專利名稱：具有抗炎活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的藿香提取物以及含有從所述提取物中分離和提純 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組合物，它含有藿香和通過(guò)分離提純方法從藿香中獲得的椴素(tilianin)，用于抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化；而且更特別地涉及藿香提取物和通過(guò)分離提純方法由其中獲得的椴素，它們不僅可有效地預(yù)防和治療炎性疾病，而且可有效地預(yù)防和治療與炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)谝种埔环N炎性反應(yīng)因子-補(bǔ)體系統(tǒng)的活性、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達(dá)、一氧化氮(NO)的產(chǎn)生方面具有良好的作用。它們還可顯著地減輕炎性反應(yīng)所致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
本發(fā)明的背景當(dāng)組織或細(xì)胞出現(xiàn)損害，或者人體被外來(lái)物質(zhì)(例如細(xì)菌、霉菌、病毒、各種引起變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì))引起感染時(shí)，它通常出現(xiàn)炎性反應(yīng)，表現(xiàn)為一系列復(fù)雜的生理反應(yīng)，諸如酶的活化、炎癥介導(dǎo)物質(zhì)的分泌、體液的滲出、細(xì)胞移動(dòng)和組織損傷，它們與局部血管、體液中的所有各種炎癥介導(dǎo)因子和免疫細(xì)胞有關(guān)，而且還表現(xiàn)出外在癥狀，諸如紅斑、水腫和發(fā)熱。正常情況下，炎性反應(yīng)除去外來(lái)感染源，使損害組織再生，并且恢復(fù)機(jī)體功能，但是，當(dāng)抗原未被除去，或者因?yàn)閮?nèi)在物質(zhì)，炎性反應(yīng)過(guò)度或連續(xù)發(fā)生時(shí)，炎性反應(yīng)則變成疾病(過(guò)敏性疾病、慢性炎癥)的主要病理癥狀，而且成為輸血、藥物應(yīng)用和器官移植等治療過(guò)程中的主要障礙。
涉及本發(fā)明相關(guān)的炎性反應(yīng)的因素的作用描述如下。
補(bǔ)體系統(tǒng)是體液的一種主要因子，它在免疫反應(yīng)的早期激活并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。補(bǔ)體系統(tǒng)激活過(guò)程中產(chǎn)生的活性蛋白(過(guò)敏毒素、C3a，C4a，C5a)和綴合蛋白質(zhì)(膜攻擊復(fù)合體(MAC))與各種炎性疾病(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、成人呼吸窘迫綜合征、阿耳茨海默氏病)相關(guān)，而且經(jīng)常成為器官移植中超急性排斥反應(yīng)的直接原因。
ICAM-1是內(nèi)皮細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞粘附分子組中的一種典型的蛋白質(zhì)。正常情況下，它表達(dá)的水平非常低，但是當(dāng)它受到諸如TNF-a、干擾素-γ和白介素-1β等的細(xì)胞因子的炎癥介導(dǎo)分子刺激時(shí)，其表達(dá)水平快速提高，以在粘附血液中移動(dòng)的諸如單核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的炎性細(xì)胞和將炎性細(xì)胞移動(dòng)至炎性組織中發(fā)揮作用。因此，在早期當(dāng)炎性細(xì)胞移動(dòng)并聚集在炎性組織上時(shí)，ICAM-1的表達(dá)在炎癥的增強(qiáng)中起重要的作用。
VCAM-1是內(nèi)皮細(xì)胞表面上表達(dá)的細(xì)胞粘附分子組中的一種。當(dāng)在與人動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程相似的動(dòng)物模型(載脂蛋白E缺陷鼠，ApoE-/-)中造成動(dòng)脈粥樣硬化損傷時(shí)，VCAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)快速增長(zhǎng)。而且，VCAM-1表達(dá)的增長(zhǎng)直接與血漿中膽固醇-低密度脂蛋白(膽固醇-LDL)的濃度相關(guān)。因此，當(dāng)動(dòng)脈粥樣硬化損害引起時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的VCAM-1粘附血液中的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并且那些炎癥細(xì)胞聚集在血管內(nèi)皮細(xì)胞下，因此在動(dòng)脈粥樣硬化損害的發(fā)展中起重要的作用。
