專利名稱：：夜香牛的黃酮類活性部位及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于天然藥物化學
技術領域：
，具體涉及一種利用色譜分離技術從菊科斑鳩菊屬夜香牛全草中提取得到的黃酮類活性部位及其制備工藝和應用。二
背景技術：
：夜香牛為菊科斑鳩菊屬(VernoniaSchreb.)植物夜香牛(Vernoniacinerea(L.)Less.[V.abbreviana(Wall.)DC.])的全草或根，又名傷寒草、夜牽牛、星拭草《呤南采藥錄》，寄色草《廣州植物志》，返魂草《廣東中藥》，消山虎(廣州部隊《常用中草藥手冊》)，假咸蝦、枝香草(廣州空軍《常用中草藥手冊》)，紅花一枝香《廣東惠陽中草藥》，四眼草《梧州中草藥》，天紅草《廣西北海民間草藥》，拐棍參(云南)；該植物為一年生草本，高20-80cm;生于山坡、曠野、田邊、路旁或密林、灌叢中；分布于浙江、江西、福建、臺灣、湖北、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州、云南、西藏等地。味苦、辛，性涼；具有疏風清熱，除濕，解毒的功效。主治外感發(fā)熱，咳嗽，急性黃疽型肝炎，濕熱腹瀉，白帶，療疳腫毒，乳腺炎，鼻炎和毒蛇咬傷。對夜香?；瘜W成分的研究目前主要是通過柱層析色傳法，自夜香牛中分離得到單體化合物，并通過光譜法確定所分得化合物的結(jié)構(gòu)。如自夜香牛的全草中分得香葉木素(Diosmetin),木犀草素-7-0-葡萄糖醛酸苷(Luteolin-7-O-glucuronide)，木犀草素(Luteolin)和木犀草素-7-0-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-glucoside)。自新鮮花中分得木犀草素，木犀草素-7-0-葡萄糖苷，異葒草素(Isoorientin)和金圣草素(Chrysoeriol)。自根中分得5,17(20)-豆甾二烯-3(3-醇(Stigmast-5,17(20)-dien-3(3-ol)，26-曱基二十七碳酸(26-Methylheptacosanoicacid)，豆甾醇(Stigmasterol),谷甾醇(Sitosterol),a-、P隱香樹脂醇(a-、|3-Amyrin),5-香樹脂乙酸酯(S-Amyrinacetate)，a-、p-香樹脂乙酸酯(a-、p-Amyrinacetate),3(3-乙酰氧基-13(18)-烏蘇烯(3p-Acetoxyurs-13(18)-ene)和24-羥基-14-蒲公英賽烯(24-Hydroxytaraxer-14-ene)。自地上部分分得8a-巴豆酰氧基-硬毛鉤藤內(nèi)酯-13-0-乙酸酯(8a-Tigloyloxyhirsutinolide-l3-O-acetate)，8a-(輕異丁烯酰氧基-硬毛鉤藤內(nèi)酯-13-乙酸酉旨(8a-(Hydroxymethacryloyloxy)-hirsutinolide-13-O-acetate),斯4弟i若妥曼內(nèi)酉旨-8-0-巴豆酸酯(Stilpnotomentolide-8-O-tiglate),8a-(4-羥異丁烯酰)-10a-輕基硬毛鉤藤內(nèi)酉旨-13-乙酸西旨(8a-(4-Hydroxymethacryloyloxy)-10a-hydroxyhirsutinolide-13-O-acetate),8a-(4-羥基巴豆酰氧基)-lOa-羥基硬毛鉤藤內(nèi)酯-13-O-乙酸酯(8a-(4-Hydroxytigloyloxy).10a-hydroxyhirsutinolide-13-O-acetate),8a-(4-羥基巴豆酰氧基)硬毛鉤藤內(nèi)酯-13-0-乙酸酯(8a-(4隱Hydroxytigloyloxy)隱hirsutinolide-13-O-acetate)，白前內(nèi)酉旨E(GlaucolideE),19-羥基白前內(nèi)酯E(19-HydroxyglaucolideE)和夜香牛內(nèi)酯-8-O-(4-羥異丁烯酸酯)(Vemocinerolide-8-0-(4-hydroxymethacrylate))。但目前未見利用色i普技術對該植物有效部位進行分離的報道。
