專利名稱：包含脂肽和聚i:c作為佐劑的強(qiáng)力疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含脂肽和聚I:C(聚肌苷酸聚胞苷酸)的佐劑，還涉及包含所述佐 劑的疫苗。
背景技術(shù)：
通過加速或放大各種免疫應(yīng)答誘導(dǎo)過程的一個(gè)或多個(gè)特異性階段，佐劑在促進(jìn)免 疫應(yīng)答方面起到一定作用。因此，當(dāng)將佐劑與抗原共同給予時(shí)，可提高所述抗原的免疫原 性和/或改變針對所述抗原的免疫應(yīng)答種類。這類佐劑的典型實(shí)例為油乳劑(弗氏佐劑 (Freund' s adjuvant))、單磷酰脂A(MPL)、皂甙Q、氫氧化鋁或鋁的磷酸鹽或鈣鹽(Alum)、 非離子嵌段共聚物表面活性劑、脂多糖、分枝桿菌、破傷風(fēng)類毒素、CpG等。單獨(dú)使用蛋白抗原并不經(jīng)常誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的免疫應(yīng)答以及所需種類的免疫應(yīng)答，因 此所述疫苗組合物通常含有抗原和佐劑。根據(jù)免疫應(yīng)答的雙信號(hào)模型，通過抗原表位與抗 原受體的接合(engagement)進(jìn)行傳輸?shù)男盘?hào)不足以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，所述抗原表位由MHC分 子遞呈。需要由共刺激分子產(chǎn)生另外的信號(hào)。于是，所述佐劑能夠使得由共刺激分子產(chǎn)生 的信號(hào)強(qiáng)度加強(qiáng)和/或誘導(dǎo)共刺激分子，以及誘導(dǎo)決定免疫應(yīng)答種類的細(xì)胞因子。某些抗 原(例如脂蛋白、糖蛋白或全微生物)能夠以病原體相關(guān)分子模式(PAMP)的形式同時(shí)提供 表位和佐劑功能。蛋白抗原的一級結(jié)構(gòu)(即抗原的氨基酸序列)不能改變，但可加入適當(dāng) 的佐劑或附屬結(jié)構(gòu)來對抗原的PAMP進(jìn)行修飾和補(bǔ)充以影響免疫原性(Dempsey PW等人， Science 271 348-350,1996 ；Deres K 等人，Nature 342:561-564,1989)。對抗原的分子 模式進(jìn)行修飾可提高免疫原性并影響所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的種類。舉例來說，在HBV表面抗 原的情況下，不含PreSl和preS2的S-蛋白在特定的同類系小鼠菌株中沒有顯示出免疫原 性，而含有PreSl和preS2的L-蛋白不僅誘導(dǎo)生成針對preSl和preS2的抗體，而且有助于 誘導(dǎo)生成針對 S 抗原的抗體(Milich DR 等人，1986，New Approaches tolmmunization, pp 377-382，Cold Spring Harbor Laboratories, New York)。在用全病原微生物作為抗原的 情況下，預(yù)計(jì)所述微生物包含各類PAMP，例如脂多糖、核酸、脂蛋白和綴合蛋白(conjugated proteins) 0在這種情況下，存在于抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面上的病原體識(shí)別受體(PRR)識(shí) 別出PAMP，從而產(chǎn)生信號(hào)以誘導(dǎo)各種共刺激分子和細(xì)胞因子，影響免疫應(yīng)答的種類和量級。 舉例來說，干擾素Y和IL-12有助于誘導(dǎo)Thl(T輔助細(xì)胞1)應(yīng)答，所述Thl應(yīng)答在針對病 毒感染的免疫應(yīng)答方面起重要作用。Thl型免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)IgG2a和IgG2b生成的增加，并誘 導(dǎo)強(qiáng)力的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。于是，各類與抗原有關(guān)的PAMP起到佐劑的功能，并且這類 佐劑能有助于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。然而，通常情況下，這類天然佐劑與抗原有關(guān)的功能不足以強(qiáng) 到誘導(dǎo)出所需強(qiáng)度和質(zhì)量的免疫應(yīng)答，因而在疫苗制劑方面需要優(yōu)良的佐劑。因此，開發(fā)良好的佐劑在開發(fā)良好的疫苗中是一項(xiàng)非常重要的工作，但佐劑的開 發(fā)仍然不得不主要依靠經(jīng)驗(yàn)性的成果。舉例來說，Toll樣受體(TLR)是參與抗原遞呈細(xì)胞 (APC)的活化和由APC進(jìn)行抗原遞呈的抗原遞呈細(xì)胞上最重要的PRR。然而，強(qiáng)效抗體應(yīng) 答并非全部取決于 TLR 信號(hào)(Gavin. A.L.等人，Science 314 1936-1938，2006)。進(jìn)一步地，作為TLR2配體之一的Pam3Cys在獨(dú)立誘導(dǎo)TLR2免疫應(yīng)答方面發(fā)揮作用(Yoder等人， Infect. Immun. 71 =3894-3900,2003)。為使得事實(shí)更為復(fù)雜，良好的保護(hù)性免疫應(yīng)答需要平 衡同時(shí)包括強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及體液抗體應(yīng)答在內(nèi)的免疫應(yīng)答。因此，對有助于 誘導(dǎo)平衡性良好的適應(yīng)性免疫應(yīng)答的佐劑進(jìn)行開發(fā)仍然超出了能夠合理預(yù)測的范圍。在本發(fā)明中，關(guān)于最眾所周知的佐劑氫氧化鋁，發(fā)明者定義了一種強(qiáng)力的疫苗作 為疫苗制劑，所述疫苗能夠產(chǎn)生大量高質(zhì)量的抗原特異性抗體。對于生產(chǎn)優(yōu)良的預(yù)防性疫 苗或有效的治療性疫苗而言，生成適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體是非常重要的因素。舉例來說，IgG 同種型在清除腫瘤細(xì)胞方面起到不同的作用；相比于IgGl、IgG2b或IgG3，IgG2a是最為有 效的一種(Nimmerjahn F & Ravetch JV, Science 310 1510-1512，2005)。已知 IgG2a 禾口 IgG2b在誘導(dǎo)抗病毒免疫方面最為有效(Coutelier JP等人，J Exp Med 165 =64-69,1987 ； Markine-GorianoffD & Coutelier JP, J of Virol76 :432_435，2002)，其通過由 Thl 細(xì)胞 產(chǎn)生的細(xì)胞因子生成，還可誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，對于生成適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體 而言，Thl細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是一種良好的指示。作為應(yīng)用最為廣泛的佐劑Alum誘導(dǎo)Th 2型 免疫應(yīng)答，并且所誘導(dǎo)的抗體主要為IgGl。因此，本發(fā)明所述強(qiáng)力的疫苗組合物通過下述內(nèi)容進(jìn)行判斷所產(chǎn)生抗原特異性 抗體的量；以及與廣泛應(yīng)用的含有Alum佐劑的疫苗相比，高比例的IgG2a/IgGl和IgG2b/ IgGl。本發(fā)明中所描述的佐劑能誘導(dǎo)強(qiáng)力的抗體應(yīng)答以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并且能轉(zhuǎn) 換免疫球蛋白同種型以生成IgG2a和IgG2b。