L-精氨酸被一氧化氮合酶(NOS)氧化后，NO與L-瓜氨酸一起產(chǎn)生。NO是一種介導(dǎo)分子，它與血管減壓、血小板的粘附和凝結(jié)、神經(jīng)傳遞、消化器官的運(yùn)動(dòng)有關(guān)，并通過(guò)影響血管系統(tǒng)與陰莖的勃起相關(guān)。而且NO防護(hù)微生物感染，不僅是通過(guò)在炎性細(xì)胞中產(chǎn)生，而且還通過(guò)在非炎性細(xì)胞中產(chǎn)生而獲得。同時(shí)，在產(chǎn)生NO中參與的一種NOS-誘導(dǎo)-NOS(iNOS)不依賴鈣和鈣調(diào)蛋白，并通過(guò)脂多糖(LPS)和細(xì)胞因子(IFN-γ，TNF等)的刺激而表達(dá)。因?yàn)榄h(huán)加氧酶-2(COX-2)也是通過(guò)這種刺激激活從而產(chǎn)生炎性介導(dǎo)分子、前列腺素，所以COX-2和iNOS的表達(dá)密切相關(guān)，因此所產(chǎn)生的NO也影響COX-2的表達(dá)。iNOS的表達(dá)選擇性地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，因此誘導(dǎo)其它炎性反應(yīng)的激活。所以，NO是炎性疾病中一種重要的因子。
動(dòng)脈粥樣硬化是由遺傳條件引起的動(dòng)脈變硬的一種疾病，這些條件與脂質(zhì)代謝以及諸如飲食習(xí)慣、吸煙和缺乏鍛煉等環(huán)境條件相關(guān)，而且它可導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)的疾病，諸如心臟病和腦血管疾病。動(dòng)脈粥樣硬化早期發(fā)病的一種假說(shuō)是“反應(yīng)-損傷”假說(shuō)，它指由于遺傳改變、過(guò)氧化物、高血壓、糖尿病、血漿高半胱氨酸濃度升高和微生物感染等因素，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞不能保持正常的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而發(fā)生機(jī)能障礙。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生機(jī)能障礙時(shí)，細(xì)胞粘附分子的表達(dá)增高，細(xì)胞傳遞增強(qiáng)，然后免疫細(xì)胞、血小板和脂肪的粘附以及向組織的傳遞開始增強(qiáng)。炎性反應(yīng)，諸如炎癥介導(dǎo)因子和免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)因子的分泌導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化損害的發(fā)生。在這里，由于氧化作用、糖類結(jié)合、蓄積和糖蛋白結(jié)合等因素，導(dǎo)致血液中低密度脂蛋白(LDL)變成修飾LDL(MLDL)，它引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌的刺激和破壞。因此，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞上VCAM-1的表達(dá)和炎癥細(xì)胞的炎癥介導(dǎo)因子的釋放升高時(shí)，LDL溢出并蓄積至內(nèi)皮細(xì)胞下，蓄積的LDL和氧化的MLDL重復(fù)誘導(dǎo)諸如巨噬細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞流入和激活的過(guò)程，結(jié)果損害處的炎癥增強(qiáng)。此后，流入至這個(gè)損害處的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞釋放的水解酶、炎癥介導(dǎo)因子和生長(zhǎng)因子使此斑點(diǎn)發(fā)生壞死。通過(guò)單核細(xì)胞流入至壞死灶的重復(fù)過(guò)程，平滑肌的運(yùn)動(dòng)和分化，以及纖維組織的形成，損害組織生長(zhǎng)為一種纖維組織復(fù)合結(jié)構(gòu)，它在壞死組織中覆蓋著纖維物質(zhì)，核心部分是MLDL。從生長(zhǎng)的損害組織中產(chǎn)生血栓，動(dòng)脈變硬，并且發(fā)生循環(huán)系統(tǒng)疾病，諸如血流障礙物。因此，在血液中諸如膽固醇和LDL等的脂肪量升高時(shí)，發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，但僅僅是脂肪蓄積時(shí)，它并不發(fā)生。相反，動(dòng)脈粥樣硬化是一種典型的炎性反應(yīng)，其中內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞與脂肪涌入并蓄積在動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞下，此后損害發(fā)展，以及最后細(xì)胞壞死等的一系列過(guò)程相關(guān)。
藿香是一種多年生植物，它屬于唇形科，分布在東北亞，包括朝鮮、日本、中國(guó)等地。在朝鮮，它主要野生在南部地區(qū)或在某些地區(qū)栽培。在中藥中，這種植物的地上部分稱為廣藿香(藿香的別名)，一本中國(guó)書“Myoneubyolok”說(shuō)到“它解除機(jī)體的惡氣和外界疫毒，并治療假霍亂，即治療嘔吐和腸痙攣”。在普通人中，其葉子用作各種湯中的調(diào)料，諸如泥鰍湯，花用作蜜源。
