反應(yīng)，不與母林B300.19細(xì)胞反應(yīng)。將生產(chǎn)所得抗hTARM 單克隆抗體#11、 #18、 #19、 #22、 #26、 #40的雜交瘤接種于棵鼠的腹 腔內(nèi)，得到腹水，使用蛋白A柱純化抗體。
f實施例101活化人T細(xì)胞與hTARM重組蛋白的粘附
肝素采集人末梢血，加入等量的Ficoll-Paque PLUS (Amersham Biosciences),通過400xg、 30分鐘的比重離心法分離單核細(xì)胞。懸浮 于MACS緩沖液(PBS/10/。 FBS/2 mM EDTA)中，以5 xl()7個加入FcR 封閉溶液(Miltenyi公司制備)，在4°C下反應(yīng)15分鐘。使用人 CD25+CD4+ Treg分離試劑盒(Miltenyi公司制備)和Auto MACS ，獲得 寸木止期的CD4陽性T細(xì)胞。由MACS純化的CD4陽性細(xì)胞是將PE標(biāo)記'J、
54鼠抗人CD25抗體(Miltenyi公司制備)和FITC標(biāo)記小鼠抗人CD4抗體 (Miltenyi公司制備)分別加入溶液的l/ll容量，在4。C下反應(yīng)20分鐘，使 用FACS Aria (BD Biosciences)獲得CD4陽性CD25陰性T細(xì)胞。CD4陽 性CD25陰性T細(xì)胞使用T細(xì)胞活化/擴(kuò)展試劑盒人類(Miltenyi公司制備) 進(jìn)行活化。由刺激后的第3天開始加入人IL-2(2ng/ml)，使用刺激后第 6天和第8天的活化CD4陽性T細(xì)胞，研究hTARM-AP嵌合蛋白是否發(fā) 揮活化T細(xì)胞的粘附分子的功能。
首先，在96孔ELISA板(Nunc公司制備)中各加入50 〃l抗堿性磷酸 酶抗體(10^g/ml) (Seradyn公司制備)，在37。C下靜置30分鐘，進(jìn)行固定。 用PBS清洗，然后用Block Ace (大曰本制藥公司制備)封閉非特異性結(jié) 合部位。向各孔中加入AP嵌合蛋白(l nM)，在室溫下靜置30分鐘，進(jìn) 行固定。活化T細(xì)胞懸浮于細(xì)胞粘附緩沖液(RPMI1640/0.5。/。 BSA/20 mM HEPES/55 nM 2ME (pH 7.4))中，通過4丐黃綠素-AM(同仁社制備) 進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后每孔中分別加入5xl(^個細(xì)胞，在37。C下反應(yīng)1小 時。洗滌并除去非粘附細(xì)胞，加入細(xì)胞溶解液(IO mM Tris-HCl (pH 8.0)/1% TritonX-lOO)，然后使用Wallac ARVO SX 1420 MULTILABEL COUNTER (Perkin Elmer公司制備)，用485 nm激發(fā)波長、535 nm檢測 波長測定，對粘附細(xì)胞進(jìn)行定量。細(xì)胞粘附的程度用粘附細(xì)胞相對于 添加的細(xì)胞的比例、以百分?jǐn)?shù)表示。
結(jié)果可知，hTARM對活化人T細(xì)胞發(fā)揮粘附分子的功能(圖20)。
「實施例111抗TARM抗體的抑制細(xì)胞粘附的活性 果進(jìn)行研究。
向各孔中加入AP嵌合蛋白，在室溫下靜置30分鐘，進(jìn)行固定，然 后向各孔中加入IO ^g/ml抗hTARM抗體(弁11、 #18、 #19、 #22、 #26、 #40),在室溫下前處理30分鐘。然后加入熒光標(biāo)記的活化T細(xì)胞，在各 抗體存在下研究細(xì)胞粘附活性。對于#11、 #19、 #26、 #40，使用抗IgG2a抗體作為對照，對于#18、 #22,使用抗IgG2b抗體作為對照。
結(jié)果，活化T細(xì)胞與hTARM-AP嵌合蛋白的粘附在抗hTARM抗體 #18、 #19、 #22、 #26中受到顯著抑制，在#11、 #40中受到部分抑制(圖 20)。
「實施例121 mTARM的新型配體mTARM-L的鑒定 (1) mTARM-L (mTARM配體)侯選分子的選擇
在活化T細(xì)胞上存在mTARM結(jié)合分子(實施例5)，因此，采用實 施例5的方法對于來自小鼠免疫細(xì)胞的細(xì)胞林(L 517 8 Y-R細(xì)胞抹、 BW5147細(xì)胞抹、Raw264.7細(xì)胞抹)是否存在mTARM結(jié)合分子進(jìn)行研 咒。
結(jié)果，mTARM結(jié)合分子在L5178Y-R細(xì)胞林中強烈表達(dá)，但在 B W5147細(xì)胞林和Raw264.7細(xì)胞抹中幾乎不表達(dá)(圖21 A)。
接著，假定mTARM的未知的配體屬于免疫球蛋白超級家族 (IgSF)，檢索小鼠系綜數(shù)據(jù)庫，著眼于47個IgSF侯選，通過實時PCR 研究免疫細(xì)胞中的表達(dá)。總RNA是使用RNeasy mini試劑盒(Qiagen, Hilden， Germany),由L5178Y-R細(xì)胞、BW5147細(xì)胞、Raw264.7細(xì)胞中 分離。實時PCR是在SYBR-green存在下、使用ABI7700測序系統(tǒng)(PE Applied-Biosystems)進(jìn)行。