本發(fā)明者通過證實(shí)下述內(nèi)容完成本發(fā)明包含脂肽和聚I:C(聚肌苷酸聚胞苷 酸)的佐劑組合物要遠(yuǎn)比常規(guī)的佐劑氫氧化鋁更為強(qiáng)力，并進(jìn)一步證實(shí)在刺激適應(yīng)性免疫 應(yīng)答方面，脂肽和聚I:C具有協(xié)同作用而非加和作用。盡管已知Pam3Cys和聚I:C在巨噬 細(xì)胞中誘導(dǎo)TNF-α和IL-6方面具有協(xié)同作用(Bagchi，A.等人，J. Immun. 178 :1164_1171， 2007)，但由脂肽和聚I:C組成的類似組合具有平衡性良好的強(qiáng)力佐劑功能是一個(gè)意想不 到的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明者進(jìn)一步證實(shí)不需要將脂肽共價(jià)連接至抗原。以脂肽、聚I:C和至少一 種抗原的混合物的形式制成的簡單制劑已經(jīng)足夠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供能夠有助于抗原誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答的佐劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述佐劑和抗原的疫苗組合物。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供使用上述佐劑產(chǎn)生適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體的方法。本發(fā)明的目的還在于提供使用上述佐劑增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明的目的還在于提供用于病毒感染或寄生蟲感染的治療性疫苗，所述治療性 疫苗含有上述佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原。本發(fā)明的目的還在于提供針對癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗，所述疫苗含有所述佐 劑和至少一種癌特異性抗原。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了包含脂肽和聚I:C(聚肌苷酸聚胞苷酸)的佐 劑。本發(fā)明還提供了含有上述佐劑和至少一種適當(dāng)抗原的疫苗組合物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生適當(dāng)?shù)摹⒏哔|(zhì)量抗體的方法，所述方法包括將上述疫苗組合物給予對其有需要的受試者的步驟。本發(fā)明還提供了用于增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將上述疫苗組合物 給予對其有需要的受試者的步驟。本發(fā)明還提供了針對病毒感染或寄生蟲感染的治療性疫苗，所述治療性疫苗包含 所述佐劑組合物以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原。本發(fā)明還提供了針對癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗，所述疫苗含有所述佐劑組合物 以及至少一種癌特異性抗原。本發(fā)明還提供了所述佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原在生產(chǎn)用于治療 病毒感染或寄生蟲感染的治療劑方面的用途。此外，本發(fā)明提供了所述佐劑和至少一種癌特異性抗原在生產(chǎn)用于治療癌癥的治 療劑方面的用途。當(dāng)本發(fā)明所述的佐劑與抗原一起使用時(shí)，所述抗原特異性抗體的誘導(dǎo)得到刺激， 并且Thl型免疫應(yīng)答也得到誘導(dǎo)。因此，本發(fā)明所述的佐劑作為用于疫苗制劑的佐劑非常 有效，所述疫苗制劑用于預(yù)防和治療病毒感染或寄生蟲感染、或用于預(yù)防和治療癌癥。


本發(fā)明中優(yōu)選實(shí)施方式的應(yīng)用參考附圖可以得到最好的理解，其中圖1為顯示由各種疫苗制劑所誘發(fā)的S-蛋白抗體的滴度的圖，所述疫苗制劑含有 由L-蛋白(S-蛋白-preS2-preSl)、M_蛋白(S-蛋白-preS2)和S-蛋白組成的L-HBsAg， 并以氫氧化鋁(Alum)、僅Pam3Cys-SKKKK、僅聚I:C、或者Pam3Cys-SKKKK和聚I:C兩者作為 佐劑。圖2為顯示由各種疫苗制劑誘導(dǎo)的針對preS抗原的抗體滴度的圖，所述疫苗制劑 含有 L-HBsAg，并以 Alum、僅 Pam3Cys_SKKKK、僅聚 I:C、或者 Pam3Cys_SKKKK 和聚 I:C 兩者 作為佐劑。在本實(shí)驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)Pam3Cys-SKKKK和聚I :C之間協(xié)同作用的明顯效果。圖3為顯示由各種不同的疫苗制劑所誘導(dǎo)的抗體同種型的一組圖，所述疫苗制劑 含有 L-HBsAg，并以 Alum、僅 Pam3Cys_SKKKK ；僅聚 I :C ；或者 Pam3Cys_SKKKK 和聚 I :C 兩者 作為佐劑。a 每個(gè)同種型的抗體滴度；b :IgG2a/IgGl ；c :IgG2b/IgGl。圖4為顯示針對流感病毒HA抗原的免疫原性的圖，所述抗原用下述不同的佐劑進(jìn) 行制劑Alum、僅 Pam3Cys-SKKKK、僅聚 I :C、或者 Pam3Cys_SKKKK 和聚 I :C 兩者。圖5為顯示由流感病毒抗原所誘導(dǎo)的抗體同種型的一組圖，所述抗原用下述不同 類型的佐劑進(jìn)行制劑Alum、僅Pam3Cys-SKKKK、僅聚I :C ；或者Pam3Cys_SKKKK和聚I :C兩 者οa 每個(gè)同種型的抗體滴度b :IgG2a/IgGl圖6為顯示針對來自多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)的HBsAg抗原(S-蛋 白)的免疫原性和針對來自釀酒酵母菌(Saccharomycescereviciae)的preS的免疫原 性的圖，上述抗原在下述不同的佐劑中進(jìn)行制劑Alum、僅Pam3Cys-SKKKK、僅聚I:C、或者 Pam3Cys-SKKKK 和聚 I C 兩者。圖7為顯示疫苗針對preS抗原的免疫原性的圖，所述疫苗用漢遜酵母菌(Hansenula) S-蛋白和來自酵母菌的preS在下述不同的佐劑中進(jìn)行制劑Alum、僅 Pam3Cys-SKKKK、僅聚 I :C、或者 Pam3Cys_SKKKK 和聚 I :C 兩者。圖8為顯示由疫苗誘導(dǎo)的抗體同種型的圖，所述疫苗用來自漢遜酵母菌 的HBsAg(S-蛋白)和來自酵母菌的preS在下述不同的佐劑中進(jìn)行制劑Alum、僅 Pam3Cys-SKKKK、僅聚 I :C、或者 Pam3Cys_SKKKK 和聚 I :C 兩者。a 每個(gè)同種型的抗體滴度；b :IgG2a/IgGl ；c :IgG2b/IgGl。圖9為顯示由各種疫苗制劑所誘發(fā)的S-蛋白抗體的滴度的圖，所述疫苗制劑含有 由L-蛋白(S-蛋白-preS2-preSl)、M_蛋白(S-蛋白-preS2)和S-蛋白組成的L-HBsAg， 并以下述物質(zhì)作為佐劑氫氧化鋁(Alum)、僅Pam3Cys-SKKKK、僅Pam3Cys_SR8、僅FSL-1、 僅聚I :C、Pam3Cys-SKKKK和聚I :C的組合、Pam3Cys_SR8和聚I :C的組合、或者FSL-1和聚 I:C的組合。圖10為顯示各種疫苗制劑誘導(dǎo)的針對preS抗原的抗體的滴度的圖，所述疫 苗制劑含有L-HBsAg，并以下述物質(zhì)作為佐劑氫氧化鋁(Alum)、僅Pam3Cys-SKKKK、僅 Pam3Cys-SR8、僅 FSL-1、僅聚 I:C、Pam3Cys_SKKKK 和聚 I:C 的組合、Pam3Cys_SR8 和聚 I:C 的組合、或者FSL-I和聚I:C的組合。在本實(shí)驗(yàn)中，可以發(fā)現(xiàn)脂肽和聚I:C之間協(xié)同作用的明顯效果。圖11為顯示由各種不同的疫苗制劑所誘導(dǎo)的抗體同種型的一組圖，所述疫 苗制劑含有L-HBsAg，并以下述物質(zhì)作為佐劑氫氧化鋁(Alum)、僅Pam3Cys-SKKKK、僅 Pam3Cys-SR8、僅 FSL-1、僅聚 I:C、Pam3Cys_SKKKK 和聚 I:C 的組合、Pam3Cys_SR8 和聚 I:C 的組合、或者FSL-I和聚I:C的組合。a 每個(gè)同種型的抗體滴度；b :IgG2a/IgGl ；c :IgG2b/IgGl。
