專利名稱：抗白細(xì)胞粘附分子vla-4的人源化抗體的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及對(duì)白細(xì)胞粘附分子VLA-4的α-4亞單位特異的人源化抗體。
背景技術(shù)：
發(fā)炎是血管化組織對(duì)感染或損傷的反應(yīng)，是白細(xì)胞粘附到血管的內(nèi)皮細(xì)胞且浸潤(rùn)到周圍組織中而引起的。發(fā)火在正常情況下，浸潤(rùn)的白細(xì)胞釋放出毒性介質(zhì)以殺死侵入的有機(jī)體，吞噬殘片和死細(xì)胞，在組織修復(fù)和免疫應(yīng)答中起作用。然而，發(fā)炎在病理?xiàng)l件下，浸潤(rùn)的白細(xì)胞反應(yīng)過度并可引起嚴(yán)重的或致命的損害。參見，例如，Hickey，Psychoneuroimmunology II(Academic Press 1990)。
通過內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞的細(xì)胞表面配體和受體間的相互作用，白細(xì)胞附著到內(nèi)皮細(xì)胞上。參見Springer，Nature 346425～433(1990)。配體和受體間的同一性隨細(xì)胞亞型、解剖部位發(fā)炎刺激物的不同而異。VLA-4白細(xì)胞細(xì)胞表面受體是由Hemler首先鑒定的(Hemler，EP 330,506(1989)，為各種目的在整體上引作參考)。VLA-4是細(xì)胞表面受體β1整合蛋白家族的成員，均含有α和β鏈。VLA-4含有α4和β1鏈。VLA-4與稱作VCAM-1的內(nèi)皮細(xì)胞配體特異地結(jié)合。參見Elices等，Cell 60577-584(1990)(該文獻(xiàn)在整體上作為參考)。雖然VCAM-1是在活化的人臍靜脈細(xì)胞上被首次探測(cè)到的，但該配體在腦內(nèi)皮細(xì)胞上也已被探測(cè)到。參見共同擁有的待審查的美國(guó)序號(hào)為07/871,223的申請(qǐng)(該文獻(xiàn)在整體上引作參考)。
粘附分子，如VLA-4，是治療劑的潛在的靶位。由于VLA-4受體與位于腦內(nèi)皮細(xì)胞上的配體相互作用，VLA-4受體是特別重要的靶位。由大腦發(fā)炎而產(chǎn)生的疾病和癥狀具有特別嚴(yán)重的后果。例如，一種多樣硬化癥的疾病(MS)有慢性病程(有或沒有病情加重或緩解)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的能力喪失和死亡。據(jù)估計(jì)該疾病僅在美國(guó)就有250,000到350,000的人數(shù)受到了影響。
在動(dòng)物模型中，已在活體內(nèi)和活體外對(duì)抗VLA-4受體抗體的抗炎能力進(jìn)行測(cè)試。參見USSN 07/871,223和Yednock等，Nature 35663～66(1992)(這些文獻(xiàn)在整體上引作參考)?；铙w外的試驗(yàn)證明了抗-VLA-4抗體阻斷淋巴細(xì)胞附粘于腦內(nèi)皮細(xì)胞。在人工誘導(dǎo)條件(試驗(yàn)自體免疫腦脊髓炎)刺激動(dòng)物產(chǎn)生多樣性硬化病，動(dòng)物試驗(yàn)測(cè)試了抗-VLA-4抗體對(duì)所述動(dòng)物的作用效果。試驗(yàn)表明給藥抗-VLA-4抗體可防止動(dòng)物的腦發(fā)炎和隨后的麻痹。總之，這些試驗(yàn)證明了抗-VLA-4抗體可用于多樣性硬化病和其它炎癥疾病及紊亂的潛在的治療劑。
目前可得到的抗-VLA-4抗體存在的明顯的問題是它們都是鼠源的，因此有可能在臨床應(yīng)用中會(huì)引起人抗鼠應(yīng)答(HAMA)。HAMH應(yīng)答降低了鼠抗體對(duì)患者的效果，并阻礙了繼續(xù)給藥。解決這個(gè)問題的一個(gè)辦法即是將鼠抗體人源化。在該辦法中，將供體鼠可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CPRs)和某些其它氨基酸移植酸人的可變受體區(qū)，然后與人的恒定區(qū)融合起來。參見，例如，Riechmann等，Nature 332332～327(1988)；Winter，US5,225,539(1993)(每篇文獻(xiàn)在整體上引作參考)。
雖然已經(jīng)制出了幾種人源化抗體樣本，但將鼠源抗體轉(zhuǎn)變成人源化抗體涉及競(jìng)爭(zhēng)考慮的折衷，其解決辦法也因抗體的不同而異。為減小免疫原性，免疫球蛋白應(yīng)該盡可能多地保留人受體序列。然而，為保留可靠的結(jié)合性質(zhì)，免疫球蛋白框架應(yīng)含有人受體序列的充分取代以保證其CDR區(qū)的三維構(gòu)象盡可能地接近于原初的鼠供體免疫球蛋白的構(gòu)象。作為競(jìng)爭(zhēng)考慮的結(jié)果，目前生產(chǎn)的衍生于小鼠抗體的許多人源化抗體與相應(yīng)的小鼠抗體相比表明喪失了一些結(jié)合親合性。參見，例如，Jones等，Nature 321522～525(1986)；Shearman等，J.Immunol.1474366～4373(1991)；Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884181～4185(1991)；Tempest等，Biotechnology 9266～271(1991)。
基于以上所述，很明顯要求人源化抗-VLA-4抗體對(duì)VLA-4受體具有強(qiáng)親和力，而同時(shí)該抗體產(chǎn)生，即使產(chǎn)生的話，幾乎很少的人抗鼠應(yīng)答。本發(fā)明滿足了該項(xiàng)和其他要求。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供了能與VLA-4配體特異結(jié)合的人源化免疫球蛋白。人源化的抗體含有人源化的輕鏈和人源化的重鏈。人源化的輕鏈含有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2，CDR3)和來自于除自由L45、L49、L58和L69位所組成的第一組中的至少一個(gè)位點(diǎn)外的人K輕鏈可變區(qū)框架序列的可變區(qū)框架；其中氨基酸的位置由存在于小鼠21.6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)框架相應(yīng)位置上的同樣的氨基酸占據(jù)。所述的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列相應(yīng)于小鼠的21-6免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)。人源化的重鏈含有三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2、CDR3)和來自于除選自由H27、H29、H30、H44、H71組成的組中的至少一個(gè)位點(diǎn)外的人重鏈可變區(qū)框架序列的可變區(qū)框架，其中氨基酸的位置由存在于小鼠21-6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架相應(yīng)位置的同樣的氨基酸所占據(jù)。該免疫球蛋白與VLA-4特異性的結(jié)合。其親和力的下限為大約107M-1，上限為大約5倍于小鼠21-6免疫球蛋的親和力。
通常，人源化的輕鏈和重鏈可變區(qū)框架分別來自于RE1和21/28′CL可變區(qū)框架序列。當(dāng)人源化輕鏈可變區(qū)框架來自于RE1時(shí)，至少有二個(gè)框架氨基酸被替代了。一個(gè)氨基酸來自上面所述的第一組。另一個(gè)氨基酸來自由L104、L105、L107組成的第3組。這個(gè)位置由存在于人免疫球蛋白而不是RE1的K輕鏈相應(yīng)位置的氨基酸所占據(jù)。
某些人源化的免疫球蛋白具有在圖6中所示為L(zhǎng)a或Lb的成熟的輕鏈可變區(qū)序列，或在圖7中示為Ha、Hb的成熟的重鏈可變區(qū)序列。優(yōu)選的人源化免疫球蛋白包括那些具有La輕鏈和Ha、Hb或Hc重鏈。
本發(fā)明還提供前面述及的抗VLA-4人源化免疫球蛋白的結(jié)合片段。
另一方面，本發(fā)明提供編碼上面所述的抗VLA-4的人源化免疫球蛋白的核酸序列。
還提供了編程來顯示上面所述的小鼠21.6抗體或人源化免疫球蛋白的三維構(gòu)象的計(jì)算機(jī)。
另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物及用其進(jìn)行治療的方法，該藥物組合物含有上面所述的人源化免疫球蛋白或結(jié)合片段，及藥物學(xué)可接受的載體。在某些治療方法中，給患有炎癥疾病，如多樣性硬化癥的患者給藥治療有效劑量的藥物組合物。
還提供了用前面述及的人源化免疫球蛋白和結(jié)合片段來探測(cè)VLA-4抗原的方法。在這些方法中，對(duì)患者或從其身上取下的組織樣品給藥人源化的抗體或結(jié)合片段。檢測(cè)了由抗體或片段和存在于樣品中的VLA-4特異性結(jié)合所形成的復(fù)合體。
附圖的簡(jiǎn)略描述

圖1小鼠21.6輕鏈可變區(qū)的DNA(SEQ.ID NO1)和氨基酸(SEQ.ID NO2)序列。
圖2小鼠21.6重鏈可變區(qū)的DNA(SEQ.ID NO3)和氨基酸(SEQ.ID NO4)序列。
圖3用于產(chǎn)生具有在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的人κ輕鏈和人γ-1重鏈的嵌合和整形的人抗體的輕鏈(A)和重鏈(B)表達(dá)載體。
圖4與L細(xì)胞結(jié)合的嵌合的和小鼠21.6抗體的ELISA比較，L細(xì)胞在其表面表達(dá)人α4β1整合蛋白。
圖5小鼠21.6抗體可變區(qū)的分子模型。標(biāo)記了特別令人感興趣的殘基。
圖6小鼠和整形的人21.6(SEQ.ID NO5)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比較。用星號(hào)標(biāo)記的氨基酸殘基是CDR環(huán)結(jié)構(gòu)的Chothia經(jīng)典序列的部分。REI(SEQ.ID NO6)表示來自于REI輕鏈的VL區(qū)的FRs和CPRs。La(SEQ.IDNO7)和Lb(SEQ.ID NO8)是整形人21.6區(qū)的兩種形式。下畫線的殘基是不同于REI序列中的那些的La的FRs。在Lb中，只示出了與REI不同的那些框架區(qū)殘基。
圖7小鼠和整形的人21.6(SEQ.ID NO9)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的比較。用星號(hào)標(biāo)記的氨基酸殘基是Chothia CDR環(huán)結(jié)構(gòu)的經(jīng)典序列部分。2*CL(SEQ.ID NO10)表示來自于人21/28′CL抗體VH區(qū)的FRs和CDRs。Ha(SEQ.ID NO11)、Hb(SEQ.ID NO12)和HC(SEQ.ID NO13)是整形的人21.6VH區(qū)的三種形式。下畫線的殘基是Ha的FRs與21/28′CL序列中的那些不同的部分。在Hb和Hc中，只示出了與21/28′CL不同的那些框架區(qū)殘基。
圖8基于PCR的“a”型整形的人21.6輕鏈可變區(qū)的構(gòu)造。斜線表示在引物間的至少21個(gè)堿基的互補(bǔ)序列。
圖9基于PCR的“a”型整形的21.6重鏈可變區(qū)的構(gòu)造。
圖10第一型(“a”)的整形的人21.6輕鏈可變區(qū)的cDNA和氨基酸序列(SEQ.ID NOS14和15)。
圖11第一型(“a”)的整形的人21.6重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列。
圖12嵌合的和整形的人21.6抗體與L細(xì)胞結(jié)合的ELISA比較，所述的L細(xì)胞在其表面上表達(dá)α4β1整合蛋白。
圖13小鼠21.6抗體與不同的抗-VLA- 4抗體，L25的比較。圖A比較了在有和無Mn2+存在時(shí)，為純化VCA-1抗體阻斷U937單核細(xì)胞結(jié)合的能力。圖B比較了為提高VCAM-1的濃度，抗體阻斷Jurkat細(xì)胞結(jié)合的能力。
圖14用小鼠或人21.6抗體處理動(dòng)物體重減少的延遲。
圖15用小鼠或人21.6抗體處理動(dòng)物，其臨床癥狀的逆變。
圖16用小鼠或人21.6抗體處理動(dòng)物，其體重減少的逆變。
定義對(duì)天然存在的20個(gè)氨基酸的簡(jiǎn)稱可沿用慣用法(Immunology-A Synthesis(2nd ed.，E.S.Golub & D.R.Gren，eds.，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991))。該20種常規(guī)氨基酸，非天然氨基酸如α、α-雙取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其他非常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)對(duì)本發(fā)明的多肽來說也是合適的組份。非常規(guī)氨基酸的例子包括4-羥基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，ε-N-乙?；嚢彼?，O-磷酸絲氨酸，N-乙酰基絲氨酸，N-甲?；鞍装彼?，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，ω-N-甲基精氨酸，和其他類似的氨基酸及亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。此外，氨基酸可被糖基化、磷酸化等進(jìn)行修飾。
在此所用的多肽，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)用法和常規(guī)，左側(cè)是氨基末端右側(cè)是羧基末端。類似地，除非特別指出，單鏈多聚核苷酸序列的左手端是5′端；雙鏈多聚核苷酸序列的左手側(cè)指的是5′方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物的5′→3′方向的是轉(zhuǎn)錄方向；DNA鏈的與RNA具有同樣序列的區(qū)域及5′端至RNA轉(zhuǎn)錄的5′端稱為“上游序列”；DNA鏈的與RNA具有同樣序列的序列區(qū)及3′端至RNA轉(zhuǎn)錄的3′稱為“下游序列”。
術(shù)語“多聚核苷酸序列”指的是從5′→3′端閱讀的單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸或核糖核酸的聚合體。它包括自體復(fù)制的質(zhì)粒，有侵染性的DNA或RNA的聚合體和非功能的DNA或RNA。
