一種與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結合的多肽及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白（M評a)特異性結合的多膚，屬 于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 支原體介于病毒與細菌之間，缺乏細胞壁、呈高度多型性，可通過除菌過濾器，可 在無細胞的培養(yǎng)基中繁殖，在固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)可成"油煎蛋"樣的獨特菌落，是廣泛 存在于自然界的條件致病微生物。生殖支原體（Mycoplasma genitalium，Mg)是支原體屬 中的一種，首次發(fā)現是從一名非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的。臨床調查研究 表明，女性Mg感染可引起宮頸炎，盆腔炎，不孕等；而男性感染則可引起急慢性非淋菌性尿 道炎（NGU)，不育等；更值得注意的是，隨著更深入的研究顯示，Mg感染與人類免疫缺陷疾 病化IV)的機會感染密切相關，能選擇性的激活CD4+T細胞促使HIV的復制，是HIV的協(xié)同 因子之一。
[0003] 病原體和宿主細胞膜上相應受體的結合是病原體感染宿主的第一步，對其能否感 染宿主細胞至關重要。有研究表明，Mg必須先黏附于泌尿生殖道或呼吸道黏膜細胞才能感 染宿主并定植于感染部位或侵入細胞內，失去黏附能力的突變株則缺乏感染能力。支原體 缺乏細胞壁，但Mg細胞膜上存在較多的外膜蛋白，Mg通過酷基錯定在其細胞膜上的膜蛋白 介導Mg定植到宿主細胞表面而感染致病。Burgos等研究表明Mg膜蛋白能刺激機體發(fā)生 持續(xù)的免疫反應。Mg通過粘附感染宿主細胞最主要的外膜蛋白為生殖支原體粘附素蛋白 (M評a)，而自發(fā)性的無細胞黏附活性的Mg突變株則缺乏M評a。M評a的基因編碼含有S個 操縱子分別為mgl90 (m甜A)，mgl91 (m甜B(yǎng))和mgl92 (m甜C)，其中編碼M評a的基因為m甜B(yǎng)， 由其編碼的M評a蛋白主要集中在Mg燒瓶狀的頂尖部位，該一特殊位置對Mg的粘附感染宿 主起至關重要的作用。Mernau曲等研究表明Mg可憑借其尖形結構主動靠近并黏附于人胚 肺成纖維細胞表面，并通過微管將核酸、酶等輸入宿主細胞內，將某些酶解產物吸入細胞內 供Mg利用，由此影響宿主的代謝及生物合成。
[0004] 近年來，Mg感染率呈現上升趨勢，但目前仍然沒有滿足臨床需要的藥物和疫苗可 供使用，臨床上也急需安全、有效、實用藥物W用于治療和預防Mg的感染。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明解決了【背景技術】中的不足，提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白M評a 特異性結合的多膚，該多膚的的氨基酸序列為；Val-His-TiD-Asp-Phe-Arg-Gln-TiD-TiD-G In-Pro-Ser，其氨基酸序列表如SEQ ID N0;1所示。
[0006] 本發(fā)明篩選到的陽性瞻菌體擴增后用ELISA測定其能否與M評a發(fā)生特異結合。 ELISA結果說明；陽性瞻菌體與M評a的結合能力較高（0〇45。值大于1. 5)，說明該瞻菌體表 面插入的上述多膚能特異性識別M評a重組蛋白，為與M評a重組蛋白特異結合的多膚。
[0007] 為進一步證實上述陽性瞻菌體克隆能與M評a重組蛋白發(fā)生特異性結合，將陽性 瞻菌體進行競爭抑制性化ISA試驗。結果表明該些瞻菌體與M評a重組蛋白發(fā)生的特異性 結合能不同程度的被不同稀釋度的抗M評a抗體抑制，且隨著抗體稀釋比例的升高其抑制 效果相應的下降。該些結果說明上述陽性瞻菌體與M評a重組蛋白的特異結合能被M評a的 抗體所抑制，進一步說明了陽性瞻菌體克隆能與M評a重組蛋白發(fā)生特異性結合。
[000引為更進一步證明上述陽性瞻菌體克隆能與M評a重組蛋白發(fā)生特異性結合，取經 擴增后的陽性瞻菌體于硝酸纖維素膜上，分別與M評a重組蛋白及其抗M評a抗體解育后，采 用常規(guī)斑點印跡法進行陽性瞻菌體克隆的鑒定。斑點印跡圖表明，上述陽性瞻菌體克隆顯 示有明顯的斑點，而在陰性對照處無明顯斑點。說明篩選出來的陽性瞻菌體能與M評a蛋白 發(fā)生特異結合。
