專利名稱：一種甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及中藥、飲片、提取物及制劑中黃酮類成分的檢測(cè)技術(shù)，特別是涉及一種甘木通藥材提取物中黃酮類成分的檢測(cè)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘木通(Clematis filamentosa Dunn)俗稱眼蛇藥，為毛茛科絲鐵線蓮屬植物，主要分布在廣東、廣西、海南、云南等地，在粵北乳源山區(qū)有較為豐富的野生資源，對(duì)心血管疾病(冠心病、高血壓)有顯著療效。甘木通中黃酮類化合物是其有效成分之一。以甘木通為原料生產(chǎn)的“冠心康片”臨床治療冠心病心絞痛、高血壓等療效突出。 冠心康片用于肝經(jīng)有熱、肝陽(yáng)上亢、脈絡(luò)瘀阻所致之頭痛眩暈、胸痹心痛、肢體麻木等癥，還適用于防治心血管疾病，特別是冠心病和高血壓的治療，同時(shí)具有用量少、藥效長(zhǎng)、無(wú)副作用等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)有的甘木通中黃酮類成分的檢測(cè)方法有以蘆丁為對(duì)照品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以 75%乙醇為溶劑，在90°C加熱回流提取甘木通莖、葉中總黃酮類成分，用紫外分光光度法在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定總黃酮含量。但是這種應(yīng)用紫外分光光度法檢測(cè)甘木通中黃酮類成分的檢測(cè)方法專屬性較差，不能反映本藥材黃酮類具體成分的含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于填補(bǔ)現(xiàn)有甘木通黃酮類成分檢測(cè)技術(shù)的不足，提供一種新的甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法。是一種利用甘木通藥材、總黃酮提取物或制劑指紋圖譜進(jìn)行檢測(cè)的方法，并通過(guò)確定科學(xué)的檢測(cè)保證藥材、提取物、制劑的質(zhì)量更加安全、可靠。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供一種甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法，以含山柰素的甲醇溶液為對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜法對(duì)供試品溶液中甘木通黃酮類成分進(jìn)行定性和/或定量分析； 所述對(duì)照品溶液中每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素。所述檢測(cè)條件為采用填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠的色譜柱，流動(dòng)相為甲醇與水(或緩沖鹽溶液)、甲醇與酸水、或乙腈與水(或緩沖鹽溶液)或乙腈與酸水的混合物；等度或梯度洗脫； 流速0. 1 1. 5mL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)200 400nm ；進(jìn)樣量1 20 μ L ；采用黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品為內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)，進(jìn)行黃酮類成分含量測(cè)定。本發(fā)明進(jìn)一步提供更為優(yōu)選的檢測(cè)條件為。18(Φ4· 6mmX250mm, 5 μ m)色譜柱；流速:0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50°C ；檢測(cè)波長(zhǎng)200 400nm ；進(jìn)樣量:1 20 μ L ；流動(dòng)相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫Α 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37%。
優(yōu)選的檢測(cè)波長(zhǎng)為3^nm、2Mnm或370nm。具體地，本發(fā)明所述供試品溶液的制備方法包括以下幾種步驟(1)所述供試品溶液通過(guò)以下方法制備得到取過(guò)三號(hào)篩的待測(cè)藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80 %乙醇5 500mL， 稱定重量，超聲提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，重復(fù)提取1 5次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用 5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?10 250mL,過(guò)0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜即得?；蛘撸襟E(1)所述供試品溶液通過(guò)以下方法制備得到取過(guò)三號(hào)篩的藥材粉末 1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL， 稱定重量，微波提取三次，第一次功率560 500w，提取時(shí)間10 20min ；放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80 %乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，重復(fù)提取3次，第二次功率 500 400w，提取時(shí)間10 20min ；第三次功率400 350w，提取時(shí)間10 20min ；合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL 萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 250mL，過(guò)0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得?；蛘?，步驟(1)所述供試品溶液通過(guò)以下方法制備得到取過(guò)三號(hào)篩的待測(cè)藥材粉末1 50. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為30 80%乙醇5 500mL，稱定重量，索氏回流提取0. 5 3.證，放冷，再稱定重量，用體積比濃度為30 80% 乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，重復(fù)提取1 5次，合并提取液，減壓濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 250mL,過(guò)0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得；或者，步驟(1)所述供試品溶液通過(guò)以下方法制備得到取過(guò)三號(hào)篩的藥材粉末 1 50. