專利名稱：廣升麻提取物、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及天然藥物廣升麻的提取物、其制備方法、含其的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
廣升麻全稱廣東升麻，為菊科植物麻花頭Serratula chinensis S.Moore的干燥塊根。本品呈長紡錘形，稍扭曲，兩端稍尖，中部稍粗，長10～20cm，直徑0.5～1cm，表面灰黃色、棕褐色或黑褐色，有粗縱皺紋和少數(shù)須根痕。質(zhì)堅硬而脆，易折斷。斷面暗藍色或灰黃色，略呈角質(zhì)狀。氣特殊，味淡，微苦澀。主治升陽，散風(fēng)，解毒，透疹。用于風(fēng)熱頭痛，咽喉腫痛，斑疹不透，中氣下陷，久瀉脫肛，子宮下墜(中華人民共和國衛(wèi)生部《藥品標準中藥材》第一冊，一九九二年)。
廣升麻是兩廣及福建等地升麻的習(xí)慣用藥，其飲片僅作中藥配方使用，由于是地方性的習(xí)慣用藥，故受關(guān)注的可能性小，有關(guān)本品的現(xiàn)代研究極少，有關(guān)本品的主要化學(xué)成分研究又未見有報道，因此該藥材沒有得到進一步的開發(fā)，本品的植物資源較豐富，主要分布于華南地區(qū)，在湖南等地已有大面積栽培，只是在中藥組方中作為飲片使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是公開一種廣升麻的提取物及其制備方法。
本發(fā)明的另一個目的是公開一種含有該提取物的藥物組合物。
本發(fā)明的還有一個目的是公開這種組合物的治療用途，即治療腦血管疾病的用途。
本發(fā)明的提取物由以下方法制備得到將廣升麻粉碎，用有機溶劑回流提取，過濾，濾液經(jīng)回收溶媒得浸膏，干燥，即得粗提物，所述有機溶劑是丙酮或醋酸乙酯或C1-4的直鏈或支鏈的脂肪族醇。
優(yōu)選的有機溶劑是乙醇。
乙醇的濃度優(yōu)選95％。
上述制備方法進一步可包括將粗提物加水溶解，必要時可加熱，濾過，濾液調(diào)pH至8～10，用醋酸乙酯或正丁醇萃取，減壓回收溶媒，萃取物減壓干燥即得精提物。
pH調(diào)節(jié)劑優(yōu)選石灰乳。
本發(fā)明提取物中含有蛻皮甾酮和其它物質(zhì)，一般地，粗提物中含有蛻皮甾酮的量為5-10％，精提物中含蛻皮甾酮的量為30-60％，因此在質(zhì)量控制中可用蛻皮甾酮的含量作為一個質(zhì)量指標。
本發(fā)明還公開了一種藥物組合物，其含有治療有效量的廣升麻提取物和藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體是指一種或幾種惰性的、非毒性的固體或液體填充物、稀釋劑、助劑等，它們不逆向與活性化合物或病人發(fā)生作用。
所述的廣升麻提取物可以是粗提物，也可以是精提物，其都有一定的藥理功效。本發(fā)明組合物的劑型可以是片劑、膠囊、丸劑、栓劑、軟膠囊、口服液、混懸劑、注射液等藥劑學(xué)上常用的劑型。
口服用藥片和膠囊含有傳統(tǒng)的賦形劑如填充物、稀釋劑、潤滑劑、分散劑以及粘合劑?？砂凑毡绢I(lǐng)域中熟知的方法進行制備。
以上活性劑的劑量將因配方而異。一般的劑量為每單位制劑中含提取物3mg～2000mg。也可根據(jù)不同的劑型選用不用的劑量。
本發(fā)明的提取物可用于制備治療腦血管疾病的藥物。其中的腦血管疾病優(yōu)選腦缺血或腦缺氧。在藥理試驗中，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，廣升麻提取物中盡管含有蛻皮甾酮，并可用此作為質(zhì)量控制指標，但是本提取物與蛻皮甾酮單體的藥理功效相當甚至更好，而蛻皮甾酮為天然植物中的單體，提取工藝復(fù)雜，收率低，制備成本高。而本發(fā)明的廣升麻提取物不僅工藝簡單，成本低，而且療效更好，這說明廣升麻提取物中起藥理活性作用的并不僅僅是蛻皮甾酮，而是有其它多種成分在同樣起藥理作用，它們或相加或協(xié)同，達到很好的療效。