結(jié)果，ENSMUSG00000035095 (A530065I17Rik，雨—H6953)的 m脂A表達(dá)(使用引物#2558: CAGCTGGCAAGAGGAACAGT (SEQ ID NO.54), #2559: GAGCATCGGCACTTATCTCC (SEQ ID N0.55)) 顯示參與了mTARM-AP嵌合蛋白與細(xì)胞的結(jié)合活性(圖22B)。但是， ENSMUSG00000035095所編碼的氨基酸序列中不存在跨膜區(qū)，無法認(rèn) 定其發(fā)揮細(xì)胞膜蛋白的功能。該氨基酸序列是推定的序列，由基因組 序列推定cDNA序列的推定可能有錯誤。因此，首先嘗試人同源基因 產(chǎn)物的鑒定，使用ENSMUSG0O000035095所編碼的氨基酸序列進(jìn)行數(shù) 據(jù)庫檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了與ENSMUSG00000035095所編碼的氨基酸序列同源性高的人氨基酸序列LOC196264。該氨基酸序列呈現(xiàn)含有一個免 疫球蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)。因此，可以認(rèn)為LC196264是 TARM-L侯選的全長人氨基酸序列。接著，使用LOC196264的氨基酸 序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的tblastn檢索。結(jié)果，在小鼠BAC克隆AC122305的基 因組核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)了編碼與LOC196264的氨基酸序列具有同源 性的序列的區(qū)域。由該序列推定小鼠TARM-L侯選的cDNA序列和氨基 酸序列，設(shè)計引物，進(jìn)行編碼全長蛋白質(zhì)的cDNA的分離。
#2693: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCTGGCAAGAGGAACAGTA (SEQ ID NO. 56)
#2694: GCGGGCGGCCGCTCAGTACGCCTCTTCTTCGTAGTC (SEQ ID NO. 57)
模板使用Thl day2的總RNA，按照實施例l的方法擴(kuò)增cDNA。將擴(kuò)增 的cDNA插入到表達(dá)載體pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050 ~ 3058)中，制備mTARM-L侯選基因表達(dá)載體，使用ABI3100測 序儀確定核苷酸序列(SEQ ID NO. 13)。
(2)mTARM-L的鑒定
接著，為了研究mTARM-L侯選是否為TARM的未知配體，按照 實施例2的方法制備該分子的表達(dá)細(xì)胞。按照實施例5的方法測定 mTARM-AP嵌合蛋白與mTARM-L侯選表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞表面上的結(jié)合 活性，以及mTARM-L侯選表達(dá)細(xì)胞與固定的mTARM的粘附活性。
結(jié)果可知，mTARM-AP與EGFP陽性的表達(dá)mTARM-L的B300.19 細(xì)胞特異性結(jié)合，但不與EGFP陽性、導(dǎo)入了對照載體的B300.19細(xì)胞 結(jié)合(圖22A)。陰性對照的AP不與EGFP陽性、表達(dá)mTARM的B300.19 細(xì)胞結(jié)合(圖22A)。
并且，研究了表達(dá)mTARM-L的B300.19細(xì)胞與AP和mTARM-AP 嵌合蛋白的粘附活性，細(xì)胞只與mTARM-AP嵌合蛋白粘附(圖22B)。
由以上結(jié)果可知，mTARM-L侯選分子實際上是新型的TARM的 配體，將該配體命名為mTARM-L (TARM配體)。hTARM-L可以以編碼LOC196264的氨基酸序列的NM一198275的 核普酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，進(jìn)行編碼全長蛋白質(zhì)的cDNA的分離。 #2721: CGCGTCGACGCCACCATGCAGCAGAGAGGAGCAGCTGGA (SEQ ID NO. 58)
#2722: GCGG;GCGGCCGCTCAATATGTCTCTTCATAGTCTGA (SEQ ID NO. 59)
模板使用骨髓的總RNA,按照實施例l的方法擴(kuò)增cDNA。將擴(kuò)增的 cDNA插入到表達(dá)載體pMXII IRES EGFP (Oncogene (2000) 19(27): 3050~3058)中，制備TARM-L基因表達(dá)載體，使用ABI3100測序儀確 定核苷酸序列(SEQ ID NO. 15)。
人和小鼠TARM-L通過ClustalW進(jìn)行的同源性分析結(jié)果如圖23所 示。hTARM-L是235個氨基酸，mTARM-L是237個氨基酸，同源性為 86%。而與hTARM(271個氨基酸)同源性最高的mTARM m3 (293個氨 基酸)的同源性為50°/。(圖24)。
58
權(quán)利要求
1.膜蛋白或分泌蛋白，該膜蛋白或分泌蛋白含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列，或者具有1或多個保守性置換的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
2. 膜蛋白或分泌蛋白，該膜蛋白或分泌蛋白選自下述(i)、 (ii)、 (iii)和(iv):(i) 含有SEQIDNO.10所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；(ii) 含有在SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸的插 入、置換或缺失，或者向其一方或者兩末端附加l或多個氨基酸所得 的氨基酸序列，且與含有SEQ ID NO. 10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有 同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；(iii) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的多核苷 酸雜交的多核苷酸所編碼、且與含有SEQ IDNO.10所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和(iv) 含有與SEQ ID NO.IO所示的氨基酸序列具有90%以上同 一性的氨 基酸序列，且與含有SEQ ID NO. 10所示氨基i^f列的蛋白質(zhì)具有同等 功能的膜蛋白或分泌蛋白。