[0009] 因此，本發(fā)明中所提供的多膚能夠與生殖支原體M評a特異性結合，能夠用于制備 預防生殖支原體感染的疫苗及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中，具 有顯著的效果。
【附圖說明】
[0010] 圖1和圖2為本發(fā)明中瓊脂糖電泳分析提取的瞻菌體單鏈DNA結果圖；
[0011] 圖3為本發(fā)明中瞻菌體克隆與M評a蛋白及牛血清白蛋白對照的ELISA反應性結 果圖；
[0012] 圖4為本發(fā)明中抗M評a抗體與陽性瞻菌體的競爭抑制ELISA試驗結果圖；
[0013] 圖5為本發(fā)明中陽性瞻菌體克隆斑點印跡鑒定結果圖。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不局 限于W下實施例。
[0015] 本實施例中所提供的多膚為WM評a為祀分子，從瞻菌體展示12膚庫篩選而得，具 體的篩選方法本發(fā)明中不需進行過多闡述，現針對所篩選得到的瞻菌體進行鑒定及分析。
[0016] 1、瞻菌體膚庫滴度測定
[0017] 瞻菌體膚庫用無菌LB液體培養(yǎng)基從107稀釋至10M后，將處于對數生長期的瞻菌 體菌株邸2738與每個稀釋度的瞻菌體混勻后鋪于含IPTG和X-gal的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，由 于瞻菌體展示庫中的瞻菌體含特有的lacZa基因，因此當瞻菌斑生長在含有IPTG和X-gal 的培養(yǎng)平板上時，顏色呈現出藍色，而外界污染的瞻菌斑并無特定的lacZa基因，顏色則 為白色。
[0018] 2、瞻菌體特異性結合的富集分析
[0019]W純化濃縮好的M評a重組蛋白為祀分子，對瞻菌體隨機12膚庫進行3輪淘選。在 淘選過程中，為得到與M評a重組蛋白能特異性結合的瞻菌體，在淘選時逐一降低了祀蛋白 的包被量（100yg/mL、60yg/mL、30yg/mL)，同時提高了TBST中Tween-20的濃度（第一輪 為0. 1%、第二；輪0.5%)，另外，在后面兩輪的淘選中增加了洗漆次數、減少了祀分子與 瞻菌體的解育時間。測滴度時，每一個稀釋度取20y1，做兩個平板，計算少于100個的瞻菌 斑平板，取兩平行平板的平均值。在計算產率（Ratio)時，W每一輪生物淘選時加入瞻菌體 的量作為投入量（Input),洗脫后測滴度的平板上藍色瞻菌斑的量為產出的量（Ou化ut)， 產率的計算=產出量/投入量X100%。
[0020] 由表1可知，第1輪淘洗時其產率僅為1. 78X1(T6,而第3輪淘洗時其產率達到了 7.30X10^5,說明具有特異性結合活性的瞻菌體克隆得到明顯富集。
[0021] 表1親和篩選的產出與投入比
[0022]
【主權項】
1. 一種與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結合的多肽，其特征在于：所述多肽的氨 基酸序列為：Val-Hi s-Trp-Asp-Phe-Arg-Gln-Trp-Trp-Gln-Pro-Ser 〇
2. 權利要求1所述的多肽的用途，其特征在于：用于制備預防生殖支原體感染的疫苗 及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能夠與生殖支原體粘附素蛋白MgPa特異性結合的多肽，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明提供的多肽的DNA插入于噬菌體中，擴增后用ELISA測定能否與MgPa發(fā)生特異結合。ELISA結果說明：噬菌體克隆與MgPa的結合能力較高(OD450值大于1.5)，因此該噬菌體為陽性噬菌體克隆，說明該噬菌體表面插入的多肽能特異性識別MgPa重組蛋白，為與MgPa重組蛋白特異結合的多肽。本發(fā)明中所提供的多肽能夠與生殖支原體MgPa特異性結合，能夠用于制備預防生殖支原體感染的疫苗及治療因生殖支原體感染而引起的生殖系統(tǒng)疾病的藥物中，具有顯著的效果。
【IPC分類】A61K38-10, A61P31-04, C07K7-08
【公開號】CN104829693
【申請?zhí)枴緾N201510279055
【發(fā)明人】曾焱華, 朱有蔥, 朱翠明, 鄧湘贏
【申請人】南華大學
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月27日