以下是部分藥效學(xué)試驗及數(shù)據(jù)一、對急性實驗性不完全腦缺血小鼠的保護作用試驗結(jié)論廣升麻粗提物、精制物大、中劑量組均可延長急性不完全腦缺血小鼠的存活時間，與空白對照組比較差異性顯著(P＜0.05)，(P＜0.01)，與蛻皮甾酮組比較好于蛻皮甾酮組。
二、對插線法所致大腦中動脈缺血再灌注大鼠的保護作用試驗結(jié)論廣升麻精制物可改善動物的神經(jīng)行為學(xué)評分，降低動物的腦梗塞率、腦含水量和腦指數(shù)，與模型組比較差異性顯著(P＜0.05)。與蛻皮甾酮組比較好于蛻皮甾酮組。
1統(tǒng)計學(xué)處理計數(shù)資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示(x±S)，采用Student’s-t檢驗。計量資料數(shù)據(jù)采用秩和檢驗。
2實驗方法和結(jié)果2.1小鼠急性全腦缺血實驗2.1.1實驗分組小鼠急性全腦缺血實驗共分7組模型組，給予0.9％氯化鈉注射液，廣升麻精制物低(0.75mg/kg)、中(1.5mg/kg)、高(3mg/kg)三個劑量組、廣升麻粗提物(20mg/kg)蛻皮甾酮(3mg/kg)組、陽性藥對照組尼莫地平(20mg/kg)。給藥容積為10ml.kg-1。
2.1.2實驗方法取ICR小鼠，體重18～22g，雌雄兼?zhèn)?，隨機分為7組，1-3組給予廣升麻精制物三個劑量，第4組給予廣升麻粗提物，第5組給予蛻皮甾酮，第6組給予尼莫地平，第7組模型組給予生理鹽水，給藥三天，第三天給藥后，將小鼠固定，分離左右兩側(cè)頸總動脈合并迷走神經(jīng)，于給藥半小時后結(jié)扎雙側(cè)頸總合并迷走。記錄小鼠的呼吸維持時間，結(jié)果見表1。
2.2大鼠大腦中動脈阻斷再灌注實驗2.2.1實驗方法2.2.1.1尼龍栓子的制備參考Zea longa方法，將一長40mm，直徑0.2mm的尼龍線的一端加熱為光滑的球形。用酒精擦干凈并于距球端18.5mm處標記，置于0.9％的生理鹽水中備用。
2.2.1.2大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)腦缺血再灌注(IR)模型的制作取體重250～350雄大鼠，隨機分七組，假手術(shù)組，模型組(給予同等容積的生理鹽水)，陽性藥組(尼莫地平20mg/kg)，廣升麻精制物高劑量組(3mg/kg)，廣升麻精制物中劑量組(1.5mg/kg)，廣升麻精制物低劑量組(0.75mg/kg)，蛻皮甾酮組(3mg/kg)，給藥體積10ml/kg，給藥三天后，用10％水合氯醛麻醉(30mg/100g)。采用改良Zea longa法，將大鼠仰臥于手術(shù)臺上，頸正中切開，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)，頸外動脈(ECA)，頸內(nèi)動脈(ICA)，用0號線接扎并剪斷ECA的分支，接扎(兩道以利于剪斷)并游離ECA主干一段，沿ICA向下分離。用動脈夾夾住CCA及ICA。在ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA，經(jīng)CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動脈(ACA)，尼龍線插入深度約為18mm。再灌注時外拉尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)即可恢復(fù)大腦中動脈的供血。分別于手術(shù)3小時，24小時后給予再灌注。