下列術(shù)語用來描述兩個(gè)或多個(gè)多聚核苷酸間的序列關(guān)系“參考序列”、“比較窗框”(comparison window)、“序列一致性”、“序列一致性的百分?jǐn)?shù)”、和“基本上一致性”?！皡⒖夹蛄小倍x為用作序列比較基礎(chǔ)的序列；參考序列可以是較長(zhǎng)序列的一部分，例如，本序列表中列出的全長(zhǎng)cDNA或基因序列的片段，如圖1或圖2的多聚核苷酸序列，參考序列也可包含完整的DNA或基因序列。參考序列的長(zhǎng)度一般為至少20個(gè)核苷酸，通常為至少25個(gè)核苷酸，經(jīng)常為至少50個(gè)核苷酸。既然兩個(gè)多聚核苷酸(1)可能每個(gè)均含有在兩個(gè)多聚核苷酸之間相似的序列(即，完整多聚核苷酸序列的部分)，和(2)也可能還含有在兩個(gè)多聚核苷酸間不同的序列，兩個(gè)(或多個(gè))多聚核苷酸間的序列比較，典型地通過比較兩個(gè)多聚核苷酸的序列而不是通過“比較窗框”來進(jìn)行鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性。在此處所用的“比較窗框”是指至少20個(gè)緊鄰的核苷酸位置的概念的片段，其中多聚核苷酸序列可與至少20個(gè)緊鄰核苷酸的參考序列比較；和與參考序列(其不包含增加或缺失)相比，比較窗框中的多聚核苷酸序列部分可包含20％或更少些的增加或缺失有利于兩序列的最佳直線排列。對(duì)比較窗框的直線排列的序列的最佳直線排列可通過(Smith & Waterman)局部的同源性算法(Adv.Appl.Math.2482(1981))，Needleman & Wunsch的同源性直線排列算法(J.Mol.Biol.48443(1970)，通過Pearson & Lipman的相似性檢索辦法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444(1988))(每篇文獻(xiàn)在整體上均作參考)，通過這些算法的計(jì)算機(jī)化的實(shí)現(xiàn)(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA in the Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通過檢查，和由所選的各種方法所產(chǎn)生的最佳直線排列(即，通過比較窗框而得的最高比例的序列相似性)而實(shí)現(xiàn)。術(shù)語“序列一致性”意思是指通過比較窗框兩個(gè)多聚核苷酸序列是一致的(即，基于核苷酸--核苷酸的比較)。術(shù)語“序列一致性的百分?jǐn)?shù)”是通過窗框的比較而進(jìn)行兩個(gè)最佳直線排列的序列的比較，確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)的同樣核酸堿基(如，A、T、C、G、U、或I)而產(chǎn)生的匹配位置的數(shù)目，用比較窗框內(nèi)(即，窗框的大小)匹配位置的數(shù)目除以全部的位置數(shù)，和將所得的結(jié)果乘以100以得到序列一致性的百分?jǐn)?shù)。在此所用的術(shù)語“基本的一致性”，指的是多聚核苷酸序列的特征，其中該多聚核苷酸含有序列，該序列為當(dāng)通過比較窗框在至少20個(gè)核苷酸位置，經(jīng)常通過在至少25～50個(gè)核苷酸的窗框與參考序列相比較時(shí)，該序列具有至少85％的序列一致性，經(jīng)常為至少90～95％的序列一致性，更經(jīng)常為至少99％的序列一致性；其中序列一致性的百分?jǐn)?shù)是通過將參考序列與多聚核苷酸序列相比較而計(jì)算出的，所述的多聚核苷酸序列包括通過窗框比較占參考序列20％或更少些的缺失或增加。參考序列可能是較大的一部分序列，例如，示于圖1或2的序列。
當(dāng)用于多肽時(shí)，術(shù)語“序列一致性”是指肽在相應(yīng)位置具有同樣的氨基酸。術(shù)語“序列相似性”是指肽在相應(yīng)位置具有同樣的或相似的氨基酸(即保持性置換)。術(shù)語“基本的一致性”是指當(dāng)最佳直線排列時(shí)，如使用系統(tǒng)間歇重量(default gapweight)通過GAP或BESTFIT程序時(shí)，兩個(gè)肽序列，具有至少80％序列一致性，優(yōu)選至少90％的序列一致性，更優(yōu)選至少95％或更高的序列一致性(如，99％的序列一致性)。優(yōu)選地，不相同的殘基位置是由于保守氨基酸的取代產(chǎn)生的差異。術(shù)語“基本的相似性”是指兩個(gè)肽序列具有相應(yīng)百分?jǐn)?shù)的序列相似性。
術(shù)語“基本純”是指目標(biāo)成份(object species)是主要存在的成份(即，以摩爾計(jì)，該成分的含量比組合物中的任何其它單獨(dú)的組分的含量都要高)，和優(yōu)選地基本純化的級(jí)分是組合物，其中目標(biāo)成份含有至少大約50％(以摩爾計(jì))的大分子成份。通常，基本純的組合物包含多于80～90％的組合物中的所有大分子成份.。優(yōu)選地，目標(biāo)成份被純化至基本均一(用常規(guī)的檢測(cè)方法不能檢出污染成分)，其中組合物實(shí)質(zhì)上由單一的大分子成分組成。
為將氨基酸置換分為保持的或非保持的，將氨基酸分成以下幾組組I(疏水側(cè)鏈)正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；組H(中性疏水側(cè)鏈)半脫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)天冬氨酸、谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)天冬酰胺、谷氨酰酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸；組V(殘基影響鏈的方向)甘氨酸、脯氨酸；和組VI(芳香族側(cè)鏈)色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保持性置換包括在同類氨基酸間的置換。非保持性置換包括將這些類中的一類成員變成另一員。
來自于免疫球蛋白成熟重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸分別以Hx和Lxx指定，其中x是按照Kabat等的方案指定氨基酸位置的數(shù)目(Sequences of Proteins ofImmunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，MD(1987))和(1991))(在以后均表示為“Kabat等”，并在整體上該文獻(xiàn)在此引作參考)。Kabat等列出了每個(gè)亞類的抗體的許多氨基酸序列，和列出了在該亞類每個(gè)殘基位置上最經(jīng)常發(fā)生的氨基酸。Kabat等，使用了在所列序列中給予每個(gè)氨基酸一個(gè)殘基號(hào)碼的方法，該給予殘基號(hào)碼的方法已變成本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。Kabat等的方案可延及并未包括在其方案概要中其它抗體，即通過把懷有疑問的抗體與在Kabat等中的一個(gè)一致序列進(jìn)行直線排列。Kabat等的編號(hào)系統(tǒng)使用使在不同抗體的等同位置的氨基酸易于被識(shí)別。例如，人抗體L50位置的氨基酸占據(jù)小鼠抗體L50氨基酸位置的等同位置。
詳細(xì)描述I.特異于VLA-4的人源化抗體在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了特異于VLA-4的α-4亞基的人源化免疫球蛋白(抗體)。人源化免疫球蛋白具有不同的主要來自人免疫球蛋白(稱為受體免疫球蛋白)的框架區(qū)和主要來自稱為mu MAb 21.6的小鼠免疫球蛋白(指的是供體免疫球蛋白)的互補(bǔ)決定區(qū)。恒定區(qū)，如果有的話，也主要來自人免疫球蛋白，人源化抗體表現(xiàn)出對(duì)VLA-4至少107、108、109或1010M-1的結(jié)合親和力。通常，人源化抗體VLA-4的結(jié)合親和力的上限在mu MAb21.6對(duì)VLA-4結(jié)合親和力(大約109M-1)的3或5指數(shù)之內(nèi)。結(jié)合親和力的下限也經(jīng)常在mu MAb21.6的結(jié)合親和力的3或5指數(shù)之內(nèi)。
A.免疫球蛋白的一般特征已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每對(duì)具有一條“輕鏈(大約25KDa)和一條重鏈(大約50～70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包括大約100至110或更多的氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原的識(shí)別。每條鏈的羧基末端部分定義于恒定區(qū)，主要起效應(yīng)器的功能。
輕鏈被分成K或λ。重鏈被分成γ，μ，α，δ或ε，且將抗體的同型分別定義為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在重鏈和輕鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)由大約12個(gè)或更多氨基酸的“J”區(qū)連接起來且重鏈還包括大約10個(gè)或更多氨基酸的“D”區(qū)。(參見Fundamental Immunology(Paul，W.，ed.，Raven Press，N.Y.，1989)，Ch.7(整體上該文獻(xiàn)引作參考))。
每個(gè)輕/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體的結(jié)合位點(diǎn)。所有的鏈均具有三個(gè)高可變區(qū)，也被稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDRs連接的相對(duì)保持的框架區(qū)FR相同的一般結(jié)構(gòu)。來自每對(duì)兩條鏈的CDRs被框架區(qū)排列成直線，能與特定的表位結(jié)合。按上述的Kabat等定義的標(biāo)準(zhǔn)序列描述CDR和FR殘基。Chothia等建議了可選擇的結(jié)構(gòu)定義(J.Mol.Biol.196901～917(1987)；Nature 342878～883(1989)；和J.Mol.Biol.186651～663(1989)(此后均稱其為Chothia等，它們?cè)谡w上均引作參考)。當(dāng)框架位置，如上述的Kabat等所定義的，組成了如上述的Kabat等所定義的結(jié)構(gòu)環(huán)位置時(shí)，小鼠抗體內(nèi)氨基酸被經(jīng)常摻入到人源化抗體中。
B.人源化抗體的產(chǎn)生(1)、小鼠MAb 21.6用于產(chǎn)生人源化抗體的起始材料是mu MAb21.6。該抗體的分離和特性被描述于USSN 07/871,223。簡(jiǎn)言之，mu MAb21.6是對(duì)VLA-4的α-4亞基特異的，已表明它能抑制人淋巴細(xì)胞結(jié)合到用腫瘤壞死因子刺激的大鼠腦細(xì)胞的組織培養(yǎng)物。實(shí)施例1描述了編碼mu MAb21.6抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA的克隆和測(cè)序并且核苷酸及氨基酸序列示于圖1和圖2，這些圖也描述了氨基酸編碼序列并進(jìn)一步分成框架和互補(bǔ)決定區(qū)。從N末端到C末端輕鏈和重鏈均含有FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4域。將每個(gè)域的氨基酸根據(jù)上述Kabat等的編碼系統(tǒng)分配到每個(gè)域。
(2)提供框架殘基的人抗體的選擇如果人可變區(qū)框架的構(gòu)象與小鼠的相同或相似(CDRs來源于小鼠的可變區(qū)框架)，將小鼠的CDRs替換到人可變區(qū)框架很可能導(dǎo)致它們正確的空間方向的保留。這可通過獲取人抗體的人可變區(qū)而實(shí)現(xiàn)，所述人抗體的框加序列與小鼠可變框架區(qū)(CDRs即產(chǎn)生于此)表現(xiàn)出序列的高度一致?？蓮南嗤虿煌娜丝贵w序列產(chǎn)生重鏈和輕鏈的可變框架區(qū)。人抗體序列可以是天然生成的人抗體序列或者是幾種人抗體的一致性序列。參見Kettleborough等，Protein Engineering 4773(1991)；Kolbinger等，Protein Engineering 6971(1993)。
將小鼠可變區(qū)的氨基酸序列與已知的人抗體序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)比較，鑒定適當(dāng)?shù)娜丝贵w序列。對(duì)重鏈和輕鏈分別進(jìn)行獨(dú)立的比較，但規(guī)則是相似的。比較提示mu21.6輕鏈與κ1亞型的人輕鏈表現(xiàn)出極大的序列一致性，且mu21.6重鏈與被上述Kabat等定義為亞型1的人重鏈表現(xiàn)出極大的序列一致性。因此，輕鏈和重鏈的人框架區(qū)經(jīng)常來源于這些亞型的人抗體，或來源于這些亞型的一致性序列。優(yōu)選的人輕鏈和重鏈可變區(qū)，即與來自mu MAb21.6相應(yīng)區(qū)表現(xiàn)出最大序列一致性的可變區(qū)分別來自抗體RE1和21/28’CL。
(3)計(jì)算機(jī)模擬小鼠CDR區(qū)與人可變區(qū)框架的非天然并列能導(dǎo)致非天然構(gòu)象的限制，除非通過某些氨基酸殘基置換的修正，它將導(dǎo)致結(jié)合親和力的喪失。部分地通過計(jì)算機(jī)模擬決定氨基酸殘基置換的選擇.能產(chǎn)生免疫球蛋白分子三維圖像的計(jì)算機(jī)硬件和軟件可廣泛得到。一般，從開始分析免疫球蛋白鏈或其域的結(jié)構(gòu)來產(chǎn)生分子模型。比較需模型化的鏈的氨基酸序列與已分析過三維結(jié)構(gòu)的鏈或區(qū)的相似性，選擇表現(xiàn)出最大相似性的鏈或區(qū)作為構(gòu)建分子模型的起始點(diǎn)。例如，對(duì)mu MAb21.6輕鏈來說，框架區(qū)，CDR1和CDR2區(qū)模型的起點(diǎn)為人輕鏈RE1。對(duì)CDR3來說，起點(diǎn)是來自于不同人抗體HyHEL-5的輕鏈的CDR3區(qū)。對(duì)已解決的起始結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使在已模擬的免疫球蛋白鏈或域內(nèi)的氨基酸與那些起始結(jié)構(gòu)內(nèi)的氨基酸不同。然后將修飾過的結(jié)構(gòu)裝配進(jìn)復(fù)合免疫球蛋白。最后，通過能量最小化和使所有的原子彼此之間均在適當(dāng)?shù)木嚯x之內(nèi)，鏈長(zhǎng)和鏈角也均在化學(xué)可接受的限度之內(nèi)對(duì)模型進(jìn)一步精加工。實(shí)施例4更詳細(xì)地討論了對(duì)mu MAb21.6的可變區(qū)產(chǎn)生三維計(jì)算機(jī)模型的步驟，且該模型示于圖5。反過來，該模型可作為預(yù)測(cè)會(huì)有被替換進(jìn)入框架結(jié)構(gòu)內(nèi)的mu MAb21.6互補(bǔ)決定區(qū)的抗體的三維結(jié)構(gòu)。還如其它的氨基酸置換引入討論時(shí)，可構(gòu)建代表結(jié)構(gòu)的另外的模型。
