專利名稱：法呢基二苯并二氮雜酮的晶體形式的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
〔0001 〕本發(fā)明涉及法呢基二苯并二氮雜萆酮的晶體形式 (crystalline form)。本發(fā)明也涉及所述晶體形式的制備方法、包含所 述晶體形式的藥物組合物以及在藥物中應(yīng)用該晶體形式的方法，所述藥 物用于施用于需要此類藥物的哺乳動物。
背景技術(shù)：
〔0002〕新型法呢基二苯并二氮雜萆酮(在本文中稱為如下的化合 物1 )分離自》文線菌小單孢菌(actinomycetes, Micromonospora sp.)的新 菌抹，如在2004年1月21日提交的美國申請序列號10/762，107中所公 開，該申請在2004年8月以WO 2004/065591公開，該申請通過參考以 其全部引入本文。該結(jié)構(gòu)也公開在Charan等，(2004), J. Nat. Prod., vol 67, 1431-1433 (以diazepinomidn),以及公開在Igarashi等，(2005), J. Antibiot.: 350-352中。發(fā)現(xiàn)該化合物具有包括抗脂加氧酶活性、抗細(xì)菌活性以及 抗癌活性在內(nèi)的有效活性。此外，美國申請序列號(于2004年9月27 日提交)和11/130,295 (于2005年5月16日提交)公開了法呢基二苯并 二氮雜犟酮在動物模型中的體內(nèi)抗癌效力。這些申請無一公開化合物1 的晶體形式或其制備方法。
〔0003〕為制備用于施用于哺乳動物的含有化合物1的藥物組合物， 按照保健注冊權(quán)威機構(gòu)的保健注冊要求(例如，F(xiàn)DA的良好操作規(guī)范 (Good Manufacturing Practices, GMP)),化合物應(yīng)當(dāng)用以盡可能純的形 式使用，并且具有恒定的物理性質(zhì)，包括純度、溶解度和穩(wěn)定性。藥物 單獨地或者在賦形劑存在時的固態(tài)性質(zhì)能對包括其穩(wěn)定性、溶解度和生 物利用度在內(nèi)的藥物性能具有非常顯著的影響。
〔0004〕相比非晶形，晶體形式通常具有較低的雜質(zhì)濃度以及更穩(wěn) 定且一致的產(chǎn)品質(zhì)量，例如，更穩(wěn)定的物理特征如顏色、溶解率和易處 理性，以及更長期的穩(wěn)定性。因此，在藥物、藥物組合物或藥劑的制造 中，無論任何可能的情況下，重要的是提供基本晶體形式的活性化合物。 因為是更可靠的，因此就物理性質(zhì)如熔點值而言，晶體形式確保批次之間的質(zhì)量控制結(jié)果的再現(xiàn)性。
〔0005〕多晶的已知實例的藥物利托那韋，其為一種銷售用于治療 HIV/AIDS的蛋白酶抑制劑，來自Abbott Laboratories,商品名為利托那 韋(Norvir)。該產(chǎn)品于1996年以其唯一 已知的固體形式首次面世。晶 體形式后來被發(fā)現(xiàn)，其證明相比其最初的形式是熱力學(xué)更穩(wěn)定的，且溶 解度減小50%,并且發(fā)現(xiàn)其是在貯存期間形成的。該形態(tài)不滿足常規(guī)的 溶解規(guī)范，并且該藥物從市場撤出。具有第二種晶體形式的軟凝膠制劑 再次面世，但是對公眾不是沒有效果，對于HIV/AIDS患者而言失去了 治療選擇。
〔0006 〕使用玻璃化轉(zhuǎn)變(Tg)在50 °C以下的非晶形的藥物可能是開 發(fā)固體口服劑量的關(guān)注所在(例如參見，Bechard and Down (1992), Pharmaceutical Research, vol 9, no 4, 521-528)。理想地，所使用的形態(tài)不 應(yīng)當(dāng)具有低于IO(TC的Tg。這些被認(rèn)為是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，因為具有低Tg的非 晶形易于轉(zhuǎn)變成熱力學(xué)更穩(wěn)定的形式，這例如可發(fā)生在生產(chǎn)和配制步驟 (例如，加熱、壓縮等)過程中、貯存過程中，或者一旦施用后發(fā)生在胃 腸道內(nèi)。
發(fā)明內(nèi)容
〔0007〕本發(fā)明提供化合物1的晶體形式、其生產(chǎn)方法以及其作為 藥物的應(yīng)用。在一個實施方式中，化合物1具有下面的結(jié)構(gòu)式
化合物1
〔0008〕在一方面，本發(fā)明提供晶體形式I。在一個實施方式中， 晶體形式I特征在于DSC (示差掃描量熱法)掃描顯示至少在約100 。C與約14(TC之間寬的一級轉(zhuǎn)變相以及約183°C±5°C (通過DSC的開
10始)的熔解溫度；基本如圖l(c)所示的x射線衍射圖(diffraction pattern); 以及如通過熱解重量分析法(thermogravimetry analysis, TGA)所示在100 。C之下的重量損失。在一個實施方式中，形式I以在X射線粉末衍射圖 中的下述角位置(26角±1% (two theta angles±l%))為特征5.14。、 10.34。、 15.20。、 20.78°、 22.80°、 26.02°和31.20°。在另一實施方式中， 形式I以在X射線粉末衍射圖中的下述角位置(2 6角± 1%)為特征5.1。、 10.3。、 15.2。、 20.8。、 22.8。、 26.0。和31.2。。