具體實(shí)施例方式在下文中將對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。 本發(fā)明提供了用于疫苗的佐劑，所述佐劑包含聚I C (聚肌苷酸聚胞苷酸)和一 種或多種脂肽。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，將脂肽Pam3Cys-SKKKK和聚I C混合，并用該混合物 作為佐劑來制備疫苗，所述疫苗含有L-HBsAg、流感抗原、或是以HBsAg S-蛋白和PreS的混 合物作為抗原。經(jīng)證實(shí)，相比于最常用的常規(guī)佐劑氫氧化鋁，含有Pam3Cys-SKKKK和聚I:C 的混合物的疫苗顯著增強(qiáng)了抗原特異性抗體的生成(參見圖1、2、4、6和7以及表1、2和 3)。當(dāng)使用Pam3CyS-SKKKK和聚I C的混合物時(shí)，在刺激免疫應(yīng)答方面具有協(xié)同作用； 也就是說，由所述混合物誘導(dǎo)的pre S抗體的滴度比由所述混合物的各個(gè)組分所誘導(dǎo)的抗 體滴度的加和值高出數(shù)倍。這在圖2中得到了最佳的例證，其中對于所述混合物或各個(gè)組 分進(jìn)行pre S抗體的抗體滴度的評價(jià)。對于S-蛋白抗體誘導(dǎo)的情況，這一協(xié)同效應(yīng)的顯著 性差一些(圖1)。這是因?yàn)樵谒袑?shí)驗(yàn)中所使用的抗原的量為飽和量，而不會(huì)顯示佐劑依 賴性的需要量。L-蛋白中的Pre S含量低于總量(5mg)的10%。當(dāng)使用已知誘導(dǎo)Th2免疫應(yīng)答的氫氧化鋁對疫苗進(jìn)行制劑時(shí)，IgGl抗體為占主導(dǎo) 地位的IgG同種型。而當(dāng)使用包含Pam3Cys-SKKKK和聚I:C的混合物進(jìn)行疫苗制劑時(shí)，主要生成IgG2a和IgG2b。因此，相比于由常規(guī)佐劑氫氧化鋁得到的比值，在使用Pam3Cys-SKKKK 和聚I:C的混合物的情況下，IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值更高(參見圖3、5和8以 及表1、2和3)。已知IgG2a和IgG2b的增加在防范病毒感染和癌癥方面非常有效，這表明 新佐劑的使用提高了免疫應(yīng)答的質(zhì)量。這一發(fā)現(xiàn)表明，本發(fā)明所述包含脂肽和聚I:C的佐 劑能夠有效地用于開發(fā)強(qiáng)力的治療性和預(yù)防性的疫苗制劑。由Metzger等人首次合成了脂肽，作為來源于細(xì)菌和支原體的脂肽的合成類似物 (Metzger J 等人，Int J Peptide Protein Res 37:46-57,1991)。從那以后，已經(jīng)合成了 許多類似物(EMC microcollections GmbHSindelfinger Str. 372070 Tubingen，德國)。 據(jù)報(bào)道，通過將一種與流感病毒T細(xì)胞表位結(jié)合的脂肽Pam3CyS-Ser-Ser給予小鼠，得以誘 導(dǎo)病毒特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL) (Schild H等人，Eur J Immunol 21 =2649-2654, 1991)。通常，已知脂肽作為 TLR2 配體(Trinchieri G & SherA，Nat Rev Immunol 7 179-190，2007)。在本發(fā)明中，所述脂肽由連接至甘油和氨基酸的脂肪酸組成。在每個(gè)分子中，脂 肽含有一個(gè)或多個(gè)脂肪酸。所述脂肽可為由部分分子或整個(gè)分子組成的脂蛋白，所述分 子來源于革蘭氏陽性或革蘭氏陰性的細(xì)菌或支原體。并且，本文所述脂肪酸和氨基酸可 通過化學(xué)修飾進(jìn)行合成。本文所述的脂肽例如Pam3CyS-SKKKK(式1 ；分子結(jié)構(gòu)N_棕 櫚?；?S-[2，3-雙(棕櫚酰氧基)_(2RS)_丙基]-[R]-半胱氨酸-SKKKK)、PHC-SKKKK、 01e2PamCys-SKKKK、Pam2Cys-SKKKK、PamCys(Pam)-SKKKK、01e2Cys-SKKKK、Myr2Cys_SKKKK、 PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK 以及 Dhc-SKKKK,但不總限于此。式1 聚I:C已經(jīng)在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中用作I型干擾素的強(qiáng)力誘導(dǎo)物(Magee ME & Griffith MJ, life Science II，11 :1081_1086，1972 ;ManettiYR等人，Eur J Immunol 25: 2656-2660，1995)，并且已知誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟，所述樹突狀細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體 內(nèi)最為通用的抗原遞呈細(xì)胞(APC)。成熟的DC能夠有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(Rous R等人， International Immunol 16 :767_773，2004)。還已知聚 I C 作為 IL-12 誘導(dǎo)物，所述 IL-12 作為重要細(xì)胞因子，其通過促進(jìn)Thl發(fā)育的增強(qiáng)來誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和IgG2a抗體 生成。此前還顯示了聚 I :C 的佐劑活性(Cui Z & Qui F, Cancer Immunol Immunotherapy 16 1-13,2005)。所述聚I :C(聚肌苷酸聚胞苷酸)是一種合成雙鏈RNA，其長度優(yōu)選50-2000bp， 更優(yōu)選 100_500bp。本發(fā)明提供了含有所述佐劑的疫苗組合物，所述佐劑包含脂肽和聚I:C以及至少 一種抗原。更具體地說，本發(fā)明提供了包含聚I:c和一種或多種脂肽的佐劑，所述佐劑可協(xié) 同刺激免疫應(yīng)答，而并非產(chǎn)生每種佐劑組分的加和效果。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，經(jīng)證實(shí)，通過使用本發(fā)明所述佐劑制備的疫苗協(xié)同 增加了抗原特異性抗體生成以及免疫應(yīng)答質(zhì)量的變化，主要誘導(dǎo)出IgG2a以及IgG2b (參見 圖1-8和表1-3)。因此，含有本發(fā)明所述佐劑組分的佐劑組合物能有效地用以增加抗原的 免疫原性，并因而提高疫苗的功效。本文所述的抗原表示能誘導(dǎo)動(dòng)物或人的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。