2.2.2檢測指標2.2.2.1神經(jīng)行為學(xué)評分手術(shù)后參照Bederson方法進行行為學(xué)評分(1)提鼠尾離地面約1尺，觀察前肢情況。正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面。手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕肘屈曲，肩內(nèi)旋，左前肢內(nèi)收，緊貼胸臂計4分，否則0分。(2)將鼠置平滑地面上，分別推左/右肩向?qū)?cè)移動，檢查抵抗推動的阻力。正常大鼠雙側(cè)阻力明顯對稱。當右肩向左側(cè)移動時，發(fā)現(xiàn)阻力下降者，根據(jù)下降程度的不同，評為1～3分。(3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力，正常大鼠兩前肢肌張力明顯對稱。發(fā)生左前肢肌張力明顯下降者，根據(jù)下降的程度，評為1～3分。根據(jù)以上標準評分，滿分10分，分數(shù)越高，說明動物的行為障礙越嚴重。評分采用單盲法。
2.2.2.2TTC染色測量腦梗塞面積手術(shù)24小時后將大鼠斷頭取腦，將腦置冰冷的生理鹽水中10min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，將其余部分冠狀切四刀，切成五片。第一刀在腦前極與視交叉連線中間；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將腦片置5ml含有1％TTC的磷酸緩沖液中，避光溫孵30min，其中每隔7～8min翻動一次，經(jīng)染色后，正常組織呈玫瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦切片照相，剪下紅白顏色區(qū)稱重。根據(jù)“重量求面積法”分別計算出五個腦片共10個平面的總面積和梗塞去區(qū)域的面積，求出梗塞區(qū)面積占一側(cè)大于半球總面積的百分比，即梗塞范圍。
2.2.2.3測定腦指數(shù)及腦含水量MCAO后24小時斷頭取腦，稱濕重；106℃烘干至恒重，即干重，按下列公式計算腦指數(shù)和腦含水量。
腦指數(shù)＝腦濕重(g)/體重(100g)腦含水量(％)＝腦濕重(g)-腦干重(g)/腦濕重(g)×100％2.3結(jié)果
2.3.1廣升麻粗提物、精制物對小鼠急性全腦缺血的影響 結(jié)果顯示，廣升麻精制物大、中劑量組均能延長急性腦缺血小鼠的存活時間，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，(P＜0.01)，蛻皮甾酮組(3mg/kg)與廣升麻中劑量組(1.5mg/kg)作用相當。
表1廣升麻粗提物、精制物對小鼠急性全腦缺血的保護作用(X±SD)組別 劑量(mg/kg) 動物數(shù)(只)呼吸維持時間(min)模型組- 151.3±0.39尼莫地平組20mg/kg 152.45±0.89**蛻皮甾酮組3 151.89±0.73*精制物低劑量組0.75141.48±0.34精制物中劑量組1.5 151.95±0.84*精制物高劑量組3 162.16±0.81**粗提物組 20 151.82±0.63*與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3.2廣升麻精制物對局灶性腦缺血大鼠行為缺陷程度的影響大腦中動脈阻斷后，所有動物出現(xiàn)神經(jīng)運動功能障礙。廣升麻精制物三劑量組對此均有不同程度的改善作用，其中大劑量組與模型組比較，差異顯著(P＜0.05)。見表2。