〔0009〕在另一方面，本發(fā)明提供晶體形式II。在一個實施方式中， 晶體形式II特征在于DSC掃描顯示在約IO(TC與約140。C之間寬的一 級轉(zhuǎn)變相以及約183°C±5°C (通過DSC的開始)的熔解溫度；基本如 圖l(b)或圖l(d)所示的x射線衍射圖；以及如通過TGA所示在IO(TC之 下的重量損失。在一個實施方式中，形式II以在X射線粉末衍射圖中的 下述角位置(2 6角± 1%)為特征4.16。、 8.320、 12.50。、 16.70。、 20.940、 25.20。、 29.48°和33.82°。在另一實施方式中，形式II以在X射線粉末 衍射圖中的下述角位置(26角± 1%)為特征4.2。、 8.3°、 12.5°、 16.7。、 20.9。、 25.2。、 29.5°和33.8。。
〔0010〕在另一方面，本發(fā)明提供晶體形式III。在一個實施方式中， 晶體形式II特征在于DSC掃描顯示約183°C ±5°C (通過DSC的開始 溫度)的熔解溫度以及在熔解之前顯示無一級轉(zhuǎn)變相(沒有峰)；以及 基本如圖l(a)所示的X射線粉末衍射圖(XRPD)。在一個實施方式中，形 式m以在X射線粉末衍射圖中的下述角位置(26角± 1%)為特征3.96。、 7.86°、 11.80°、 15.74。、 23.64。和27.62。在另一實施方式中，形式III以 在X射線粉末衍射圖中的下述角位置(26角± 1%)為特征4.0。、 7.9。、 11.80、 15.70、 23.6。和27.6。。
〔0011〕在另一方面，本發(fā)明提供化合物1的晶體形式，其可通過 從包含至少一種低碳烷基醇的溶劑系統(tǒng)結(jié)晶獲得。在一個實施方式中，
該低碳烷基醇是d—6烷基醇，優(yōu)選d—4烷基醇。在另一實施方式中，所 述低碳烷基醇選自甲醇、乙醇和異丙醇。在另一實施方式中，所述溶劑 系統(tǒng)包含水和選自曱醇、乙醇和異丙醇的低碳烷基醇。在另一實施方式 中，晶體形式是形式I。在另一實施方式中，晶體形式是形式II。
〔0012〕在另一方面，晶體形式可通過熱處理部分結(jié)晶或基本結(jié)晶 的形式獲得。在一個實施方式中，熱處理在約50。C至接近熔點的溫度(例如約170。C)范圍內(nèi)的溫度下進行，優(yōu)選地約5(TC至約100°C,更優(yōu)選約 6(TC至約80。C。在另一實施方式中，熱處理進行30分鐘至24小時的期 間，優(yōu)選進行2至20小時的期間，更優(yōu)選進行4至10小時的期間。在 另一實施方式中，熱處理任選在減壓或者惰性條件下完成。
〔0013〕在另一方面，本發(fā)明提供制備化合物1的晶體形式的方法， 其包括下述步驟(a)提供化合物l, (b)用溶劑系統(tǒng)處理化合物1,和(c) 收集晶體。在一個實施方式中，該方法的步驟(b)還包括脫色步驟。在另 一實施方式中，該方法還包括步驟(d):干燥在(c)中收集的晶體。在一個 實施方式中，溶劑系統(tǒng)包含一種或多種溶劑，其包括有機溶劑(例如， 低碳烷基醇、乙酸烷基酯、脂族烴、卣化烴、低碳二烷基酮、乙腈和二 烷基醚)和水性溶劑(例如水)。優(yōu)選地，該溶劑系統(tǒng)包括低碳烷基醇，更 優(yōu)選地，該溶劑系統(tǒng)包括低碳烷基醇和水。在進一步的實施方式中，步 驟(d)的熱處理在約50。C至接近熔點的溫度(例如約170。C)范圍內(nèi)的溫度 下進行，優(yōu)選地約5(TC至約100°C,更優(yōu)選約6(TC至約8(TC。在另一 實施方式中，熱處理進行約30分鐘至約24小時的期間，優(yōu)選進行約2 至約20小時的期間，更優(yōu)選進行約4至約IO小時的期間。在另一實施 方式中，步驟(e)的熱處理任選在減壓或者惰性條件下完成。在一個實 施方式中，在步驟(c)得到的晶體具有晶體形式I。在另一實施方式中， 在步驟(c)中得到的晶體具體晶體形式II。在另一實施方式中，在步驟(d) 中得到的晶體具有晶體形式III。
〔0014〕在另一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含治療有效量 的化合物1的至少一種晶體形式和藥學(xué)上可接受的載體。在一個實施方 式中，該藥物組合物用于口服施用。在另一實施方式中，該藥物組合物 是用于口服施用的固體組合物。在另一實施方式中，制劑是液體懸浮液。 在該實施方式的子類中，該液體懸浮劑用于鼻內(nèi)、局部、經(jīng)口或腸胃外 施用，或者用于通過吸入施用。在又一實施方式中，制劑是用于經(jīng)口施 用或通過吸入施用的固體制劑。在另一實施方式中，藥物組合物包括晶 體形式I。在另一實施方式中，藥物組合物包括晶體形式II。在另一實
施方式中，藥物組合物包括晶體形式m。
〔0015〕在另一實施方式中，本發(fā)明提供化合物1的至少一種晶體
形式在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療需要此種治療的對象的腫 瘤。在該實施方式的子類中，所述藥物是固體口服組合物或口服懸浮液。在另一實施方式中，本發(fā)明提供化合物1的至少一種晶體形式在治療需
