專利名稱：一種黑平菇提取物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑平菇提取物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
提高免疫力是我國(guó)衛(wèi)生部倡導(dǎo)的健康生活中重要的部分，機(jī)體增強(qiáng)對(duì)疾病的抵抗力、抗感染、抗腫瘤和維持自身生理平衡具有重要意義。預(yù)防和改善免疫功能低下的疾病和免疫缺陷癥的有效方法是通過營(yíng)養(yǎng)學(xué)中改善膳食結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的，但在臨床上應(yīng)用的免疫增強(qiáng)劑多來源于化學(xué)合成類藥物，其中大多存在著毒副作用或成本高的問題，應(yīng)用上存在一定的局限性。而天然食品提取物往往存在著低毒、低副作用的優(yōu)勢(shì)，因此，篩選對(duì)人體安全性高，成本低廉的天然活性成分是解決這一問題的有效途徑。研究顯示，天然產(chǎn)物中存在多種具有生物活性的成分，其中展現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)活性的成分多為多糖和糖蛋白類物質(zhì)。多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中，從20世紀(jì)70年代開始人們逐漸發(fā)現(xiàn)多糖具有多方面的藥理作用，主要包括:增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、降血壓、降血脂、降血糖、抗衰老、增強(qiáng)骨髓造血機(jī)能、抗輻射、對(duì)肝腎等主要臟器的保護(hù)作用等。由于多糖多種的生物活性以及在保健、疾病治療領(lǐng)域的廣泛使用，使多糖生物資源的開發(fā)利用和研究成為天然藥物、生物化學(xué)、生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)。食用菌多糖是目前被認(rèn)為臨床效果較為確切的一類低毒并且免疫活性強(qiáng)的物質(zhì)。它們是一種非特異性免疫促進(jìn)劑，能提高、調(diào)整機(jī)體免疫功能。其作用機(jī)制多為通過各種信號(hào)傳導(dǎo)路徑激活巨噬細(xì)胞對(duì)癌癥細(xì)胞以及病原菌的細(xì)胞毒性，增大巨噬細(xì)胞的吞噬能力，刺激其分泌多種細(xì)胞分裂因子和化學(xué)干擾因子等，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能；或是通過不同的途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，在宿主防御機(jī)制中起重要作用，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)的重要作用。平燕(Pleurotusostreatus),屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina),側(cè)耳屬(PleuiOtus)。黑平菇是平菇的一個(gè)菌株，其子`實(shí)體顏色為深黑色，色澤的深淺隨溫度的變化而有變化，栽培簡(jiǎn)易，深層發(fā)酵生物量高，品質(zhì)好。到目前為止，國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于黑平菇菌株多糖增強(qiáng)免疫力的任何報(bào)道。相比較其他食用菌多糖，黑平菇更容易大量獲得其多糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黑平菇提取物及其制備方法。本發(fā)明所提供的一種黑平菇提取物的制備方法，按照包括如下步驟的方法制備:I)黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%_90%的乙醇溶液混合，加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣；2)將步驟I)獲得的濾渣與蒸餾水按照比例為Ig:10-100ml的比例混合，在70-100°C水浴中提取1-2小時(shí)，過濾，分別收集濾液和濾渣；重復(fù)此步驟的操作1-4次，合并所有的濾液；3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，離心，收集上清液；4)向步驟4)中的上清液里加入雙氧水進(jìn)行脫色，濃縮，得含黑平菇提取物的溶液。