3. 多核苷酸，該多核苷酸編碼權(quán)利要求l的膜蛋白或分泌蛋白。
4. 權(quán)利要求3的多核苷酸，該多核苷酸含有SEQIDNO.l、 SEQ ID N0.3、 SEQ ID N0.5或SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列。
5. 多核苷酸，該多核苷酸編碼權(quán)利要求2的膜蛋白或分泌蛋白。
6. 多核苷酸，該多核苷酸選自下述(v)、 (vi)、 (vii)和(viii):(v) 含有SEQ ID N0.9所示核苷酸序列的多核苷酸；(vi) 在含有SEQ ID N0.9所示核苷酸序列的多核苷酸中有l(wèi)或多個核 苷酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加有l(wèi)或多個核 苷酸，且編碼與含有SEQIDNO.10所示氨基Sl^列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；(vii)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有SEQ IDN0.9所示核苷酸序列的多核苷酸雜 交，且編碼與含有SEQIDNO.10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功 能的膜蛋白或分泌蛋白的多核苷酸；和(vm)與含有SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的多核苦酸具有90。/。以上 的同一性，且編碼與含有SEQ IDNO.10所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有 同等功能的膜蛋白或分泌蛋白的多核普酸。
7. 選自下述(ix)、 (x)、 (xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其 功能性片段(ix) 含有SEQIDNO,2、 SEQIDN0.4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；(x) 含有在SEQIDN0.2、 SEQIDNO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸 的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所 得的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；(xi) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDNO,8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列 的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQIDNO,2、 SEQ ID N0.4、 SEQIDNO,6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO. IO或SEQ ID NO. 12 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和(xii) 含有與SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70。/。以上的同 一性，且與含有SEQIDN0.2、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO,6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO,IO或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有 同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
8. 權(quán)利要求7的抗體或其功能性片段，它是權(quán)利要求1或2的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
9. 權(quán)利要求8的抗體或其功能性片段，它是含有SEQIDNO.10所 示氨基酸序列或者具有1或多個保守性置換的SEQ ID NO.10所示氨基 酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
10. 權(quán)利要求7的抗體或其功能性片段，它是選自下述(ix，)、 (x，)、 (xi，)和(xii，)的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段(bc，)含有SEQ IDN0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白； (x，)含有在SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸的插 入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所得的 氨基酸序列，且與含有SEQ ID NO. 12所示氨基S吏序列的蛋白質(zhì)具有同 等功能的膜蛋白或分泌蛋白；(xi')由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的多核香 酸雜交的多核苷酸所編碼、且與含有SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的 蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和(xii，)含有與SEQ ID NO.12所示氨基酸序列具有70。/。以上同一性的氨 基酸序列、且與含有SEQ ID NO. 12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等 功能的膜蛋白或分泌蛋白。