要此類治療的對象的胂瘤癥狀(neoplastic condition)中的應(yīng)用。在另一 實施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物作為抗腫瘤藥物的應(yīng)用，所述藥物 組合物包括化合物1的至少一種晶體形式和藥學(xué)上可接受的載體。在另 一實施方式中，本發(fā)明提供藥物組合物在制備治療需要此類治療的對象 的腫瘤癥狀的藥物中的應(yīng)用，所述藥物組合物包括化合物1的至少一種 晶體形式和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明進步提供試劑盒或商業(yè)包，其 包括化合物1的至少一種晶體形式以及描述化合物1晶體治療腫瘤癥狀 的使用說明的書面文件。
〔0016〕在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供治療胂瘤的方法，其 包括向需要此類治療的對象施用治療有效量的化合物l的至少一種晶體
形式的步驟。在進一步的實施方式中，化合物1的至少一種晶體形式以 進一步包含藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物施用。
〔0017〕在一個實施方式中，在任何上述方法或應(yīng)用中治療的腫瘤 選自肺癌、結(jié)腸直腸癌(包括結(jié)腸癌)、CNS癌(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、卵 巢癌、腎癌、前列腺癌、乳癌、造血癌(hematopoietic cancer)(包括白血 病)和黑色素瘤。
〔0018〕圖l(a-d):顯示各種化合物1晶體形式的特征X射線粉末 衍射(XRPD)圖(在室溫下)[垂直軸強度；水平軸2 6 (度)，從2度到 40度],關(guān)于峰值參見表1。圖l(a)顯示在60。C下進行6小時的退火 (annealing process )過程之后的晶體形式III的特征XRPD圖。圖1(b) 顯示晶體形式II(從異丙醇/水中結(jié)晶)的特征XRPD圖。圖1(c)顯示晶。體 形式I (從甲醇/水中結(jié)晶)的特征X射線粉末衍射圖(在室溫下)。圖l(d) 顯示晶體形式n (從乙醇/水中結(jié)晶)的特征XRPD。
〔0019〕圖2:顯示化合物1的部分非晶粉末形式的DSC (示差掃 描量熱法)溫i普圖(thermogram ),其中溫度殺+i皮(temperature ramp)為20 °C/min,從-60。C到210°C，包括-15。C的玻璃化轉(zhuǎn)變。
〔0020〕圖3至5:顯示在圖3至5中的所有DSC溫譜圖是在室溫 (25。C)至210。C于氮下完成的，其中溫度斜坡為5'C/min。
〔0021 〕圖3(a,b):圖3(a)顯示晶體形式I的DSC溫譜圖，其顯示
13在約183。C的熔點之下的寬一級轉(zhuǎn)變。圖3(b)顯示在減壓下于6(TC退火 形式I6小時之后晶體形式III的DSC溫譜圖，其顯示在約183。C的熔點 之下沒有一級轉(zhuǎn)變。
〔0022〕圖4(a,b):圖4(a)顯示晶體形式II (來自乙醇/水)的DSC 溫譜圖，其顯示在約183。C的熔點之下的寬一級轉(zhuǎn)變。圖4(b)顯示在減 壓下于60°C退火形式II (來自乙醇/水)6小時之后晶體形式III的DSC溫 譜圖，其顯示在約183。C的熔點之下沒有一級轉(zhuǎn)變。
〔0023〕圖5(a到d):顯示在不同溫度下退火形式II (來自乙醇/水) 6小時之后晶體形式III的DSC溫譜圖。圖5(a)顯示來自ll(TC下退火的 形式II的形式III的DSC。圖5(b)顯示來自90。C下退火的形式II的形式 m的DSC。圖5(c)顯示來自7(TC下退火的形式n的形式III的DSC。圖 5(d)顯示來自6CTC下退火的形式II的形式III的DSC。
〔0024〕圖6和7:顯示TGA (熱解重量分析法)溫譜圖，其中溫度 斜坡為20°C/min,從室溫(25。C)到675°C。在氮氣流下從室溫(25。C)到 55(TC。在55(TC,將氮氣流變?yōu)榭諝饬饕源龠M最終轉(zhuǎn)變(降解)。
〔0025〕圖6:圖6(a)顯示形式I (來自曱醇/水)在減壓下于6(TC 退火6小時之后形式III的TGA溫譜圖。圖6(b)顯示形式I (來自甲醇/ 水)的TGA溫譜圖，其在IO(TC之下顯示重量損失。
〔0026〕圖7:圖7(a)顯示形式I1 (來自乙醇/水)在減壓下于60°C 退火6小時之后形式III的TGA溫譜圖。圖7(b)顯示形式I1 (來自乙醇/ 水)的TGA溫譜圖，其在IO(TC之下顯示重量損失。
具體實施例方式
〔0027〕本發(fā)明的一方面提供具有如化合物1所定義的結(jié)構(gòu)式的化 合物的晶體形式，其相比粉末形式表現(xiàn)出更具再現(xiàn)性的純度和/或物理穩(wěn) 定性，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出-15'C左右的玻璃化轉(zhuǎn)變(Tg)?；衔飈的晶體形式 (特別是形式I、 II和III)以及如在WO 2004/065591和美國序列號 10/951,436 (于2004年9月27日提交)及11/130,295 (于2005年5月16 曰提交)中所述的化合物1粉末具有相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性光譜。