對(duì)藿香成分的研究報(bào)告到具有多種揮發(fā)油、倍半萜、二萜、三萜、類黃酮、phenylpropanoid和類胡蘿卜素。對(duì)藿香生理活性的研究報(bào)告到提取物的抗菌活性[Phytother.Res.14(3)，210-212，2000；J.Food Sci.Nutr.4(2)，97-102，1999]，抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999；U.S.Pat.No.5776462]和對(duì)單胺氧化酶的抑制活性[The Pharmaceutical Societyof Korea 42(6)，634-638，1998]。另外還報(bào)告有揮發(fā)油的抗菌活性[中國(guó)藥學(xué)雜志35(1)，9-11，2000；Weishengwuxue Zazhi 18(4)，1-4，16，1998]和驅(qū)蚊活性[中國(guó)專利No.1044205]，類胡蘿卜素的抗癌活性[The Korean Society of Pharmacognosy 30(4)，404-408，1999]，二萜的抗癌活性[J.Nat.Prod.58(11)1718-1821，1995]和抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(1)，75-77，1999]，phenylpropanoid的抗病毒活性[Arch.Pharm.Res.22(5)，520-523，1999]，抗氧化活性[The Korean Society of AgriculturalChemistry and Biotechnology 42(3)，262-266，1999]和抗補(bǔ)體活性[The Korean Society of Pharmacognosy 27(1)，20-25，1996；The Korean Society of Agricultural Chemistry andBiotechnology 39(2)，147-152，1996]。但是無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外，尚未報(bào)告藿香提取物的抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。
另一方面，已經(jīng)報(bào)告椴素存在于各種植物中，它是一種類黃酮金合歡素的葡萄糖-糖苷化合物。
對(duì)椴素生理活性的研究報(bào)告有抗氧化活性[J.Food Sci.Nutr.4(1999)，221-225；Indian J.Chem.，Sect.BOrg.Chem.Incl.Med.Chem 36B(1997)，1201-1203]和對(duì)黃嘌呤氧化酶的無(wú)任何抑制活性[J.Nat.Prod.51(1988)，345-348]。但是，無(wú)論是國(guó)內(nèi)還是國(guó)外尚未有關(guān)于椴素抗炎活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的任何報(bào)告。
本發(fā)明的總結(jié)因此，本發(fā)明人研究了用于食品和藥物目的的天然原料藥物的抗炎活性和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性，以選擇不妨礙正常脂質(zhì)代謝，并且可控制抗炎活性引起的動(dòng)脈粥樣硬化損害進(jìn)展的天然藥物。結(jié)果，本發(fā)明成功地發(fā)現(xiàn)了藿香提取物具有對(duì)各種炎性因子的抑制活性和良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性，它可顯著地減輕與炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化的損害。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種藿香提取物和通過(guò)分離-提純從其中獲得的椴素，因?yàn)樗鼈兙哂锌寡谆钚院涂箘?dòng)脈粥樣硬化活性，所以它們作為藥物和食品添加劑可有效地預(yù)防并治療炎性疾病、與炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病。
附圖的簡(jiǎn)要描述附

圖1顯示椴素對(duì)內(nèi)皮分子誘導(dǎo)的劑量依賴效應(yīng)。用10或100μM椴素將HUVECs預(yù)孵育2小時(shí)，并用TNF-a(10ng/ml)刺激16小時(shí)，對(duì)VCAM-1或同位型對(duì)照染色，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
附圖2顯示藿香提取物對(duì)用膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠油紅O染色的主動(dòng)脈瓣損傷區(qū)域中動(dòng)脈粥樣硬化損傷的影響。心臟主動(dòng)脈瓣的典型截面圖(×100)，(A)選自對(duì)照組，(B)選自1％藿香提取物飲食組。
附圖3顯示使用鼠巨噬細(xì)胞-2的單克隆抗體(MOMA-2，SerotecInc.NC.USA)后，膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠的主動(dòng)脈瓣損傷處巨噬細(xì)胞蓄積的免疫化學(xué)染色(×100)，(A)為對(duì)照組，(B)為1％藿香提取物飲食組。
附圖4顯示椴素對(duì)膽固醇飲食喂養(yǎng)8周的Ldlr-/-鼠的主動(dòng)脈瓣損傷處的動(dòng)脈粥樣硬化損傷的影響。心臟主動(dòng)脈瓣的典型截面圖(×40)，(A)選自對(duì)照組，(B)選自1％藿香提取物飲食組。
本發(fā)明詳細(xì)描述本發(fā)明涉及一個(gè)具有抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化活性的組合物，此組合物中包含藿香提取物和通過(guò)分離-提純從其提取物中獲得的椴素作為活性成分。
下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。
