專利名稱：：山楂黃酮類成分的提取純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種中藥的提取方法，具體涉及山楂的提取方法及其提取物。
背景技術(shù)：
：山楂為薔微科山楂屬植物山里紅(》atee^AS/w'朋aW/Yc/aBge.或山楂C.A/朋s"'/i^Bge.的干燥成熟果實(shí)，收載于2005年版《中國藥典》。具有消食化積、活血化瘀的功效?，F(xiàn)從山楂(果肉、核及葉)中發(fā)現(xiàn)且分離得到的成分共有150多種，主要成分為黃酮類、有機(jī)酸類等。黃酮是山楂的主要活性成分，現(xiàn)已分離得到金絲桃苷、蘆丁、槲皮素、牡荊素等。近年來，生山楂用于臨床治療高血壓、冠心病及高脂血癥等疾病?，F(xiàn)代藥理研究表明，山楂的主要有效成分為黃酮類化合物，具有降血壓、增加冠脈流量、強(qiáng)心作用、降血脂等作用。因此，山楂總黃酮的研究開發(fā)具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。對山楂葉總黃酮提取純化工藝文獻(xiàn)較多，而未見采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法對山楂總黃酮提取、純化工藝進(jìn)行全面系統(tǒng)研究的報(bào)道。本研究內(nèi)容具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。當(dāng)前，單味中藥提取物作為一種新興的產(chǎn)品正日漸受到重視，它以現(xiàn)代提取分離技術(shù)為依托，用規(guī)范的制備工藝生產(chǎn)的質(zhì)量可控而穩(wěn)定的提取物及其制劑；采用按《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GAP)要求規(guī)范化種植采收和加工的質(zhì)量可控的中藥材為原料，用現(xiàn)代化的提取技術(shù)、再按《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GMP)管理模式在完善質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)下進(jìn)行生產(chǎn)出的具有可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提取物產(chǎn)品。體現(xiàn)了中藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進(jìn)步和中藥現(xiàn)代化的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種山楂的有效部位的提取、純化和提取物的干燥方法。本發(fā)明的又一目的在于提供了采用上述方法獲得的山楂總黃酮提取物。本發(fā)明的一種山楂的提取方法包括山楂乙醇提取液濃縮后加水沉淀，過大孔樹脂柱，水洗，用乙醇洗脫，濃縮乙醇洗脫液，噴霧干燥。具體提取步驟如下1).取山楂飲片，干燥，加工成3-8毫米的碎粒，加濃度60-80%的乙醇回流提取三次，第一次加山楂重量8倍量的乙醇提取2小時(shí)，第二次加6倍量的乙醇提取1小時(shí)，第三次加6倍量的乙醇提取1小時(shí)，合并3次提取液，減壓回收乙醇，濃縮到無乙醇味，得提取濃縮液；2)、將歩驟l)得到的提取濃縮液加水至每毫升含生藥O.1克，調(diào)pH值為34，過濾，得濾液；3)、將歩驟2)得到的濾液過D-101大孔樹脂柱進(jìn)行吸附、用水洗和乙醇洗脫，吸附、水洗和乙醇洗脫工藝條件為吸附液流速為2-6倍柱體積/小時(shí)，吸附液量為4倍柱體積；水洗速率為2倍柱體積/小時(shí)，水洗體積為6倍柱體積；洗脫用乙醇的濃度為60-90%，流速為2倍柱體積/小時(shí)，用量為4.5倍柱體積；4)、收集乙醇洗脫液，濃縮至密度為l.l克/毫升，噴霧干燥，得到山楂提取物產(chǎn)品，提取物中總黃酮含量以蘆丁計(jì)為24.6%。收集干燥的山楂提取物產(chǎn)品，封口，放冷，稱重，置干燥處保存。上述提取優(yōu)選條件所述步驟1)中加濃度70%的乙醇回流提取三次。所述步驟3)中吸附流速為2倍柱體積/小時(shí)，吸附量為4倍柱體積；水洗速率為2倍柱體積/小時(shí)，水洗體積為6倍柱體積；洗脫用乙醇的濃度為80%，流速為2倍柱體積/小時(shí)，用量為4.5倍柱體積。