〔0028〕本發(fā)明的第二方面提供制備化合物1的晶體形式的方法。 在一個實施方式中，該方法提供收集結(jié)晶產(chǎn)物的步驟。在另一實施方式 中，該方法包括大規(guī)模進行的化合物的結(jié)晶，用于化合物1的商業(yè)生產(chǎn)。〔0029〕本發(fā)明的第三方面提供結(jié)晶化合物1的方法。在一個實施 方式中，相比結(jié)晶前化合物的粉末形式，該方法增加了該化合物的純度 和/或物理穩(wěn)定性。該方法包括在如下條件下結(jié)晶粉末的步驟在該條件 下，結(jié)晶的化合物比該化合物的非晶形制劑更純。
〔0030〕在該實施方式的另一方面，化合物1結(jié)晶二產(chǎn)生形式I。
在該實施方式的另一方面，化合物i結(jié)晶二產(chǎn)生形式n。在該實施方式 進一步的方面，基本、主要或部分晶體形式——例如含有形式I或II或 者含有兩者的晶體——的熱處理產(chǎn)生另 一晶體形式，例如形式III。
I. M
〔0031 〕除非另外定義，在此所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如本
發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義。
〔0032 〕術(shù)語"法呢基二苯并二氮雜罩酮(famesyl dibenzodiazepinone)"、"化合物"、"藥物"或"活性成分，，將表示化合 物l。術(shù)語"化合物1"，當(dāng)在生產(chǎn)化合物1晶體的過程或方法的情況下 使用時，是指作為結(jié)晶原材料的化合物1,其可以上粗制的、粉末、基 本純或本質(zhì)純的形式，其可以是非晶形的、部分結(jié)晶或結(jié)晶的，因為一 種晶形或晶形混合物可用于產(chǎn)生相同的晶形(例如，達到進一步的純度) 或不同的晶形。
〔0033〕化合物1或其晶體形式的純度是指其在藥物組合物中配制 之前的化合物。該純度以"百分比純度"指代，并且是化合物1 (結(jié)晶 的或非結(jié)晶的)相對于非化合物1的組分存在的量的量度，而不是結(jié)晶 純度的量度。純度可以通過包括下述的方法測量核磁共振(NMR)波譜 法、氣相色譜/質(zhì)譜分析法(GC/MS)、液相色譜/質(zhì)譜分析法(LC/MS)和液 相色譜/紫外波語法(LC/UV)。
〔0034〕術(shù)語"分離"是指已經(jīng)從其最初環(huán)境(例如，反應(yīng)混合物、 生產(chǎn)培養(yǎng)物或發(fā)酵)中轉(zhuǎn)移的化合物或產(chǎn)物，其可以處于固體或粉末形 式、半固體形式或油狀，并且是指為混合物中所存在的化合物的至少 5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95% (按 重量計％)的化合物或產(chǎn)物。術(shù)語"粗制的"是指含有按重量計至少50 %化合物1的化合物1的混合物，其可以上半固體狀或油狀，或者固體 或粉末形式，并且可以包括晶體。術(shù)語"純的"或"純化的"是指基本純的或本質(zhì)純的混合物1。術(shù)語"基本純的(substantially pure)"是指 具有至少95Wwt化合物1的樣品。術(shù)語"本質(zhì)純的(essentially pure)" 是指具有至少97。/。wt化合物1的樣品。
〔0035〕術(shù)語化合物1的"粉末形式"是指非晶形或部分非晶形， 其可以是部分結(jié)晶的?；衔?的粉末形式在本文所述的條件下通常表 現(xiàn)出在大約-15 °C處的玻璃化轉(zhuǎn)變(T g)。
〔0036〕術(shù)語"晶形"或"多晶型物，，通常是指具有相同化學(xué)組成 (例如化合物1 )但具有不同的3維排列的固體形式，其具有或者不具 有包括在該排列中的溶劑和/或水分子。術(shù)語"非晶形的"通常是指具有 很少或不具有3維排列的形式。
〔0037〕化合物1作為晶體的測定可以通過如下方法來確定，其包 括光學(xué)顯微術(shù)、電子顯微術(shù)、x射線粉末衍射、固態(tài)NMR波譜法或 偏振光顯微鏡術(shù)。光學(xué)和電子顯微術(shù)一額可以用于確定晶體的尺寸和形 式。本文的發(fā)明包括化合物1的所有晶體。
〔0038〕術(shù)語"結(jié)晶化合物1"、"化合物1晶體"或"化合物1的 晶形(一種或多種)"是指化合物1的固體形式，其包括50%、60%、70%、 80%、 90%或95%以上的一種或多種的化合物1的晶形或多晶型物。術(shù) 語"基本結(jié)晶的(substantially crystalline )"是指包含至少95%的化合物 1晶體的化合物1的固體形式。術(shù)語"本質(zhì)結(jié)晶的(essentially crystalline)" 是指基本上沒有非晶形的晶體形式。
〔0039〕術(shù)語"處理化合物1"是指從本文所述的任意溶劑中結(jié)晶 或重結(jié)晶化合物1。結(jié)晶或重結(jié)晶的必要步驟描述在III部分。