所述方法還包括將步驟4)獲得的含黑平菇提取物的溶液與體積百分比濃度為80-100%的乙醇溶液按照體積比為1:2-4 (優(yōu)選為1:3)混合，靜置沉淀，離心，收集沉淀，取上清液重復(fù)此步驟1-4次(優(yōu)選為3次)，合并沉淀，將合并后的沉淀烘干獲得黑平菇提取物粉末；所述此步驟中的乙醇溶液的體積百分比濃度優(yōu)選為95%。
所述步驟I)中，加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)的步驟是在50_70°C水浴中回流提取30-60分鐘；所述水浴溫度優(yōu)選為60°C ;所述提取時(shí)間優(yōu)選為45分鐘。所述步驟I)中所述乙醇溶液的體積百分比濃度為85% ;所述黑平菇干粉與乙醇溶液的比例為Ig:100-300ml，優(yōu)選為Ig:100ml。所述步驟2)中，所述濾渣與蒸餾水的比例為Ig:30ml ;所述的水浴溫度為95°C ；所述提取的時(shí)間為I小時(shí)；重復(fù)所述步驟2)的操作的次數(shù)為3次。所述步驟3)中，所述三氯乙酸的終質(zhì)量百分比濃度為15%_25%，優(yōu)選為20%。所述步驟4)中，所述雙氧水的終質(zhì)量百分比濃度為10%_20%，優(yōu)選為15% ;所述濃縮后，原溶液與濃縮液的體積比例為2-5:1，優(yōu)選為4:1。所述烘干獲得黑平菇提取物粉末中的烘干溫度為40_70°C，優(yōu)選為60°C。本發(fā)明所提供的黑平菇提取物是上述方法獲得的黑平菇提取物。黑平菇由于其是人類常用食物，其中本發(fā)明提取的黑平菇提取物主要含有黑平菇多糖，安全可靠，對(duì)人體無毒副作用，可以用于制備增強(qiáng)免疫功能的藥物或者食品。本發(fā)明還保護(hù)本發(fā)明提取的黑平菇提取物在制備增強(qiáng)免疫功能的藥物或者食品中的應(yīng)用。所述增強(qiáng)免疫功能為提高碳粒廓清能力和/或提高胸腺重量和/或脾臟重量。其中，提高碳粒廓清能力體現(xiàn)在提高碳粒廓清系數(shù)，其檢測(cè)方法如實(shí)施例4所示。提高胸腺重量和/或脾臟重量(提高免疫器官重量)體現(xiàn)在提高免疫器官系數(shù)，具體檢測(cè)方法如實(shí)施例5所示。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:(1)本發(fā)明黑平菇提取物的作用效果明顯，以15、30、60mg/kg的給藥劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn),給藥14天后，均可明顯提高小鼠碳粒廓清指數(shù)，與對(duì)照差異顯著(P〈0.01)，同時(shí)上述給藥劑量實(shí)驗(yàn)中可顯著提高胸腺系數(shù)，與對(duì)照差異顯著(P〈0.05-0.01)。表明本發(fā)明對(duì)小鼠碳粒廓清指數(shù)(K值)、胸腺系數(shù)具有明顯的提高作用，能夠增強(qiáng)小鼠的免疫功能。( 2 )本發(fā)明黑平菇提取物制備原料易得，成本較低，適于生產(chǎn)和應(yīng)用。(3)本發(fā)明提取工藝簡(jiǎn)單，提取率高，穩(wěn)定性好。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所示的百分含量，如無特別說明，液體溶液含量均為體積百分含量；固體溶液含量均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、本發(fā)明黑平菇提取物的制備黑平菇提取物的制備按照如下方法進(jìn)行:I)將黑平菇在30 40°C下烘干后打碎成粉，過60 200目篩篩子獲得黑平菇干粉2g與體積百分濃度為85%的乙醇溶液200ml混合，在60°C水浴中回流提取45分鐘，去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣；
2)向上述濾渣中加入蒸餾水，固液比例為Ig:30ml，在95°C水浴中回流提取I小時(shí)，過濾，分別收集濾液和濾渣；取濾渣重復(fù)此步驟三次，合并所有的濾液。3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質(zhì)量百分濃度為20%)去除其中的蛋白，離心，收集上清液；4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質(zhì)量百分濃度為15%)進(jìn)行脫色，低壓濃縮，濃縮體積與原體積比例為4:1，得黑平菇提取物的濃縮液；5)向上述濃縮液中加入體積百分濃度為95%的乙醇溶液，濃縮液與乙醇溶液的體積比例為1:3，靜置(室溫(25°C)靜置至不再有沉淀析出)，離心，收集沉淀；取上清液重復(fù)此步驟3次,合并沉淀；6)將上述沉淀烘干(60°C干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。