11. 權(quán)利要求10的抗體或其功能性片段，它是含有SEQIDN0.12 所示氨基酸序列或者具有1或多個保守性置換的SEQ ID N0.12所示氨 基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白的抗體或其功能性片段。
12. 權(quán)利要求ll的抗體或其功能性片段，它由以保藏號FERM BP-103 76委托保藏的雜交瘤生成。
13. 雜交瘤，該雜交瘤以4呆藏號FERMBP-10376委托保藏。
14. 蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)選自下述(xiii)、 (xiv)、 (xv)和(xvi):(xiii) 含有SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(xiv) 含有在SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示的氨基S^f列中有l(wèi) 或多個氨基酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或 多個氨基酸所得的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.14或SEQ IDN0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)；(xv) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基 酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQ ID NO. 14或 SEQIDN0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)；和(xvi) 含有與SEQ ID N0.14或SEQ ID NO,16所示的氨基酸序列具有 70%以上同一性的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)。
15. 多核苷酸，該多核苷酸編碼權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)。
16. 多核苷酸，該多核苷酸選自下述(xvii)、 (xviii)、 (xix)和(xx):(xvii) 含有SEQ ID N0.13或SEQ ID NO,15所示核苷酸序列的多核苦 酸；(xviii) 在含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷酸序列的多核 苷酸中有l(wèi)或多個核苷酸的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末 端附加1或多個核苦酸，且編碼與含有SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；(xix) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苷 酸序列的多核苷酸雜交，且編碼與含有SEQ ID NO. 14或SEQ ID NO. 16 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸；和(xx) 與含有SEQ ID N0.13或SEQ ID N0.15所示核苦酸序列的多核普 酸具有70。/。以上的同一性，且編碼與含有SEQ ID N0.14或SEQ ID N0.16所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
17. 權(quán)利要求14的蛋白質(zhì)的抗體或其功能性片段。
18. 自身免疫疾病治療藥，該自身免疫疾病治療藥含有權(quán)利要求 7 ~ 12和17中任一 項的抗體或其功能性片段作為有效成分。
19. 權(quán)利要求18的自身免疫疾病治療藥，該藥物用于類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的治療。
20. T細(xì)胞粘附抑制劑，該T細(xì)胞粘附抑制劑含有權(quán)利要求7-12 和17中任一項的抗體或其功能性片段作為有效成分。
21. 抑制TARM蛋白與T細(xì)胞粘附的物質(zhì)或其鹽或者它們的溶劑 合物的篩選方法，該篩選方法包含下述步驟(a) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使TARM蛋白與T細(xì)胞接觸的步 驟；和(b) 測定上述TARM蛋白與T細(xì)胞的粘附活性的步驟； 上述TARM蛋白是選自下述(ix)、 (x)、 (xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白(ix) 含有SEQIDNO-2、 SEQIDNO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；(x) 含有在SEQIDNO,2、 SEQIDN0.4、 SEQIDNO,6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸 的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所 得的氨基酸序列，且與含有SEQ ID NO,2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；(xi) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDNO.S、 SEQIDNO.10或SEQIDNO.12所示氨基酸序列 的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQIDN0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO. IO或SEQ ID NO. 12 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和(xii) 含有與SEQ ID NO,2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列具有70。/。以上同一 性的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