C0040〕術(shù)語"溶質(zhì)"是指溶解于另一種物質(zhì)中而形成溶液的物質(zhì)。 如本文所用，溶質(zhì)是指非晶形粉末或晶體形式的化合物1。
〔0041〕術(shù)語"溶液，，是指兩種或多種物質(zhì)混合而形成單一均勻的 相。 一種物質(zhì)是溶劑而其它(溶質(zhì))被認(rèn)為是溶解在其中。如本文所用， 溶液包含如上所述的一種溶質(zhì)和一種溶劑或組合的多種溶劑。
〔0042〕術(shù)語"低分子量醇"、"低碳烷基醇"或"d-6烷基醇"是 指含有至少一個醇官能團和1至3個碳原子的有機化合物。低分子量 醇的代表性實例包括而不限于曱醇、乙醇、丙醇(例如，異丙醇和正丙醇)、 丁醇(例如異丁醇、仲丁醇、^又丁醇和正丁醇)和二元醇(例如，乙二醇和 丙二醇。
16〔0043〕術(shù)語"一級轉(zhuǎn)變溫度(一級轉(zhuǎn)變溫度，first order transition temperature)"是指物理狀態(tài)變?yōu)榱?一種狀態(tài)(無分子降解)時的溫度。 該溫度可以是分子重排(晶體類型改變)或者熔點。術(shù)語"熔點"是指固 體物質(zhì)(晶狀的或非晶形的)轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w狀態(tài)時的溫度。
〔0043〕術(shù)語"玻璃化轉(zhuǎn)變溫度"或"Tg"是指發(fā)生熱值變化時的 溫度，并且就分子流動性而言固體物質(zhì)(非晶態(tài))獲得自由度。
〔0044〕術(shù)語"溫度斜坡(temperature ramp)"是指進行掃描時的 力口熱禾口;令^卩速度。
〔0046〕術(shù)語"重量損失，，是指利用恒定的溫度斜坡在加熱過程中 樣品(或其內(nèi)含物，如溶劑)的重量損失，并且通常以。/owt(o/。重量)表達。 該重量損失可與捕獲在化合物中溶劑(一種或多種)的去除有關(guān)。重量 損失也與溶劑去除之后的分子降解有關(guān)。
〔0047〕術(shù)語"分解溫度"是指化合物開始降解時的溫度。其為通 常發(fā)生在熔點之后的轉(zhuǎn)變。
〔0048〕術(shù)語"退火(annealing)"是指涉及物質(zhì)的加熱和受控冷 卻以增加其晶體大小以及減少其缺陷的技術(shù)。熱引起原子(分子)開始脫 離其初始位置(內(nèi)部能量的局部最小化)并無規(guī)則地移動經(jīng)過較高的能量 態(tài)；緩慢的冷卻給它們提供了更多找到比其初始構(gòu)型具有更低內(nèi)部能量 的構(gòu)型的機會。術(shù)語"退火過程(annealing process )"、"退火步驟"或 "熱處理"是指等溫步驟，在該步驟期間針對確定的階段溫度被設(shè)為恒 定，目的是得到更穩(wěn)定的晶態(tài)，其有時通過去溶劑化完成。術(shù)語"去溶 劑化"是指這樣的過程，通過該過程組合物分別去除了大部分的溶劑分 子。當(dāng)溶劑分子是水分子時，去溶劑化過程也被稱為"脫水"。在此，"退 火，，發(fā)生在等溫下的樣品干燥過程中，并且術(shù)語"退火過程"、"熱處理" 和"干燥"在通篇說明書中被等同使用。
〔0049〕術(shù)語"產(chǎn)生化合物1的微生物"及其等同物是指攜帶產(chǎn)生 化合物1必需的遺傳信息的微生物，無論該生物體是否天然產(chǎn)生該化合 物。該術(shù)語等價地適用于這樣的生物體，其中當(dāng)該生物體存在于其天然 環(huán)境中時，在該生物體中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生化合物1的遺傳信息；適用于這樣的 生物體(宿主細(xì)胞)，其中遺傳信息通過已知的重組技術(shù)被引入。可以 弓1入宿主細(xì)胞中的遺傳信息的實例提供在美國專利公開2005-0043297 以及于2006年1月12日提交的美國專利申請XX/XXX,XXX中，通過參考以其全部將它們引入本文。 II. 化合物1的晶體形式
〔0050〕本發(fā)明提供在本文中被稱為化合物1的化合物的晶形:
HO
化合物1
〔0051〕化合物i的晶體形式i、 n和m以其任一種或多種物化性
質(zhì)為特征，如熔解溫度、X-射線粉末衍射(XRPD)圖、示差掃描量熱 法(DSC)溫譜圖和熱解重量分析法(TGA)。所有晶體形式以約183。C土5 °C (通過DSC的開始)的熔解溫度為特征。
〔0052〕晶形I進一步的特征在于基本如圖l(c)所示以及如表1 所述的XRPD圖；基本如圖3(a)所示的DSC溫譜圖；至少在約100°C 到約140。C之間的寬一級轉(zhuǎn)變；約183。C土5。C (通過DSC的開始)的熔 解溫度；和基本如圖6(b)所示的TGA溫譜圖。
〔0053〕晶形II進一步的特征在于基本如圖l(b)或圖l(d)所示以 及如表1所述的XRPD圖；基本如圖4(a)所示的DSC溫鐠圖；約100 。C到約140。C之間的寬一級轉(zhuǎn)變；約183。C土5。C (通過DSC的開始)的 熔解溫度；和基本如圖7(b)所示的TGA溫i普圖。
〔0054〕晶形III進一步的特征在于基本如圖l(a)所示以及如表1 所述的XRPD圖；基本如圖3(b)、 4(b)和5(a-d)中任一所示的DSC溫語 圖；在熔點之下沒有寬一級轉(zhuǎn)變；約183。C土5。C (通過DSC的開始)的 熔解溫度；和基本如圖6(a)和7(a)中任一所示的TGA溫譜圖。