按照本發(fā)明，藿香提取物或通過(guò)分離-提純獲得的椴素具有炎性因子的抑制活性，即抗補(bǔ)體活性，對(duì)ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的抑制活性，以及對(duì)NO產(chǎn)生的抑制活性，這樣，由于其對(duì)炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化損傷良好的抑制活性，所以它不僅對(duì)炎癥疾病，而且對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化均可進(jìn)行有效地預(yù)防和治療。
因此，本發(fā)明包括藥物或食品添加劑，其含有的藿香提取物和通過(guò)分離-提純獲得的椴素作為活性成分。
下面更詳細(xì)地描述本發(fā)明的藿香提取物和椴素的分離-提純過(guò)程。
干燥整個(gè)藿香植物，用低級(jí)醇提取，然后濃縮，獲得藿香的提取物。此提取物的分餾收率約為干燥藿香重量的10-20％。因此，將所得藿香提取物懸浮在水中，充分搖動(dòng)后用相同體積的正己烷分餾，并按此順序加入氯仿和低級(jí)醇分餾，然后獲得通過(guò)溶劑分餾的餾分。此處，低級(jí)醇為1到6個(gè)碳原子的烷基醇，需要的是正丁醇。通過(guò)溶劑分餾后進(jìn)行諸如硅膠柱色譜法和高速液相色譜法的常規(guī)方法?；蛘呖蓱?yīng)用常用的分離-提純方法，諸如再結(jié)晶。
在如上述所述獲得的藿香提取物和通過(guò)分離-提純獲得的椴素中分別檢測(cè)角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥小鼠中對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抗補(bǔ)體活性，對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性，對(duì)VCAM-1表達(dá)的抑制活性和對(duì)NO產(chǎn)生的抑制活性，以及抗炎活性和動(dòng)脈粥樣硬化損傷的抑制活性。
藿香提取物具有抗補(bǔ)體活性，它可強(qiáng)烈地抑制人抗免疫復(fù)合物血清的補(bǔ)體活性。而且，它強(qiáng)烈地抑制ICAM-1對(duì)THP-1單核細(xì)胞的白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)的表達(dá)，此THP-1細(xì)胞通過(guò)腫瘤壞死因子-a(TNF-a)誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)。而且，它對(duì)脂多糖(LPS)活化的小鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的NO產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的抑制活性。另外，它還在患有角叉菜膠誘導(dǎo)急性炎癥的小鼠中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗炎活性，而且當(dāng)用加入飼料中的1％藿香提取物飼養(yǎng)低密度脂蛋白受體缺乏鼠(LDLR-/-mice)時(shí)，對(duì)照組主動(dòng)脈竇處的動(dòng)脈粥樣硬化損傷明顯減輕。
另外，已證實(shí)藿香提取物己烷餾分具有上述強(qiáng)烈的抗補(bǔ)體活性和對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性，氯仿餾分具有強(qiáng)烈的對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性和對(duì)NO產(chǎn)生的抑制活性，丁醇餾分具有強(qiáng)烈的對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性。
同時(shí)，因?yàn)楸景l(fā)明包括藥物和食品添加劑，其所含藿香提取物和通過(guò)分離-提純獲得的椴素為活性成分，所以制備藥物和食品添加劑的方法與所熟知的方法一致。
因?yàn)檗较闾崛∥锖烷菜厥翘烊坏男问?，所以?yīng)用中可采用其自身的形式，但是也可以將其與制藥中所允許的載體、成形劑和稀釋劑混合制成粉末、顆粒、膠囊或注射劑。從很久以前藿香提取物就已經(jīng)用于食品和藥物，而且劑量不受限制，并且可根據(jù)內(nèi)吸收性、體重、患者年齡、性別、健康狀況、給藥時(shí)間、給藥方法、排泄率和疾病的程度進(jìn)行改變。一般情況下，作為活性成分的藿香提取物(濃縮狀態(tài))和椴素的所想要的量為0.1-100mg/kg(體重)。因此，考慮到有效劑量的限制，必須制備含有本發(fā)明活性成分的組合物，而且一旦需要，例如觀察者或?qū)＜业臎Q定和個(gè)人的要求，則可間斷地應(yīng)用或進(jìn)行幾次特殊給藥。
同時(shí)，當(dāng)將藿香提取物和椴素制備為食品添加劑時(shí)，它們可包括在諸如飲料、口香糖、油酥點(diǎn)心等食品中。
如上述含有藿香提取物和椴素作為活性成分的藥物和食品添加劑善于預(yù)防和治療炎性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病。
下面應(yīng)用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，然而，本發(fā)明的范圍將不限制在下面的實(shí)施例中。