(4)氨基酸殘基的替代如上所指出的，本發(fā)明的人源化抗體含有主要來自人免疫球蛋白的可變框架區(qū)和主要來自稱為mu MAb21.6的小鼠免疫球蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)。已經(jīng)確定了muMAb21.6的互補(bǔ)決定區(qū)和適當(dāng)?shù)娜耸荏w免疫球蛋白，需要決定的下一步，如果有的話，即確定在這些組份中需要替換的殘基，以便所得的人源化抗體具有最佳的性質(zhì)。一般，應(yīng)使鼠源殘基替代人氨基酸殘基最小化，因?yàn)槭笤礆埢囊雽⒃黾涌贵w在人體內(nèi)產(chǎn)生HAMA應(yīng)答的危險(xiǎn)?；谒鼈儗?duì)CDR構(gòu)象和/或?qū)乖慕Y(jié)合的可能的影響來選擇氨基酸的替換。通過模擬、特定位置氨基酸特性的檢驗(yàn)、或特定氨基酸替換或突變效應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)觀察來調(diào)查上述可能的影響。
在mu MAb21.6可變框架區(qū)和相應(yīng)的人可變框架區(qū)之間氨基酸不同時(shí)，如果能合理地預(yù)期此氨基酸(1)直接非共價(jià)結(jié)合抗原(例如，mu MAb 26.1 L49、L69位的氨基酸)，(2)與CDR區(qū)鄰近，是上述Chathia等建議的可選擇定義的CDR區(qū)的一部分，或否則與CDR區(qū)相互作用(如，在CDR區(qū)大約3之內(nèi))(如，mu MAb 21.6的L45、L58、H27、H28、H29、H30和H71位的氨基酸)，或(3)參與VL-VH介面(如，mu MAb 21.6的H44位的氨基酸)，其它的可候選的取代是受體人框架氨基酸，對(duì)人免疫球蛋白來說在該位該氨基酸是不尋常的(如，mu MAb 21.6的L104、L105和L107位的氨基酸)。這些氨基酸可被來自較典型人免疫球蛋白的相應(yīng)位置的氨基酸所取代。可選擇地，當(dāng)它們是人免疫球蛋白等同位置的典型的氨基酸時(shí)小鼠MAb 21.6內(nèi)等同位置的氨基酸可引入人框架區(qū)。
通常，需要將符合上述標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸作全部或大部分取代。然則有時(shí)地，對(duì)特定的氨基酸是否符合上述標(biāo)準(zhǔn)存在一些雙重的看法，且生產(chǎn)出了可選擇的變異體免疫球蛋白，其中一個(gè)具有特定的取代，而另一個(gè)卻沒有。本發(fā)明的人源化抗體通常包含人輕鏈框架的取代，即用至少1、2或3，且常常為4個(gè)如，mu MAb 21.6的相應(yīng)的殘基在下列位置L45、L49、L59和L69進(jìn)行取代，至少含有1、2、3、4或5，且有時(shí)是6個(gè)在下列位置H27、H28、H29、H30、H44和H71進(jìn)行的取代。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)人輕鏈?zhǔn)荏w免疫球蛋白是RE1時(shí)，輕鏈也包含至少1或2，且通常3個(gè)在下列位置L104、L105、和L107進(jìn)行的取代。用來自具有較典型氨基酸殘基的人免疫球蛋白等同位置的氨基酸對(duì)這些位置進(jìn)行取代。圖6和圖7顯示了合適的取代氨基酸。
人源化抗體內(nèi)CDR區(qū)與相應(yīng)的mu MAb 21.6抗體內(nèi)的CDR區(qū)通常基本上一致，且更經(jīng)常地一致。然而有時(shí)地，需要在CDR區(qū)進(jìn)行一個(gè)殘基的改變。例如，實(shí)施例5鑒別了在mu MAb 21.6 CDR3和VCAM-1配體間的氨基酸的相似性。這一結(jié)果提示，將重鏈CDR3區(qū)重新設(shè)計(jì)成與VCAM-1更為接近可提高人源化抗體的結(jié)合親和力。結(jié)果，CDR3區(qū)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被VCAM-1結(jié)合區(qū)內(nèi)的氨基酸所取代。雖然通常不希望進(jìn)行保守氨基酸的取代，有時(shí)在不影響所得人源化免疫球蛋白結(jié)合親和力的情況下，對(duì)CDR殘基也可進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸的取代。
不象上面所討論的特定氨基酸的取代，人源化免疫球蛋白的框架區(qū)與它們從其中衍生的人抗體的框架區(qū)通常是基本一致的，更經(jīng)常是一致的。當(dāng)然，框架區(qū)的許多氨在酸對(duì)抗體的特異性和親合性幾乎不或不產(chǎn)生直接的貢獻(xiàn)。因此，在所得的人源化免疫球蛋白的特異性和親合性不發(fā)生可覺察的變化時(shí)，可進(jìn)行框架區(qū)殘基的許多單個(gè)的保守取代。然而，通常，這樣的取代是不希望的。
(5)可變區(qū)的產(chǎn)生已經(jīng)對(duì)人源化免疫球蛋白CDR和框架區(qū)進(jìn)行了概念性地選擇，可得到生產(chǎn)這樣抗體的各種方法。由于存在密碼的簡(jiǎn)并，許多核酸序列能編碼每種免疫球蛋白氨基酸序列。可通過de novo固相DNA合成法或通過對(duì)所要獲得的多聚核苷酸的早期制備的變異體進(jìn)行PCR誘變?cè)诋a(chǎn)生所要的核酸序列。寡聚核苷酸介導(dǎo)的誘變是優(yōu)選的對(duì)靶多肽DNA進(jìn)行取代、缺失和插入變異體的方法。參見Adelman等，DNA 2183(1983)。簡(jiǎn)言之，通過將編碼所希望突變的寡核苷酸與單鏈DNA模板雜交來改變靶多肽DNA。雜交后，用DNA聚合酶合成完整的該模板的第二互補(bǔ)鏈，其中摻入了寡聚核苷酸引物，且在靶多肽DNA內(nèi)編碼所選擇的變化。
(6)恒定區(qū)的選擇將上面所述產(chǎn)生的可變的人源化抗體片段典型地與至少免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)部分連接起來，典型地與人免疫球蛋白連接起來。從各種人細(xì)胞，但優(yōu)選死亡的B-細(xì)胞中按照熟知的方法分離人恒定區(qū)DNA序列(參見上述的Kabat等，和WO87/02671)(每篇文獻(xiàn)在整體上均引作參考)。通常，抗體含有輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)常常包括CH1、絞鏈、CH2、CH3、和CH4區(qū)。
人源化抗體包括具有各種類型恒定區(qū)的抗體，包括IgM、IgG、IgA、和IgE，和任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。當(dāng)希望人源化抗體表現(xiàn)出細(xì)胞毒性時(shí)，恒定區(qū)常常是互補(bǔ)-固定恒定域，且其類為IgG1。當(dāng)不需要這樣的細(xì)胞毒性時(shí)，恒定域可以是IgG2類。人源化抗體可包含來自不只一類或同型的序列。
(7)表達(dá)系統(tǒng)將編碼人源化輕鏈和重鏈可變區(qū)(該區(qū)選擇地與恒定區(qū)連接)的核酸插入表達(dá)載體?？蓪⒅劓溁蜉p鏈克隆到相同或不同的表達(dá)載體上。編碼免疫球蛋白鏈的DNA片段與表達(dá)載體的控制序列連接，以保證免疫球蛋白的表達(dá)。所述的控制序列包括信號(hào)序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達(dá)載體在宿主生物體內(nèi)作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分典型地進(jìn)行復(fù)制。常規(guī)地，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記，如四環(huán)素或新霉素以便檢測(cè)用所需DNA序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(參見，如U.S.Patent 4,704,362.)。
大腸桿菌是很有用的用于克隆本發(fā)明多聚核苷酸的一種原核宿主。可用的其它合適的微生物宿主包括桿菌，如枯草桿菌，和其它腸細(xì)菌，如沙門氏菌、Serratia，和各種Pseudomonas species。在這些原核宿主內(nèi)，可構(gòu)建表達(dá)載體，該表達(dá)載體典型地含有與宿主細(xì)胞相容的表達(dá)控制序列(如，復(fù)制的起點(diǎn))。另外，可使用任何數(shù)目的各種各樣熟知的啟動(dòng)子，如乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、β-乳糖酶啟動(dòng)子系統(tǒng)、或來自噬菌體人的啟動(dòng)子系統(tǒng)。啟動(dòng)子典型地控制表達(dá)，選擇性地用操縱子序列，且具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列及其它，以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和完成。
其它微生物，如酵母菌也可用于表達(dá)。Saccharomyces是優(yōu)選的宿主，它具有適當(dāng)?shù)妮d體，該載體具有表達(dá)控制序列，如啟動(dòng)子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其它甘油酵解酶、和復(fù)制的起點(diǎn)、終止序列及其它所需要的。
除了微生物外，哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達(dá)并生產(chǎn)本發(fā)明的多肽(參見Winnacker，F(xiàn)rom Gene to Glones(VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987)。實(shí)際上優(yōu)選真核細(xì)胞，因?yàn)樵诒绢I(lǐng)域中許多適當(dāng)?shù)哪芊置谕暾拿庖咔虻鞍椎乃拗骷?xì)胞系已培育出來，包括CHO細(xì)胞系、各種Cos細(xì)胞系、Hela細(xì)胞，優(yōu)選骨髓瘤細(xì)胞系，或轉(zhuǎn)化的B-細(xì)胞或雜交瘤。這些細(xì)胞的表達(dá)載體包含表達(dá)控制序列，如復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子(Queen等，Immol.Rev.8949～68(1986))，和必要的加工信號(hào)位點(diǎn)，如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA斷裂位點(diǎn)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止子序列。優(yōu)選的表達(dá)控制序列是源于免疫球蛋白基因，SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、細(xì)胞肥大病毒及其它的啟動(dòng)子。
用已知的方法，根據(jù)細(xì)胞宿主的類型，將含有目標(biāo)多聚核苷酸序列(如，重鏈和輕鏈編碼序列和表在控制序列)的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染法常用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用于其它細(xì)胞宿主。(參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manul(Cold Spring Harbor Press，2nd.ed.1989)(在整體引作參考)。當(dāng)重鏈和輕鏈分別克隆在獨(dú)自的表達(dá)載體上時(shí)，使載體共轉(zhuǎn)染以表達(dá)和裝配完整的免疫球蛋白。
一旦表達(dá)了可根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，包括硫酸銨沉淀、親和層析柱、色譜層析柱、凝膠電泳及其他方法(參見Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，N.Y.，1982)，對(duì)本發(fā)明的所有抗體、它們的二聚體、單個(gè)的輕鏈和重鏈或其他形式的免疫球蛋白進(jìn)行純化，在藥物學(xué)上使用優(yōu)選具有至少大約90％～95％一致性的基本純的免疫球蛋白，更優(yōu)選98～99％或更高一致性的免疫球蛋白。