發(fā)明內(nèi)容技術問題本發(fā)明提供了一種從菊科斑鳩菊屬夜香牛全草中提取得到的黃酮類活性部位，及其提:f又方法和在制藥中的應用。技術方案本發(fā)明的技術解決方案為一種夜香牛的黃酮類活性部位，含有以下7個黃酮類化合物I.洋芹素，質(zhì)量百分含量1~3%,黃色針晶，分子式為C15H1()05;II.金圣草素，質(zhì)量百分含量2~5%，黃色粉末，分子式為C16H1206;III.木樨草素，質(zhì)量百分含量2~5%,黃色針晶，分子式為C15H1()06;IV.金圣草素-7-0-P-D-葡萄糖普，質(zhì)量百分含量30~40%，黃色粉末，分子式為C22H220n;V.木樨草素-7-0-(3-D-葡萄糖香，質(zhì)量百分含量30~40%，黃色粉末，分子式為C21H2oOu;VI.槲皮素，質(zhì)量百分含量1~3%，土黃色粉末，分子式為C15H10O7;W.洋芽素-4'-0-p-D-葡萄糖苷，質(zhì)量百分含量1~3%,黃色粉末，分子式為C21H20C)10。制備上述夜香牛的黃酮類活性部位的方法，步驟為a.稱取夜香牛全草為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為70%的乙醇溶液提取3次，各次所用乙醇溶液的質(zhì)量依次為夜香牛全草原料質(zhì)量的10倍、8倍和8倍，每次提取2小時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于80。C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物；c.將上述乙醇提取物用蒸餾水稀釋至密度1.10-1.20，依次用沸程60-90°C的分析純石油醚萃取5次、分析純乙酸乙酯萃取5次、分析純水飽和正丁醇萃取3次，然后分別將石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和水飽和正丁醇萃取液在低于80。C溫度下進行減壓濃縮，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃耳又物和正丁醇萃耳又物；d.將上述乙酸乙酯萃取物加蒸餾水超聲溶解，加入蒸餾水的質(zhì)量為乙酸乙酯萃取物質(zhì)量的15倍，溶解后管式離心除去不溶物，得到乙酸乙酯提取部位；e.將上述乙酸乙酯提取部位上AB-8大孔吸附樹脂柱，經(jīng)體積百分濃度為70%的乙醇洗脫，得到夜香牛的黃酮類活性4部位。上述夜香牛的黃酮類活性部位在制備抗老年癡呆藥物中的應用。有益效果本發(fā)明以天然產(chǎn)物研究為基礎，同時結(jié)合活性篩選從中草藥中發(fā)現(xiàn)活性良好的先導化合物，該研發(fā)思路是創(chuàng)新藥物開發(fā)的源泉。本發(fā)明采用乙酸乙酯萃取、大孔吸附樹脂精制分離，從菊科斑鳩菊屬夜香牛^"o"/fl！cinerea(L.)Less.[Kabbreviana(Wall.)DC.]全草中制備得到一種黃酮類活性部位，該部位主要由8個黃酮類化合物組成，即洋芹素(apigenin,I),金圣草素(chrysoeriol,II),木樨草素(luteolin,III),金圣草素-7-O-p-D-葡萄糖苦(thermopsoside，IV),木樨草素-7-O-p-D-葡萄糖苷(luteolin隱7-0-(3-D-glucoside,V),槲皮素(quercetin,VI),洋芽素-4'-0國P-D國葡萄糖苷(apigenin4'-0-p-D-glucoside,VH)。其中化合物IV為首次從斑鳩菊屬植物中分離得到。該活性部位的抗老年癡呆活性屬首次發(fā)現(xiàn)。五具體實施例方式實施例1:黃酮類活性部位的制備方法稱取夜香牛全草5.0Kg作為原料，晾干、粉碎后用體積百分濃度為70%的乙醇溶液提取3次，三次所用乙醇溶液的質(zhì)量依次為夜香牛全草原料質(zhì)量的10倍、8倍和8倍，每次提取2小時，將三次的提取液用紗布過濾后合并；將合并后的提取液在低于80。