專利名稱：陰地蕨提取物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥提取物的新用途，具體涉及陰地蕨提取物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物 中的應用。
背景技術(shù)：
國際癌癥研究中心(IARC)最新報告，全球癌癥病人數(shù)以年均3% -5%的速度遞 增，癌癥已成為全球最大的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)預計2007年到2030年期 間，癌癥新發(fā)病例數(shù)將增加37% (由1130萬例增至1550萬例)，死亡人數(shù)增加45% (由 790萬人增至1150萬人)。由此可見，惡性腫瘤是目前威脅人類健康的重要疾病，其侵襲和 轉(zhuǎn)移的特性是導致臨床上大多數(shù)腫瘤患者死亡的主要因素。因此，研究出安全、有效的抗腫 瘤轉(zhuǎn)移新藥具有重要的實踐意義。癌癥嚴重威脅人類健康，是世界各國面臨的重要社會問 題之一。近年來，中藥或天然藥物抗腫瘤作用的研究已成為新熱點。王光鳳等采用多種腫瘤模型，研究橘皮中提取的黃酮化合物川陳皮素的抗腫瘤作 用。結(jié)果顯示，川陳皮素8 32mg/kg小鼠黑色素瘤B16的抑瘤率為42. 24% 65. 95%, 對小鼠Lewis肺癌的抑瘤率為38. 84% 59. 09%;對小鼠S180肉瘤的抑瘤率為36. 02% 45. 98%。川陳皮素與小劑量的紫杉醇、絲裂霉素、52氟尿嘧啶、順鉬和阿霉素聯(lián)用時，表現(xiàn) 明顯的協(xié)同效應。川陳皮素對小鼠Lewis肺癌腋皮下接種肺轉(zhuǎn)移的抑制率為33. 63% 38. 94% ；對小鼠Colon26結(jié)腸癌腹腔接種腹膜轉(zhuǎn)移的抑制率為37. 74% 43. 40%。(王 光鳳，王小晨，肖璘，等.柑橘黃酮川陳皮素的抗腫瘤作用研究，中草藥，2007,38(11) 1694-1697)，但以上研究都只能對某種腫瘤細胞發(fā)揮作用，研究還不夠深入。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供陰地蕨提取物的新用途，即在制藥領(lǐng)域中的新 用途。技術(shù)方案本發(fā)明涉及陰地蕨提取物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將陰地蕨提取物的藥理試驗及實驗結(jié)果來說 明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。以下是陰地蕨提取物抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的研究，實驗方法及結(jié)果如下一、陰地蕨提取物的制備取處方量的陰地蕨藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回 流，回流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至相對密度1. 10 1. 25(90 95°C )， 的浸膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。二、陰地蕨提取物對自發(fā)性B16F10黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型的影響1.實驗材料1.1實驗動物與細胞
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清潔級C57BL/6小鼠(雌性，6_8周齡，16_20g)，上海斯萊克實驗動物有限責任公 司，許可證號SCXK (滬)2007-0005 ；B16F10黑色素瘤細胞株。1.2實驗藥物陰地蕨提取物，福建省立醫(yī)院，批號090602。1.3實驗試劑DMEM(美國GIBC0公司批號1340114)，PBS(實驗室自制)，小牛血清(天津 市洋生物制品科技有限公司批號:QWTC0701), Trypsin(AMRESC0公司批號=2009/08) EDTA(AMRESC0公司批號0105)，甲醛(上海久億化學試劑有限公司批號20070610)，生理 鹽水(上海華源長富藥業(yè)有限公司批號070405045)，NaHC03(南京化學試劑有限公司批 號050480039)，液體石蠟(上海久億化學試劑有限公司批號20040701)。1.4實驗器材