制備實(shí)施例1藿香提取物的制備和應(yīng)用溶劑分餾采集、干燥和精細(xì)剪切農(nóng)場(chǎng)中栽培的30kg藿香的地上部分，然后將其保持在甲醇(120L)中3天。將提取物(30kg)濃縮3遍，獲得提取物(3.5kg)。然后將一些提取物(2.5kg)懸浮在水(10L)中，并用正己烷(10L)分餾2遍。結(jié)果，獲得380g正己烷餾分。隨后，按上述方法用氯仿和正丁醇對(duì)其進(jìn)行分餾，并濃縮。結(jié)果，獲得590g氯仿餾分，450g正丁醇餾分和980g水餾分。
制備實(shí)施例2從藿香中分離-提純椴素采集、干燥和精細(xì)剪切農(nóng)場(chǎng)中栽培的藿香地上部分后，獲得30kg原料。將其保持在甲醇(120L)中3天，通過(guò)將其(30kg)提取3遍，獲得提取物(3.5kg)。
然后將一些提取物(2.5kg)懸浮在水(10L)中，用氯仿(10L)分餾，并重復(fù)此步驟2遍，除去氯仿餾分。隨后，按照上述方法用正丁醇對(duì)其進(jìn)行分餾，獲得450g正丁醇餾分。將吸附于硅膠(1kg)的正丁醇餾分(150g)接受填充有硅膠(4kg)的柱色譜法(25×75cm)，然后用氯仿-甲醇混合物(甲醇比例5％～10％)洗脫含椴素的餾分。將剩余的餾分(300g)保持在甲醇(10L)中，并用甲醇將此處獲得的沉淀沖洗數(shù)遍，獲得含椴素超過(guò)90％的沉淀。應(yīng)用高速液相色譜法將上述2種方法獲得的純椴素與含化合物的椴素分離開。
實(shí)施例1抗補(bǔ)體活性采用Meyer等[Kabat，E.A.和Mayer M.M.(1961)《試驗(yàn)免疫化學(xué)》第2版Charles and Thomas，USA]的方法的改良方法進(jìn)行補(bǔ)體系統(tǒng)的抗補(bǔ)體活性的測(cè)定，試驗(yàn)方法如下。
用明膠-佛羅那緩沖溶液(1.8mM巴比妥鈉，3.1mM巴比妥酸，0.1％明膠，0.141M鹽，0.3％疊氮化鈉，0.5mM氯化鎂，0.15mM氯化鈣，pH7.3)沖洗新鮮綿羊紅細(xì)胞3遍，然后將其濃度調(diào)整為5×108細(xì)胞數(shù)/ml。在上述緩沖溶液中將抗體(抗綿羊紅細(xì)胞基質(zhì)兔抗血清，S-1389，Sigma)稀釋至1/100，與相等體積的綿羊血細(xì)胞稀釋溶液混合，在37℃的孵化器中緩慢攪拌1小時(shí)，制備出致敏紅細(xì)胞(EA)，用冷緩沖溶液將其沖洗2遍，并將濃度調(diào)整至5×108細(xì)胞數(shù)/ml。從人血液中獲得的補(bǔ)體(血清)在2500×g下離心后，將其在緩沖液中稀釋至1/90，與40μl EA溶液、80μl補(bǔ)體稀釋溶液和80μl緩沖溶液混合，并將其置于37℃孵化器中進(jìn)行反應(yīng)。然后在離心后，立即在504nm下測(cè)定100μl上層溶液的吸光度。按照濃度測(cè)定每個(gè)抗體和補(bǔ)體(血清)的吸光度，并測(cè)定50％溶血(標(biāo)準(zhǔn)溶血)發(fā)生的抗體和血清(補(bǔ)體)的稀釋濃度。隨后，將融化在DMSO中的試驗(yàn)樣品在80μl緩沖溶液中稀釋至2.5％，為達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)溶血將其加入，然后將吸光度的測(cè)定重復(fù)3遍，并計(jì)算吸光度的下降。然后用此，將對(duì)試驗(yàn)樣品溶血的抑制活性轉(zhuǎn)化為抗補(bǔ)體活性。

結(jié)果，藿香提取物的正己烷餾分和氯仿餾分顯示高的抗補(bǔ)體活性，如表1所示。
表1
實(shí)施例2對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性下面是對(duì)THP-1細(xì)胞的ICAM-1表達(dá)抑制活性的試驗(yàn)方法。
在CO2孵化器(5％CO2、相對(duì)濕度95％、37℃)中用加入10％胎牛血清(Gibco BRL 26140-079，F(xiàn)BS)的RPMI-1640肉湯(RPMI-1640，Gibco BRL 23400-021，1.62％；0.2％NaHCO3；1％混合有青霉素和鏈酶素的抗菌劑)培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。在DMSO中融化試驗(yàn)樣品，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋至5％以下，并加入反應(yīng)溶液，達(dá)原先的5％，以使終溶液中此融化樣品的DMSO濃度不超過(guò)0.25％。將200μl THP-1細(xì)胞(2.5×105細(xì)胞/ml)分入96孔板的每個(gè)孔中，每個(gè)孔中添加了在恒濃度下制備的10μl溶液。在37℃的CO2孵化器中將其培養(yǎng)1小時(shí)后，加入TNF-a(終濃度10ng/ml)，誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)，并在CO2孵化器中再培養(yǎng)16小時(shí)。準(zhǔn)備反應(yīng)溶液，加入25μl戊二醛緩沖溶液(PBS中戊二醛濃度為2.08％)，以分離非特異性結(jié)合部分，使細(xì)胞處于良好狀態(tài)，用PBST(PBS中tween-20濃度0.005％)沖洗，加入3％脫脂乳。再次沖洗后，按順序加入一抗(抗人ICAM-1)和二抗(抗鼠IgG過(guò)氧化物酶綴合物)，加入200μl著色用底物溶液(OPD過(guò)氧化物酶底物(Sigma P-9187)，在0.05M磷酸鹽-枸櫞酸鹽緩沖液中)，然后加入50μl 3M HCl，5-10分鐘后停止反應(yīng)。然后，在測(cè)定490 nm下的吸光度和TNF-a引起THP-1細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)后，計(jì)算樣品所致表達(dá)的抑制率。
表2