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水5 500mL，稱定重量，加水煎煮兩次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至適量，加入乙醇使含醇量達(dá)65 70%， 靜置，濾過(guò)，濾液濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至5 150mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 5 150mL萃取2 5次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用5 150mL乙酸乙酯萃取2 5次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?0 250mL，過(guò)0. 22 0. 45 μ m微孔濾膜，即得。通過(guò)有效性評(píng)價(jià)，本發(fā)明所述檢測(cè)方法的專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、測(cè)定范圍以及耐用性較好。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選在326nm、2Mnm或370nm波長(zhǎng)下山奈素對(duì)照的色譜圖的保留時(shí)間與峰面積，再使用matlab 7. 1進(jìn)行編程，將不同波長(zhǎng)下的色譜圖中相同組分按最大峰面積覆蓋融合。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，可應(yīng)用于檢測(cè)提取方法相同或相近的含有甘木通組成的任何一種提取物、制劑、飲片或藥材；所述制劑包括顆粒劑、膠囊、片劑、丸劑、軟膠囊劑、滴丸劑等。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明建立了高效液相指紋圖譜檢測(cè)黃酮類成分含量的方法，與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比較，專屬性良好，能準(zhǔn)確反映甘木通黃酮類具體某成分的含量。(2)本發(fā)明首次采用高效液相色譜法對(duì)甘木通中黃酮類成分中的12個(gè)共有峰進(jìn)行了分離，并以山奈素為內(nèi)標(biāo)，建立了甘木通中黃酮類成分定性以及定量分析的科學(xué)方案， 提高了藥材、制劑、提取物的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，從而有效確保了含甘木通的品種均一、穩(wěn)定、有效、 可控，保證了工藝的規(guī)范化和質(zhì)量的穩(wěn)定一致。(3)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握， 能從色譜的整體特征面貌上把握甘木通藥材、飲片、其提取物和制劑的品種和質(zhì)量情況。


圖1波長(zhǎng)下對(duì)照品山奈素的色圖譜；圖2326nm波長(zhǎng)下樣品的色圖譜；圖3326nm波長(zhǎng)下樣品中添加內(nèi)標(biāo)山奈素的色圖譜；圖4326nm波長(zhǎng)下甘木通總黃酮的色圖譜；圖5指紋圖譜各共有指紋峰；圖6254nm波長(zhǎng)下甘木通總黃酮的色圖譜；圖7370nm波長(zhǎng)下甘木通總黃酮的色圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1Waters 600高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器、柱溫箱；色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑=XBridge Shield RP18 6_X 250_，5 μ m)。乙腈(色譜純，美國(guó)默克公司)，超純水；其它試劑為分析純。1、供試品溶液的制備取甘木通藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)5. 0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80 %的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 90°C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用15mL乙酸乙酯萃取 2次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜罥OOmL,過(guò)0. 45 μ m微孔濾膜， 即得供試品溶液。2、內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密稱取山柰素對(duì)照品適量，用甲醇配制成每ImL含11. 2μ g 的內(nèi)標(biāo)溶液。3、進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定參照中國(guó)藥典2010版一部附錄VI D進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相梯度流動(dòng)相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫A相梯度:0 15min， 13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ；50 60min，22%— 27% ；60 75min, 27%- 37% ；流速1. OmL/min ；檢測(cè)波長(zhǎng)326nm ；進(jìn)樣量20 μ L，理論塔板數(shù)計(jì)算，應(yīng)不低于3000 ；
4、方法學(xué)考察，其中包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及線形范圍。4. 1內(nèi)標(biāo)物的選擇用內(nèi)標(biāo)溶液、樣品溶液，按照上述色譜條件測(cè)試，結(jié)果樣品HPLC圖譜中在與內(nèi)標(biāo)液山奈素HPLC圖譜中相同保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，樣品中加入內(nèi)標(biāo)液HPLC圖，樣品中與山奈素相鄰的峰達(dá)到很好分離，見(jiàn)附圖1 5所示。如附圖5所示，有13個(gè)共有峰，各特征峰以13號(hào)峰(RT = 72. 59)為參照峰，相對(duì)保留時(shí)間分別為0.067,0. 126,0. 135,0. 204， 0. 314,0. 361，0. 420,0. 436,0. 578,0. 589,0. 845，1. 00。在 326nm 波長(zhǎng)下測(cè)得山奈素的保留時(shí)間是72. 