專利名稱：一種殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體應(yīng)用的用途，屬于醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀90年代以來，隨著“人類基因組計劃”的實施，基因技術(shù)、納米技術(shù)的發(fā)展，人們對于癌癥的發(fā)生機理有了更加深入的認識與研究，眾多科學(xué)工作者開始嘗試從癌細胞的產(chǎn)生根源——基因變異上尋找治療癌癥的方法。人們開始關(guān)注并致力于研究一種新的癌癥治療技術(shù)——基因治療。
基因治療，是指通過有效的基因傳遞系統(tǒng)，將質(zhì)粒DNA插入到目標(biāo)細胞中，進行轉(zhuǎn)錄，最終將所攜帶的基因信息傳遞給所連接的細胞中，從而達到治療疾病的目的。而具備高效，安全的基因載體是基因治療的關(guān)鍵。
由于病毒載體有較大的安全隱患，非病毒載體在被利用，如陽離子脂質(zhì)體，陽離子多聚物，SiO2等。但它們都有各自的局限性陽離子脂質(zhì)體具有一定的細胞毒性；陽離子多聚物生物相容性差，可降解性不高；SiO2需進行陽離子聚合物或氨基硅烷化等功能化修飾，程序化較復(fù)雜。因此，尋找新型安全高效的基因載體是基因治療的當(dāng)務(wù)之急。
殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料是目前一種剛研制出不久的新型納米復(fù)合材料，已被證實具有較好的藥物包封率和緩釋效果，但對其用途的研究還處于開發(fā)階段，目前尚未有將殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體應(yīng)用的任何報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開拓殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的新用途，將殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體應(yīng)用，為基因治療技術(shù)提供一種新型的、安全有效的基因載體材料——殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是將殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料用作基因載體。
且所用殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料中的殼聚糖季銨鹽與累托石重量百分比分別為1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
并且，以殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為質(zhì)粒DNA的載體，兩者形成的納米顆粒復(fù)合物為攜帶基因藥物，用于基因治療。
并且通過調(diào)節(jié)殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料與質(zhì)粒DNA的比例確定最佳轉(zhuǎn)染劑量。
本發(fā)明將殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體應(yīng)用，是因為該納米復(fù)合材料的細胞相容性良好，它是有機、無機納米復(fù)合物的典型雜化材料，通過二者的耦合作用而產(chǎn)生許多優(yōu)異的性能。而且由于納米粒子較小的尺寸、大的比表面產(chǎn)生的量子效應(yīng)，賦予納米復(fù)合材料許多特殊的功能。它有效地結(jié)合保護DNA，良好的內(nèi)吞性，強質(zhì)子海綿特性提高了細胞的轉(zhuǎn)染率。它分散性良好，滿足了基因載體的有效性。
本發(fā)明通過細胞相容性實驗、載體包裹質(zhì)粒DNA實驗、瓊脂糖凝膠電泳實驗、殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合體的制備和載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗，證明作為殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體時具有細胞相容性好、安全低毒、DNA包載量大的優(yōu)點，是一種安全有效的基因載體。


圖1細胞相容性結(jié)果圖。
圖2載體包裹質(zhì)粒DNA實驗結(jié)果圖。圖中殼聚糖季銨鹽與累托石重量百分比分別為1∶2，1∶1，2∶1和4∶1，分別標(biāo)記為HR1，HR2，HR3及HR4。
圖3瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果照片。
圖4殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合體照片。
圖5載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗中轉(zhuǎn)染72h后熒光顯微鏡照片。
圖6A載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗中細胞流失儀對照孔圖。
圖6B載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗中轉(zhuǎn)染96h后細胞流失儀檢測結(jié)果圖。
圖7A載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗中轉(zhuǎn)染120h后激光共聚焦暗視野照片。
圖7B載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗中轉(zhuǎn)染120h后激光共聚焦明視野照片。
具體實施例方式
殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料細胞相容性實驗、載體包裹質(zhì)粒DNA實驗、瓊脂糖凝膠電泳實驗、殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合體的制備和體外轉(zhuǎn)染實驗的具體過程如下(1)殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料細胞相容性實驗取一定量的殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料溶于水中，加入磁子攪拌之其完全溶解。接種HCCLM7于96孔板中，10000個/孔，24h待細胞貼壁后，加入殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料溶液，使其濃度為0.1，0.5，1.0，2.5，5，25，50，100μg/孔。在溫箱中培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，PBS洗三次；每孔加入100ul無血清培養(yǎng)基，并加入MTT 20μl/孔，4h后小心吸干孔內(nèi)液體，每孔加入DMST 150ul酶標(biāo)儀測量490nm吸光度。細胞相容性結(jié)果見如圖1。