C.人源化抗體片斷在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了人源化抗體的片段。典型的，這些片段表現(xiàn)出VLA-4抗原特異結(jié)合，其親和力為至少107M-1和更典型的108或109M-1。人源化抗體片斷包括單獨(dú)的重鏈、輕鏈Fab、Fab′F(ab′)2，F(xiàn)abc，和Fv。通過重組DNA技術(shù)，或通過對(duì)完整免疫球蛋白的酶學(xué)或化學(xué)分離，產(chǎn)生片斷。II.核酸通常通過核酸的表達(dá)來產(chǎn)生人源化抗體雜交片段。在本申請(qǐng)中描述的編碼人源化抗體或其片段的所有的核酸均包括在本發(fā)明之內(nèi)。III.計(jì)算機(jī)本發(fā)明的另一方面，提供了在監(jiān)示器上顯示抗體三維圖像的編程計(jì)算機(jī)。例如，在UNIX操作系統(tǒng)下運(yùn)行的使用分子模擬包QUANTA(Polygen Corp.USA)的Silicon Graphics IRIS 4D工作站Silicon是合適的。計(jì)算機(jī)有利于人源化抗體變異體的目測(cè)模型。通常，本發(fā)明的抗體已提供了滿意的結(jié)合親和性。然而，通過某些氨基酸殘基進(jìn)一步的變化鑒定出結(jié)合親和力更強(qiáng)的抗體是可能的。三維圖象也可鑒定許多非臨界(noncritical)氨基酸，這些氨基酸在不影響抗體結(jié)合親和力時(shí)，成為保守取代的對(duì)象?？傊词故潜Ｊ厝〈部蓪?duì)免疫球蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生重大影響，然而，許多個(gè)別保守取代可能不嚴(yán)重?fù)p害免疫球蛋白的性質(zhì)。IV.人源化抗體測(cè)試通過各種分析對(duì)本發(fā)明的人源化抗體進(jìn)行測(cè)試。這些分析包括用來檢測(cè)與具有VLA-受體的細(xì)胞結(jié)合的抗體其存在或力度的簡(jiǎn)單結(jié)合分析。也測(cè)試了抗體阻斷具有VLA-4受體的細(xì)胞與表達(dá)VCAM-1配體的內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的能力。內(nèi)皮細(xì)胞可于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)和刺激，或可能是天然發(fā)生的腦組織切片的成份。參見上述的Yednock等和USSN 07/871,223。也測(cè)試了人源化抗體對(duì)防止或減少具有試驗(yàn)性自動(dòng)免疫腦脊髓炎(EAE)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物炎癥的能力。用對(duì)髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)特異的CD4+T-細(xì)胞注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，或通過髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)對(duì)動(dòng)物直接免疫來誘導(dǎo)EAE。髓鞘質(zhì)堿性蛋白質(zhì)定位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以在多樣性硬化癥中刺激免疫應(yīng)答的方式T-細(xì)胞啟動(dòng)含有該蛋白質(zhì)的鞘的破壞。參見Yednock等，和共申請(qǐng)的待審申請(qǐng)USSN 07/871,223。V.藥物學(xué)組合物本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療處理的藥物學(xué)組合物，其含有活性治療試劑，即人源21.6抗體或其結(jié)合片段，和各種其它組份。優(yōu)選的形式依賴于給藥和治療應(yīng)用的方式。組合物也可包括，依據(jù)所希望的制劑，藥物學(xué)上可接受的、無毒性的載體或稀釋劑，它們被定義為通常用來形成給動(dòng)物或人給藥的藥物組合物的載體。選擇稀釋劑以便使其不影響組合的生物活性，這樣的稀釋劑的例子有蒸餾水、生理學(xué)磷酸-緩沖鹽水，Riger溶液、蔗糖溶液、和Hank溶液。另外，藥物組合物或制劑也可包含其它載體，佐劑、或無毒性、作治療、無免疫源性的穩(wěn)定劑和其相似物。VI.診斷方法用人源化抗體及其結(jié)合片段來檢測(cè)具VLA-4受體的細(xì)胞的存在。這種細(xì)胞在腦中的存在是診斷炎癥反應(yīng)并且是需要用下面討論的方法開始治療的信號(hào)?？赏ㄟ^從患者身上取下細(xì)胞樣本來完成診斷。然后確定樣本每個(gè)細(xì)胞表達(dá)VLA-4抗原的數(shù)量。例如通過固定化細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色，或通過用人源化MAb 21.6抗體或其結(jié)合片段，對(duì)細(xì)胞抽提物進(jìn)行Western印跡。
診斷也可通過在活體內(nèi)給藥標(biāo)記的人源化MAb 21.6(或結(jié)合片段)和通過活體影像檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)。人源化MAb 21.6的給藥濃度應(yīng)是以使具有靶抗原的細(xì)胞的結(jié)合與背景信號(hào)相比是可檢測(cè)的。診斷試劑可用放射性同位素標(biāo)記來照像成像或用順磁同位素來磁性共振或電子自旋共振成像。
來自于個(gè)體的細(xì)胞樣品內(nèi)的VLA-4蛋白質(zhì)水平的變化(典型的增加)，該變化在臨床學(xué)建立的正常水平的范圍之外，只是在個(gè)體中存在不希望的炎癥反應(yīng)(樣品是從該個(gè)體得到的)，和/或只是該個(gè)體形成(或加劇)這樣的反應(yīng)。VLA-4蛋白質(zhì)也可用作分化的標(biāo)記已鑒定和分類某些譜系和發(fā)音起點(diǎn)的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞型特異的檢測(cè)可用于不希望的免疫應(yīng)答的組織病理學(xué)診斷。VII.治療方法本發(fā)明也提供了用人源化MAb 21.6來阻斷α4-依賴的VLA-4受體的相互反應(yīng)的能力和治療方法。VLA-4受體與VCAM-1配體的α4-依賴的相互作用對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是許多炎癥反應(yīng)早期事件，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的那些。由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥導(dǎo)致的不希望的疾病和情形包括急性急病，如窒息和中樞創(chuàng)傷，和慢性急病，如多樣性硬化癥、腦膜炎和腦炎。多樣性硬化癥是進(jìn)行性的神經(jīng)學(xué)自動(dòng)免疫疾病，它在美國(guó)影響了大約250000到350000的人。認(rèn)為多樣性硬化癥是特異性自動(dòng)免疫反應(yīng)的結(jié)果，在該反應(yīng)中，某些白細(xì)胞攻擊并引起髓鞘質(zhì)(覆蓋神經(jīng)纖維的絕緣鞘)的破壞。在多樣性硬化癥的動(dòng)物模型中，針對(duì)α-4-β-1整合蛋白的鼠源單克隆抗體已顯示對(duì)白細(xì)胞和內(nèi)皮的粘附的阻斷，并且因此防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)炎和隨后的動(dòng)物麻痹。
本發(fā)明的人源化MAb 21.6抗體比小鼠抗體有幾個(gè)優(yōu)越性，已在動(dòng)物模型中有效地表現(xiàn)了出來1)人的免疫系統(tǒng)不應(yīng)將人源化抗體的框架或恒定區(qū)識(shí)別為異源，因此抗這樣注射抗體的抗體應(yīng)答應(yīng)比抗全部是異源的小鼠抗體或部分異源的嵌和抗體的抗體應(yīng)答要少。
2)因?yàn)槿嗽椿贵w的效應(yīng)器是人，它可以和人免疫系統(tǒng)的其他部分更好地相互作用。
3)已經(jīng)報(bào)道注射的小鼠抗體在人體循環(huán)中的半衰期比正常人抗體的半衰期要短得多(Shaw et al.，J.Immunol，1384534-4538(1987))。注射的人源化抗體具有與天然生成的人抗體基本相當(dāng)?shù)陌胨テ冢梢允菇o藥次數(shù)較少、給藥的劑量較小。
上面所討論的藥物組合物可用于預(yù)防或/和治療處理多樣性硬化癥或其他炎癥紊亂的給藥，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的那些。在治療應(yīng)用中對(duì)懷疑的病人或已經(jīng)患有如多樣性硬化病的疾病的病人給藥的量應(yīng)是以治愈，或至少部分消除該疾病的癥狀或其并發(fā)癥。完成上述任務(wù)的適當(dāng)劑量被定義為治療-或藥物學(xué)-有效劑量。
在預(yù)防應(yīng)用中對(duì)易于，或有危險(xiǎn)患某種病的病人給藥的量應(yīng)足以消除或減少該危險(xiǎn)或推遲該疾病的發(fā)生。這樣的劑量被定義為預(yù)防性有效劑量。有多樣性硬化癥的病人在其緩解期可通過NMR成像來估計(jì)危險(xiǎn)，在一些情況下，通過觀察病人的前期癥狀來估計(jì)危險(xiǎn)。
可通過腸胃外、局部、靜脈內(nèi)、口服或皮下、肌肉內(nèi)局部給藥如通過氣霧劑或經(jīng)皮，為進(jìn)行預(yù)防性和/或治療性處理而給藥藥物組合物。根據(jù)給藥的方法，藥物組合物可以不同的單位劑量形式給藥。例如適合于了口服給藥的單位劑量形式包括粉劑、片劑、丸劑、膠囊和錠劑。
本發(fā)明組合物的有效劑量在上面所述的條件下進(jìn)行，將依據(jù)許多不同的因素，包括給藥的方式、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)和所給的其他藥物而異。因此，需要時(shí)處理劑量進(jìn)行效價(jià)測(cè)定以獲得最大的安全性和有效性。這些組合物可以以與其他治療劑相似的方式，即以生理學(xué)可以接受的載體，對(duì)哺乳動(dòng)物獸醫(yī)用給藥和人類的臨床用給藥。通常，給藥劑量的范圍從大約0.0001mg到100mg/kg，更經(jīng)常為0.01到0.5mg/kg的宿主體重。
VIII.其他用途人源化抗體也可用于VLA-4受體的純化。將抗體固定到固體支持物上，將分散有蛋白質(zhì)的溶液通過該支持物。VLA-4結(jié)合到支持物上，從而與其它蛋白質(zhì)分離開。用該方法可制得的純化的VLA-4或其片段可用作疫苗或用作用于進(jìn)一步產(chǎn)生抗體的免疫原。
本發(fā)明的人源化抗體也可通過，例如，用人源化抗體免疫動(dòng)物來產(chǎn)生異型抗體。選擇出異型抗體，該抗體被VLA-4或其片段抑制同人抗體的結(jié)合。因?yàn)榭巩愋涂贵w和VLA-4或其片段兩者都能與人源化免疫球蛋白結(jié)合，抗異型抗體可代表表位的“內(nèi)部影像”，因此可替代VLA-4受體的配體，即VCAM-1。
實(shí)施例實(shí)施例1小鼠21.6可變區(qū)的克隆和測(cè)序小鼠抗-VLA抗體21.6已在其有待審申請(qǐng)USSN 07/871,223中描述過。從產(chǎn)生小鼠21.6抗體的雜交瘤細(xì)胞中分離總RNA。用試劑盒(Pharmacia BiosystemsLimited)合成cDNA的第一條鏈。用設(shè)計(jì)的PCR引物，該引物設(shè)計(jì)用來與側(cè)翼序列和編碼可變區(qū)序列以外的序列雜交，因此小鼠可克隆21.6抗體可變區(qū)的整個(gè)編碼區(qū)，來獲得重鏈和輕鏈可變區(qū)。有義的PCR引物可與小鼠κ輕鏈引導(dǎo)序列的5′-端和小鼠重鏈引導(dǎo)序列的5′-端雜交，所述的引物是基于42個(gè)小鼠κ輕鏈引導(dǎo)序列和55個(gè)小鼠重鏈引導(dǎo)序列的數(shù)據(jù)而設(shè)計(jì)的(Jones & Bendig，Bio/Technology988～89)((1991))。(該文獻(xiàn)在整體上引作參考)。這些引物用于連接反義PCR引物，該引物可與小鼠恒定區(qū)的3′-端雜交(κ或γ)。
在典型地含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、200μM dNTPs、1.5mM MgCl2，1個(gè)單位的AmpliTaq(Perkin Elmer Cetus)DNA聚合酶、1μl cDNA模板、0.25μM MKV引物和0.25μM小鼠κ輕鏈反義PCR引物(圖1)的50μl的反應(yīng)液中進(jìn)行小鼠21.6VH區(qū)的PCR擴(kuò)增(圖2)。每個(gè)PCR反應(yīng)在94℃起始融化5分鐘后，94℃ 1分鐘，55℃ 1小時(shí)、和72℃ 2分鐘，循環(huán)25圈。完成最后一圈的循環(huán)后于72℃進(jìn)行10分鐘的最后延伸。在引物退火和延伸步驟之間的斜線時(shí)間是2.5分鐘。PCR擴(kuò)增后，從每個(gè)反應(yīng)中取10μl的等分在溴化乙錠染色的瓊脂糖膠上進(jìn)行分析。
用“TA Cloning System”(Invitrogen Corporation)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。含有正確大小插入片段的載體用雙鏈質(zhì)粒DNA和測(cè)序酶(United States BiochemicalCorporation)進(jìn)行測(cè)序。為避免在PCR擴(kuò)增中引入任何錯(cuò)誤，至少用兩個(gè)獨(dú)立的PCR擴(kuò)增的和克隆的DNA片段進(jìn)行每個(gè)可變區(qū)的測(cè)序。
將PCR產(chǎn)物的序列與其他小鼠輕鏈和重鏈可變區(qū)進(jìn)行比較(參見表1和表2)。該比較提示來源于MKV和MKV引物的PCR產(chǎn)物代表可靠的小鼠21.6可變區(qū)，和來自于MHV1和MHV2引入的那些代表可靠的小鼠VH區(qū)，并且得出結(jié)論是這些產(chǎn)物的序列就是小鼠21.6抗體可變區(qū)的那些序列。編碼小鼠21.6VL和VH區(qū)的cDNA的DNA和氨基酸系列示于圖1和圖2。
表1小鼠21.6輕鏈可變區(qū)與其它輕鏈可變區(qū)的比較小鼠21.6VL相似百分?jǐn)?shù)一致百分?jǐn)?shù)比較小鼠κVL亞組5的 84.0 72.6一致性序列2人κVL亞組1的一致84.0 69.8性序列2人κVL亞組2的一致65.1 52.8性序列2人κVL亞組3的一致72.6 57.5性序列2人KVL亞組4的一致 72.6 58.5性序列2來自人REI的序列3(人 81.0 72.4VL亞組1的成員)1用University of Wisconsin Genetics Computer Group的“GAP”程序確定的相似百分?jǐn)?shù)。
2來自前面所述的Kabat等的一致性序列。
3通過Palm et al.，Hoppe-Seyler’s Z.Physiol.Chem.356167-191(1975)測(cè)序的REI。
表2小鼠21.6重鏈可變區(qū)與其它重鏈可變區(qū)的比較小鼠21.6VH的比較相似百分?jǐn)?shù)一致百分?jǐn)?shù)小鼠VH亞組2C的一致 94.3 91.1性序列2人VH亞組1的一致性序 78.0 65.0列2人VH亞組2的一致性序 70.5 53.3列2人VH亞組3的一致性序 67.5 52.8列2來自人21/281CL的VH76.5 64.7序列3(人VH亞組1的成員)1用University of Wisconsin Genetics Computer Group的“GAP”程序確定的相似百分?jǐn)?shù)。
2來自前面所述的Kabat等的一致性序列。
3通過Dersimonian et al..J.Immunol.1392496-2501(1987).