〔0055〕晶體形式I和II如本文所述通過用低碳烷基醇處理化合物 l產(chǎn)生，而形式m通過干燥形式I或II產(chǎn)生。所有形式可以通過用不同 的溶劑系統(tǒng)處理化合物1而產(chǎn)生。本發(fā)明的晶體形式不限于如本文所示例來生產(chǎn)它們的方法。形式m可以通過用非質(zhì)子溶劑系統(tǒng)處理化合物i 而產(chǎn)生。形式m可以如下產(chǎn)生用非質(zhì)子溶劑系統(tǒng)處理化合物i,以及 在減壓下蒸發(fā)溶劑，伴隨溫和加熱。
ni. 制備晶體的方法
〔0056〕藥物的晶體形式通常通過下述方法獲得，諸如熔融和緩 慢冷卻、結(jié)晶(有時稱為重結(jié)晶)、升華或熱處理，有時包括脫水或去溶 劑化步驟。結(jié)晶通常通過不同的方法來完成，這取決于原材料的性質(zhì)(例 如，結(jié)晶度、純度、存在雜雜質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性等)，這些方法例如包 括利用單一溶劑(在低溫下是不良溶劑，但加熱時是良好溶劑)的傳統(tǒng) 結(jié)晶；通過使用共溶劑(例如，至少一種良好溶劑與一種不良溶劑)得到 同樣的結(jié)果；通過冷卻溶液；通過接種化合物的晶體；或者通過緩慢蒸 發(fā)。
〔0057〕通常通過過飽和現(xiàn)象使結(jié)晶稱為可能。過飽和是這樣的狀 況，在該狀況下，溶解在溶劑中的溶質(zhì)的量大于溶劑能夠容納的量。例 如，含有較多組分"溶質(zhì)A"和較少雜質(zhì)"溶質(zhì)B" (A和B具有類似 的溶解度性質(zhì))的固體物質(zhì)溶解在熱溶劑中，使得溶液中溶質(zhì)A是飽和 的，而溶質(zhì)B是不々包和的。4吏溶液冷卻時，其達到一點，在該點溶液中 的溶質(zhì)A變成過飽和的，并且溶質(zhì)A的晶體開始首先緩慢形成。起初的 晶體起著晶種的作用，其誘導(dǎo)溶質(zhì)A從溶液中進一步結(jié)晶，而溶質(zhì)B—一 其并非處于飽和點——保留在溶液中。溶質(zhì)A的純晶體然后可以;故回 收。
〔0058〕通過不同的方法實現(xiàn)過飽和。 一般而言，當(dāng)飽和溶液一皮冷 卻時，或者當(dāng)來自溶液的溶劑緩慢蒸發(fā)時，溶液開始過飽和。其它方法， 例如加入抗溶劑(不良溶劑)，或者通過加入鹽NaCl或鹽酸三乙胺降低溶 解度，或者通過任意上述方法的組合。
〔0059〕用于結(jié)晶的純?nèi)軇┑氖褂檬怯邢薜模驗槿軇┍仨氃谡?溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出大的溶解度差異。使用溶劑系統(tǒng)是更靈活的。該溶劑 系統(tǒng)包含至少 一種良好溶劑(藥物在其中具有優(yōu)良溶解度的溶劑)和至少 一種不良溶劑(藥物在其中溶解不佳的溶劑)，該不良溶劑可溶混于第一 種中。溶劑系統(tǒng)通常包括一種良好溶劑和一種不良溶劑(抗溶劑)，但是 也可以包才舌兩種以上的溶劑?！?060〕用于溶解化合物1的良好溶劑的實例包括而不限于低碳烷 基醇(例如，甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、丙二醇)、乙腈、芳族溶劑 (例如甲苯)和含氧的有機溶劑如二烷基酮(例如，丙酮、2-丁酮)、四氫呋 喃、二聰烷、乙酸烷基酯(例如，乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯)和 二烷基醚(例如，叔丁基曱基醚)?；衔?在其中溶解不佳的溶劑的實 例包括而不限于水性溶劑(例如水)、脂族烴(例如，己烷、正庚烷、異辛 烷)和卣代烴(例如，二氯曱烷、氯仿)。
〔0061〕在該方法的任意步驟，在晶體形成之前，溶液可以用脫色 劑如NoritTM活性炭來處理，然后過濾該脫色劑。也可以通過使溶液經(jīng) 過脫色劑的柱來進行脫色步驟，該脫色劑的柱具有或不具有過濾劑如 CeliteTM的幫助。在結(jié)晶過程之前，當(dāng)藥物在溶液中時完成在脫色步驟， 例如，在不良溶劑加入共溶劑系統(tǒng)中之前進行，或者如果溶液^皮加熱， 在冷卻過程之前進行。
〔0062〕當(dāng)達到過飽和時，開始結(jié)晶。晶體可能自然形成，或者該 過程可以通過利用沉淀劑或者通過在溶液中接種化合物的晶體來引發(fā)。 溶劑的緩慢蒸發(fā)或者加入小量的不良溶劑也可以引發(fā)結(jié)晶。pH變化或 者加入鹽也能夠幫助該結(jié)晶過程。通過包括過濾、離心和潷析或它們的 組合收集晶體。
〔0063 〕晶體以溶劑化物形式(當(dāng)溶劑是水時包括水合形式)或者以 基本非溶劑化物(ansolvate)形式(在晶體結(jié)構(gòu)中沒有或者具有非常少的 溶劑分子存在，當(dāng)不存在的溶劑是水時也稱為脫水(anhydrate))產(chǎn)生。 溶劑化物形式在存在溶劑的情況下制備(或者對于水合形式為水分子)。 脫水形式通過從溶劑系統(tǒng)中去除水來制備(例如，通過基本無水的有機溶 劑)，或者通過使水合晶體升溫直到所殘存的水分子被去除。因此，非溶 劑化物形式通過如下方式制備使用將不會在晶體結(jié)構(gòu)內(nèi)停留的溶劑； 使用基本排除了具有殘存傾向的溶劑的溶劑系統(tǒng)；或者加熱(干燥)溶劑 化晶體直到殘存的溶劑分子被去除。