C的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物；乙醇提取物用蒸餾水稀釋至密度為1.10-1.20g/cm3，依次用沸程60-90。C的分析純石油醚萃取5次、分析純乙酸乙酯萃取5次、分析純水飽和正丁醇萃取3次，然后分別將石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和水飽和正丁醇萃取液在低于8(TC溫度下進行減壓濃縮，得石油醚萃取物50g，乙酸乙酯萃取物250g,正丁醇萃取物100g;在乙酸乙酯萃取物250g中加入15倍質(zhì)量的水，50kHz、250W超聲溶解，溶解后管式離心除去不溶物，得乙酸乙酯提取部位；將上述乙酸乙酯提取部位上AB-8大孔吸附樹脂，樹脂用量為2Kg，經(jīng)體積百分濃度為70%的乙醇洗脫，得到夜香牛的黃酮類活性部位50g。實施例2:黃酮類活性部位的結(jié)構(gòu)鑒定夜香牛的黃酮類活性部位40g,以硅膠(0.063-0.200mm,250g)拌樣，上硅膠柱(0.060-0.200mm)色語分離，以二氯曱烷-曱醇(100:0—100:30)梯度洗脫，每100mL為一流份，共等到105部分；二氯曱烷-甲醇(100:8)部分經(jīng)硅5膠柱(0.040-0.063mm)和SephadexLH-20柱色譜分離，分得化合物I(15mg)，II(15mg);二氯曱烷-曱醇(100:10)部分經(jīng)硅膠柱(0.040-0.063mm)和SephadexLH-20柱色譜分離，分得化合物m(18mg)，VI(20mg);二氯曱烷-曱醇(100:20)部分經(jīng)硅膠(0.040-0.063mm)反復柱層析和SephadexLH-20柱色譜分離，分得化合物IV(20mg),V(15mg),VII(25mg)，。Table113C-NMR(100MHz,DMSO-d6,5ppm)dataofFlavonoidscIIIIIIVIIVVVI2163.5163.5163.7147.5162.8164,3164.13102.7103.1102.7135.5103.7103.1103.04181,5181.6181.4175.6181.7181,7181.8160.9161.2161,3155.9160.9156.8156.8698.798.798.798.199.599.499.47163.9163.9164.0163.8163.9162.8162.8893.893.993.893,294.794.694.79157.1157.1157.1160.5156.8160.9160.910103.6103.5103.6102.8105.3105.2105.2r121.0121.4121.4121.8122.8119.0120.92,128.3110.1113.3114.9112.0113.4128.53，115.8150.5145.6144.9151,1145.6115.94，161.3147.8149.6145.6146.6149.7161.25，115.8115.6115.9115.5113.0115.8115.96,128.3120.2118.9119.8118.8121.3128.5r，99.899.899.82，，73.073.073.03，，77.177.077.14，，69.569.569.55,,76.376.376.46，，60.660.560.5OCH355.955.8實施例3:黃酮類活性部位的抗老年癡呆作用的初步研究數(shù)據(jù)分別取乙酸乙酯萃取物、大孔樹脂洗脫部位、化合物i-vn進行神經(jīng)細胞活性篩選，結(jié)果表明乙酸乙酯萃取物和大孔樹脂洗脫部位均有很強的NGF誘導活性，化合物I-VH具有一定的NGF誘導活性。1、原理和方法運用神經(jīng)細胞體外模型試驗，利用PC-12細胞，檢測單體化合物的NGF誘導活性。(1)PC12細胞大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤分化的細胞林，它具有神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的一般特征，現(xiàn)以廣泛應用于神經(jīng)生理及神經(jīng)藥理研究。