所述步驟4)中噴霧干燥條件為噴霧干燥器進(jìn)風(fēng)口溫度為170°C，出風(fēng)口溫度為90°C，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000轉(zhuǎn)/分鐘。采用本發(fā)明的山楂提取方法，其山楂總黃酮轉(zhuǎn)移率達(dá)79.5%，提取物中總黃酮含量以蘆丁計(jì)為24.6%。本發(fā)明中所述乙醇濃度％是指IOO體積乙醇水溶液中含乙醇體積分?jǐn)?shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、工藝簡化。本發(fā)明采用合適濃度的乙醇回流提取，黃酮成分轉(zhuǎn)移率高；同時(shí)，本方法中將乙醇提取液濃縮無醇味后，加蒸餾水溶解，過濾，濾液過柱，這樣處理既保證有效成分的全部轉(zhuǎn)移，濾液還有利于有效成分的吸附，而且可以有效地防止樹脂柱的堵塞，保證大生產(chǎn)工藝的暢通性。2、采用噴霧干燥可以明顯縮短活性成分的受熱時(shí)間，減少成分損失。3、本工藝釆用D-101大孔樹脂進(jìn)行分離純化。該樹脂價(jià)格較低，而且安全性較高，是目前國內(nèi)藥品行業(yè)使用最多的一種大孔樹脂。圖1工藝過程流程圖圖2山楂樣品溶液上D101大孔樹脂柱吸附總黃酮的泄漏曲線圖380%乙醇為洗脫劑洗脫樹脂柱中總黃酮的洗脫曲線圖l所示工藝流程為山楂藥材(飲片)15公斤，用70%乙醇回流提取3次，第一次用乙醇120升，回流提取2小時(shí)，第二、三次用乙醇分別為90升，分別回流提取1小時(shí)，3次得到的山楂提取液合并，回收乙醇，濃縮到無乙醇味，放置過夜，濾過，濾液稀釋至150升，備用；稀釋的濾液以2倍柱體積/小時(shí)速率通過大孔樹脂，吸附完全后先用6倍柱體積蒸餾水沖洗，再用4.5倍柱體積的80%乙醇以相同流速洗脫，收集洗脫液，洗脫液濃縮至適量體積，噴霧干燥，得山楂提取物密封保存。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明方法作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1山楂總黃酮的提取工藝實(shí)驗(yàn)(1)使用乙醇回流提取法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用"(3"正交實(shí)驗(yàn)法考察乙醇回流提取山楂總黃酮中乙醇濃度、乙醇用量(山楂重量的倍數(shù))、提取時(shí)間以及飲片粒度等因素的工藝參數(shù)，并采用紫外一可見分光光度法對提取物中總黃酮的含量進(jìn)行測定，并以此為指標(biāo)進(jìn)行比較分析。結(jié)果見表l，表2，表3。表1試驗(yàn)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>正交試驗(yàn)結(jié)果表明(見表l，表2，表3)，影響因素最大的為乙醇濃度，其次為乙醇用量和飲片粒度，提取時(shí)間無明顯影響，直觀分析出最佳提取工藝為A2B2CJ)3?？疾斓斤嬈６纫蛩刂兴榱Ｅc最粗粉對山楂總黃酮收率無明顯的差異，加之加工成最粗粉增加工藝生產(chǎn)上的難度和生產(chǎn)成本，故選擇飲片加工成3毫米-8毫米的碎粒。綜上所述，選定最合適的工藝條件為A2BAD2，即將山楂加工成3毫米-8毫米碎粒，加8倍量的70%乙醇，提取3次，提取時(shí)間分別為2小時(shí)，1小時(shí)，1小時(shí)。(2)驗(yàn)證試驗(yàn)取山楂碎粒，共3份，按照優(yōu)選提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得總黃酮含量分別為15.23毫克/克、15.17毫克/克、15.32毫克/克，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。實(shí)施例2山楂總黃酮的大孔樹脂純化工藝實(shí)驗(yàn)用前述優(yōu)選提取條件提取得到的山楂提取液進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)(1)大孔樹脂的篩選實(shí)驗(yàn)樹脂來源D101樹脂(天津市海光化工有限公司)，AB-8、D4020樹脂(南開大學(xué)化工廠)，SP825、HP20、SP70(日本三菱公司)。樹脂的篩選結(jié)果見表4，表5，表6。