萊卡倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司型號DM1L)，精密移液器(法國吉爾森公 司型號P2)，全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司型號MLS-3020)，超凈工作臺(蘇凈集 團安泰公司制造型號SW-CJ-ZFD)，超低溫冰箱(美國紐艾爾公司型號Nu-6511)，C02培 養(yǎng)箱(FORMA型號3111)，純水儀(美國Spring公司型號S/N 020579)，電子天平(德 國賽多利斯有限公司型號BT323S)，臺式電熱鼓風干燥箱(上海精密實驗設(shè)備公司型號 DHG9123A)，冰箱(西門子公司型號KG18V21TI)，液氮罐(CBS型號:2001)，離心機(上海安 亭科學儀器廠型號KA-1000)，PH計(HANNA公司型號HI_221)，注射器。2.實驗方法2. 1制備B16F10細胞懸液常規(guī)培養(yǎng)B16F10腫瘤細胞，實驗前4-5天，按1 10細胞傳代于細胞培養(yǎng)瓶中， 以免細胞生長過度而出現(xiàn)不完全融合。每個培養(yǎng)瓶大約含6-8 X 106細胞，取對數(shù)生長期的 細胞，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗凈，加入lmL 0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化液，放入細胞培養(yǎng) 箱中，l-3min后，輕敲培養(yǎng)瓶使細胞脫落。加10mL DMEM，用移液管吹打細胞，獲得單細胞懸 液，轉(zhuǎn)入50mL聚丙烯離心管。離心細胞(1200rpmX10min)，然后用PBS洗兩遍。用苔盼藍 計數(shù)細胞，調(diào)整細胞濃度為lX107/mL。2. 3復制B16F10自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移模型每只C57BL/6小鼠左后肢足墊皮下注射含5 X 105個B16F10細胞的懸液0. 05mL, 這些小鼠每五天稱一次體重。于接種后第八天按照左足墊上原發(fā)瘤的大小將小鼠隨機分為 四組模型組對照組(生理鹽水組)、陰地蕨提取物低劑量組(2g/kg小鼠體重)、陰地蕨提 取物中劑量組(4mg/kg小鼠體重)、陰地蕨提取物高劑量組(6g/kg小鼠體重)，每組動物數(shù) 為10只。從接種的第九天開始各組灌胃給予相應劑量的藥物，模型組給予相應的生理鹽 水，每日一次，直至處死動物，采集標本。在接種后第23天，麻醉小鼠，截除荷瘤下肢，10% PBS-福爾馬林固定原發(fā)瘤組織，稱取原發(fā)腫瘤重量以及用直尺測量原發(fā)瘤的長軸(L1)和 縱軸(L2)，按照以下公式計算原發(fā)瘤的體積0.5236XL1X(L2)2。切除原發(fā)灶后22天處 死小鼠，取出肺，避免鑷子觸及臟器表面損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固 定肺組織，稱取肺重，拍照并且在解剖顯微鏡下計算肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)。3.實驗結(jié)果3. 1陰地蕨提取物對B16F10黑色素瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型肺轉(zhuǎn)移的影響
實驗結(jié)果采用Excel統(tǒng)計軟件學生t檢驗進行檢驗，由實驗數(shù)據(jù)可以看出，陰地蕨 提取物各劑量組與對照組相比對黑色素瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均有抑制作用， 且呈現(xiàn)劑量相關(guān)性陰地蕨提取物2g/kg劑量組(P < 0. 05)、陰地蕨提取物4g/kg劑量組 (P < 0. 01)、陰地蕨提取物6g/kg劑量組(P < 0. 01)。對于肺重的影響，陰地蕨提取物6g/ kg劑量組的腫瘤重量明顯低于對照組的肺重(P < 0. 01)，其他兩組無明顯作用。3. 2陰地蕨提取物對B16F10黑色素瘤原發(fā)位腫瘤體積和重量的影響從表1-2可以看出，與生理鹽水組相比，陰地蕨提取物對于接種B16F10黑色素瘤 細胞后的小鼠足墊部的原發(fā)位腫瘤無論是體積以及重量都沒有明顯的影響作用。4.結(jié)論陰地蕨提取物能夠抑制B16F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，而且也抑制轉(zhuǎn)移灶的生長，但是 對原發(fā)腫瘤細胞增殖沒有影響，從小鼠體重變化可以看出，陰地蕨提取物的毒副作用很小， 為今后體內(nèi)安全用藥提供基礎(chǔ)。