當用很低濃度的NGF培養(yǎng)PC12細胞，能被誘導分化成NGF依賴型的多巴胺能神經(jīng)元。(2)LDH(Lacticdehydrogenase,乳酸脫氫酶)用于4全測才羊品的細J包毒性。LDH在細胞培養(yǎng)液中含量越高，說明樣品的細胞毒性越大。(3)MTT法采用此法測定各樣品對PC12細胞的生長抑制作用，DMSO做空白對照。(4)TarkANGF的受體。TarkBBrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF，與NGF有聯(lián)系的神經(jīng)營養(yǎng)因子)的受體。表達TarkA的纖維原細胞(Fibroblast)只能靠NGF生存；表達TarkB的纖維原細胞(Fibroblast)只能靠BDNF生存。用樣品代替NGF或BDNF培養(yǎng)細胞，細胞的存活率越高，證明樣品的活性越高，即具有NGF誘導活性。2、實驗結(jié)果表1夜香牛中分離得到化合物的生物活性檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注LDH為乳酸脫氫酶；TrkA在成纖維細胞依賴神經(jīng)生長因子NGF存活的ED50值為25ng'mL-l，TrkB在成纖維細胞依賴BDNF存活的ED50值為lOng.mL-l;實驗以DMSO為空白對照。實施例4:黃酮類活性部位AD大鼠的初步藥效學研究1、材料與方法1.1動物雄性SD大鼠，體重250土20g，由南京中醫(yī)藥大學實-驗動物中心提供。1.2藥物制備見實施例l,l.Og相當于100g原藥材；陽性對照藥都可喜，由施維雅(天津)，批號868159(生產(chǎn)日期20080730)。1.3試劑AP1~40購自Sigma公司，批號151-003-pc05。1.4分組SD大鼠50只，隨機分成正常組、模型組、陽性對照組、治療I組(夜香?；钚圆课?.0g.Kg".cT1)、治療II組(夜香?；钚圆课?.0g.Kg".cT1),每組10只。1.5造模方法取模型組、陽性對照組、治療I組(夜香?；钚圆课?.5g.Kg"'cT1)、治療II組(夜香?；钚圆课?.0g'Kg"'cT1)造模。具體方法各組大鼠給予3。/。戊巴比妥鈉30mg'Kg"腹腔注射麻醉后，將鼠頭固定于立體定位儀上保持前后囪在同一水平，剪開頭皮，暴露前囪，按大鼠腦立體定位圖譜進行定位，在前自點后方1.2mm,中線旁開2.0mm,用牙科鉆鉆一小孔，垂直插入一小塑料管，深度為4.0mm(達側(cè)腦室)，將小管固定于大鼠頭頂骨，局部撒復方新諾明藥粉防止感染，縫合頭皮，術后每天肌肉注射青霉素40萬U/只。其中，造模組每天側(cè)腦室內(nèi)給予Ap1-40,2lag/只，連續(xù)14d;末次注射后7d，即實驗第21天，對50只大鼠進行學習記憶能力測試，以評價造模是否成功。1.6給藥方法造模成功后開始給藥。治療I組、II組分別每天給予大鼠也香牛水溶液1.5，3.0g.Kg"灌胃，正常組、模型組均給予等容量生理鹽水灌胃；陽性對照組以都可喜混懸液每天IOOiag.g"灌胃，連續(xù)28d。1.7學習記憶能力測試所有大鼠均在實驗的第21，49d,以水迷宮實驗中的平均逃避潛伏期(從起點至尋找到終點平臺逃生所需時間)的長短以及進入盲端錯誤次數(shù)來進行各組大鼠學習和記憶能力的評價。第21d評價造模是否成功，第49d評價各種施加因素對學習記憶能力的影響。1.8統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SAS8.0統(tǒng)計軟件包處理，分別采用t檢驗和《檢驗。2、結(jié)果82.1各組大鼠學習記憶能力比較表l各組大鼠平均逃避潛伏期的比較(f±S，"=10)s<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注**p<0.01,與模型組比較。