實(shí)施例2、本發(fā)明黑平菇提取物的制備黑平菇提取物的制備按照如下方法進(jìn)行:I)菌株黑平菇干粉(黑平菇干粉的制備同實(shí)施例1) 2g與體積百分濃度為70%的乙醇溶液600ml混合，在50°C水浴中回流提取60分鐘，去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣；2)向上述濾渣中加入蒸餾水，固液比例為Ig:100ml，在70°C水浴中回流提取2小時(shí),過濾,分別收集濾液和濾渣；取濾渣重復(fù)此步驟4次，合并所有的濾液。

3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質(zhì)量百分濃度為15%)去除其中的蛋白，離心，收集上清液；4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質(zhì)量百分濃度為10%)進(jìn)行脫色，低壓濃縮，濃縮體積與原體積比例為2:1，得黑平菇提取物的濃縮液；5)向上述濃縮液中加入體積百分比濃度為80%的乙醇溶液，濃縮液與乙醇溶液的體積比例為1:4，，靜置(室溫(25°C)靜置至不再有沉淀析出)，離心，收集沉淀；取上清液重復(fù)此步驟I次，合并沉淀；6)將上述沉淀烘干(60°C干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。實(shí)施例3、本發(fā)明黑平菇提取物的制備黑平菇提取物的制備按照如下方法進(jìn)行:I)菌株黑平菇干粉(黑平菇干粉的制備同實(shí)施例1) 2g與體積百分濃度為90%的乙醇溶液200ml混合，在70°C水浴中回流提取30分鐘，去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣；2)向上述濾渣中加入蒸餾水，固液比例為Ig:10ml，在100°C水浴中回流提取I小時(shí)，過濾，分別收集濾液和濾渣；取濾渣重復(fù)此步驟I次，合并所有的濾液。3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸(TCA)(使其終質(zhì)量百分濃度為25%)去除其中的蛋白，離心，收集上清液；4)向步驟3)中的上清液里加入雙氧水(使其終質(zhì)量百分濃度為20%)進(jìn)行脫色，低壓濃縮，濃縮體積與原體積比例為2:1，得黑平菇提取物的濃縮液；5)向上述濃縮液中加入乙醇，濃縮液與乙醇的體積比例為1:2，靜置(室溫(25°0靜置至不再有沉淀析出)，離心，收集沉淀；取上清液重復(fù)此步驟4次，合并沉淀；6)將上述沉淀烘干(60°C干燥)得到精制黑平菇提取物。該提取物主要成分為黑平菇多糖成分。實(shí)施例4黑平菇提取物影響小鼠碳粒廓清指數(shù)的增強(qiáng)免疫功能實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選:選擇健康體重在20_22g范圍內(nèi)的昆明種小鼠(購(gòu)自承德醫(yī)學(xué)院)40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，采取自由取食的方式飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12小時(shí)禁食，飲水不限。2、藥物灌胃:將實(shí)施例1制備的黑平菇提取物用蒸餾水溶解稀釋成不同濃度藥齊U，按照表I的劑量分別進(jìn)行灌胃給藥，空白對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，連續(xù)給藥14天，每天灌胃一次，取食、飲水不限。3、碳粒檢測(cè):最后一次給藥40分鐘后，從小鼠尾靜脈以0.05ml/10g的比例注射印度墨汁。注射后2分鐘和20分鐘時(shí)間點(diǎn)上，分別從眶后靜脈叢取血20 μ 1，溶于2ml0.l%Na2C03溶液中搖勻，測(cè)定溶液在600_800nm下的吸光值。4、廓清指數(shù)計(jì)算:測(cè)定吸光值后，根據(jù)文獻(xiàn)方法獲得廓清指數(shù)公式:廓清指數(shù)(K)=(LogA20-LogA2) / (20-2)A20、A2指步驟3中20分 鐘和2分鐘時(shí)間點(diǎn)上測(cè)得的吸光值。通過公式計(jì)算得出不同濃度黑平菇提取物溶液的K值。表I黑平菇提取物對(duì)小鼠碳粒廓清指數(shù)的影響(X土s)的數(shù)據(jù))
權(quán)利要求