三、陰地蕨提取物對B16F10黑色素瘤細胞實驗性肺轉(zhuǎn)移影響1.實驗材料同前2.實驗方法2. 1制備細胞懸液同前2. 2復制B16F10實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移模型取C57BL/6小鼠置于小鼠注射固定器，尾靜脈注射0. 2mL細胞懸液(含5X 105腫 瘤細胞)。接種過腫瘤細胞的小鼠隨機分為4組模型組對照組(生理鹽水組)、陰地蕨提 取物低劑量組(2g/kg小鼠體重)、陰地蕨提取物中劑量組(4mg/kg小鼠體重)、陰地蕨提取 物高劑量組(6g/kg小鼠體重)，每組動物數(shù)為10只，從接種后開始各組灌胃給予相應劑量 的藥物，模型組給予相應的生理鹽水，每日一次，給藥23天，處死小鼠，取肺臟。避免鑷子觸 及臟器表面，防止損傷組織，用PBS洗凈組織。10% PBS-福爾馬林固定肺組織，稱取肺重， 拍照，評價陰地蕨提取物對B16F10腫瘤血行肺轉(zhuǎn)移的影響。3.實驗結(jié)果實驗結(jié)果采用Excel統(tǒng)計軟件學生t檢驗，從各組取出的肺組織可以看出，模型組 的肺組織轉(zhuǎn)移腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目顯著多于給藥組，由于肺結(jié)節(jié)太多，無法計數(shù)統(tǒng)計，對肺重的統(tǒng) 計分析表明，陰地蕨提取物高劑量組(6g/kg)和陰地蕨提取物中劑量組(4g/kg)均能抑制 小鼠肺組織重量，P值分別為P < 0. 01和P < 0. 05。陰地蕨提取物給藥前后小鼠體重差異 不大，且與對照組相比，小鼠體重未發(fā)現(xiàn)有大幅度減少，各組的死亡率顯示，陰地蕨提取物 藥物對于小鼠的體內(nèi)毒性較小。4.結(jié)論陰地蕨提取物給藥組小鼠的死亡率與對照組相當，而且體重與給藥前也沒有明顯 的減少，說明陰地蕨提取物的毒副作用很小，陰地蕨提取物可以很好的抑制實驗性B16F10 黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，陰地蕨提取物對于B16F10細胞直接入血之后的血行過程，黏附過程以及 穿出血管過程有一定的抑制作用。有益效果陰地蕨別名一朵云、花蕨、獨立金雞、獨腳蒿、冬草、郎萁細辛、背蛇生、破天云、散 血葉、小春花、蛇不見、吊竹良枝、良枝草、獨腳金雞、丹桂移星草、黃連七、雞爪蓮。為陰地蕨科植物陰地蕨的全草。分布于陜西、江蘇、安徽、浙江、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、廣 西等地。主治清熱解毒；平肝熄風；止咳；止血；明目去翳。主小兒高熱驚搐；肺熱咳嗽； 咳血；百日咳；癲狂；癇疾；瘡瘍腫毒；瘰疬；毒蛇咬傷；目赤火眼；目生翳障?，F(xiàn)代藥理學研 究，陰地蕨提取物具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。
具體實施例方式結(jié)合具體實施方式
，對本發(fā)明進一步說明如下陰地蕨為陰地蕨科植物 Septeridiumternatum(Thunb.) Lyon的帶根全草，為福建民間習用草藥，性味甘平，味淡。具 有平肝、清熱、鎮(zhèn)咳和清火、明目、解毒祛風的功效。其主要化學成分為黃酮類木犀草素和 陰地蕨素等。實施例1取50克陰地蕨藥材，加入8倍藥材重量的體積濃度為70%乙醇進行加熱回流，回 流0. 5小時，重復一次，合并乙醇提取液，濃縮至相對密度1. 10 1. 25(90 95°C )，的浸 膏，干燥，粉碎成干浸膏粉。
權(quán)利要求
陰地蕨提取物在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用。
2.陰地蕨提取物在制備抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從陰地蕨中提取的木犀草素、陰地蕨素等提取物在抗腫瘤藥物中的新用途，該提取物具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，具體表現(xiàn)為抑制自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移和實驗性腫瘤轉(zhuǎn)移，可用于制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。
文檔編號A61K36/11GK101849975SQ20101020363
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者莊捷, 王凌, 王少明, 阮君山 申請人:福建省立醫(yī)院