如表2所示，藿香提取物、其溶劑餾分和椴素對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制活性低于抗炎藥物地塞米松，但是正己烷餾分和氯仿餾分特別顯示出良好的抑制活性。地塞米松是一種甾類藥物，它與其它甾類藥物一樣，具有良好作用的同時(shí)，長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)副作用(腎功不全、炎癥加重、糖尿、肌肉萎縮、生長(zhǎng)抑制、骨質(zhì)疏松等)。但是藿香提取物和椴素沒(méi)有這些副作用。
實(shí)施例3對(duì)VCAM-1表達(dá)的抑制活性下面是對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)VCAM-1表達(dá)的抑制活性的試驗(yàn)方法。
用加入100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的EGM-2 Bulletkit肉湯培養(yǎng)基[盒內(nèi)含500ml瓶裝內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基-2(EBM-2，Clonetics CC-3156，MD，USA)]在CO2孵育器中培養(yǎng)HUVEC。在DMSO中融化試驗(yàn)樣品，其在終反應(yīng)溶液中的濃度保持在0.1％以下。每組所用的HUVEC為兩培養(yǎng)皿(ψ10cm，2×106個(gè)細(xì)胞)，并在樣品處理前交換肉湯培養(yǎng)基。首先，將終濃度100μM和10μM的椴素預(yù)處理2小時(shí)。然后，將每組TNF-a處理為10ng/ml，并誘導(dǎo)VCAM-1表達(dá)16小時(shí)。用PBS沖洗2遍，并用胰蛋白酶(0.025％)作用5分鐘后，收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞在15ml試管中離心后，除去上層溶液，用PBS懸浮細(xì)胞沉淀物，再次離心細(xì)胞并沖洗。用PBS沖洗細(xì)胞2遍后，將細(xì)胞懸浮在100μl加入0.5.％BSA(牛血清白蛋白)的PBS中，并加入鼠抗人單克隆抗體(Rb 1/9；1μg/ml)。誘導(dǎo)單克隆抗體與冰上的細(xì)胞結(jié)合30分鐘后，用冷PBS沖洗這些細(xì)胞3遍，并在含有FITC(異硫氰酸熒光素)的冰中孵育40分鐘，此處FITC與山羊F(ab’)2抗-鼠IgG結(jié)合，其在PBS中的稀釋度為1∶25(W/W)。然后用1％低聚甲醛固定細(xì)胞，并通過(guò)FACScan(Bio-Rad，USA)分析，測(cè)定試驗(yàn)樣品對(duì)VCAM-1表達(dá)的抑制活性。
表3和附圖1顯示對(duì)椴素處理的HUVEC組的VCAM-1表達(dá)的抑制活性，并證實(shí)對(duì)VCAM-1表達(dá)具有強(qiáng)烈的抑制作用。
表3
實(shí)施例4對(duì)NO產(chǎn)生的抑制活性下面是對(duì)鼠單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞RAW264.7(RAW264.7細(xì)胞)NO產(chǎn)生的抑制活性的試驗(yàn)方法，此細(xì)胞的活化是由脂多糖誘導(dǎo)的。
用Sherman等的方法(Sherman et.al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.191，1301-1308，1993)的改良方法進(jìn)行此試驗(yàn)。測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的NO3產(chǎn)生和樣品對(duì)其產(chǎn)生的抑制率，NO3是NO的一種穩(wěn)定的氧化物。將LPS(10μg/ml)加入在Dulbecco’s ModifiedEagle’s培養(yǎng)基(Gibco BRL，USA，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，10％FBS，6g/L HEPES，3.7g/L NaHCO3)中培育的RAW264.7細(xì)胞中，并誘導(dǎo)活化，然后在CO2孵化器(5％CO2、相對(duì)濕度95％、37℃)中培育RAW264.7細(xì)胞48小時(shí)。然后，離心(1000rpm，10分鐘)此培養(yǎng)基，獲得上層溶液，將100μl Griess試劑(37.5mM對(duì)氨基苯磺酸、12.5mM二鹽酸化N-(1-萘基)乙二胺、6.5mM鹽酸)加入此上層溶液中，在室溫下培育10分鐘，然后通過(guò)分光光度計(jì)在540nm下測(cè)定吸光度。應(yīng)用NO3濃度吸光度相關(guān)系數(shù)計(jì)算RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的NO3濃度，其相關(guān)系數(shù)是通過(guò)在0-50μM中制備的硝酸鹽得出的。在DMSO中融化試驗(yàn)樣品，并在LPS處理前2小時(shí)加至RAW264.7細(xì)胞中，濃度達(dá)0.1％，然后通過(guò)測(cè)定反應(yīng)后NO3濃度，計(jì)算樣品對(duì)NO3產(chǎn)生的抑制率。
NO濃度的標(biāo)準(zhǔn)等式＝吸光度(540nm)×179.4215-8.5221
結(jié)果，如表4中所示，在藿香提取物、氯仿餾分和正丁醇餾分中發(fā)現(xiàn)對(duì)NO產(chǎn)生的高的抑制活性。
表4
實(shí)施例5角叉菜膠誘導(dǎo)急性炎癥模型的抗炎活性試驗(yàn)動(dòng)物為雄性Sprague-Dawley大鼠(210-220g)，角叉菜膠為炎癥試劑，研究試驗(yàn)樣品對(duì)水腫模型的水腫抑制率。試驗(yàn)方法如下。