表2廣升麻精制物對缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分及腦梗塞率的影響(n，x±s)組別 樣本數(shù)(n) 行為學(xué)評分 腦梗塞率(％)4h 24h假手術(shù)組 10 2.67±1.75**1.80±0.45*0.00±0.00**模型組 86.57±1.72 5.17±2.40 12.71±5.89尼莫地平組 10 3.80±1.79*2.40±0.55*6.40±2.07*蛻皮甾酮組 96.27±1.30 4.75±2.10 7.78±4.28廣升麻精制物低劑量組 85.80±1.10 4.00±2.35 6.41±4.57*廣升麻精制物中劑量組 86.40±0.55 4.80±2.28 8.54±3.98廣升麻精制物高劑量組 95.25±2.12 2.88±1.13*7.86±2.30*與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
2.3.3廣升麻精制物對大鼠局灶性腦梗塞范圍的影響MCAO模型組大鼠腦冠狀切面可見較大蒼白區(qū)，與正常組織界面較明顯。廣升麻精制物可縮小局灶性腦缺血大鼠梗塞范圍，其中廣升麻精制物大劑量組與模型組相比，差異性顯著(P＜0.05)。見表3。
2.3.4廣升麻精制物對大鼠局灶性腦梗塞范圍的影響MCAO后模型組大鼠的腦含水量及腦指數(shù)與假手術(shù)組比較均有所上升，且差異顯著(P＜0.05)；廣升麻精制物三劑量組均可降低造模后大鼠腦含水量和腦指數(shù)，與模型組比較有顯著性的差異(P＜0.05)，(P＜0.01)。蛻皮甾酮組與模型組比較無顯著性的差異。
表3廣升麻精制物對缺血再灌注大鼠腦指數(shù)及腦含水量的影響(n，x±s)組別樣本數(shù)(n) 腦指數(shù)(g/100g) 腦含水量(％)假手術(shù)組10 0.51±0.08*70.64±3.25*模型組 8 0.58±0.04 74.33±1.80尼莫地平組 10 0.51±0.07*70.40±2.89*蛻皮甾酮組 9 0.55±0.07 72.78±3.28廣升麻精制物低劑量組8 0.56±0.09 71.89±1.49*廣升麻精制物中劑量組8 0.52±0.06*72.17±4.05廣升麻精制物高劑量組9 0.55±0.09 71.48±1.82**與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01三、廣升麻提取物抗腦缺氧作用的實驗研究1.試驗材料1.1供試品廣升麻粗提取物，廣升麻精提物。
1.2藥物配制取廣升麻粗提取物加蒸餾水配制成每ml含20mg的溶液；取廣升麻精提取物加蒸餾水配制成每ml含4mg的溶液；取亞硝酸鈉4g，加蒸餾水至200ml(2％的亞硝酸鈉溶液)1.3動物SD大鼠，體重180-200g。
2.實驗方法與結(jié)果2.1大鼠對腦缺氧的影響取大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，即(1)對照組蒸餾水；(2)廣升麻粗提取物高劑量組40mg/kg；(3)廣升麻粗提取物低劑量組20mg/kg(4)廣升麻精提取物高劑量組8mg/kg；(5)廣升麻精提取物低劑量組4mg/kg；各組按上述劑量給藥，于給藥后一小時，腹腔注射3％的亞硝酸鈉溶液，記錄其死亡時間，觀察大鼠腦缺氧的情況。實驗數(shù)據(jù)進行t檢驗。結(jié)果見表42.2實驗結(jié)果表4廣升麻粗提取物對大鼠腦缺氧的影響組別動物數(shù) 劑量死亡時間(min)(只) (mg/kg)
對照組10---- 18.3±2.2粗提物大劑量組1040 22.6±4.3粗提物小劑量組1020 20.0±1.7精提物大劑量組10822.1±5.3精提物大劑量組10421.1±1.03.實驗結(jié)論廣升麻粗、精提取物均能提高機體的耐缺氧能力，與對照組比較有顯著性差異。
具體實施例方式