實(shí)施例2嵌合的21.6抗體的構(gòu)建通過將小鼠21.6VL和VH區(qū)的與人恒定工的PCR克隆的cDNA連接起來來構(gòu)建嵌合型輕鏈和重鏈。用特定設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)小鼠cDNA序列的5′-和3′-端進(jìn)行修飾。設(shè)計(jì)與編碼引導(dǎo)序列的開始部分的DNA雜交的5′-端PCR引物(表3)，來產(chǎn)生進(jìn)行有效翻譯的必要的DNA序列(kozak，J.Mol.Biol.196947-950(1987))，和用來產(chǎn)生將其克隆到表達(dá)載體內(nèi)的HindIII限制性位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物的3′-端(表3)，該引物可與編碼J區(qū)的DNA序列進(jìn)行雜交，來產(chǎn)生與恒定區(qū)進(jìn)行連接的必要的DNA序列，和用來產(chǎn)生將其克隆到表達(dá)載體內(nèi)的BamHI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用HindIII和BamHI進(jìn)行消化，將其克隆到pUC19載體，并進(jìn)行測(cè)序以確定在PCR擴(kuò)增過程中沒有錯(cuò)誤發(fā)生。將適宜的小鼠21.6可變區(qū)亞克隆到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體內(nèi)，該載體或者含有人κ或者含有γ-1恒定區(qū)(圖3)。
表3構(gòu)建嵌合性21.6抗體的PCR引物A.輕鏈可變區(qū)1.用來構(gòu)建5’-端的引物(37聚體)(SEQ.ID NO18)5′C AGAAAG CTTGCC GCC ACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG 3′HindIII Kozak M R P S I Q一致性序列2.用來構(gòu)建3’-端的引物(35聚體)(SEQ.ID NO19)5′CC GAG GAT CCACTC ACG TTT GAT TTC CAG CTT GGT 3′BamHI 接合供體位點(diǎn)B.重鏈可變區(qū)1.用來構(gòu)建5′-端的引物(37聚體)(SEQ.ID NO20)5′C AGAAAG CTTGCC GCC ACC ATG AAA TGC AGC TGG GTC 3′HindIII Kozak M K C S W V一致性序列2，用來構(gòu)建3’-端的引物(33聚體)(SEQ.ID NO21)5′CC GAG GAT CCACTC ACC TGA GGA GAC GGT GAC T 3′BamHI 接合供體位點(diǎn)實(shí)施例321.6嵌合型抗體的表達(dá)和分析將編碼嵌合的21.6抗體輕鏈和重鏈的兩個(gè)質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染到Cos細(xì)胞。2或3周后，用ELISA對(duì)來自Cos細(xì)胞的介質(zhì)進(jìn)行分析，(1)分析人IgG-樣抗體的產(chǎn)生和(2)分析這個(gè)人-樣抗體與L細(xì)胞相結(jié)合的能力，所述的L細(xì)胞在其表面表達(dá)人α4β1整合蛋白。圖4和圖12顯示了未純化的和蛋白A純化的嵌合的21.6抗體樣品對(duì)人α4β1整合蛋白的結(jié)合的分析結(jié)果，該結(jié)果與純化的小鼠21.6抗體對(duì)照做了比較。這些圖表明嵌合的21.6抗體與抗原結(jié)合得很好，并確切地表明正確的小鼠21.6VL和VH區(qū)已經(jīng)被克隆了。
實(shí)施例4小鼠21.6可變區(qū)結(jié)構(gòu)的模擬小鼠21.6抗體的VL和VH區(qū)的分子模型被建立了。該模型是在運(yùn)行UNIX操作系統(tǒng)，使用分子模擬包QUANTA的Silicon Graphics IRIS 4D工作站建立的(Polygen Corp.，USA)。小鼠21.6VL區(qū)的FRs的結(jié)構(gòu)基于已分析過的人Bence-Jones免疫球蛋白R(shí)EI的結(jié)構(gòu)(Epp等，B徼144943-4952(1975)。
小鼠21.6VH區(qū)的FRs的結(jié)構(gòu)基于已分析過的小鼠抗體Gloop 2的結(jié)構(gòu)。保留下相同的殘基，不相同的殘基在QUANTA內(nèi)用易化措施進(jìn)行替代。小鼠21.6VL區(qū)的CDR1和CDR2被鑒定為分別屬于經(jīng)典(canonical)結(jié)構(gòu)組1和組2.(Chothiat等，如前所述)。既然REI的CDR1和CDR2屬于相同的經(jīng)典組，在REI的CDR1和CDR2的結(jié)構(gòu)上構(gòu)建小鼠21.6VL的CDR1和CDR2模型。小鼠的21.6VL區(qū)的CDR3看來不與VL區(qū)的CDR3的任何經(jīng)典結(jié)構(gòu)組相對(duì)應(yīng)。然而對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索提示，小鼠21.6VL區(qū)的CDR3與小鼠HyHEL-5VL區(qū)的CDR3相似(Sheriff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 840 8075-8079(1987)))。因此，小鼠21.6VL區(qū)的CDR3的模型在小鼠HyHEL-5VL區(qū)的CDR3結(jié)構(gòu)上構(gòu)建。小鼠21.6VH區(qū)的CDR1和CDR2被鑒定為分別屬于經(jīng)典結(jié)構(gòu)組1和組2。小鼠21.6VH區(qū)的CDR1模型在Gloop2 VH區(qū)的CDR1上建立，Gloop2VH區(qū)與VH區(qū)的CDR1的經(jīng)典組1的成員非常相似.小鼠21.6VH區(qū)的CDR2模型在小鼠HyHEL-5的CDR2上建立(Sheriff等)，小鼠HyHEL-5的CDR2也是VH區(qū)CDR2的經(jīng)典2組的成員。對(duì)VH區(qū)的CDR3來說，沒有經(jīng)典結(jié)構(gòu)。然而，小鼠21.6VH區(qū)的CDR3與小鼠R19.9VH區(qū)的CDR3相似(Lascombe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86607～611(1989))，其模型通過在這個(gè)CDR3上去掉在小鼠R19.9VH區(qū)的CDR3環(huán)頂端的額外的絲氨酸殘基，并通過退火和精加工該缺口而建立。為減小不利的原子接觸，并使范德華力和靜電相互作用達(dá)最佳狀態(tài)，用在QUANTA內(nèi)實(shí)施的CHARMM潛能(Brooks等，J.Comp.Chem.4187～217(1983)使模型最后形成最后世代并使成分連接能量最小化。
小鼠21.6可變區(qū)的結(jié)構(gòu)模型示于圖5。該模型用于幫助精加工人源化21.6抗體可變區(qū)的設(shè)計(jì)。
實(shí)施例5改型的人21.6可變區(qū)的設(shè)計(jì)(1)框架序列的同源性人抗體的選擇表現(xiàn)出與小鼠21.6的可變區(qū)具有很高一致性百分?jǐn)?shù)的人可變區(qū)，通過氨基酸序列的比較已被鑒定出來。表4和表5將小鼠21.6可變區(qū)與所有已知的小鼠可變區(qū)，與所有已知的人可變區(qū)做了比較。小鼠21.6VL區(qū)被鑒定為屬于被上述Kabat等所定義的小鼠κVL區(qū)。個(gè)別小鼠κVL區(qū)具有與小鼠21.6κVL區(qū)。具有93.4％的一致性(38C13V′CL和PC613′CL)。小鼠21.6VL區(qū)與如前面Kabat等所定義的亞組1的人κVL區(qū)最相似。個(gè)別人κVL區(qū)被鑒定出具有與小鼠21.6κVL區(qū)72.4％的一致性。來自一個(gè)最相似的人可變區(qū)，REI，的框架(FRs)被用于改型人21.6VL區(qū)的設(shè)計(jì)。小鼠21.6VH區(qū)被鑒定為屬于前面Kabat等所定義的小鼠VH區(qū)亞組2c。個(gè)別小鼠重鏈可變區(qū)被鑒定為具有與小鼠21.6VH區(qū)93.3％的一致性(17.2.25′CL和87.92.6′CL)。小鼠21.6VH區(qū)與如前面Kabat等所定義的亞組1的人VH區(qū)最相似。個(gè)別人VH區(qū)被鑒定為與小鼠21.6VH區(qū)具有64.7％的一致性。來自一個(gè)最相似的人可變區(qū)，21/28′CL的FRs被用于改型人21.6VH區(qū)的設(shè)計(jì)。
(2)框架的內(nèi)氨基酸殘基的取代(a)輕鏈對(duì)改型人21.6VL區(qū)的設(shè)計(jì)程序的下一步就是將來自小鼠21.6VL區(qū)的CDRs同來自人REI的FRs連接起來。(如前所述，Palm等)。在第一形式的改型人21.6VL區(qū)(La)中，在人FRs中發(fā)生了幾個(gè)變化(表4，圖6)。
在FR4的104位，105位、和107位，來自REI的氨基酸被來自另一個(gè)人κ輕鏈的更典型的人J區(qū)氨基酸所取代(Riechmann等，Nature 332323～327)((1988))。
在FR2的45位，在REI內(nèi)存在的正常的賴氨酸被變成在小鼠21.6VL區(qū)發(fā)現(xiàn)的組氨酸。認(rèn)為在這個(gè)位置的氨基酸殘基在支持小鼠21.6VL區(qū)的CDR2環(huán)中是重要的。
在FR2的49位，在REI內(nèi)存在的正常的酪氨基被變成在小鼠21.6VL區(qū)的該位發(fā)現(xiàn)的組氨基。小鼠21.6VL區(qū)的該位的組氨酸在模型中被觀察到位于結(jié)合位點(diǎn)的中部，且可能在抗體—抗原結(jié)合過程中與抗原發(fā)生直接接觸。
在FR3的58位，在REI內(nèi)存在的正常的纈氨酸被變成在小鼠21.6VL區(qū)的該位發(fā)現(xiàn)的異亮氨酸。認(rèn)為該位的氨基酸殘基在支持小鼠21.6VL區(qū)的CDR2環(huán)中是重要的。
在FR3的69位，在REI內(nèi)存在的正常的蘇氨酸被變成在小鼠21.6VL區(qū)的該位發(fā)現(xiàn)精氨酸。小鼠21.6VL區(qū)的該位的精氨酸在模型中被觀察到定位于接近CDR1環(huán)，且可能在抗體—抗原結(jié)合過程中與抗原發(fā)生直接接觸。
改型人21.6VL區(qū)的第二種形式(稱為L(zhǎng)b)被設(shè)計(jì)成除在REI的RR2的49位不發(fā)生變化外，含有與上述相同的替代。(圖6)。
(b)重鏈對(duì)改型人21.6VH區(qū)的設(shè)計(jì)的下一步就是將來自小鼠21.6VH區(qū)的CDRs與來自21/28′CL的FRs連接起來(Dersimonian等，J.Immunol.1392496～2501(1987))。在第一形式的改型的人21.6V區(qū)(Ha)中，在人框架區(qū)進(jìn)行了5個(gè)改變(表5，圖7).在人FRs內(nèi)的這5個(gè)變化是在27位、28位、29位、30位和71位。
在FR1的27位、28位、29位和30位，在人21/28′CL在的氨基酸被變成在小鼠21.6VH區(qū)的這些位置發(fā)現(xiàn)的氨基酸。雖然這些位置被指定為位于FR1(如前面所述，Kabat等)，26位至30位是結(jié)構(gòu)環(huán)部分，形成了VH區(qū)的CDR1環(huán)。因此，這些位置的氨基酸可能直接參與了與抗原的結(jié)合。實(shí)際上，37至30位的氨基酸是如上述Chothia等所定義的VH區(qū)的CDR1的經(jīng)典結(jié)構(gòu)部分。
在FR3的71位，存于在人21/28′CL內(nèi)的精氨酸被變成在小鼠21.6VH區(qū)的該位發(fā)現(xiàn)的丙氨酸。71位是如上述Chathia等所定義的VH區(qū)CDR2的經(jīng)典結(jié)構(gòu)部分。在小鼠21.6可變區(qū)的模型中，看來71位的丙氨酸是支持VH區(qū)CDR2環(huán)的重要位置。在該位的精氨酸替換成丙氨酸很可能破壞CDR2環(huán)的安置。
含有上面所述的Ha形的5個(gè)變化的改型的人21.6VH區(qū)的第二種形式(Hb)，在FR2中還增加了一個(gè)另外的變化。
在FR2的44位，在人21/28′CL內(nèi)存在的精氨酸被變成在小鼠21.6VH區(qū)的該位發(fā)現(xiàn)的甘氨酸?；谝压_的VL-VL區(qū)的折疊(Packing)信息和基于小鼠21.6可變區(qū)模型，認(rèn)為在44位的氨基酸殘基在VL-VL的折疊中是很重要的(如上所述，Chothia等)。(圖5)。
將改型人21.6V.區(qū)的HC形設(shè)計(jì)成使CDR3看起來與人VCAM-1更相似。小鼠21.6抗體和人VCAM-1均能與α4β1整合蛋白質(zhì)結(jié)合?？贵w的VH區(qū)的CDR3環(huán)是6個(gè)CDR環(huán)中最具多樣性的，且一般來講是抗體—抗原相互作用中抗體的最重要的成份(Chothia等，如前所述；Hoogenboom & Winter，J.Mol.Biol.227381～388(1992)；Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894457～4461(1992))。在小鼠21.6VH區(qū)的CDR3和人VCAM-1的86～94位氨基酸之間，特別是在CDR3環(huán)內(nèi)的YGN(酪氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列和VCAM-1內(nèi)的FGN(苯丙氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)序列之間進(jìn)行了一些序列相似性的鑒定。認(rèn)為這些序列與在各種細(xì)胞粘附事件中的重要的RGD(精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸)序列有關(guān)(Main等，Cell71671～678(1992))。因此，在CDR3的98位，在小鼠21.6VH區(qū)存在的酪氨酸被變成在人VCAM-1的序列中發(fā)現(xiàn)的苯丙氨酸。
也考慮了在FR2的36位的可能的取代。在小鼠的21.6VH鏈中，在FR2的36位含有不常見的半胱氨酸殘基。在有關(guān)的小鼠和人序列中，F(xiàn)R2中該位置通常是色氨酸。雖然半胱氨酸殘基在抗體的構(gòu)象中經(jīng)常是重要的，小鼠的21.6可變區(qū)模型并未提示該半胱氨酸殘基直接或間接地參與了抗原的結(jié)合，因此，存在于人21/28′CL VH區(qū)的RF2內(nèi)的色氨酸在三種形式的人源化21.6抗體中被保留下來而未做取代。
實(shí)施例6改型人21.6抗體的構(gòu)建改型人21.6VL區(qū)的第一形式(resh 21.6V La)基本上是按Daugherty等在NucleicAcids Res.192471～2476(1991)所述的以重疊PCR片段來構(gòu)建的。(參見圖8)。將按實(shí)施例2改造的并插入pUC19中的小鼠21.6VL區(qū)用作模板。合成了4對(duì)引物，APCR1-v1a1，v1a2-v1a3，v1a4-v1a5和v1a6-v1a7。(表6和圖8)。鄰接對(duì)的引物至少重疊21個(gè)堿基。APCR1引物與pUC19載體互補(bǔ)。在含有10mMTris-Hcl(pH8.3)，50mM Kcl，200μM dNTPs和1.5mM MgCl2的50μl的PCR緩沖液中，將適當(dāng)?shù)囊飳?duì)(0.2μM)與10ng的模板DNA、1單位的AmpliTaqDNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)混合。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行25次循環(huán)。在94℃起始融化后5分鐘后，在94℃1分鐘，55℃1分鐘，和72℃2分鐘，且最后在72℃進(jìn)一步溫育10分鐘。在引物退火和延伸步驟之間的斜線時(shí)間為2.5分鐘。用苯酚抽提和乙醇沉淀從第一輪中的四個(gè)反應(yīng)(A、B、C和D)所得的產(chǎn)物。
表6為構(gòu)建改型人21.6可變區(qū)的PCR引物A.輕鏈可變區(qū)1.合成“a”形的引物21.6VLa1(39聚體)(SEQ.ID NO22)5′GAT GGT GAC TCT ATC TCC TAC AGA TGC AGA CAG TGA GGA 3′21.6 VLa2(32聚體)(SEQ.ID NO23)5′CTG TAG GAG ATA GAG TCA CCA TCA CTT GCA AG 3′21.6VLa3(39聚體)(SEQ.ID NO24)5′AGG AGC TTT TCC AGG TGT CTG TTG GTA CCA AGC CAT ATA 3′21.6VLa4(41聚體)(SEQ.ID NO25)5′ACC AAC AGA CAC CTG GAA AAG CTC CTA GGC TGC TCA TAC AT3′
21.6VLa5(40聚體)(SEQ.ID NO26)5′GCA GGC TGC TGA TGG TGA AAG TAT AAT CTC TCC CAG ACC C 3′21.6VLa6(42聚體)(SEQ.ID NO27)5′ACT TTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT3′21.6VLa7(59聚體)(SEQ.ID NO28)5′CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTG GTG CCT TGACCG AAC GTC CAC AGA TT 3’2.合成“b”形的引物21.6VLb1(33聚體(SEQ.ID NO29))(將H-49變成Y-495′GGA AAA GCT CCT AGG CTG CTC ATA TAT TAC ACA 3′21.6VLb2(38聚體)(SEQ.ID NO30)ACC-101變成ACA-101來破壞StyI位點(diǎn)5′CCG AGG ATC CAC TCA CGT TTG ATT TCC ACC TTT GTG CC 3′B.重鏈可變區(qū)1.合成“a”形的引物21.6VHal(51聚體)(SEQ.ID NO31)5′AAC CCA GTG TAT ATA GGT GTC TTT AAT GTT GAA ACC GCT AGCTTT ACA GCT21.6VHa2(67聚體)(SEQ.ID NO32)5′AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT GGC CAAAGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT G 3′21.6VHa3(26聚體)(SEQ.ID NO33)5′GAC CCG GCC CTG GAA CTT CGG GTC AT 3′21.6VHa4(66聚體)(SEQ.ID NO34)5′GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC ACCTCT GCC AGC ACC GCC TAC ATG GAA 3′
21.6VHa5(64聚體)(SEQ.ID NO35)5′CCA TAG CAT AGA CCC CGT AGT TAC CAT AAT ATC CCT CTC TGGCGC AGT AGT AGA CTG CAG TGT C 3′21.6Vha6(63聚體)(SEQ.ID NO36)5′GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGAACC CTT GTC ACC GTC TCC TCA 3′2.合成“b”形的引物21.6VH了(37聚體)(SEQ.ID NO37)從R-44變成G-445’CCA GGG CCG GGT CAC CAT CAC CAG AGA CAC CTC TGC C 3’3.合成“c”形的引物21.6VHc(27聚體)(SEQ.ID NO38)從Y98變成F-985′CAG GCC CCT GGC CAA GGG CTG GAG TGG 3′C.輕鏈和重鏈可變區(qū)與pUC19載體DNA的側(cè)翼雜交的引物APCR1(17聚體(SEQ.ID NO39)，有意引物)5′TAC GCA AAC CGC CTC TC 3′APCR4(18聚體(SEQ.ID NO40)，反義引物)5′GAG TGC ACC ATA TGC GGT 3′在PCR反應(yīng)的第二輪將PCR產(chǎn)物A和B、C和D連接起來。將PCR產(chǎn)物A和B、C和D(每種50ng)加入50μl PCR反應(yīng)液中(如上所述)，除了將退火溫度升至60℃外，按上面所描述的進(jìn)行20圈的擴(kuò)增。這些反應(yīng)的產(chǎn)物稱之為E和F。所用的PCR引物對(duì)分別為APCR1-v1a3和v1a4-v1a7。用苯酚抽提和乙醇沉淀PCR產(chǎn)物E和F，通過其自身的互補(bǔ)性在兩步—PCR反應(yīng)中使之在第三輪PCR反應(yīng)中裝配，兩步—PCR反應(yīng)用APCR1和v1a7作終止引物。完全裝配的片段代表包括引導(dǎo)序列的完整的改型人21.6VL區(qū)，用HindIII和BamHI消化之，并將其克隆到pUC19中以便測(cè)序。具有正確序列的克隆被指定為resh21.6Vla。
通過Kamman等在Nu cl.Acids.Res.175404(1989)的方法，對(duì)第一形式的改型人21.6VL區(qū)(La)進(jìn)行較小的修飾，用PCR引物來構(gòu)建改型人21.6VL區(qū)的第二形式(Lb)。
合成了兩套引物(表6)。每個(gè)PCR反應(yīng)基本上是在上面所述的同樣的條件下進(jìn)行的。在第一PCR反應(yīng)中，用誘變引物21.6VLb2來破壞StyI位點(diǎn)(蘇氨酸—ACC—97變成蘇氨酸—ACA—97)，以產(chǎn)生resh21.6VLa2。然后，在第二PCR反應(yīng)中，誘變引物21.6VLb1(組氨酸-49變成酪氨酸-49)和PUC-resh21.6Vla2一起用作模板DNA。用StyI和BamHI切PCR產(chǎn)物，并將之亞克隆到PUC-resh21.6 VLa2中，用同樣的限制性酶裂解之。具有正確序列的克隆被指定為pUC-resh21.6VLb。