表4五種樹脂靜態(tài)飽和吸附量測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6五種大孔樹脂動態(tài)篩選結(jié)果樹脂種類上柱量(毫克)比吸附量(毫克/克)比洗脫量(毫克/克)D-101141.2815.5712.77AB-8144.4915.0211.71SP825142.9716.2413.13HP20140.5310.267.24D4020142.389.355.61試驗(yàn)結(jié)果表明D-101、AB-8及SP825型大孔樹脂對山楂總黃酮的比吸附量、和比洗脫量均優(yōu)于HP20和D4020型號的大孔樹脂。其中SP825型號的樹脂效果最好，其次為D-101型。但是兩者效果差異不是很明顯，考察到D-101型大孔樹脂價(jià)格較低，而且安全性較高，是目前國內(nèi)藥品行業(yè)使用最多的一種大孔樹脂，故本研究選用D-101型大孔樹脂對山楂總黃酮進(jìn)行純化研究。(2)D-101樹脂純化工藝實(shí)驗(yàn)①吸附條件優(yōu)選實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)方法以上樣流速、藥液的濃度(以樣品中所含有的原藥材量計(jì))及卜-樣藥液的pH值作為考察因數(shù)，應(yīng)用U(3')正交表安排試驗(yàn)，因素及水平安排見表7。對以上9組試驗(yàn)分別測定總黃酮含量，并進(jìn)行評價(jià)。分析結(jié)果見表8，表9。_表7因素水平表_因素上樣流速上樣濃度&^上樣藥液空白_(倍柱體積/小時(shí))(克/毫升)_pH值120.0534240.156360.278_表8正交試驗(yàn)結(jié)果_因素實(shí)驗(yàn)號-結(jié)果ABCD<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>干溶劑，將浸膏衡重，精密稱定并計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果見表io。表io不同濃度洗脫液中總黃酮的量<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>結(jié)果表明80%與90%洗脫效果相差不明顯，從生產(chǎn)過程中安全因素以及成本等綜合考慮選用80%乙醇洗脫。④洗脫速率考察按上述條件進(jìn)行動態(tài)吸附，以80%乙醇為洗脫劑，分別以2，4，6倍柱體積/小時(shí)的速度洗脫，測定乙醇洗脫物中總黃酮量并計(jì)算洗脫率，結(jié)果表明洗脫速率為2倍柱體積/小時(shí)時(shí)洗脫率最高。⑤乙醇洗脫量考察按上述條件進(jìn)行動態(tài)吸附，以80%乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，定量收集流出液并測定其中總黃酮濃度。結(jié)果見圖2。結(jié)果表明用90毫升(約4.5倍柱體積)80%乙醇以2倍柱體積/小時(shí)流速可以完全洗脫20g樹脂所吸附的黃酮類成分。⑥水洗條件考察取按上述條件吸附好的大孔樹脂柱，用蒸熘水沖洗，流速為2倍柱體積/小時(shí)，每個(gè)流分收集10毫升，濃縮至1毫升，用a-萘酚反應(yīng)(Molish反應(yīng))檢識，當(dāng)反應(yīng)呈陰性時(shí)，停止水洗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用120毫升水洗(約6倍柱體積)后樹脂柱上的糖可以基本除去。實(shí)施例3中試放大實(shí)驗(yàn)稱取山楂飲片15千克，70%乙醇回流提取3次，第一次用乙醇120升，回流提取2小時(shí)，第二、三次用乙醇分別為90升，分別回流提取l小時(shí)，合并3次提取液，回收乙醇至無醇味，放置過夜，次日用濾布濾除沉淀，稀釋至每毫升含生藥O.1克的溶液，備用。將20千克藥用級D101型大孔樹脂用適量乙醇浸泡，濕法上柱，處理后備用。提取藥液分兩次上樣加入樹脂柱，每次75升，上樣流速為2倍柱體積/小時(shí)，pH值為原藥液pH值(約為pH34)，上樣后先用6倍柱體積的蒸餾水沖洗，再用4.5倍柱體積80%乙醇以相同流速洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮至小體積(密度約為l.l克/毫升)，噴霧干燥(噴霧干燥器進(jìn)風(fēng)口溫度為170°C，出風(fēng)口溫度為90°C，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000轉(zhuǎn)/分鐘)。