一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，特別涉及一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法。
技術(shù)背景
[0002]通過免疫共沉淀分離蛋白是一種常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的，用于研宄蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用模型被整體保留了下來。這種方法得到的目的蛋白符合體內(nèi)實(shí)際情況，結(jié)果可信度高。所以常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
[0003]傳統(tǒng)的免疫共沉淀操作主要用于研宄蛋白與蛋白的相互作用。然而，對于催化酶與底物、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與被轉(zhuǎn)運(yùn)化學(xué)物質(zhì)等小分子分化合物與相關(guān)蛋白的對應(yīng)關(guān)系及相互作用，目前主要通過體外催化、基因遺傳轉(zhuǎn)化等途徑進(jìn)行驗(yàn)證。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法具有盲目性大，周期長，針對性差等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的，就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提供一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一，將小分子物質(zhì)與多肽片段相耦連，制備半抗原載體系統(tǒng)；
[0007]步驟二，將步驟一得到的半抗原載體系統(tǒng)免疫動物，提取、分離單克隆抗體；
[0008]步驟三，將步驟二得到的抗體固定到磁珠上；
[0009]步驟四，在非變性條件下裂解生物細(xì)胞，并加入防止蛋白降解的緩沖液，得到含有目標(biāo)蛋白與小分子物質(zhì)的溶液；
[0010]步驟五，將步驟三得到的磁珠加入到步驟四得到的溶液中進(jìn)行反應(yīng)；
[0011]步驟六，離心收集磁珠、以及磁珠上的“小分子物質(zhì)-蛋白”復(fù)合體，并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。
[0012]步驟一所述多肽片段長度為10-20個(gè)氨基酸。
[0013]步驟四所述防止蛋白降解的緩沖液包含EDTA 0.5-1.0mol/L，4_ (2_氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽1.5-2.0mol/L，抑肽酶1.0-2.0mol/L, E-64蛋白酶抑制劑0.5-1.0mol/L，pH值為 7.0-8.5o
[0014]本發(fā)明將小分子物質(zhì)與多肽分子親連，然后免疫動物制備完全抗體。小分子物質(zhì)作為半抗原結(jié)合到大分子載體上以后，可以改變載體原有的表位，也可以形成新的表位，半抗原在表位中是關(guān)鍵性的基團(tuán)。最后利用免疫反應(yīng)將細(xì)胞內(nèi)該小分子物質(zhì)及與之相互結(jié)合的蛋白模型作為一個(gè)復(fù)合體沉淀下來，并從中篩選目標(biāo)蛋白。具有目的明確，周期短，針對性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0015]具體實(shí)施方法
[0016]下面通過一個(gè)具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0017]實(shí)施例從青蒿中分離與青蒿素相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0018]步驟如下:
[0019]1、將青蒿素與包含10個(gè)氨基酸的多肽片段通過生物素相連，制備半抗原載體系統(tǒng)；
[0020]2、將得到的半抗原載體系統(tǒng)免疫小白鼠，提取、分離單克隆抗體；
[0021]3、將抗體固定到磁珠上；
[0022]4、用液氮速凍生物體細(xì)胞后研磨成粉，并加入到緩沖液中，得到含有目標(biāo)蛋白與小分子物質(zhì)的溶液；
[0023]5、把步驟3得到的磁珠加入到步驟4得到的溶液中進(jìn)行反應(yīng)；
[0024]6、離心收集磁珠，以及磁珠上的“小分子物質(zhì)-蛋白”復(fù)合體，并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。
[0025]上述緩沖液包含EDTA 0.5-1.0mol/L, AEBSF (4- (2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽)1.5-2.0mol/L，Aprotinin (抑肽酶)1.0-2.0mol/L，E_64(蛋白酶抑制劑)0.5-1.0mol/L，pH 值為 7.0-8.5。
[0026]質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果表明，本實(shí)施例成功找到了一個(gè)與青蒿素相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對應(yīng)的基因長度為40010bp，屬于PDR家族，其具體特征正在研宄中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，將小分子物質(zhì)與多肽片段相耦連，制備半抗原載體系統(tǒng)； 步驟二，將步驟一得到的半抗原載體系統(tǒng)免疫動物，提取、分離單克隆抗體； 步驟三，將步驟二得到的抗體固定到磁珠上； 步驟四，在非變性條件下裂解生物細(xì)胞，并加入防止蛋白降解的緩沖液，得到含有目標(biāo)蛋白與小分子物質(zhì)的溶液； 步驟五，將步驟三得到的磁珠加入到步驟四得到的溶液中進(jìn)行反應(yīng)； 步驟六，離心收集磁珠、以及磁珠上的“小分子物質(zhì)-蛋白”復(fù)合體，并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法，其特征在于:步驟一所述多肽片段長度為10-20個(gè)氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法，其特征在于:步驟四所述防止蛋白降解的緩沖液包含EDTA0.5-1.011101/1，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽1.5-2.0mol/L，抑肽酶1.0-2.0mol/L，E_64蛋白酶抑制劑0.5-1.0mol/L，pH值為.7.0-8.5 ο
【專利摘要】一種通過小分子化合物免疫共沉淀分離目標(biāo)蛋白的方法，是將小分子物質(zhì)與多肽分子耦連，然后免疫動物制備完全抗體。小分子物質(zhì)作為半抗原結(jié)合到大分子載體上以后，可以形成新的表位，半抗原在表位中是關(guān)鍵性的基團(tuán)。最后利用免疫反應(yīng)將細(xì)胞內(nèi)該小分子物質(zhì)及與之相互結(jié)合的蛋白模型作為一個(gè)復(fù)合體沉淀下來，并從中篩選目標(biāo)蛋白。本發(fā)明的方法具有目的明確，周期短，針對性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】C07K1-32
【公開號】CN104829686
【申請?zhí)枴緾N201510225303
【發(fā)明人】王貴榮
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年5月4日