其可為全長或片段。所述抗原可作為合成物質(zhì)、純化的亞基、全微生物或混合物提供，但優(yōu)選純 化的抗原。本文所述的抗原例如重組蛋白、或來自肝炎病毒的肽或來自流感病毒的病毒蛋 白，但所述抗原可為多糖、糖蛋白、脂多糖、DNA分子、癌細(xì)胞、活病毒或半抗原分子等。所 述病原體蛋白例如流感病毒抗原(HA 血凝素或神經(jīng)氨酸酶抗原)，但其可為百日咳桿菌抗 原、百日咳毒素、絲狀血凝素、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原、幽門螺桿菌抗原(血清群A、B、 (、￥和1-135的莢膜多糖)、破傷風(fēng)類毒素、白喉抗原(白喉類毒素)、肺炎球菌抗原(3型 肺炎鏈球菌莢膜多糖)、結(jié)核抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、GP-160)、霍亂抗原 (霍亂毒素B亞基)、葡萄球菌抗原(葡萄球菌腸毒素B)、志賀氏菌抗原(志賀氏菌多糖)、 水皰性口炎病毒抗原(水皰性口炎病毒糖蛋白)、巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原、肝炎抗原(甲型 肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV) =L-HBsAg, S-HBsAg, M-HBsAg, pre S)、呼吸道合胞體病毒(RSV)抗原、單純皰疹抗原、以及它們的組合 (例如白喉、百日咳和破傷風(fēng)；DPT)，但不總限于此。除所述佐劑和抗原外，本發(fā)明所述的疫苗組合物可另外包含一種或多種與其具有 相同或相似效果的有效成分。除上述有效成分外，為進(jìn)行給藥，所述疫苗組合物也可包含一 種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述藥學(xué)上可接受的載體可選自于由下列物質(zhì)所組成的 組或通過將其中多于一種成分進(jìn)行混合而制備鹽水、無菌水、林格氏溶液、緩沖鹽水、右旋 糖溶液、麥芽右旋糖(maltodextrose)溶液、甘油和乙醇。可加入其他通用的添加劑，例如 抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑等。為制備可注射的溶液例如水溶液、懸浮液和乳液，可另外 加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑。通過Remington' s Pharmaceutical Science (最新版，Mack Publishing Company, Easton, PA)中提供的方法，本發(fā)明所述的疫 苗組合物可進(jìn)一步針對每種疾病或根據(jù)其成分制備為適當(dāng)?shù)男问?。本發(fā)明所述的疫苗組合物可通過各種途徑進(jìn)行胃腸外給藥，所述胃腸外給藥包括 皮下注射、靜脈注射、肌內(nèi)注射和胸腔內(nèi)注射。為將所述疫苗組合物制備為用于胃腸外給藥 的制劑，將所述疫苗組合物與穩(wěn)定劑或緩沖劑混合，以生成溶液或懸浮液，然后以單劑量或 多劑量制劑為安瓿、注射器或小瓶的內(nèi)容物。本發(fā)明所述的疫苗組合物可根據(jù)給藥途徑制劑為各種形式。舉例來說，所述疫苗 組合物可制備為用于注射的滅菌水溶液或懸浮液，或制備為凍干形式。所述凍干疫苗組合 物通常貯藏于4°C，并可用含有或不含有添加劑(例如鹽水和/或HEPES)的穩(wěn)定劑復(fù)水。本發(fā)明所述疫苗組合物的劑量可通過考慮下述因素進(jìn)行確定給藥方法和頻率、 或正在治療的疾病、疾病的嚴(yán)重程度、病史、是否與另一種治療劑共同治療、以及年齡、身 高、體重、健康狀況、或身體條件，但不總限于此。通常，該疫苗組合物的劑量優(yōu)選隨著接受 治療的患者體重的增加而增加。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體的方法，所述方法包括將上述疫苗 組合物給予受試者的步驟。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明所述佐劑制備的疫苗組合物增加了 抗原特異性抗體的生成以及IgG2a和IgG2b的生成(參見圖1-10以及表1-4)。因此，本發(fā) 明所述的疫苗組合物可有效地用于適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體的大量生產(chǎn)，所述抗體需要有抗原 免疫原性的刺激。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，可通過腹膜內(nèi)注射、皮下注射、靜脈注射或肌內(nèi)注 射，將所述疫苗組合物進(jìn)行胃腸外給藥。所述疫苗組合物以能足以在受試者體內(nèi)刺激免疫 應(yīng)答的劑量進(jìn)行給予。舉例來說，所述疫苗可分一次或若干次給予人，每次劑量1-250 μ g， 更優(yōu)選10-100 μ g。本發(fā)明還提供了用于增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將上述疫苗組合物 給予對其有需要的受試者的步驟。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明所述佐劑制備的疫苗組合物增加了 IgG2a和IgG2b的生成(參見圖3、5、8和10以及表1、2、3以及4)。因此，本發(fā)明所述的疫 苗組合物可有效地用于增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答以提高免疫原性。本發(fā)明還提供了用于病毒感染或寄生蟲感染的免疫治療劑，所述免疫治療劑含有 所述佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原的組合物作為活性成分。本發(fā)明還提供了所述佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原在生產(chǎn)用于治療 病毒感染或寄生蟲感染的治療劑方面的用途。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明所述佐劑制備的治療劑組合物增加 了抗原特異性抗體的生成以及IgG2a和IgG2b的生成(參見圖1_10以及表1_4)。已知 IgG2a和IgG2b在防范病毒感染和寄生蟲的細(xì)胞性感染方面是有效的。因此，在包含本發(fā)明 所述用于疫苗的佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原的情況下，所述疫苗組合物可有 效地用作病毒感染或寄生蟲感染的治療劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病毒抗原為流感病毒抗原(HA 血凝素或神經(jīng) 氨酸酶抗原)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、GP-160)、 水皰性口炎病毒抗原(水皰性口炎病毒糖蛋白)、巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原、肝炎抗原(甲型 肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV) =L-HBsAg, S-HBsAg, M-HBsAg, Pre S)、呼吸道合胞體病毒(RSV)抗原或單純皰疹病毒抗原。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述寄生蟲為原生動(dòng)物、線蟲、吸蟲或絳蟲，但不限 于此。所述原生動(dòng)物優(yōu)選根足蟲、鞭毛蟲、纖毛蟲或孢子蟲，但不限于此。所述根足蟲包括溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histoytica)和結(jié)腸內(nèi)阿米巴 (Entamoeba coli)。