收集干燥提取物，封口，放冷，稱重，置干燥處保存。采用紫外一可見分光光度法測定提取物中總黃酮的含量(以蘆丁計(jì))，計(jì)算轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率二提取物中總黃酮的含量/原藥材中總黃酮的含量X100。/。)和收膏率(收膏率=提取物總重量/原藥材總重量乂100%)。試驗(yàn)結(jié)果見表ll。表11中試實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)批次投藥量(千克)收膏率(％)轉(zhuǎn)移率(％)提取物總黃酮含量(％)115.03.179.324.5215.03.180.124.7315.03.079.224.6平均值15.03.179.524.6三批中試放大研究結(jié)果表明其山楂總黃酮轉(zhuǎn)移率達(dá)79.5%，提取物中總黃酮含量以蘆丁計(jì)為24.6%。表明本研究的工藝參數(shù)可行，工藝條件穩(wěn)定，可望過渡到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。權(quán)利要求1、一種山楂提取物，其特征在于提取物中總黃酮含量以蘆丁計(jì)為24.6％。2、權(quán)利要求1所述的山楂提取物的提取方法，其特征在于提取步驟為1)、取山楂飲片，干燥，加工成3-8毫米的碎粒，加濃度60-80%的乙醇回流提取三次，第一次加山楂重量8倍量的乙醇提取2小時(shí)，第二次加6倍量的乙醇提取1小時(shí)，第三次加6倍量的乙醇提取1小時(shí)，合并3次提取液，減壓回收乙醇，濃縮到無醇味，得提取濃縮液；2)、將歩驟l)得到的提取濃縮液加水至每毫升含生藥0.1克，調(diào)pH值為34-，過濾，得濾液；3)、將歩驟2)得到的濾液過D-101大孔樹脂柱進(jìn)行吸附、用水洗和乙醇洗脫，吸附、水洗和乙醇洗脫工藝條件為吸附液流速為2-6倍柱體積/小時(shí)，吸附液量為4倍柱體積；水洗速率為2倍柱體積/小時(shí)，水洗體積為6倍柱體積；洗脫用乙醇的濃度為60-90%，流速為2倍柱體積/小時(shí)，用量為4.5倍柱體積；4)、收集乙醇洗脫液，濃縮至密度為1.1克/毫升，噴霧干燥，得到山楂提取物產(chǎn)品，提取物中總黃酮含量以盧丁計(jì)為24.6%。3、如權(quán)利要求2所述的山楂提取物的提取方法，其特征在于所述歩驟1)中加濃度70%的乙醇回流提取三次。4、如權(quán)利要求2所述的山楂提取物的提取方法，其特征在于所述歩驟3)中吸附液流速為2倍柱體積/小時(shí)，吸附液量為4倍柱體積；水洗速率為2倍柱體積/小時(shí)，水洗體積為6倍柱體積；洗脫用乙醇的濃度為80%，流速為2倍柱體積/小時(shí)，用量為4.5倍柱體積。5、如權(quán)利要求2所述的山楂提取物的提取方法，其特征在于所述步驟4)中噴霧干燥條件為噴霧干燥器進(jìn)風(fēng)口溫度為170°C，出風(fēng)口溫度為90'C，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000轉(zhuǎn)/分鐘。全文摘要一種山楂黃酮類成分的提取純化工藝。其工藝步驟為1)取山楂飲片，干燥，加工成3-8毫米的碎粒，加濃度為70％乙醇回流提取3次，第1次加山楂重量8倍量的乙醇提取2小時(shí)，第2、3次分別加6倍量的乙醇提取1小時(shí)，合并提取液，減壓回收乙醇，濃縮，得提取濃縮液；2)提取濃縮液加水至每毫升含生藥0.1克，調(diào)pH值3～4，過濾得濾液；3)將濾液過D-101大孔樹脂柱進(jìn)行吸附、水洗和乙醇洗脫；4)收集乙醇洗脫液，濃縮至密度1.1克/毫升，噴霧干燥，即得山楂提取物產(chǎn)品。采用本山楂提取方法，其山楂總黃酮轉(zhuǎn)移率達(dá)79.5％，提取物中總黃酮含量以蘆丁計(jì)為24.6％。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有工藝簡化，活性成分損失減少，安全性較高等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號A61P9/00GK101104010SQ200710052649公開日2008年1月16日申請日期2007年7月5日優(yōu)先權(quán)日2007年7月5日發(fā)明者何再安,劉焱文,王光忠,磊閆,陳樹和申請人:湖北中醫(yī)學(xué)院