實施例1廣升麻精制物的制備取廣升麻細粉200克，加丙酮2000ml回流提取3次，每次1.5小時，合并濾液，減壓回收丙酮至無丙酮味，殘液加150ml水加熱至60℃溶解，趁熱濾過，濾液加石灰水調(diào)節(jié)pH＝8，加醋酸乙酯萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加醋酸乙酯飽和的水洗滌3次，每次10ml，減壓回收醋酸乙酯至無醋酸乙酯味，萃取物80℃減壓干燥2小時，得2.5克廣升麻精制物。
實施例2廣升麻精制物的制備取廣升麻細粉200克，加甲醇2000ml回流提取3次，每次1.5小時，合并濾液，減壓回收甲醇至干，殘渣加200ml水加熱至60℃溶解，趁熱濾過，濾液加石灰水調(diào)節(jié)pH＝9，加醋酸乙酯萃取3次，每次60ml，合并萃取液，加醋酸乙酯飽和的水洗滌3次，每次10ml，減壓回收醋酸乙酯至無醋酸乙酯味，萃取物80℃減壓干燥2小時，得3.2克廣升麻精制物。
實施例3廣升麻精制物的制備取廣升麻細粉200克，加95％乙醇2000ml回流提取3次，每次1.5小時，合并濾液，減壓回收乙醇至干(8％得率)，殘渣加160ml水加熱至70℃溶解，趁熱濾過，濾液加石灰水調(diào)節(jié)pH＝10，加水飽和的正丁醇萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加正丁醇飽和的水洗滌3次，每次10ml，減壓回收溶劑至干，萃取物80℃減壓干燥2小時，得3克廣升麻精制物。
實施例4廣升麻精制物的制備取廣升麻細粉200克，加醋酸乙酯1000ml回流提取3次，每次1.5小時，合并濾液，減壓回收醋酸乙酯，殘液加200ml水加熱至65℃溶解，趁熱濾過，濾液加石灰水調(diào)節(jié)pH＝8.5，加水飽和的正丁醇萃取3次，每次50ml，合并萃取液，加正丁醇飽和的水洗滌3次，每次10ml，減壓回收溶劑至干，萃取物80℃減壓干燥2小時，得2克廣升麻精制物。
實施例5藥物片劑取2克廣升麻精制物，粉碎過100目篩，另取淀粉25.6克、微晶纖維素6.4克、吡咯烷酮1.6克，分別粉碎過100目篩，上述原輔料混勻，加水制成軟材，過30目制粒，60℃干燥2小時，30目整粒，加0.3克硬脂酸鎂，混勻，壓片，即得185片。
權(quán)利要求
1.一種廣升麻提取物，由以下方法制備得到將廣升麻粉碎，用有機溶劑回流提取，過濾，濾液經(jīng)回收溶媒得浸膏，干燥，即得提取物粗提物，所述有機溶劑是丙酮、醋酸乙酯或C1-4的直鏈或支鏈的脂肪族醇。
2.權(quán)利要求1的廣升麻提取物，其中有機溶劑是乙醇。
3.權(quán)利要求2的廣升麻提取物，其中乙醇的濃度是95％。
4.權(quán)利要求1、2或3的廣升麻提取物，其制備方法進一步包括將粗提物加水溶解，濾過，濾液調(diào)pH至7～11，用醋酸乙酯或正丁醇萃取，減壓回收溶媒，萃取物減壓干燥即得精提物。
5.權(quán)利要求4的廣升麻提取物，其中pH為8。
6.權(quán)利要求4的廣升麻提取物，其中pH調(diào)節(jié)劑是石灰乳。
7.權(quán)利要求1至6中任一項的提取物用于制備治療腦血管疾病的藥物的用途。
8.權(quán)利要求8的用途，其中的腦血管疾病是腦缺血或腦缺氧。
9.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求1至6中任一項的廣升麻提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體公開了廣升麻的提取物、其制備方法、含其的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明廣升麻提取物可用于治療腦血管疾病，特別是治療腦缺血或腦缺氧。
文檔編號A61P9/10GK1562145SQ200410014710
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者黃馳 申請人:黃馳