(2)載體包裹質(zhì)粒DNA實驗取10μgDNA分別與不同質(zhì)量比殼聚糖季銨鹽/累托石的復(fù)合物以1∶1；1∶2；1∶4；1∶8混合，振蕩器上振蕩2h，離心機上7000rpm 5分鐘，紫外分光光度計測定上清中DNA濃度，由此可以得出殼聚糖季銨鹽/累托石復(fù)合材料所包裹的DNA量。載體包裹質(zhì)粒DNA實驗結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，HR3顯示了最好的包裹能力，可以確定最佳轉(zhuǎn)染劑量為質(zhì)粒DNA與殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的質(zhì)量比為2∶1。說明通過調(diào)節(jié)殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料與質(zhì)粒DNA的比例能確定最佳轉(zhuǎn)染劑量(3)瓊脂糖凝膠電泳實驗稱取0.8g瓊脂糖放入0.5×TBE緩沖液100ml中，加熱30min至完全溶化，取出搖勻，待瓊脂糖凝膠溶液冷卻到50℃左右，再加入10μl濃度為5μl/ml的EB，在第一泳道加入裸質(zhì)粒DNA，其他泳道加入10μl不同比例殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合物，電泳條件是電壓60V時間90min。瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果見圖3。
(4)殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合體的制備取10ug的殼聚糖季銨鹽/累托石復(fù)合物和5ug的質(zhì)粒DNA混合，室溫振蕩器上振蕩2h，-20℃保存。所得殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合體照片見圖4。
(5)載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗將LCCM7細胞以2×105接種在六孔板中，每孔中加入3ml培養(yǎng)液(含10％血清的RPMI1640)，置于37℃、5％CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；轉(zhuǎn)染前去掉培養(yǎng)液，用0.01mol/L(pH7.4)PBS洗滌一次，每孔中先分別加入1ml無血清的RPMI1640，再加入10μl不同質(zhì)量比的殼聚糖季銨鹽/累托石-DNA復(fù)合物；轉(zhuǎn)染24h后，去掉培養(yǎng)液，細胞用PBS洗滌兩次后，每孔中再加入3ml培養(yǎng)液(含10％血清的RPMI1640)；再培養(yǎng)48h后，去掉培養(yǎng)液，用PBS洗滌三次后，以75％的乙醇固定15min；再用PBS洗滌三次，每次10min；然后將濃度為4μg/ml的PI分別加入到六孔板中，室溫避光染色15min后，再次用PBS洗滌三次，每次約15min，最后取出六孔板中的蓋玻片，用50％的緩沖甘油封片備用。
細胞表達的GFP通過熒光顯微鏡，流式細胞儀，激光共聚焦熒光顯微鏡進行檢測。GFP采用波長為488nm的氖激光激發(fā)，其熒光發(fā)射波長為495-550nm。載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果照片見圖5、圖6A、圖6B、圖7A和圖7B。
從上述實驗結(jié)果可知本發(fā)明用作基因載體的殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的細胞相容性好，能100％包裹質(zhì)粒DNA，載體-質(zhì)粒DNA復(fù)合體穩(wěn)定分散，在激光共聚焦顯微鏡下，約80％細胞表達綠色熒光，殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為質(zhì)粒DNA的載體，兩者形成的納米顆粒復(fù)合物為攜帶基因藥物，能用于基因治療。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的用途，其特征在于將殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料用作基因載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的用途，其特征在于殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料中的殼聚糖季銨鹽與累托石重量百分比分別為1∶2、1∶1、2∶1或4∶1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的用途，其特征在于殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為質(zhì)粒DNA的載體，兩者形成的納米顆粒復(fù)合物為攜帶基因藥物，用于基因治療。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料的用途，其特征在于通過調(diào)節(jié)殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料與質(zhì)粒DNA的比例確定最佳轉(zhuǎn)染劑量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料作為基因載體應(yīng)用的用途。本發(fā)明通過細胞相容性實驗、載體包裹質(zhì)粒DNA實驗、瓊脂糖凝膠電泳實驗、殼聚糖季銨鹽/累托石－DNA復(fù)合體的制備及體外轉(zhuǎn)染實驗，表明該殼聚糖季銨鹽/累托石納米復(fù)合材料是一種細胞相容性好、安全低毒、高效的基因載體。
文檔編號A61K47/02GK101085360SQ200710052430
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月8日
發(fā)明者尚林源, 郭陽潔, 朱卓 申請人:武漢大學(xué)