〔0064〕按照用于其制備的條件(例如，溫度、溶劑和溶劑比例，以 及化合物的濃度)得到不同形式或多晶型物的晶體。形式的差別在于晶體 中分子的三維排列，以及通常在于晶體結(jié)構(gòu)中水和/或溶劑分子的存在或 缺乏。這些差異通過以x射線粉末衍射或者以光學(xué)顯微術(shù)、固態(tài)NMR 波鐠法或偏振光顯微術(shù)分析晶體來展示。不同的多晶型物具有不同的能量和穩(wěn)定性。通過諸如干燥和熱處理——也稱為退火過程——的方法， 多晶型物有時能夠以另 一種晶體形式轉(zhuǎn)變(例如，低能或更穩(wěn)定的形式)。
〔0065〕晶體形式可具有任何宏觀結(jié)晶或類晶體形式，其包括而不 限于針狀、條狀、片狀、片狀或海膽狀(urchin-like),而海膽狀是指針 狀晶體聚集在一起，類似于海膽(sea urchin )。 制備化合物1晶體的通用步驟
〔0066〕在一方面，本發(fā)明提供制備基本晶體形式的化合物1的方 法，該方法包括如下步驟其包括下述步驟(a)提供化合物l, (b)用包 含一種或多種溶劑的溶劑系統(tǒng)處理化合物1,和(c)從上清液分離晶體。 在一個實施方式中，步驟(b)包括脫色步驟。在另一實施方式中，步驟(b) 包括接種化合物1晶體。在另一實施方式中，該方法進一步任選包括步 驟(d)，退火或干燥在(c)中分離的晶體。
〔0067〕在結(jié)晶之前，化合物l以粗制形式、粉末形式、非晶形或 部分非晶形提供，并且也可以是部分結(jié)晶的或結(jié)晶的?；衔?可以是 化合物1的粉末或粗制形式，或者可以是基本純的形式。晶體形式也可 以通過處理化合物l產(chǎn)生，其中化合物1是相同或不同的晶體形式，或 者是晶體形式的混合物?；衔?的粉末或粗制形式可以如下獲得培 養(yǎng)"產(chǎn)生化合物1的微生物，，，之后通過分離和純化技術(shù)，包括沉淀、 過濾、HPLC (高效液相色譜)、高速反電流色譜、尺寸排阻超濾和/或離 子交換色譜，以及利用包括DiaionTMHP-20柱在內(nèi)的其它樹脂的技術(shù)。 產(chǎn)生化合物1的示例性步驟提供在實施例1中。
〔0068〕在一方面，用包含至少一種良好溶劑和一種不良溶劑的溶 劑系統(tǒng)處理化合物l。在另一方面，溶劑系統(tǒng)包括低碳烷基醇，優(yōu)選地， 低碳烷基醇選自甲醇、乙醇或異丙醇，利用水作為"抗溶劑"(不良溶劑)。 結(jié)晶的時間和溫度取決于化合物l在溶液中的濃度和純度，以及取決于 所用的溶劑系統(tǒng)。所得到的晶體的純度可取決于原材料的純度，即結(jié)晶
之前化合物1的純度。晶體優(yōu)選通過過濾分離，但是也人防其它方法入 離心和/或潷析收集。
〔0069〕在本發(fā)明的另一方面，產(chǎn)生晶體形式的方法包括步驟(d) 在約5(TC至約17(TC、優(yōu)選約5(TC至約IO(TC之間、更優(yōu)選約6(TC至約 8CTC之間的等溫溫度下干燥化合物1的至少一種晶體形式約30分鐘至 約24小時，優(yōu)選在約2小時至約20小時之間，更優(yōu)選在約4小時至約IO小時之間。在一個實施方式中，干燥步驟任選在惰性條件如減壓或惰
性氣氛(例如，氮或氬氣氛)下進行。在一個實施方式中，在干燥之前晶 體形式是形式I或形式II,或者它們的混合物。在另一實施方式中，干 燥之后得到的晶體形式是形式III。
〔0070〕在進一步的方面，該方法可以大規(guī)才莫、工藝或生產(chǎn)規(guī)才莫完 成，利用藥物生產(chǎn)領(lǐng)域已知的任何藥學(xué)上接受的設(shè)備或方法。
〔0071〕在另一方面，本發(fā)明提供用于制備化合物1的晶體形式的 方法，包括下述步驟(a)提供化合物l， (b)用包含水和至少一種低碳烷 基醇的溶劑系統(tǒng)處理化合物1，和(c)收集所形成的晶體。在一個實施方 式中，步驟(b)進一步包括脫色步驟。在另一實施方式中，該方法進一步 包括步驟(d)干燥在(c)中收集的晶體。在一個實施方式中，低碳烷基醇與 水的比例在20:80至80:20之間，優(yōu)選為約30:70至60:40。在另一實施 方式中，醇/水溶劑系統(tǒng)中4分末的最終濃度上約0.1至100 mg/mL,優(yōu)選 約15至100mg/L。
〔0072〕在另一方面，本發(fā)明提供制備化合物1的晶體形式的方法， 包括下述步驟(a)提供化合物l, (b)用水中含有約20%至約80%乙醇的 溶劑系統(tǒng)處理化合物1, (c)使溶液在約27。C至4(TC的溫度下升溫，直到 足夠的乙醇已經(jīng)蒸發(fā)，達到過飽和，和(d)收集所形成的晶體。在一個實 施方式中，該方法進一步包括步驟(e)干燥在(d)中收集的晶體。
〔0073〕因為本發(fā)明晶體形式的高純度以及易于處理，因此其可以 被用于制備藥物。它們可以被用作用于腸胃外或非腸胃外施用的藥物制 備方法中的中間體。
IV 包含晶體形式的藥物組合物