所述鞭毛蟲包括蘭伯氏賈第蟲(Giardia lamblia)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)、腸毛滴蟲(Trichomonas hominis)禾口血鞭毛蟲(Haemoflagellates)0所述纖毛蟲包括結(jié)腸小袋蟲(Balantidium coli)。所述孢子蟲優(yōu)選瘧原蟲屬(Plasmodium sp.)，包括間日瘧原蟲(P. vivax)和惡 性瘧原蟲(P. falciparum)；剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)；卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)人等抱子球蟲(Isospora hominis)；隱抱子蟲屬(Cryptosporidium sp.)，包括 微小隱孢子蟲(C.parvum)和小鼠隱孢子蟲(C.muris)。所述線蟲優(yōu)選鞭蟲、鉤蟲、蟯蟲、蛔蟲或絲蟲，但不限于此。所述鞭蟲優(yōu)選毛首鞭蟲(Trichuris trichiura)或鞭形鞭蟲(Trichocephalus trichiuris)，但不限于此。然而，可包括對動(dòng)物(例如犬、貓和豬)造成感染的任何其他鞭 蟲。
所述鉤蟲優(yōu)選十二指腸鉤蟲(Ancylostoma duodenale)或美洲鉤蟲(Necator americanus),但不限于此。所述蟯蟲優(yōu)選蠕形住腸線蟲(Enterobius vermicularis)或格里高利蟯蟲 (Enterobius gregorii)。所述蛔蟲優(yōu)選通常對豬造成感染的豬蛔蟲(A. suum)或?qū)θ嗽斐筛腥镜娜嘶紫x (A.Iumbricoides)。所述絲蟲優(yōu)選班氏絲蟲(Wuchereria bancrofti)、盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)、羅阿絲蟲(Loa Ioa)或犬惡絲蟲(Dirofilariaimmitis)。所述吸蟲優(yōu)選復(fù)殖吸蟲(Digenea)，但不限于此。所述復(fù)殖吸蟲包括血吸蟲或非血 吸蟲。所述血吸蟲包括曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、埃及血吸蟲(Schistosoma haematobium)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicun)禾口 間插血吸蟲(Schistosoma intercalatum),但不限于此。所述非血吸蟲包括布氏姜片吸蟲(Fasciolopsis buski)、異形異形吸蟲 (Heterophyes heterophyes)、橫川后殖吸蟲(Metagonimus yokogawaii)、人似腹盤吸蟲 (Gastrodiscoides hominis)、華枝睪吸蟲(Clonorchissinensis)、月干片吸蟲(Fasciola hepatica)禾口衛(wèi)氏并殖吸蟲(Paragonimuswestermani),但不限于此。所述絳蟲優(yōu)選帶絳蟲(Taeniidae)或裂頭絳蟲(Diphyllobothriidae)，但不限于 此。所述帶絳蟲包括豬帶絳蟲(Taenia solium)和牛帶絳蟲(Taeniasaginata)。 所述裂頭絳蟲包括裂頭屬絳蟲(Diphyllobothrium sp.)，例如闊節(jié)裂頭絳蟲 (Diphyllobothrium latum)、樹狀裂頭絳蟲(Diphyllobothriumdendriticum)、日本海裂頭 絳蟲(D. nihonkaiense)、太平洋裂頭絳蟲(D. pacific·)、心形裂頭絳蟲(D. cordatum)、厄 氏裂頭絳蟲(D. ursi)、矛形裂頭絳蟲(D. Ianceolatum)、達(dá)林裂頭絳蟲(D. dalliae)以及米 子裂頭絳蟲(D. yonagoensis)?！凹纳x抗原”是指從能夠在宿主體內(nèi)誘導(dǎo)體液應(yīng)答的寄生蟲獲得的分子。所述寄 生蟲抗原可為表面糖蛋白或其碳水化合物分子，或?yàn)橹|(zhì)分子。對于特定的寄生蟲抗原，本領(lǐng)域公開了各種寄生蟲抗原。特別地，W09526402A1公開了蠕蟲寄生蟲抗原，其特征在于(i)為膜內(nèi)在蛋白 (integral membrane protein)的天然形式；(ii)天然定位于寄生蟲內(nèi)臟(gut) ； (iii)能 夠結(jié)合至硫醇親和培養(yǎng)基(thiol affinitymedium)以及(iv)被來自經(jīng)免疫的動(dòng)物宿主的 血清識(shí)別。W09512671A1公開了具有氨基肽酶樣活性的蠕蟲寄生蟲抗原。US6399077公開 了剛地弓形蟲感染的細(xì)胞培養(yǎng)裂解物的非感染性可溶組分。US6413521公開了針對非專性 吸血蠕蟲(non-obligate blood feeding helminth)來賦予保護(hù)性免疫的經(jīng)分離和純化的 抗原，其特征在于具有氨基肽酶M樣活性。US20070087012A1公開了新型的成束蛋白相關(guān) 粘附蛋白(FRAP)，所述粘附蛋白來自瘧原蟲和相關(guān)的寄生蟲。W09402169A1公開了能夠與 胃酶抑素結(jié)合的保護(hù)性后生動(dòng)物寄生蟲抗原。US4656251公開了犬惡絲蟲的寄生蟲抗原。 US4839275公開了犬惡絲蟲的循環(huán)寄生蟲抗原。針對病毒感染或寄生蟲感染的所述治療劑可通過皮下注射、靜脈注射或肌內(nèi)注射進(jìn)行胃腸外給藥。為將所述疫苗組合物制備為用于胃腸外給藥的制劑，將本發(fā)明所述的疫 苗組合物制備為油乳劑，然后制劑到安瓿、注射器或小瓶?？筛鶕?jù)吸收速率、失活速率、患者 的年齡、性別、健康狀況以及疾病的嚴(yán)重程度等來確定有效劑量。本發(fā)明還提供了用于癌癥的預(yù)防劑或治療劑，所述藥劑含有所述佐劑以及至少一 種癌特異性抗原組合物作為活性成分。所述癌癥優(yōu)選腎細(xì)胞癌、黑素瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、宮頸癌、胃癌、甲 狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、膽管瘤、肝癌、結(jié)腸癌或直腸癌，但不限于此。“癌特異性抗原”是在癌性組織和正常組織中區(qū)別表達(dá)的蛋白或其免疫學(xué)活性 片段。各種癌特異性抗原在本領(lǐng)域中是已知的。舉例來說，gplOO、MART-I和MAGE-I是 公知對于黑素瘤具有特異性的抗原。其他癌特異性抗原包括酪氨酸酶、CEA(癌胚抗原)、 PSA (前列腺特異性抗原)、HER2/neu、MAGE-l、MAGE-2、MAGE-3、NY-ESO-1、MUC-I、SART-I 或 SART-3、TERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶)或源自TERT的部分肽(partial peptide)、WTl或源自 WTl的部分肽、Survivin-2B或源自Survivin_2B的部分肽、gp75、MDM2、端粒酶、α-1甲胎 蛋白、CA125、CA15-3、CA19-9、G250 和 NY-ES0-1，但不限于此(參見 WO 2006/078059 和 WO 2007/065957)。另外的癌相關(guān)抗原(CAA)以及用于鑒別CAA的方法公開于Miller (Drug Discovery Today, 8 :31_38,2003)以及 Kawakami 禾口 Rosenberg (Immunol. Res. 16 :313, 2003)以及 Slingluff 等人(Curr. Opin. Immunol.，6 :733，1994)，將所述文件引入作為參考。