59，峰面積分別是524684，樣品中對(duì)應(yīng)的峰是13號(hào)。采用相同的方法分別在 254nm和370nm波長(zhǎng)下檢測(cè)甘木通總黃酮，檢測(cè)得到的色圖譜見(jiàn)附圖6和附圖7所示。附圖中橫坐標(biāo)代表出峰時(shí)間(分鐘)，縱坐標(biāo)代表峰的高度。4. 2內(nèi)標(biāo)溶液線性關(guān)系考察精密稱取山奈素對(duì)照品適量，加甲醇制成每Iml含11. 2 μ g的溶液，精密吸取2、4、 8、12、16、20 μ 1，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以山奈素峰面積值為Y，進(jìn)樣量為χ( μ g)，進(jìn)行線性回歸，得線性方程=Y = 2328. 4X-4947. l，r = 0. 9999。結(jié)果表明，山柰素在22. 4 22^g的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見(jiàn)表1所示。表1內(nèi)標(biāo)物線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
進(jìn)樣體積(μ 1)248121620進(jìn)樣量(μ g)22. 444. 889. 6134. 4179. 2224峰面積49556991062001453092694108275182564. 3樣品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值與樣品含量線性關(guān)系考察取甘木通藥材粉末(過(guò)三號(hào)篩)5. Og,精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入體積比濃度為80%的乙醇50mL，稱定重量，加熱回流1. 5h，放冷，再稱定重量，用80 %乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至無(wú)醇味，用水稀釋至15mL，每次加入石油醚(60 900C ) 15mL萃取2次，石油醚液棄去；水層繼續(xù)用15mL乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯液并減壓蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5mL，分別精密量取5、4、3、2、ImL置IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，過(guò)0. 45 μ m微孔濾膜，得各供試樣品溶液。各供試樣品分別與濃度為11. 2 μ g/mL的內(nèi)標(biāo)溶液按1:1(體積比)均勻混合， 按照測(cè)定方法進(jìn)樣，計(jì)算樣品中12號(hào)峰與13號(hào)峰(山奈素)的面積比值，以及供試樣品取樣量(mL)/10的比值，對(duì)兩個(gè)比值進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y = 1. 9056Χ+0. 0066 (r = 0. 9999)；實(shí)驗(yàn)表明樣品中黃酮類成分以12號(hào)峰計(jì)，與內(nèi)標(biāo)物山奈素的峰面積比與樣品中 12號(hào)峰含量呈良好的線性關(guān)系。4. 4精密度試驗(yàn)取內(nèi)標(biāo)溶液連續(xù)測(cè)定六次，結(jié)果6次測(cè)定圖譜中對(duì)照品的峰保留時(shí)間和峰面積的 RSD均小于2%，證明儀器精密度良好。表2對(duì)照品HPLC精密度數(shù)據(jù)表
權(quán)利要求
1.一種甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法，其特征在于是以含山柰素的甲醇溶液為對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜法對(duì)供試品溶液中甘木通黃酮類成分進(jìn)行定性和/或定量分析； 所述檢測(cè)條件為C18 (φ 4. 6 讓 X25(toim，5ym)色譜柱；流速0. 1 1. 5mL/min，柱溫20 50 °C ；檢測(cè)波長(zhǎng)200 400nm;進(jìn)樣量1 20yL;流動(dòng)相乙腈(A)-O. 冰乙酸水溶液(B)，采用梯度洗脫A 相梯度0 15min，13% ；15 30min，13%— 17% ；30 50min，17%— 22% ； 50 60min，22%— 27% ；60 75min，27%— 37% ；所述對(duì)照品溶液是每ImL甲醇含5 110 μ g山柰素的溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)所述供試品溶液通過(guò)以下方法制備得到取待測(cè)藥材粉末，經(jīng)加水煎煮或乙醇提取得到提取液，再經(jīng)石油醚萃取后取水層，水層用乙酸乙酯萃取得到的萃取液蒸干而得殘?jiān)?，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ莺筮^(guò)微孔濾膜，制得供試品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法，其特征在于所述乙醇提取是索氏回流提取、超聲提取或微波提取。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法，其特征在于所述檢測(cè)波長(zhǎng)為 326nm>254nm^ 370nmo
5.一種權(quán)利要求1、2、3或4所述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于檢測(cè)提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、制劑、飲片或藥材中黃酮類成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于所述制劑為顆粒劑、膠囊、片劑、 丸劑、軟膠囊劑或滴丸劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種甘木通黃酮類成分的檢測(cè)方法及應(yīng)用。本發(fā)明以含山柰素的甲醇溶液為對(duì)照品溶液，采用高效液相色譜法對(duì)配制好供試品溶液中甘木通黃酮類成分進(jìn)行定性和/或定量分析。本發(fā)明可應(yīng)用于檢測(cè)提取方法相同或相近的含有甘木通組成的提取物、制劑、飲片或藥材中黃酮類成分的檢測(cè)，陰性無(wú)干擾，具有較強(qiáng)的專屬性和良好的重現(xiàn)性，可有效確保含甘木通的制劑品種均一、穩(wěn)定、有效、可控，保證了工藝的規(guī)范化和質(zhì)量的穩(wěn)定一致。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102426207SQ201110350669
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者鄧亞利 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)