200mg/kg藿香提取物懸浮在水中，用作試驗(yàn)樣品，用其飼養(yǎng)每只鼠，1小時(shí)后，在鼠后腿附近皮下給予0.1ml的在0.85％鹽水中的1％角叉菜膠懸浮液。給藥后的5小時(shí)中，測(cè)定每組7只鼠的模型足底的厚度，每小時(shí)測(cè)定1次。同時(shí)，一起測(cè)定對(duì)照組(鹽水)模型足底的厚度，并根據(jù)對(duì)照組隨時(shí)間水腫的加重，研究樣品組水腫的抑制率。
表5顯示角叉菜膠誘導(dǎo)的急性炎癥模型中藿香提取物的抗炎活性。從給藥的2小時(shí)開始，藿香表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎活性，對(duì)水腫的抑制作用持續(xù)了測(cè)定的5小時(shí)。
表5
實(shí)施例6對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害的抑制活性下面詳細(xì)描述動(dòng)脈粥樣硬化損害的抑制活性的試驗(yàn)方法。
步驟I)鼠的飼養(yǎng)和藿香提取物應(yīng)用于鼠的試驗(yàn)將所用的模型，雌性LDLR-/-鼠(6-8周，平均體重16.8g)隨機(jī)分入2組，每組各10只。一組以高膽固醇飲食(15％脂肪，1.25％膽固醇，0.5％Na-膽酸鹽)飼養(yǎng)，另一組以添加了0.1％和1％試驗(yàn)樣品的上述飲食飼養(yǎng)。在試驗(yàn)期間，鼠可自由地進(jìn)食水和食物。
步驟II)模型動(dòng)脈粥樣硬化損害的測(cè)定試驗(yàn)進(jìn)行8周后，通過(guò)眼睛對(duì)所有鼠采血。然后，用PBS(磷緩沖溶液)灌流鼠的心臟和動(dòng)脈10分鐘，隨后用低聚甲醛灌流5分鐘。此過(guò)程后，摘除心臟和動(dòng)脈，浸入10％中性福爾馬林中24小時(shí)，將其置于OCT培養(yǎng)基(10.24％聚乙烯醇，4.26％聚乙二醇，80.5％非反應(yīng)成分，w/w，Life Science International，英格蘭，UK)中，然后保持于-70℃。用低溫下(-20℃)的切片機(jī)從動(dòng)脈區(qū)域開始制備冰凍切片(每個(gè)9μm)，用油紅O將6個(gè)冰凍切片染色，并用Harris蘇木精對(duì)染。然后通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助形態(tài)測(cè)定法對(duì)這些染色切片進(jìn)行定量分析，并計(jì)算每組動(dòng)物損害大小的平均值。這樣，根據(jù)對(duì)照組損害的發(fā)作，計(jì)算對(duì)樣品組損害的抑制活性。
(其中對(duì)照組指高膽固醇飲食組)(1)藿香組對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害抑制活性的試驗(yàn)結(jié)果如表6所示，與對(duì)照組相比，8周試驗(yàn)中藿香組的攝入量和體重沒(méi)有任何變化。
表6
另外，如表7所示，藿香提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害抑制作用的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用包括0.1％和1％藿香提取物的飲食飼養(yǎng)的組中，損害的大小分別下降了23％和46.6％。
表7
而且，當(dāng)對(duì)心臟的動(dòng)脈橫切面染色時(shí)，與對(duì)照組相比，1％藿香提取物組中炎癥所致?lián)p害(壞死組織)的大小顯著下降(附圖2)。另外，當(dāng)僅對(duì)損害的巨噬細(xì)胞染色時(shí)，與對(duì)照組相比，1％藿香提取物組中巨噬細(xì)胞的聚集顯著下降(附圖3)。
因此，動(dòng)脈粥樣硬化損害進(jìn)展至巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞下的聚集和炎癥顯示，藿香提取物顯著地降低了炎癥所致?lián)p害的發(fā)展。
(2)椴素組對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害抑制活性的試驗(yàn)結(jié)果如表8所示，椴素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害抑制作用的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用包括1％椴素的飲食飼養(yǎng)的組中，損害的大小下降了41.9％。
表8
如表8所示，1％洛伐他汀組中對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害的抑制活性高于1％椴素組，但是本發(fā)明的椴素是安全的，沒(méi)有任何副作用，而洛伐他汀對(duì)肝臟具有毒性作用。另外，可以肯定的是本發(fā)明的椴素組比對(duì)照組更有效。
而且，心臟的動(dòng)脈橫切面染色的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，1％椴素組中炎性反應(yīng)所致?lián)p害(壞死組織)的大小顯著下降(附圖4)。因此，在動(dòng)脈粥樣硬化損害進(jìn)展至巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞下的聚集和炎癥的過(guò)程中，證實(shí)椴素顯著地減輕了動(dòng)脈粥樣硬化損害的發(fā)展。