此外，本發(fā)明提供了所述佐劑作為疫苗組分在制造用于治療癌癥的免疫學(xué)治療劑 方面的應(yīng)用，其中所述治療需要強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過使用本發(fā)明所述佐劑制備的免疫學(xué)治療劑組合 物增加了抗原特異性抗體的生成以及IgG2a和IgG2b的生成(參見圖1_10以及表1_4)。 已知IgG2a和IgG2b在抗癌免疫應(yīng)答方面非常有效。因此，含有本發(fā)明所述用于疫苗的佐 劑以及適當(dāng)?shù)陌┨禺愋钥乖乃雒庖邔W(xué)治療劑組合物能有效地用作預(yù)防或治療癌癥的 預(yù)防劑或治療劑。所述預(yù)防或治療癌癥的免疫學(xué)藥劑可通過皮下注射、靜脈注射或肌內(nèi)注射進(jìn)行胃 腸外給藥。為將所述疫苗組合物制備成用于胃腸外給藥的制劑，將本發(fā)明所述的疫苗組合 物制備為油乳劑，然后以安瓿、注射器或小瓶的形式貯存?？筛鶕?jù)吸收速率、失活速率、患者 的年齡、性別、健康狀況以及疾病的嚴(yán)重程度等來確定有效劑量。實(shí)施例在下面的實(shí)施例中，對本發(fā)明實(shí)用的和現(xiàn)有的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行說明。但是，可以理解的是，在考慮本發(fā)明所公開的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā) 明的精神和范圍內(nèi)進(jìn)行修改和改進(jìn)。實(shí)施例1 乙型肝炎病毒(HBV)抗原免疫原性的刺激用乙型肝炎病毒抗原和各種佐劑制備疫苗，并比較每種疫苗制劑所誘導(dǎo)的抗體滴 度，所述佐劑包含氫氧化鋁(Alum ;Brenntag Biosector，德國)；僅Pam3Cys_SKKKK (脂 肽)(EMC microcollections GmbH，德國)；僅聚 I C (Sigma，美國)；或Pam3Cys_SKKKK和聚 I:C兩者的混合物。
<!-!>疫苗的制備及給予通過將乙型肝炎病毒全表面抗原(whole surface antigen) (L-HBsAg ；韓國專利 號(hào)10-0836745)以及所述佐劑混合制備疫苗，將該疫苗給予小鼠。其中，L-HBsAg由S-蛋 白(無pre Sl和pre S2的小蛋白)、M-蛋白(只有pre S2的中蛋白)和L-蛋白(同時(shí) 有preSl和preS2的大蛋白)組成。特別地，如表1 所示，將 20 μ g 的 Pam3Cys_SKKKK、或聚 I C、或 Pam3Cys_SKKKK 和 聚I:c兩者與0. 5μ g的L-HBsAg混合以產(chǎn)生油乳劑形式的疫苗，然后比較不同制劑所誘導(dǎo) 的抗體滴度。作為陽性對照組，將等量抗原用氫氧化鋁進(jìn)行制劑。將疫苗通過肌內(nèi)注射給 予6周齡的C57BL/6雌性小鼠，注射三次，每次間隔兩星期。陰性對照組注射不含抗原和佐 劑的PBS。表 1 <1~2>免疫應(yīng)答的分析<1-2~1>針對HBSAg(S-蛋白)的抗體滴度在給予疫苗前、以及第三次給予疫苗后2個(gè)星期采集血清，并通過ELISA對抗原特 異性抗體的生成進(jìn)行分析以測定抗體滴度。具體而言，將96孔微板用重組S-蛋白(Dobeel Corp.，韓國)以IOOng/孔的濃度 覆蓋，然后通過加入BSA進(jìn)行阻斷l(xiāng)h。洗滌所述微板，向每個(gè)孔中加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的血 清，并在37°C培養(yǎng)2h。然后，將抗小鼠山羊IgG-HRP(辣根過氧化物酶；Sigma，美國)作為 二抗加入每個(gè)孔，并在37°C培養(yǎng)lh。培養(yǎng)結(jié)束后，將板用PBST (含有Tween 20的PBS)徹 底洗滌，再加入TMB (3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)過氧化物酶底物溶液(KPL，美國)，然后在室溫下培養(yǎng)20分鐘。然后，用ELISA讀取器測定0D450?？贵w滴度由抗體最終稀釋度的 倒數(shù)(inverse value)確定，所產(chǎn)生的OD讀數(shù)為陰性對照組OD的三倍。如表1和圖1所示，在誘導(dǎo)針對HBV包膜蛋白的S-蛋白更高的抗體滴度方面，使 用Pam3Cys-SKKKK或聚I:C要比氫氧化鋁更為有效。具體而言，當(dāng)使用Pam3Cys-SKKKK和聚 I C的混合物時(shí)，所誘導(dǎo)的抗體滴度略高于其各自單獨(dú)誘導(dǎo)的抗體滴度的加和值，這表明了 兩種組分的協(xié)同效應(yīng)。組合使用Pam3Cys-SKKKK和聚I :C的協(xié)同效應(yīng)在誘導(dǎo)Pre S抗體方 面更為明顯。這可歸因于所使用抗原的量，原因是L-HBsAg制劑中的pre S的量低于總量 的10%。并且，0.5yg抗原對于小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答而言接近飽和量(數(shù)據(jù)未顯示)。<1-2-2>針對pre S的抗體滴度除用pre S抗原(Dobeel Corp.，韓國)作為捕捉抗體的抗原外，通過與實(shí)施例 <1-2-1>中所描述的相同的方法測定抗體滴度。如表1和圖2所示，同時(shí)含有Pam3Cys-SKKKK和聚I:C的佐劑混合物在誘導(dǎo)針對 pre S更高的抗體滴度方面更為有效。通過所述佐劑混合物誘導(dǎo)pre S抗體具有協(xié)同作用， 與單獨(dú)由Pam3Cys-SKKKK和聚I:C所誘導(dǎo)的pre S抗體滴度的相加值相比，其誘導(dǎo)出高于 4倍的pre S抗體。<1-2-3>所誘導(dǎo)HBsAg特異件抗體的同種型除使用IgGl、IgG2a和IgG2b (小鼠單克隆抗體同種型試劑；Sigma，美國)作為二 抗外，通過與實(shí)施例<1-2-1>中所描述的相同的方式測定抗體滴度。并且用所得到的抗體 滴度計(jì)算IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值。如圖3a所示，用所述佐劑混合物得到的同種型IgG2a和IgG2b比由氫氧化鋁得到 的值高出許多。具體而言，對IgG2b的誘導(dǎo)，用所述佐劑混合物得到的值高于用氫氧化鋁得 到的值的20倍。當(dāng)使用包含Pam3Cys-SKKKK和聚I:C的佐劑混合物時(shí)，IgG2a/IgGl比值 約為使用氫氧化鋁情況下的10倍。具體而言，IgG2b的生成顯著較高，并且IgG2b/IgGl的 比值遠(yuǎn)高于IgG2a/IgGl (圖3b和圖3c)。實(shí)施例2 流感病毒抗原免疫原性的刺激用氫氧化鋁、僅Pam3Cys_SKKKK、僅聚I:C、或Pam3Cys_SKKKK和聚I:C的混合物作 為佐劑對流感病毒抗原進(jìn)行制劑，并且對于HBsAg抗體分析，使用流感病毒抗原作為捕捉 抗原測定所誘導(dǎo)抗體的滴度。<2-1>流感病毒抗原的制劑及給予通過將重組裂解疫苗抗原(Korea Vaccine Co.，Ltd，韓國)和所述佐劑混合來制 備不同的制劑，將該疫苗給予小鼠。所述抗原通過下述步驟進(jìn)行制備用流感病毒菌株A/ 新喀里多尼亞/20/99 (HlNl)、A/威斯康星/67/2005 (H3N2)以及B/馬來西亞/2506/2004 感染發(fā)育中的卵的尿囊；對其進(jìn)行培養(yǎng)、純化和失活。特別地，如表2 所示，將 20 μ g 的 Pam3Cys_SKKKK、聚 I C、Pam3Cys_SKKKK 和聚 I :C 的混合物、或氫氧化鋁與1. 8μ g的所述裂解疫苗抗原混合，得到油乳劑的形式的各種不同 的疫苗制劑。將這些不同的制劑通過肌內(nèi)注射給予5周齡的C57BL/6雌性小鼠，注射兩次， 每次間隔三星期。陰性對照組只接受PBS，而陽性對照組僅接受所述抗原而不含任何佐劑。 所有組均含有6只小鼠。