用所述的構(gòu)建“a”形改型人21.6VL區(qū)的同樣的PCR方法，來構(gòu)建“a”形改型人21.6VH區(qū)。(表6和圖9)。將編碼“g”形改型人425VH區(qū)(如前所述，Kettleborough等)和“b”形改型人AUK12-20 VH區(qū)的Hind III-BamHI DNA片段亞克隆到pUC19載體中，分別產(chǎn)生出pUC—resh425g和pUC—reshAUK12-20b。(AUK12-20的“b”形衍生于如Kettleborough等所描述的片段VHa 425的誘變，且編碼氨基酸序列(SEQ.ID NO41)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH WVRQAPGQGLEWVGYIDPFNGGTSYNQKFKG KVTMTVDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGN-RFAY WGQGTLVTVSS(空白間隔區(qū)將FR和CDR區(qū)分開)。
pUC-resh425g和pUC-reshAUK12-20b質(zhì)粒，及含有修飾后用于構(gòu)建嵌合型21.6重鏈的小鼠21.6VH區(qū)的pUC載體(pUC-chim 21.6VH)，在以后的PCR反應(yīng)中用作模板DNA。設(shè)計(jì)和合成了用于“a”形改型人21.6VH區(qū)的PCR引物(表6)。用pUC-reshAUK12-20b作DNA模板和APCR1-val1作為引物對(duì)來獲得PCR產(chǎn)物A(圖9)。用pUC-chim 21.6VH做DNA模板，用vha2-vha3和vha6-APCR4分別作PCR引物對(duì)，得到了PCR產(chǎn)物B和D。最后，用pUC-resh425g作DNA模板和vLa4-vLa5作PCR引物對(duì)，得到了PCR產(chǎn)物C。將最終的PCR產(chǎn)物的HimdIII-BamHI片段亞克隆到pUC19中從便測(cè)序。具有正確DNA序列的克隆被指定為pUC-resh21.6VHa。第一形式的改型21.6可變區(qū)的DNA和氨基酸序列示于圖10。
用上面描述的構(gòu)建“b”形改型人21.6VL區(qū)的基本相同的方法構(gòu)建剩下的其它形式的改型人21.6VH區(qū)。合成了兩套引物(表6)。對(duì)第二形(Hb)和第三形(Hc)來說，在PCR反應(yīng)中分別使用誘變引物21.6VHb(精氨酸—44變成甘氨酸—44)和21.6VHc(酪氨酸—98變成苯丙氨酸—98)，而同時(shí)用pUC-resh21.6VHa作模板DNA。用限制酶切PCR產(chǎn)物，并分別將其MscI-BamHI和PstI-BamHI片段亞克隆到pUC載體pUC-21.6VHa中，來產(chǎn)生pUC-resh21.6VHb和pUC-resh21.6VHc。
用與用來構(gòu)建第一形式的改型人21.6VL區(qū)(La)相似的方法來構(gòu)建第一形式的改型人21.6VH區(qū)(Ha)。然而，在這種情況下，PCR引物與三種不同的模板DNA一起使用；三種模板是已被改造成的表達(dá)嵌合的21.6重鏈的小鼠21.6VH區(qū)、“g”形的人源化425VH區(qū)(如前所述，Kettleborough等)和“b”形的人源化AUK12-20VH區(qū)(表6，圖9)。第一形式的人源化21.6重鏈可變區(qū)的DNA和氨基酸序列被示于圖11。對(duì)第一形式的人源化21.6VH區(qū)(Ha)用PCR引物做較少的修飾，可構(gòu)建第二和第三形的人源化21.6VH區(qū)(Hb和Hc)。
實(shí)施例7人源化抗體的表達(dá)和分析1.在表達(dá)載體內(nèi)可變區(qū)與恒定區(qū)的連接將編碼嵌合的和改型的21.6VL和VH區(qū)的DNA片段亞克隆到HCMV載體中，該載體是設(shè)計(jì)用來在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人κ輕鏈或人ν-1重鏈的(參見圖3)(Maeda等，Hum.Antibod.Hybridomas.2124～134(1991)。兩個(gè)載體均含有人細(xì)胞肥大病毒(HCMV)啟動(dòng)子和使免疫球蛋白輕鏈和重鏈高水平轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子。輕鏈表達(dá)載體就是Maeda等所描述的載體，該載體含有編碼人κ恒定區(qū)的基因組DNA(Rabbitts等，Curr.Top.Microbiol.Immuno.113166-171(1984)。除由cDNA代替了編碼人γ-1恒定區(qū)的基因組DNA外，重鏈表達(dá)載體基本上與Maeda等描述的相同，通過PCR從分泌人γ-1抗體的人細(xì)胞系中克隆了編碼人γ-1恒定區(qū)的cDNA。為方便將其亞克隆到表達(dá)載體中，在cDNA的每一端均產(chǎn)生了BamHI位點(diǎn)。另外，在cDNA序列的5′-端產(chǎn)生了接合受體位點(diǎn)和65bp的內(nèi)含子序列。含有人γ-1cDNA接合受體位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的BamHI片段(1176bp)取代現(xiàn)存的重鏈載體(如前所述，Maeda等)內(nèi)的BamHI片段(大約2.0kb)。然后用Klenow聚合酶除去在人γ-1恒定區(qū)3′一端的BamHI位點(diǎn)。
2.表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染用Gene Pulsar儀(BioRad)通過電穿孔法將表達(dá)載體導(dǎo)入Cos細(xì)胞。將DNA(每個(gè)載體10μg)加入0.8ml含1×177細(xì)胞/ml的PBS中。給以1900伏，25μF電容的脈沖?；謴?fù)期10分鐘后于環(huán)境溫度下，將電穿孔的細(xì)胞加入8ml含5％熱滅活的無球蛋白的胎牛血清的DMEM(GIBCO)中。經(jīng)72小時(shí)溫育后，收集培養(yǎng)基，離心以除去細(xì)胞殘片，于4℃在滅菌條件下短期貯存，或在-20℃長(zhǎng)期保存。
3.人源化抗體的純化將來自轉(zhuǎn)染的Cos細(xì)胞的上清液部分集合起來，用固相蛋白A純化(ImmunoPure IgG Purification Kit，Pierce)。將上清液通過0.22μm的濾膜而將其滅菌。與等體積的ImmunoPure Ig G結(jié)合緩沖液(pH8.0)混合后，將稀釋的樣品上樣到1ml的蛋白A柱上，并使其完全流入凝膠。在用15ml的ImmunoPure IgG結(jié)合緩沖液洗滌后，用5ml的ImmunoPure IgG洗脫緩沖液(pH2.8)洗脫結(jié)合的抗體，收集1ml的級(jí)分。第1和第2級(jí)分的pH值大約為8.0。通過加入100μl的ImmunoPure結(jié)合緩沖液，將第3級(jí)分的pH調(diào)至生理pH。含有蛋白A純化的抗體的第5級(jí)分用ELISA分析，來確定在每個(gè)級(jí)分中所含有人IgG抗體的量。用堿性磷酸結(jié)合的羊抗—人IgG(全分子，Sigma)來檢測(cè)抗體。
4.結(jié)合親和性的測(cè)量改型的人21.6抗體與α4β1整合蛋白的結(jié)合用ELISA進(jìn)行了分析，并與小鼠的和嵌合的抗體做了比較。簡(jiǎn)言之，將轉(zhuǎn)化的在其細(xì)胞表面表達(dá)α4β1整合蛋白的L細(xì)胞于96-孔組織培養(yǎng)板中埔板，并使其長(zhǎng)至匯合。被測(cè)樣品(或者是未提純的上清液或者是蛋白A純化的)做連續(xù)稀釋后，加到每個(gè)孔中。在冰上保溫1小時(shí)和輕輕洗滌后，加羊抗鼠或羊抗人(γ-鏈特異的)過氧化酶接合抗體(Sigma)。在冰上保溫另外1小時(shí)和輕輕洗滌后，加入底物(鄰苯二胺二氫氯化物，Sigma)。在室溫下溫育30分鐘后，加1 M H2SO4，終止反應(yīng)，并于A490進(jìn)行測(cè)量。
結(jié)合Ha形的改型的人21.6重鏈，對(duì)兩種形式的改型的人21.6輕鏈(La和Lb)的未提純的上清液的分析結(jié)果，提示La形的改型的人21.6VL區(qū)與抗原的親和性比Lb形的要稍好些。因此，La形被用于以后的試驗(yàn)。結(jié)合La形的改型的人21.6輕鏈，對(duì)人源化21.6重鏈(Ha和Hb)的未提純的上清液的分析結(jié)果表明在改型的人VH區(qū)的兩種形式(Ha和Hb)之間沒有顯著差異。因?yàn)樵谌薋Rs中Ha形只含有5個(gè)改變，選擇Ha形用于以后的進(jìn)一步試驗(yàn)。
圖12比較了人源化21.6抗體(La+Ha)的結(jié)合和嵌合的21.6抗體的結(jié)合。數(shù)據(jù)表明改型的人21.6抗體(La+Ha)對(duì)抗原的結(jié)合與嵌合的21.6抗體對(duì)抗原的結(jié)合一樣好，并且可能還稍好一些。因?yàn)榍逗系?1.6抗體含有完整的小鼠21.6的可變區(qū)，預(yù)期在對(duì)抗的結(jié)合特征方面嵌合之21.6抗體相當(dāng)。改型的人21.6抗體(La+Ha)也表現(xiàn)出阻斷人α4β1整合蛋白質(zhì)的結(jié)合，其效力可以與原始的小鼠21.6抗體和嵌合的抗體的效力相比。因此，可以得出結(jié)論，改型的人21.6抗體(La+Ha)具有與小鼠21.6抗體基本相當(dāng)?shù)奶禺惖慕Y(jié)合親和力。而且，因?yàn)橹恍柙谌薋Rs做較小的修飾就能在人可變區(qū)內(nèi)再生成小鼠21.6抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此預(yù)期改型的人21.6抗體可成為可靠的人抗體。
對(duì)含有La形的改型的人21.6VL區(qū)和Hc形的改型的人VH區(qū)的改型人21.6抗體也進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試了其與在細(xì)胞表面表達(dá)人α4β1整合蛋白的L細(xì)胞的結(jié)合，并與嵌合的抗體進(jìn)行了比較。結(jié)果提示改型的人21.6抗體(La+Ha)可與抗原很好地結(jié)合。VH區(qū)的CDR3內(nèi)的變化不損害與抗原的結(jié)合。實(shí)際上，有一些跡象表明CDR3內(nèi)的變化稍稍促進(jìn)與抗原的結(jié)合(圖12)。可以想象地，該促進(jìn)在功能性阻斷分析中可能會(huì)更明顯。
實(shí)施例8Mu 21.6抗體的阻斷性質(zhì)將Mu 21.6與另一個(gè)抗α4整合蛋白稱作L25的抗體進(jìn)行了比較。L25可從BectonDickinson商購(gòu)得到，在文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道它是α4β1整合蛋白粘附性功能的好的抑制劑。如圖13A所示，在無Mn2+存在時(shí)，Mu 21.6和L25兩者都能完全抑制單核細(xì)胞與純化的VCAM-1的α4β1整合蛋白—依賴的粘附。然而，在Mn2+(1mM)(α4β1的幾個(gè)活化子中的一個(gè))，L25就不再是有效的抑制劑了。當(dāng)α4β1整合蛋白用其它刺激物活化時(shí)，也會(huì)觀察到類似的結(jié)果。阻斷活化的α4β1整合蛋白的能力在治療炎癥疾病如多樣性硬化癥時(shí)，可能是有價(jià)值的。
作為mu 21.6和L25的進(jìn)一步的比較，對(duì)抑制人T細(xì)胞與增加量的VCAM-1的粘附的抗體能力進(jìn)行了測(cè)定。在這樣試驗(yàn)中，用增加量的VCAM-1包被96-孔測(cè)試板的料孔，測(cè)量了人T細(xì)胞系，Jurkat(它表達(dá)高水平的α4β1整合蛋白)與包被孔的結(jié)合能力。Y-軸的值代表在四次洗滌后仍然結(jié)合的占最初加入每孔的Jurkat細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(圖13B)。這個(gè)試驗(yàn)證明，在遇到低水平的VCAM-1時(shí)，L25是細(xì)胞粘附的好的抑制劑，但在VCAM-1的水平較高時(shí)則變得完全失去作用。另一方面，無論VCAM-1存在的量的多寡，Mu 21.6均能完全抑制細(xì)胞粘附。由于VCAM-1在炎癥位置的上調(diào)控(upregulation)，高濃度的VCAM-1的阻斷能力在治療應(yīng)用中是很希望的。
實(shí)施例9人源化21.6抗體在動(dòng)物模型中的效能本實(shí)施例建立人源化21.6抗體在刺激多樣性硬化癥的動(dòng)物模型中，預(yù)防和治療EAE的效能。
(a)方法(1)EAE的誘導(dǎo)分別從5只用CO2窒息處死的豚鼠中取出腦和脊髓。將該組織于PBS中在濕冰上保存，直至將其稱重和均化成濃度為每毫升PBS中含1克組織。用電子手控勻漿器將該組織完全均化，并隨后將其與等體積的Freund’s完全佐劑(FCA)相混合。通過將100mg的分枝結(jié)核桿菌H37 RA(DIFCO，3114-33-8)加入10ml的Freund’s不完全佐劑而制得FCA(Sigma，F(xiàn)-5506)。通過使溶液在由兩向開關(guān)連接的兩個(gè)注射器之間經(jīng)過，使混合物乳化成蛋黃醬樣(mayonaise)的稠度。每只鼠用600μl的乳濁液免疫，分別在3個(gè)位點(diǎn)給藥。
(2)計(jì)錄有疾病癥狀的動(dòng)物通過促使動(dòng)物行走，且按照下述通常接受的標(biāo)準(zhǔn)給動(dòng)物打分來估計(jì)疾病癥狀0無病1后肢無力2、后肢完全麻痹3、后肢完全麻痹和一些前麻痹4、涉死的或死亡(3)血清和組織的收集通過心臟穿刺從甲氧基熒烷—麻醉的豚鼠中取樣。收集大約300～400μl的血液，將其置于微量血清分離器中并使之在室溫下凝集20～30分鐘。將試管在室溫下離心5分鐘。將血清移入正appendorf管，并將其于-20℃貯存以便以后的熒光活化的細(xì)胞分類(sorting)法(FACS)的抗體效價(jià)的分析。
為進(jìn)行血液學(xué)分析，將血液收集到乙二胺四乙酸包被的微量管中。將100μl等份吸入吖啶包被的血細(xì)胞比容管中。蓋上管蓋，通過輕輕倒置試管15次使血液與吖啶橙混合。將浮器放入血細(xì)胞比容管中，并將樣品離心5分鐘。將血細(xì)胞比容管置于預(yù)先校準(zhǔn)的Idexx QBC Vet Autoreader中，該儀器是設(shè)計(jì)用來進(jìn)行定量buffey包被分析的。在馬校準(zhǔn)系統(tǒng)中讀取數(shù)值，并用預(yù)先確定的轉(zhuǎn)換系數(shù)將其調(diào)整到豚鼠相應(yīng)值。
在試驗(yàn)的最后，用CO2窒息法將豚鼠殺死，并將其腦和脊髓取出。每只豚鼠一半的腦和脊髓在2-甲基—丁烷中在于冰上(-20℃至-40℃)上快速冷凍。切割組織，用親和素—生物素連接的過氧化物酶分析法(Vector Laboratories，Inc.，Burlingame，CA)和二氨基聯(lián)苯胺作生色劑，并以巨噬細(xì)胞標(biāo)記(Serotec MCA-518)和T-淋巴細(xì)胞標(biāo)記(Serotec MCA-751)對(duì)其進(jìn)行免疫染色。按照下列計(jì)分系統(tǒng)對(duì)組織的細(xì)胞浸潤(rùn)計(jì)分0 沒有浸潤(rùn)細(xì)胞。
0.5很少染色；可能是人工假象；通常與脈管有關(guān)。
1通常在血管附近的少數(shù)細(xì)胞染色(少于15個(gè))2許多細(xì)胞染色(20～50)，通常自脈管放射出。
3許多細(xì)胞染色(＞50)，散布在組織中；許多折褶的脈管。
(b)預(yù)防性治療該試驗(yàn)是設(shè)計(jì)用來評(píng)估人源化抗體延遲臨床癥狀的發(fā)作的效能。以前的數(shù)據(jù)表明白細(xì)胞典型地在第7和第8天之間開始流入EAE豚鼠的腦和脊髓。因此，在免疫后7天和10天進(jìn)行抗體給藥。為比較小鼠和人源化21.6抗體，給藥相應(yīng)劑量的每種抗體(3.0、0.30和0.03mg/kg)。初步的藥物動(dòng)力學(xué)研究表明小鼠21.6抗體在皮下給藥后24小時(shí)就能達(dá)到飽和的血液水平，并直到48小時(shí)時(shí)還保持很高水平。
在第11天，即第二次的抗體給藥后24小時(shí)，從每組中隨機(jī)選取3只動(dòng)物抽取血樣。計(jì)算每個(gè)處理組中每只豚鼠達(dá)到臨床得分為1時(shí)的天數(shù)的平均數(shù)(表7)。在此試驗(yàn)中，PBS—處理組的平均值為免疫后11天(該值是以前的典型的結(jié)果)。用高劑量的人源化和小鼠抗體所作的處理，其結(jié)果是疾病分別顯著延遲了4.6天(p＝0.000)和3(p＝0.007)天?？贵w的較低劑量對(duì)疾病的病程沒有影響。
表7小鼠或人源化21.6抗體對(duì)在免疫后達(dá)到臨床分?jǐn)?shù)為1的時(shí)間的影響
@H表示人源化抗體；#表示小鼠。
**p＝0.000和*p＝0.007，與PBS相比。
豚鼠的每日的體重反映出高劑量的人源化和小鼠抗體的類似的效果(圖14)。這些治療組中的動(dòng)物的體重逐漸增加。其它所有處理組中的豚鼠恰在疾病發(fā)作之前的日子即開始損失體重。
在第11天，即第二次處理后大約24小時(shí)后，通過心臟穿刺對(duì)從每個(gè)組中隨機(jī)選取的三只動(dòng)物的抗體進(jìn)行了效價(jià)測(cè)定。抗體延遲疾病的效能與血清水平密切相關(guān)。在所有的用高劑量的人源化和小鼠抗體注射的動(dòng)物中，在循環(huán)血中存在大約20μg/ml的血清抗體。這一濃度與在活體外飽和VLA-4位點(diǎn)所需的21.6抗體的濃度的數(shù)量級(jí)相當(dāng)。作為對(duì)照所有其它組中的動(dòng)物幾乎不具有或不具有可檢測(cè)的血清抗體。
(C)發(fā)生中的疾病的逆轉(zhuǎn)免疫了大約60只豚鼠并使之發(fā)展到EAE的監(jiān)床癥狀。在第13天，將所有的獲得臨床得分為1的豚鼠隨機(jī)分成治療組。圖15表明用3mg/kg人源化抗體處理的動(dòng)物，在處理48小時(shí)之內(nèi)就開始恢復(fù)后肢的功能。在第17和第18天，即給以第二劑量后的1和2天后，所有的8只動(dòng)物都沒病了。在每個(gè)治療組曲線值下的面積和ANOVA表明只有3mg/kg人源化抗體的處理組的值令人滿意地比PBS對(duì)照組的要低(p＝0.042)。在第一次給藥后24小時(shí)直至在第19天終止試驗(yàn)時(shí)，這些動(dòng)物逐漸增加體重(圖16)。
用FACS分析法對(duì)在第一次注射后24小時(shí)(第14天)和處死時(shí)(第19天)所取的樣品進(jìn)行了抗體血清效價(jià)的測(cè)量。結(jié)果是用小鼠21.6抗體處理的血清抗體效價(jià)要比用人源化21.6抗體處理的血清抗體效價(jià)稍低(9.1比12.6μg/ml)。這種差異在第19天，即第二次給藥后3天變得更加明顯，此時(shí)，幾乎沒有可檢測(cè)的血清小鼠抗體；而在第19天雖然人源化抗體的水平降低到了飽和水平以下，但仍是可測(cè)量的(6.1μg/ml)。這些數(shù)據(jù)證明在抗體血漿水平和生理學(xué)效能之間存在相關(guān)，并且提示豚鼠的有效的循環(huán)抗體的水平的范圍是10～20μg/ml。
用第19天處死的動(dòng)物的組織對(duì)白細(xì)胞滲入腦和脊髓進(jìn)行估測(cè)。表8表明在作為抗體治療功能的浸潤(rùn)程度存在顯著差異。用3mg/kg處理后，T細(xì)胞浸潤(rùn)腦和脊髓和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)脊髓的減少是顯著的。低劑量趨向減少浸潤(rùn)，但沒達(dá)到顯著差異。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到脊髓在任何劑量都沒有顯著差異。因用來進(jìn)行估測(cè)的免疫組織化學(xué)技術(shù)不能將常住細(xì)胞(resident)和入侵細(xì)胞區(qū)分開，巨噬細(xì)胞的效果的缺乏可能表示常住巨噬細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的持久存在。
在疾病發(fā)生后通過給藥抗體使腦組織內(nèi)T細(xì)胞和單核細(xì)胞減少，提示細(xì)胞堵塞并不是累積的過程，而是細(xì)胞進(jìn)出CNS組織的動(dòng)態(tài)的運(yùn)動(dòng)。更重要地，該數(shù)據(jù)表明白細(xì)胞進(jìn)入薄壁組織的中斷使CNS自身能擺脫侵入的病理學(xué)因素。
表8腦脊髓
NS＝無差異。
在第19天T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對(duì)腦和脊髓的浸潤(rùn)的顯著差異血液學(xué)數(shù)據(jù)表明用小鼠或人源化21.6抗體進(jìn)行處理，在全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞計(jì)數(shù)或在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方面不產(chǎn)生差異。與PBS處理的動(dòng)物相比，高劑時(shí)的小鼠或人源化抗體導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)的顯著增加(表9)。豚鼠的血小板計(jì)數(shù)為755±103細(xì)胞/ml，大約是PBS—處理的EAE動(dòng)物的兩倍。因此，用使疾病有效逆轉(zhuǎn)的小鼠和人源化抗體的劑量處理，也可使血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)到正常。
表9在EAE動(dòng)物中抗體治療對(duì)血小板計(jì)數(shù)的影響
++非-EAE豚鼠的血小板計(jì)數(shù)在獨(dú)立的試驗(yàn)中測(cè)定。
*P＝0.05與PBS相比。