表2各組大鼠進入盲端錯誤次數(shù)的比較(f±S，"=10)次/2min<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注*p<0.05，**p<0.01，與模型組比較。2.2結(jié)論表l、2顯示，給予AP140注射造模的各組大鼠平均逃避潛伏期和進入盲端錯誤次數(shù)增加，與正常組比較，有顯著統(tǒng)計學意義(p<0.01);治療結(jié)束后，治療組大鼠平均逃避潛伏期和進入盲端錯誤次數(shù)均明顯低于模型組，且與模型組相比，存在顯著性統(tǒng)計學意義，提示夜香牛黃酮類活性部位能明顯改善AD大鼠的學習記憶能力。權(quán)利要求1、一種夜香牛的黃酮類活性部位，其特征在于含有以下7個黃酮類化合物I.洋芹素，質(zhì)量百分含量1～3％，黃色針晶，分子式為C15H10O5；II.金圣草素，質(zhì)量百分含量2～5％，黃色粉末，分子式為C16H12O6；III.木樨草素，質(zhì)量百分含量2～5％，黃色針晶，分子式為C15H10O6；IV.金圣草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，質(zhì)量百分含量30～40％，黃色粉末，分子式為C22H22O11；V.木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，質(zhì)量百分含量30～40％，黃色粉末，分子式為C21H20O11；VI.槲皮素，質(zhì)量百分含量1～3％，土黃色粉末，分子式為C15H10O7；VII.洋芹素-4′-O-β-D-葡萄糖苷，質(zhì)量百分含量1～3％，黃色粉末，分子式為C21H20O10。2、一種制備權(quán)利要求1所述夜香牛的黃酮類活性部位的方法，其特征在于步驟為a.稱取夜香牛全草為原料，晾干、粉碎，用體積百分濃度為70%的乙醇溶液提取3次，各次所用乙醇溶液的質(zhì)量依次為夜香牛全草原料質(zhì)量的10倍、8倍和8倍，每次提取2小時，將三次的提^/液用紗布過濾后合并；b.將上述合并后的提取液在低于8(TC的溫度下，減壓濃縮回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物；c.將上述乙醇提取物用蒸餾水稀釋至密度為1.10-1.20g/cm3，依次用沸程60-90。C的分析純石油醚萃取5次、分析純乙酸乙酯萃取5次、分析純水飽和正丁醇萃取3次，然后分別將石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液和水飽和正丁醇萃取液在低于80。C溫度下進行減壓濃縮，得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；d.將上述乙酸乙酯萃取物加蒸餾水超聲溶解，加入蒸餾水的質(zhì)量為乙酸乙酯萃取物質(zhì)量的15倍，溶解后管式離心除去不溶物，得到乙酸乙酯提取部位；e.將上述乙酸乙酯提取部位上AB-8大孔吸附樹脂柱，經(jīng)體積百分濃度為70%的乙醇洗脫，得到夜香牛的黃酮類活性部位。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述夜香牛的黃酮類活性部位在制備抗老年癡呆藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及從菊科斑鳩菊屬植物夜香牛的全草或根中分離得到一個黃酮類活性部位，及其制法方法本發(fā)明利用色譜分離技術從夜香牛的全草中分離制備一類活性部位，該活性部位包括7個黃酮類化合物，分別是洋芹素，金圣草素，木樨草素，金圣草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，木樨草素-7-O-β-D-葡萄糖苷，槲皮素，洋芹素-4′-O-β-D-葡萄糖苷，本發(fā)明所述的活性部位有抗老年癡呆的作用。文檔編號A61K31/7048GK101474196SQ200910025080公開日2009年7月8日申請日期2009年2月17日優(yōu)先權(quán)日2009年2月17日發(fā)明者唐于平,張啟春,朱華旭,段金廒,潘林梅申請人:南京中醫(yī)藥大學