表2 <2~2>免疫應(yīng)答的分析在給予疫苗前、以及第二次給予疫苗后2個(gè)星期，從每只小鼠體內(nèi)采集血清，并通 過ELISA對抗原特異性抗體的生成進(jìn)行分析以測定抗體滴度。<2-2-1>ΗΑ抗體滴度的測定除用HA抗原(Korea Vaccine Co.，Ltd，韓國)作為捕捉抗體的抗原外，通過與實(shí) 施例<1-2-1>中所描述的相同的方式測定抗體滴度。如表2和圖4所示，在誘導(dǎo)針對HA更高的抗體滴度方面，Pam3Cys_SKKKK和聚I C 的混合物比單一組分或氫氧化鋁更為有效(協(xié)同效應(yīng))。<2-2-2>所誘導(dǎo)的HA特異件抗體的同種型除用IgGl和IgG2a作為二抗用于同種型測定外，通過與實(shí)施例<2_2_1>中所描述 的相同的方法測定抗體滴度。用所得到的抗體滴度計(jì)算IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值。圖5a顯示同種型IgGl和IgG2a的抗體滴度。并且，用所述抗體滴度計(jì)算同種型 的比值。與由單一組分或氫氧化鋁得到的值相比，用所述佐劑混合物得到的IgG2a/IgGl值 特別高(圖5b)。實(shí)施例3:伸用重_ HBsAg(來自多形m孫酵母的S-蛋白)和重鉬weS蛋白(來 自釀酒酵母菌)的強(qiáng)力疫苗制劑通過使用氫氧化鋁、或Pam3Cys-SKKKK和聚I:C的混合物作為佐劑，用重組HBsAg 和重組preS蛋白制備各種疫苗制劑，并對免疫應(yīng)答進(jìn)行比較。<3-1>疫苗的制備及其給予通過將重組HBsAg (Dobeel Corp.，韓國)、重組 preS 蛋白(DobeelCorp.，韓國) 和所述佐劑混合制備疫苗，并將所得疫苗通過肌內(nèi)注射給予小鼠。使用重組HBsAg和重組 PreS蛋白作為抗原，所述重組HBsAg只含有S-蛋白而不含preS抗原，所述重組preS蛋白 通過與膠體金結(jié)合而制備為顆粒型。特別地，用含有Pam3Cys-SKKKK和聚I C每種各20 μ g的混合物作為佐劑，與 0. 5 μ g重組S-蛋白和5 μ g的preS蛋白產(chǎn)生油乳劑形式的疫苗。每種測試疫苗的每劑含有 0. 5 μ g所述重組S-蛋白和5 μ g所述preS，然后將其通過肌內(nèi)注射給予5周齡的C57BL/6 雌性小鼠，注射三次，每次間隔兩星期。陰性對照組只接受PBS。陽性對照組接受包含氫氧化鋁、S-蛋白和與膠體金結(jié)合的重組PreS抗原的混合物。實(shí)驗(yàn)組1接受通過將乳化的S-蛋白、Pam3Cys-SKKKK和 聚I:C與膠體金結(jié)合的重組preS抗原進(jìn)行混合而制備的疫苗。實(shí)驗(yàn)組2接受通過將所有 組分共同乳化而制備的疫苗，所述組分包括S-蛋白、與膠體金結(jié)合的重組preS抗原以及 Pam3Cys-SKKKK和聚I :C的混合物。<3~2>免疫應(yīng)答的分析在給予疫苗前、以及第三次給予疫苗后2個(gè)星期采集血清樣品，并通過ELISA對抗 原特異性抗體的生成進(jìn)行分析，并將其表達(dá)為抗體滴度。<3-2~1>針對S-蛋白的抗體滴度通過與實(shí)施例<1-2-1>中所描述的相同的方法測定針對S-蛋白的抗體滴度。如表3和圖6所示，Pam3Cys-SKKKK和聚I :C的佐劑混合物所誘導(dǎo)的針對S-蛋白 的抗體滴度高于使用氫氧化鋁情況下的10倍。特別地，相比于通過首先將所述佐劑與S-蛋 白先乳化、再加入結(jié)合的pre S而制備的疫苗，通過將所有組分共同乳化而制備的疫苗誘導(dǎo) 出更高的抗體滴度。表3 <3~2~2>Pre S 抗體滴度通過與實(shí)施例<1-2-2>中所描述的相同的方式測定Pre S抗體滴度。如表3和圖7所示，相比于使用氫氧化鋁，使用Pam3Cys-SKKKK和聚I C作為佐劑 混合物，誘導(dǎo)出更高的針對pre S的抗體滴度。特別地，通過將所有組分(包括HBsAg和 PreS抗原)與所述佐劑共同乳化而制備的疫苗最有效地誘導(dǎo)了 pre S抗體，其高于使用氫 氧化鋁情況下所誘導(dǎo)的抗體的3倍。<3-2-3>所誘導(dǎo)HBsAg特異件抗體的同種型通過與實(shí)施例<1-2-3>中所描述的相同的方式測定同種型的抗體滴度。并由所得 到的抗體滴度計(jì)算IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值。如圖8a所示，得到同種型IgGl、IgG2a和IgG2b的抗體滴度。并且，用所述抗體 滴度計(jì)算同種型的比值。當(dāng)使用Pam3Cys-SKKKK和聚I :C的佐劑混合物時(shí)，IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值高于使用氫氧化鋁的情況。特別地，經(jīng)證實(shí)，相比于通過將preS抗原與 乳化的HBsAg和所述佐劑混合而制備的疫苗，通過將HBsAg和preS抗原與所述佐劑混合并 共同乳化而制備的疫苗更為有效(圖8b和圖8c)。實(shí)施例4 使用各種脂肽的佐劑組合物為測試各種脂肽與聚I:C的協(xié)同佐劑效應(yīng)，將Pam3Cys_SKKKK、Pam3Cys_SR8或 FSL-1 (成纖維細(xì)胞刺激脂肽)與乙型肝炎病毒抗原進(jìn)行制劑。<4-1>疫苗的制備及給予通過將預(yù)吸附在氫氧化鋁上的乙型肝炎病毒全表面抗原與所述佐劑組分混合來 制備疫苗，并將所得疫苗給予小鼠。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，被氫氧化鋁吸附的抗原更為穩(wěn)定， 并且所述氫氧化鋁對于脂肽和聚I:C混合物的佐劑效果沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)。特別地，如表4所示，將0. g吸附于氫氧化鋁的L-HBsAg用20ii g的各種脂肽或 聚I:C(實(shí)驗(yàn)組1-4)進(jìn)行制劑。并且，將等量抗原用脂肽和聚I:C的混合物(實(shí)驗(yàn)組5-7) 進(jìn)行制劑。將疫苗通過肌內(nèi)注射給予6周齡的C57BL/6雌性小鼠，注射三次，每次間隔兩星 期。陰性對照組只給予PBS而不給予所述疫苗和所述抗原，陽性對照組給予用氫氧化鋁制 劑的所述抗原。表4 <4~2>免疫應(yīng)答的分析在給予疫苗前、以及最后一次給予疫苗2個(gè)星期后，從每只小鼠體內(nèi)采集血清，并 通過ELISA對抗原特異性抗體的生成進(jìn)行分析以測定抗體滴度。<4-2~1>針對HBsAg的(S-蛋白)的抗體滴度通過與實(shí)施例<1-2-1>中所描述的相同的方式測定抗體滴度。如表4和圖9所示，當(dāng)使用所述脂肽(例如Pam3Cys_SKKKK和Pam3Cys_SR8)和聚 I C的混合物時(shí)，所誘導(dǎo)的抗體滴度略高于各自單獨(dú)誘導(dǎo)的抗體滴度的加和值，這表明了這 兩種組分的協(xié)同效應(yīng)。<4~2~2>針對preS的抗體滴度除用preS抗原(Dobeel Corp.，韓國)作為捕捉抗體的抗原外，通過與實(shí)施例 <1-2-1>中所描述的相同的方法測定抗體滴度。如表4和圖10所示，含有所述脂肽之一和聚I:C的佐劑混合物在誘導(dǎo)針對preS 更高的抗體滴度方面更為有效。對于pre S抗體的生成而言，如前述在實(shí)施例<1-2-2>中 使用Pam3Cys-SKKKK和聚I:C的情況那樣，Pam3Cys-SKKKK以外的脂肽與聚I:C組合使用 的協(xié)同效應(yīng)也更為顯著。<4-2-3>所誘導(dǎo)HBsAg特異性抗體的同種型除使用IgGl、IgG2a和IgG2b作為二抗外，通過與實(shí)施例<1_2_1>中所描述的相同 的方式測定抗體滴度。通過使用所得到的抗體滴度，計(jì)算IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值。如圖11a所示，與用氫氧化鋁作為佐劑所誘導(dǎo)的值相比，當(dāng)用所述脂肽和聚I:C的 組合作為佐劑時(shí)，同種型IgG2a和IgG2b的抗體滴度要高出許多。因而，當(dāng)使用所述佐劑混 合物時(shí)，IgG2a/IgGl和IgG2b/IgGl的比值也更高(圖lib、圖11c)。當(dāng)使用Pam3Cys_SKKKK、 Pam3Cys-SR8或FLS-1作為所述脂肽組分時(shí)，具有類似的協(xié)同效應(yīng)。特別是Pam3Cys-SKKKK 和聚I:C的組合最為有效。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明了的是，可容易地利用在上述說明書中所公開的概念和具 體實(shí)施方式，作為改進(jìn)或設(shè)計(jì)其他實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明用途相同的實(shí)施方式的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域技術(shù) 人員還將明了的是，這類等同的實(shí)施方式?jīng)]有脫離如所附權(quán)利要求書中闡明的本發(fā)明的精 神和范圍。