得出結(jié)論，人源化和小鼠21.6抗體兩者均能在動(dòng)物模型中延遲和逆轉(zhuǎn)刺激的多樣性硬化癥的臨床癥狀。在逆轉(zhuǎn)癥狀時(shí)，人源化抗體比相同劑量的小鼠抗體更有效。
雖然為使理解清楚的目的已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，很明顯可在所附的權(quán)利要求之內(nèi)進(jìn)行某些修飾。上面引用的出版物和專利文件在此同樣地在整體上引作參考，就象每篇文獻(xiàn)被分別做了說明。
表4導(dǎo)致改型的人21.6輕鏈可變區(qū)的設(shè)計(jì)的氨基酸序列的直線排列
說明(Kabat)根據(jù)如前所述的Kabat等的編號(hào)；(#)用于分子模擬的序列號(hào)；(小鼠21.6)來自小鼠21.6抗體的VL區(qū)的氨基酸序列；(小鼠κ5)來自亞組5的小鼠κVL區(qū)的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人κ1)來自亞組1的人VL區(qū)的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人REI)人VL區(qū)的氨基酸序列(Palm等(1975)，如前所述)；(RH VL21.6)改型人抗體的21.6VL區(qū)的L1形的氨基酸序列；(*)CDR環(huán)的經(jīng)典結(jié)構(gòu)部分的殘基(Chothia等，如前所述)；(下劃線的)在人FRs中氨基酸殘基被改變了的殘基。
表5導(dǎo)致改型的人21.6重鏈可變區(qū)的設(shè)計(jì)的氨基酸序列
說明(Kabat)根據(jù)如前所述的Kabat等的編號(hào)；(#)用于分子模擬的序列號(hào)；(小鼠21.6)來自小鼠21.6抗體的VH區(qū)的氨基酸序列；(小鼠2c)來自亞組2c的小鼠VH區(qū)的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人1)來自亞組1的人VH區(qū)的一致性序列(Kabat等，如前所述)；(人21/28′CL)人VH區(qū)的氨基酸序列(Dersimonian等(1987)，如前所述)；(RHVH21.6)改型的人21.6VH區(qū)H1形的氨基酸序列；(*)CDR環(huán)的經(jīng)典結(jié)構(gòu)部分的殘基(Chothia等，如前所述)；(下劃線的)人的FRs中氨基酸殘基被改變了的殘基。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人瑪麗·M·本迪希奧立費(fèi)爾·J·列格爾瓊斯·薩爾德拿泰倫·S·瓊斯(ii)發(fā)明名稱抗白細(xì)胞粘附分子VLA-4的人源化抗體(iii)序列數(shù)45(iv)通訊地址(A)收件人湯森和湯森 庫(kù)瑞和克魯(B)街 道One Market Plaza，Steuart Tower，Suite 2000(C)城 市舊金山(D)州加利福尼亞(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵 編94105(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體形式Flooppy disk(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)目前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)序號(hào)US 08/186,269(B)申請(qǐng)?zhí)?994年1月25日(C)分類(viii)代理人信息(A)姓 名威兼·L·史密斯(B)登記號(hào)30,223(C)案卷/卷宗號(hào)15270-14(ix)通信信息(A)電話415-543-9600(B)電傳415-543-5043(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度483個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)53…430(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGAGGGCCC CTGCTCAGAT TTTTGGATTC TTGGTCAGGA GACGTTGTAG AA ATG 55Met1AGA CCG TCT ATT CAG TTC CTG GGG CTC TTG TTG TTC TGG CTT CAT GGT 103Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His Gly5 10 15GCT CAG TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA 151Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala20 25 30TCT CTG GGA GGC AAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG ACA AGC CAA GAC ATT199Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile35 40 45AAC AAG TAT ATG GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT GGA AAA CGT CCT AGG247Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Arg Pro Arg50 55 60 65CTG CTC ATA CAT TAC ACA TCT GCA TTA CAG CCA GGC ATC CCA TCA AGG295Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg70 75 80TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC TTC AAC ATC AGC AAC343Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Ser Asn85 90 95CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT TGT CTA CAG TAT GAT AAT391Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn100 105 110CTG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGGGCTGATG 440Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCACCCGGGA TCC483(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度126個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His1 5 10 15Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp35 40 45Ile Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Arg Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Ser85 90 95Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp100 105 110Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度470對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)1…420(xi)序列描述SEQ ID NO3ATG AAA TGC AGC TGG GTC ATG TTC TTC CTG ATG GCA GTG GTT ACA GGG48Met Lys Cys Ser Trp Val Met Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15GTC AAT TCA GAG GTT CAG CTG CAG CAG TCT GGG GCA GAG CTT GTG AAG96Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30CCA GGG GCC TCA GTC AAG TTG TCC TGC ACA GCT TCT GGC TTC AAC ATT144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGT GTG AAG CAG AGG CCT GAA CAG GGC CTG192Lys Asp Thr Tyr Ile His Cys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu50 55 60GAG TGG ATT GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT TAT ACT AAA TAT GAC240Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp65 70 75 80CCG AAG TTC CAG GGC AAG GCC ACT ATA ACA GCT GAC ACA TCC TCC AAC288Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn85 90 95ACA GCC TAC CTG CAG CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC ACT GCC GTC336Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110TAT TTC TGT GCT AGA GAG GGA TAT TAT GGT AAC TAC GGG GTC TAT GCT384Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala115 120 125ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCCTCAGCCA 430Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val130 135 140AAACGACACC CCCATCTGTC TATCCACTGG CCCGGGATCC470(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度140個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Cys Ser Trp Val Met Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1 5 10 15Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45Lys Asp Thr Tyr Ile His Cys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp65 70 75 80Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val130 135 140(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度106個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO5Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr20 25 30Me Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Arg Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Ser Asn Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ile Lys Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr100 105(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度106個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO7Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr20 25 30Met Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度107個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO8Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ile Lys Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Gln Ala Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr100 105(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度123個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO9Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Ile His Cys Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO10Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度123個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO11Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr100 105 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO12Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Ser Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度119個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO13Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Ser Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Tyr Phe Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度406對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型雙(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)16..393(xi)序列描述SEQ ID NO14AAGCTTGCCG CCACC ATG AGA CCG TCT ATT CAG TTC CTG GGG CTC TTG TTG 51Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu1 5 10TTC TGG CTT CAT GGT GCT CAG TGT GAC ATC CAG ATG ACA CAG TCT CCA 99Phe Trp Leu His Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro15 20 25TCC TCA CTG TCT GCA TCT CTG GGA GGC AAA GTC ACC ATC ACT TGC AAG147Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys30 35 40ACA AGC CAA GAC ATT AAC AAG TAT ATG GCT TGG TAC CAA CAC AAG CCT195Thr Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro45 50 55 60GGA AAA CGT CCT AGG CTG CTC ATA CAT TAC ACA TCT GCA TTA CAG CCA243Gly Lys Arg Pro Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro65 70 75GGC ATC CCA TCA AGG TTC AGT GGA AGT GGG TCT GGG AGA GAT TAT TCC291Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser80 85 90TTC AAC ATC AGC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCA ACT TAT TAT TGT339Phe Asn Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys95 100 105CTA CAG TAT GAT AAT CTG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA387Leu Gln Tyr Asp Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu110 115 120ATC AAA CGTGAGTGGA TCC 406Ile Lys125(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度126個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO15Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His1 5 10 15Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Thr Ser Gln Asp35 40 45Ile Asn Lys Tyr Met Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Arg Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ala Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Asn Ile Ser85 90 95Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp100 105 110Asn Leu Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys115 120 125(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度454對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型cDNA(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位點(diǎn)16..441(xi)序列描述SEQ ID NO16AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC51Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala1 5 10GTG GCT CCT GGG GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC 99Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala15 20 25GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA GCT AGC 147Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser30 35 40GGT TTC AAC ATT AAA GAC ACC TAT ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCT 195Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro45 50 55 60GGC CAA AGG CTG GAG TGG ATG GGA AGG ATT GAT CCT GCG AAT GGT TAT 243Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr65 70 75ACT AAA TAT GAC CCG AAG TTC CAG GGC CGG GTC ACC ATC ACC GCA GAC 291Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp80 85 90ACC TCT GCC AGC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG 339Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu95 100 105GAC ACT GCA GTC TAC TAC TGC GCC AGA GAG GGA TAT TAT GGT AAC TAC 387Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr110 115 120GGG GTC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC CTT GTC ACC GTC 435Gly Val Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val125 130 135 140TCC TCA GGTGAGTGGA TCC 454Ser Ser(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度142個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO17Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly1 5 10 15Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile35 40 45Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp65 70 75 80Pro Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Val Tyr Ala115 120 125Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO18CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGAGACCGTC TATTCAG 37(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度35對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO19CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCAGC TTGGT35(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)