1.一種黑平菇提取物的制備方法，按照包括如下步驟的方法制備: O黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%-90%的乙醇溶液混合，加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣； 2)將步驟I)獲得的濾渣與蒸餾水按照比例為Ig=IO-1OOml的比例混合，在70_100°C水浴中提取1-2小時(shí)，過濾，分別收集濾液和濾渣；重復(fù)此步驟的操作1-4次，合并所有的濾液； 3)向步驟2)中得到的濾液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，離心，收集上清液； 4)向步驟4)中的上清液里加入雙氧水進(jìn)行脫色，濃縮，得含黑平菇提取物的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法還包括將步驟4)獲得的含黑平菇提取物的溶液與體積百分比濃度為80-100%的乙醇溶液按照體積比為1:2-4混合，靜置沉淀，離心，收集沉淀，取上清液重復(fù)此步驟1-4次，合并沉淀，將沉淀烘干獲得黑平菇提取物粉末；所述此步驟中的乙醇溶液的體積百分比濃度優(yōu)選為95%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中，加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)的步驟是在50-70°C水浴中回流提取30-60分鐘；所述水浴溫度優(yōu)選為600C ;所述提取時(shí)間優(yōu)選為45分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟I)中所述乙醇溶液的體積百分比濃度為85% ;所述黑平菇干粉與乙醇溶液的比例為Ig:100-300ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，所述濾渣與蒸餾水的比例為Ig:30ml ;所述的水浴溫度為95°C;所述提取的時(shí)間為I小時(shí)；重復(fù)所述步驟2)的操作的次數(shù)為3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟3)中，所述三氯乙酸的添加終質(zhì)量百分比濃度為15-25%，優(yōu)選為20%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述步驟4)中，所述雙氧水的添加終質(zhì)量百分比濃度為10-20%，優(yōu)選為15% ;所述濃縮后，原溶液與濃縮液的體積比例為2-5:1，優(yōu)選為4:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:所述烘干獲得黑平菇提取物粉末中的烘干溫度為40-70°C，優(yōu)選為60°C。
9.權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的黑平菇提取物。
10.權(quán)利要求9所述的黑平菇提取物在制備增強(qiáng)免疫功能的藥物或者食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑平菇提取物及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的黑平菇提取物的制備方法，按照包括如下步驟的方法制備1)黑平菇干粉與體積百分比濃度為70%-90%的乙醇溶液混合，加熱去除單糖和雙聚糖等小分子物質(zhì)，過濾，收集濾渣；2)將濾渣與蒸餾水按照比例為1g10-100ml的比例混合，在70-100℃水浴中提取1-2小時(shí)，過濾，分別收集濾液和濾渣；重復(fù)此步驟的操作1-4次，合并所有的濾液；3)向?yàn)V液中加入三氯乙酸，去除其中的蛋白，離心，收集上清液；4)向上清液里加入雙氧水進(jìn)行脫色，濃縮，得含黑平菇提取物的溶液。本發(fā)明可以用于制備增強(qiáng)免疫功能的藥物或者食品，制備方法簡(jiǎn)單，原料易得，成本較低，適于生產(chǎn)和應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23L1/29GK103202864SQ20131014795
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月25日
發(fā)明者燕繼曄, 李興紅, 劉建華, 嚴(yán)紅, 趙爽, 周瑩, 張瑋, 喬廣行 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院