實(shí)施例7片劑的制備在將10g藿香提取物(包括1g椴素)、70g乳糖、15g結(jié)晶纖維素和5g硬脂酸鎂壓碎和混合后，通過(guò)直接壓片法制備片劑。每片總量為100mg，活性成分藿香提取物的量為10mg(1mg椴素)。
實(shí)施例8散劑的制備通過(guò)將10g藿香提取物(包括1g椴素)、50g玉米淀粉和40g羧基纖維素壓碎和混合，制備散劑。并通過(guò)將100mg散劑放入硬度VI的膠囊中而制備膠囊。
實(shí)施例9毒性試驗(yàn)從很早以前開始，藿香提取物和通過(guò)分離-提純獲得的椴素是無(wú)毒的原料和天然藥物，用作食品和藥物。將在二甲亞砜中溶解并在水中稀釋的1g/kg成分給予每只鼠(10只/組)，7天后未發(fā)現(xiàn)任何鼠死亡。
實(shí)施例10包括藿香提取物的飲用組分將李子提取物(李子固體提取物(固體量69°Bx)，制造商韓國(guó)Hadong National Agricultural Cooperative Federation)、中國(guó)榅桲、大獨(dú)活、干姜、五味子、肉桂(漢城Kyongdong市場(chǎng))、葡萄汁(固體量65°Bx，制造商Comax international Corp.)和梨汁(制造商Hanmi aromatics chemistry)制備為包含藿香提取物的飲用組分。
首先，加入天然藥物重量10倍的水，然后在100℃將中國(guó)榅桲、大獨(dú)活、干姜、五味子和肉桂等天然藥物水熱提取30分鐘。將這些保持在4℃24小時(shí)，在將它們離心10分鐘后，應(yīng)用上層溶液的天然藥物提取物。
將所用的李子提取物的李子固體提取物(69°Bx)稀釋至10°Bx，所用的葡萄汁(65°Bx)和梨汁(69°Bx)不稀釋。
對(duì)于包含藿香提取物的飲用組分，將0.1％藿香提取物、0.2％李子提取物、0.3％干姜提取物、0.3％中國(guó)榅桲提取物、0.01％肉桂提取物、5.0％梨汁和17％超級(jí)果糖(superfructose)在水中稀釋以調(diào)整為100ml，在95℃進(jìn)行射線照射和處理15秒，制備為飲料商品。
上面所述是制備包含藿香提取物的飲料商品的方法，也可制備相同用途的包含椴素的飲用商品，其中椴素替代藿香提取物。
如上所述，本發(fā)明的藿香提取物和通過(guò)分離-提純獲得的椴素可抑制各種炎癥因子的活化、產(chǎn)生和表達(dá)，在動(dòng)物中具有抗炎活性，而且對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化損害的產(chǎn)生具有顯著的抑制活性，因此，它們可用作預(yù)防或治療炎性疾病、與炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和由動(dòng)脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病的藥物或食品添加劑。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，它含有藿香提取物作為活性成分。
2.按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說(shuō)的提取物含有正己烷、氯仿或正丁醇分餾的溶劑餾分。
3.按照權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所說(shuō)的提取物含有椴素作為活性成分。
4.按照權(quán)利要求1或3的藥物組合物，其中所說(shuō)的組合物對(duì)炎癥反應(yīng)中的一種因子-補(bǔ)體系統(tǒng)具有抑制活性。
5.按照權(quán)利要求1或3的藥物組合物，其中所說(shuō)的組合物可抑制細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)。
6.按照權(quán)利要求1或3的藥物組合物，其中所說(shuō)的組合物可抑制一氧化氮的產(chǎn)生。
7.按照權(quán)利要求1或3的藥物組合物，其中所說(shuō)的組合物具有抗炎活性及抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。
8.食品添加劑組合物，它包括藿香提取物或通過(guò)分離-提純獲得的椴素作為活性成分，并具有抗炎活性及抗動(dòng)脈粥樣硬化活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含藿香和通過(guò)分離－提純獲得的椴素(tilianin)的組合物，它用于抗炎和抗動(dòng)脈粥樣硬化，而且更特別的是，本發(fā)明涉及藿香提取物以及通過(guò)分離－提純從其中獲得的椴素，它們不僅可有效地預(yù)防和治療炎癥疾病，而且可有效地預(yù)防和治療與炎性反應(yīng)相關(guān)的動(dòng)脈粥樣硬化和由動(dòng)脈粥樣硬化引起的循環(huán)系統(tǒng)疾病，這是因?yàn)樗鼈兛闪己玫匾种蒲仔苑磻?yīng)中的一種因子－補(bǔ)體系統(tǒng)的活性，細(xì)胞間粘附分子－1(ICAM－1)和血管細(xì)胞粘附分子－1(VCAM－1)的表達(dá)，以及一氧化氮(NO)的產(chǎn)生。它們還可顯著地減輕炎性反應(yīng)所致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
文檔編號(hào)A61P9/10GK1518454SQ01823069
公開日2004年8月4日 申請(qǐng)日期2001年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月27日
發(fā)明者李炯圭, 吳世洋, 安境燮, 崔順子, 金正姬, 吳九澤, 弘廷宙, 樸成圭, 南窮佑 申請(qǐng)人:韓國(guó)生命工學(xué)研究院