22. 權(quán)利要求21的篩選方法，該篩選方法是在步驟(b)之后進(jìn)一步性進(jìn)行比較的步驟。
23. 權(quán)利要求21或22的篩選方法，其中，T細(xì)胞是活化T細(xì)胞。
24. 權(quán)利要求21 23中任一項的篩選方法，其中，活化T細(xì)胞是 活化Th2細(xì)胞。
25. 抑制樹狀細(xì)胞活化的物質(zhì)或其鹽或者它們的溶劑合物的篩選 方法，該篩選方法包含以下步驟(d) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使權(quán)利要求7~ 12中任一項的抗 體或其功能性片段與樹狀細(xì)胞接觸的步驟；和(e) 測定上述樹狀細(xì)胞的活化程度的步驟。
26. 權(quán)利要求25的篩選方法，其中，步驟(e)中，以樹狀細(xì)胞中的 IL-6和/或MCP-1的生成量作為指標(biāo)測定樹狀細(xì)胞的活化程度。
27. 權(quán)利要求26的篩選方法，該篩選方法是在步驟(e)之后進(jìn)一步 含有(f-l)將被檢物質(zhì)存在下的IL-6和/或MCP-l的生成量與被檢物質(zhì) 非存在下的IL-6和/或MCP-l生成量進(jìn)行比較的步驟。
28. 權(quán)利要求25的篩選方法，其中，步驟(e)中，以樹狀細(xì)胞中的 FcRy鏈的表達(dá)量作為指標(biāo)測定樹狀細(xì)胞的活化程度。
29. 權(quán)利要求28的篩選方法，該篩選方法是在步驟(e)之后進(jìn)一步 含有(f-2)將被檢物質(zhì)存在下的FcRy鏈的表達(dá)量與被檢物質(zhì)非存在下 的FcRY鏈的表達(dá)量進(jìn)行比較的步驟。
30. 抑制TARM蛋白與FcRY鏈形成復(fù)合物的物質(zhì)或者其鹽或它們 的溶劑合物的篩選方法，該篩選方法包含下述步驟(g) 在被檢物質(zhì)的存在下或非存在下，使權(quán)利要求7-12中任一項的抗 體或其功能性片段與樹狀細(xì)胞接觸的步驟；和(h) 測定上述樹狀細(xì)胞中FcRfT連的表達(dá)量的步驟； 上述TARM蛋白是選自下述(ix)、 (x)、 (xi)和(xii)的膜蛋白或分泌蛋白(ix) 含有SEQIDN0.2、 SEQIDNO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的膜蛋白或分泌蛋白；(x) 含有在SEQIDNO,2、 SEQIDNO,4、 SEQIDN0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示的氨基酸序列中有l(wèi)或多個氨基酸 的插入、置換或缺失，或者向其一方或兩末端附加l或多個氨基酸所得的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO.IO或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列的蛋白 質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；(xi) 由在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與編碼SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序列 的多核苷酸雜交的多核苷酸所編碼，且與含有SEQIDN0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQIDNO,6、 SEQIDNO,8、 SEQ ID NO. IO或SEQ ID NO. 12 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白；和(xii) 含有與SEQ ID N0.2、 SEQ ID N0.4、 SEQ ID N0.6、 SEQ ID N0.8、 SEQ ID NO. 10或SEQ ID NO. 12所示的氨基酸序列具有70%以上同一 性的氨基酸序列，且與含有SEQ ID N0.2、 SEQ ID NO,4、 SEQ ID N0.6、 SEQIDN0.8、 SEQ ID NO.10或SEQ ID N0.12所示氨基酸序 列的蛋白質(zhì)具有同等功能的膜蛋白或分泌蛋白。
31.權(quán)利要求30的篩選方法，該篩選方法是在步驟(h)之后進(jìn)一步 含有(i)將被檢物質(zhì)存在下的FcRy鏈的表達(dá)量與被檢物質(zhì)非存在下的 FcRY鏈的表達(dá)量進(jìn)行比較的步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供在樹狀細(xì)胞上表達(dá)的T細(xì)胞粘附分子。根據(jù)本發(fā)明，提供含有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQID NO.8、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
文檔編號A61P37/06GK101316930SQ20068004461
公開日2008年12月3日 申請日期2006年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者今井俊夫, 小笠原秀晃, 有田貴久, 水野惠子, 西村美由希 申請人:衛(wèi)材R&D管理有限公司