權(quán)利要求
一種用于疫苗的佐劑，所述佐劑包含聚I∶C(聚肌苷酸∶聚胞苷酸)和一種或多種脂肽，其中各種組分在刺激誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面具有協(xié)同作用。
2.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其中，所述脂肽選自于由下列物質(zhì)所組成的組 Pam3Cys-SKKKK、Pam3Cys_SR8、FLS-I、PHC-SKKKK、01e2PamCys_SKKKK、Pam2Cys_SKKKK、 PamCys (Pam)-SKKKK、01e2Cys_SKKKK、Myr2Cys_SKKKK、PamDhc-SKKKK, PamCSKKKK 以及 Dhc-SKKKK。
3.如權(quán)利要求1所述的佐劑，其中，所述聚I C的長度為50-2，000bp。
4.一種疫苗組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1所述的佐劑以及至少一種抗原。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述抗原為選自于由下述物質(zhì)所組成的組 中的一種或多種組分病原體蛋白、重組蛋白、肽、半抗原、多糖、糖蛋白、脂多糖、DNA分子 (多聚核苷酸)、癌細(xì)胞以及微生物。
6.如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述抗原選自于由L-HBsAg、流感HA、S-蛋 白和preS所組成的組。
7.如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，所述組合物能夠有效地誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫，產(chǎn) 生適當(dāng)?shù)?、抗原特異性的高質(zhì)量抗體，所述抗體包括IgGl、IgG2a和IgG2b。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其中，所述適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體為IgGl、IgG2a和 IgG2b 型。
9.一種用于生成適當(dāng)?shù)?、高質(zhì)量抗體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求4所述的疫苗 組合物給予對其有需要的受試者的步驟。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述方法有助于適當(dāng)?shù)摹⒏哔|(zhì)量抗體的大量生產(chǎn)。
11.一種用于增強(qiáng)Thl免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將權(quán)利要求4所述的疫苗組合物 給予對其有需要的受試者。
12.一種用于病毒感染或寄生蟲感染的治療劑，所述治療劑包括權(quán)利要求1所述的佐 劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原。
13.如權(quán)利要求12所述的治療劑，其中，所述病毒抗原為流感病毒抗原(血凝素(HA) 或神經(jīng)氨酸酶抗原)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原、人免疫缺陷病毒(HIV)抗原(GP-120、 GP-160)、水皰性口炎病毒抗原(水皰性口炎病毒糖蛋白)、巨細(xì)胞病毒(CMV)抗原、肝炎抗 原(甲型肝炎(HAV)、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)和庚型肝炎(HGV) L-HBsAg, S-HBsAg, M-HBsAg, pre S)、呼吸道合胞體病毒(RSV)抗原或單純皰疹病毒抗原。
14.如權(quán)利要求12所述的治療劑，其中，所述寄生蟲為原生動(dòng)物、線蟲、吸蟲或絳蟲。
15.一種用于癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗，所述疫苗包含權(quán)利要求1所述的佐劑以及 至少一種癌特異性抗原。
16.如權(quán)利要求15所述的預(yù)防性或治療性疫苗，其中，所述癌癥為腎細(xì)胞癌、黑素瘤、 慢性淋巴細(xì)胞性白血病、肺癌、宮頸癌、胃癌、甲狀腺癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、 膽管瘤、肝癌、結(jié)腸癌或直腸癌。
17.如權(quán)利要求15所述的用于癌癥的預(yù)防性或治療性疫苗，其中，所述癌特異性抗原 為gpl00、MART-l和MAGE-I、酪氨酸酶、CEA(癌胚抗原)、PSA(前列腺特異性抗原)、HER2/ neu、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、NY-ESO-1、MUC-1、SART-I 或 SART_3、TERT (端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶) 或源自TERT的部分肽、WTl或源自WTl的部分肽、Survivin-2B或源自Survivin-2B的部分肽、gp75、MDM2、端粒酶、α -1 甲胎蛋白、CA125、CA15-3、CA19-9、G250 或 NY-ESO-l。
18.權(quán)利要求1所述的佐劑以及至少一種病毒抗原或寄生蟲抗原在生產(chǎn)用于治療病毒 感染或寄生蟲感染的治療劑方面的用途。
19.權(quán)利要求1所述的佐劑以及至少一種癌特異性抗原在生產(chǎn)用于預(yù)防或治療癌癥的 免疫學(xué)藥劑方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含脂肽和聚I:C的佐劑。當(dāng)使用本發(fā)明所述包含脂肽和聚I:C的佐劑時(shí)，抗原特異性抗體誘導(dǎo)的水平得以協(xié)同性地增加，并誘導(dǎo)了Th1型免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明所述的佐劑能夠非常有效地在疫苗的制劑中用作佐劑，所述疫苗為用于病毒感染和癌癥的預(yù)防性和治療性疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/385GK101883585SQ200880119025
公開日2010年11月10日 申請日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者安秉喆, 廉晶善, 文洪模 申請人:多見爾有限公司