(xi)序列描述SEQ ID NO20CAGAAAGCTT GCCGCCACCA TGAAATGCAG CTGGGTC 37(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO21CCGAGGATCC ACTCACCTGA GGAGACGGTG ACT 33(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO22NO22GATGGTGACT CTATCTCCTA CAGATGCAGA CAGTGAGGA39(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO23CTGTAGGAGA TAGAGTCACC ATCACTTGCA AG 32(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度39對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO24AGGAGCTTTT CCAGGTGTCT GTTGGTACCA AGCCATATA39(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度41對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO25ACCAACAGAC ACCTGGAAAA GCTCCTAGGC TGCTCATACA T 412)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度40對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO26GCAGGCTGCT GATGGTGAAA GTATAATCTC TCCCAGACCC 40(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO27ACTTTCACCA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATATTGCAA CT42(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度59對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO28CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTGGTGCCTT GACCGAACGT CCACAGATT 59(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度33對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO29GGAAAAGCTC CTAGGCT GCT CATATATTAC ACA 33(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度38對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO30CCGAGGATCC ACTCACGTTT GATTTCCACC TTTGTGCC 38(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度51對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO31AACCCAGTGT ATATAGGTGT CTTTAATGTT GAAACCGCTA GCTTTACAGC T 51(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度67對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO32AAAGACACCT ATATACACTG GGTTAGACAG GCCCCTGGCC AAAGGCTGGA GTGGATGGGA 60AGGATTG 67(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度26對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO33GACCCGGCCC TGGAACTTCG GGTCAT 26(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度66對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO34GACCCGAAGT TCCAGGGCAG GGTCACCATC ACCGCAGACA CCTCTGCCAG CACCGCCTAC 60ATGGAA66(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度64對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO35CCATAGCATA GACCCCGTAG TTACCATAAT ATCCCTCTCT GGCGCAGTAG TAGACTGCAG 60TGTC 64(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度63對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO36GGTAACTACG GGGTCTATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCCTTGT CACCGTCTCC 60TCA 63(2)SEQ ID NO37的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度37對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO37CCAGGGCCGG GTCACCATCA CCAGAGACAC CTCTGCC 37(2)SEQ ID NO38的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO38CAGGCCCCTG GCCAAGGGCT GGAGTGG 27(2)SEQ ID NO39的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO39TACGCAAACC GCCTCTC17(2)SEQ ID NO40的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度18對(duì)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型DNA(引物)(xi)序列描述SEQ ID NO40GAGTGCACCA TATGCGGT 18(2)SEQ ID NO41的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度116個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO41Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Tyr Ile Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO42的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度109個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO42Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Sar Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Asp Ile Ser Asn20 25 30Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ser Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile Tyr Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu65 70 75 80Gln Glu Asp Ile Ala Thr Phe Cys GIn Gln Gly Asn Thr Leu Pro85 90 95Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)SEQ ID NO43的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度114個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO43Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ser Leu Val Xaa20 25 30Xaa Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys35 40 45Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val50 55 60Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln85 90 95Tyr Asn Ser Leu Pro Glu Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu100 105 110Ile Lys(2)SEQ ID NO44的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度125個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO44Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr20 25 30Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe50 55 60Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Xaa Val Gly Tyr Tyr Ala Met100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser115 120 125(2)SEQ ID NO45的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度129個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單(D)拓?fù)渚€性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO45Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys50 55 60Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala65 70 75 80Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr85 90 95Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly Asp100 105 110Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 12權(quán)利要求
1.含有人源化重鏈和人源化輕鏈的人源化免疫球蛋白(1)人源化輕鏈包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和可變區(qū)框架，所述的互補(bǔ)決定區(qū)具有相應(yīng)于小鼠21-6免疫球蛋白輕鏈的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列，所述的可變區(qū)框架來自除了選自由L45、L49、L58和L69組成的第一組中的至少一個(gè)位置外的人κ輕鏈可變區(qū)框架序列，其中例外的氨基酸位置由與小鼠21-6免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)框架的等同位置相同的氨基酸所占據(jù)；和(2)人源化重鏈包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)和可變框架區(qū)，所述的互補(bǔ)決定區(qū)具有相應(yīng)于小鼠21-6免疫球蛋白重鏈的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列，所述的可變區(qū)框架來自除選自由H27、H28、H29、H30、H44、H71組成的組中的至少一個(gè)位置外的人重鏈可變區(qū)框架序列，其中例外的氨基酸位置由與小鼠21-6免疫球蛋白重鏈可變區(qū)框架的等同位置相同的氨基酸所占據(jù)；其中免疫球蛋白與VLA-4配體特異性地結(jié)合，具有下限為大約107M-1和上限為大約5倍于小鼠21-6免疫球蛋白結(jié)合親和力的結(jié)合親和力。
2.權(quán)利要求1的人源化抗體，其中人源化輕鏈可變區(qū)框架來自除了選自第一組中的至少一個(gè)位置和選自由L104、L105和L07位所組成的第三組中的至少一個(gè)位置外的RE1可變區(qū)框架序列，例外的氨基酸位置由與來自人免疫球蛋白的而不是RE1κ輕鏈的等同位置相同的氨基酸所占據(jù)。
3.權(quán)利要求2的人源化免疫球蛋白，其中人源化重鏈可變區(qū)框架來自21/28′CL可變區(qū)框架序列。
4.權(quán)利要求3的人源化免疫球蛋白，其中人源化輕鏈可變區(qū)框架含有至少3個(gè)來自小鼠21.6免疫球蛋白第一組位置的氨基酸和3個(gè)來自人免疫球蛋白而不是REI的κ輕鏈的第三組位置的氨基酸，并且人源化重鏈可變區(qū)框架含有至少5個(gè)來自小鼠21.6免疫球蛋白在第二組位置的氨基酸。
5.權(quán)利要求4的人源化抗體，其中除了來自第一組的至少3個(gè)位置和來自第三組的3個(gè)位置外，人源化輕鏈可變區(qū)框架與RE1輕鏈可變區(qū)框架序列是相同的；且除了來自第二組的至少5個(gè)位置外，重鏈可變區(qū)框架與21/28′CL重鏈可變區(qū)框架序列是相同的。
6.權(quán)利要求5的人源化免疫球蛋白，其中來自第一組的至少3個(gè)位置是L45位、L58位和L69位，來自第二組的至少5個(gè)位置是H27位、H28位、H29位、H30位和H71位。
7.權(quán)利要求6的人源化免疫球蛋白，其中除了在人源化重鏈的CDR3區(qū)可含或不含第98位的苯丙氨酸外，人源化輕鏈含有與小鼠21-6重鏈的相應(yīng)的互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)，且人源化重鏈含有與小鼠21-6重鏈的相應(yīng)的互補(bǔ)決定區(qū)相同的互補(bǔ)決定區(qū)。
8.權(quán)利要求7的免疫球蛋白，其中人源化重鏈含有在98位的苯丙氨酸殘基。
9.權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是在圖6中指定為L(zhǎng)a的序列(SEQ.ID NO7)。
10.權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列是在圖6中指定為L(zhǎng)b的序列(SEQ.ID NO8)。
11.權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是在圖7中指定為Ha的序列(SEQ.ID NO11)。
12.權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是圖7中指定的為Hb的序列(SEQ.ID NO12)。
13.權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)氨基酸序列是在圖7中指定為Hc的序列(SEQ.ID NO13)。
14.權(quán)利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是圖7中指定的Ha(SEQ.ID NO11)。
15.權(quán)利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是圖7中的Hb(SEQ.ID NO12)。
16.權(quán)利要求9的人源化免疫球蛋白，其中成熟的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列是在圖7中指定的Hc(SEQ.ID NO13)。
17.權(quán)利要求14或16的人源化免疫球蛋白的結(jié)合片段。
18.權(quán)利要求14或16的人源化免疫球蛋白，具有恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。
19.權(quán)利要求18的人源化免疫球蛋白，其中恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域具有效應(yīng)器功能。
20.權(quán)利要求18的人源化免疫球蛋白，其中恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域缺少效應(yīng)器功能。
21.權(quán)利要求19的人源化免疫球蛋白，其中效應(yīng)器功能能補(bǔ)充固定的或抗體依賴的細(xì)胞毒性。
22.編碼權(quán)利要求1的人源化抗體重鏈或其結(jié)合片段的核酸序列。
23.編碼權(quán)利要求1的人源化抗體輕鏈或其結(jié)合片段的核酸序列。
24.編程以在監(jiān)視器上顯示權(quán)利要求1的人源化免疫球蛋白三維圖像的計(jì)算機(jī)。
25.含有權(quán)利要求14或16的人源化抗體、或其結(jié)合片段，和其藥物學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
26.檢測(cè)VLA-4抗原的方法，該方法包括對(duì)患者或其組織樣品給藥權(quán)利要求14或16的人源化免疫球蛋白或其結(jié)合片段；和檢測(cè)由于抗體或片段和靶樣品內(nèi)存在的VLA-4的特異性結(jié)合而形成的復(fù)合體。
27.抑制白細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞的方法，該方法包括給藥治療有效量的權(quán)利要求25的藥物組合物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中內(nèi)皮細(xì)胞是腦細(xì)胞。
29.治療患者炎癥疾病的方法，包括給患者給藥治療有效量的權(quán)利要求25的藥物組合物。
30.權(quán)利要求29的方法，其中炎癥疾病是多樣性硬化癥。
全文摘要
本發(fā)明提供了與VLA-4配體特異性結(jié)合的人源化免疫球蛋白，及用其進(jìn)行治療的方法。該方法對(duì)治療多樣性硬化癥特別有用。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1140413SQ95191354
公開日1997年1月15日 申請(qǐng)日期1995年1月25日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月25日
發(fā)明者瑪麗·M·本迪希, 奧立弗爾·J·列格爾, 瓊斯·薩爾德拿, 泰倫·S·瓊斯 申請(qǐng)人:雅典娜神經(jīng)科學(xué)公司