〔0074〕本發(fā)明提供藥物組合物，其包括至少一種如本文所述的化 合物1的晶體形式連同藥學(xué)上可接受的載體。包含晶形的藥物組合物用 于治療與不受控的細(xì)胞生長和增殖有關(guān)的疾病和病癥，如腫瘤癥狀。包 含化合物1的晶形的藥物組合物可以被封裝到便利的商業(yè)包裝中，以便 在合適的容器中提供必需的物質(zhì)，如藥物組合物和關(guān)于其在治療腫瘤癥 狀中應(yīng)用的書面i兌明書。
〔0075〕本發(fā)明的晶體可以在配制之前被進一步加工。例如，化合 物1的晶體形式在進行適當(dāng)?shù)呐渲浦翱梢缘v^分石f或^展磨成更小的顆粒。
〔0076〕本發(fā)明的晶體可以被配制用于口服、舌下、鼻內(nèi)、目艮內(nèi)、 直腸、經(jīng)皮、粘膜、局部或腸胃外施用，用于治療性或預(yù)防性治療腫瘤 和增殖疾病和病癥。施用的腸胃外方式包括而不限于皮內(nèi)、皮下(s.c., s.q., sub-Q, Hypo)、月幾內(nèi)(i.m.) 、 l爭脈內(nèi)(i.v.)、腹月莫內(nèi)(i.p.)、動脈內(nèi)、 intramedulary、、心內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié))、滑液內(nèi)(關(guān)節(jié)液區(qū)域)、腦內(nèi)或顱 內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)(intracisternal)和鞘內(nèi)的(脊髓液)。所有已知的用 于藥物制劑腸胃外注射或輸注的器械可以用來實施此類施用。對于口服 和/或腸胃外施用，本發(fā)明的晶形可以與常規(guī)藥物載體和賦形劑混合，并 以溶液、乳劑、片劑、膠嚢、軟膠嚢、酏劑、懸浮液、糖漿、糯米紙嚢 劑(wafers)及類似物的形式使用。制劑可以是例如以口服、舌下或直 腸施用所使用的固體制劑。包含本發(fā)明晶形的組合物將含有按重量計約 0.1%至約99.9%、約1%至約98%、約5%至約95%、約10%至約80% 或約15%至約60%的該晶形。
〔0077〕在此所公開的藥物組合物按照標(biāo)準(zhǔn)步驟(USP， FDA)制備， 并且以選擇用來降低、防止或消除癌癥或初期癌的劑量施用。(關(guān)于施用 各種藥物用于人類治療的方法——包括化學(xué)療法——的概括描述,參見 例如Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA;和Goodman and Gilman, Pharmaceutical Basis of Therapeutics: Pergamon Press, New York, NY,其內(nèi)容通過參考引入本文)。
〔0078〕如本文所用，術(shù)語"單位劑量，，是指適合作為人類對象和 其它哺乳動物的單一劑量的物理上分離的單位，每單位含有經(jīng)計算可產(chǎn) 生期望治療效果的預(yù)定量的晶形(活性成分)以及合適的藥學(xué)上可接受的 載體。在一個實施方式中，單位劑量含有10至3000 mg的活性成分。 在另一實施方式中，單位劑量含有20至1000 mg的活性成分。本發(fā)明 的組合物可以利用受控的(例如膠嚢)或持續(xù)釋放輸送系統(tǒng)(例如可生物 侵蝕的基質(zhì)(bioerodable matrices))進行輸送。適合本發(fā)明組合物施用 的藥物遞送的示例性緩釋輸送系統(tǒng)在美國專利號4,452,775 (授予Kent)、 5,039,660 (授予Leonard)和3，854,480 (授予Zaffaroni)中予以描述，這些 專利通過參考以其全部并入本文。
〔0079 〕本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物包括一種或多種本發(fā)明的 晶形并結(jié)合在此被統(tǒng)稱為"載體，，物質(zhì)的一種或多種無毒的、藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑和/或佐劑和/或賦形劑，并且如果需要包括其它
活性成分。藥學(xué)上可接受的載體包括例如乳劑、媒介物(vehicle)或 介質(zhì)，如鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、丙二醇、聚山梨 醇酯80 (Tween-80TM)、聚乙二醇300和400 (PEG 300和400)、聚乙二 醇化(PEGylated)蓖麻油(例如Cremophor EL)、泊洛沙姆407和188、
疏水載體及其組合。疏水載體包括例如脂肪乳劑、脂質(zhì)、聚乙二醇化 phopholids、聚合物母體、生物相容性聚合物、脂肪球(lipospheres)、 小泡(vesicles )、顆粒和脂質(zhì)體。術(shù)語特定地不包括細(xì)J包培養(yǎng)基。
〔0080〕包括在制劑中的賦形劑或添加劑具有不同的目的，例如這 取決于藥物的性質(zhì)以及給藥方式。通常使用的賦形劑的例子包括而不 限于穩(wěn)定劑、增溶劑和表面活性劑、緩沖劑、抗氧化劑和防腐劑、張 度劑、填充劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑或粘度劑、惰性稀釋劑、填料、 崩解劑、粘結(jié)劑、濕潤劑、潤滑劑、抗菌劑、螯合劑、甜料(sweetners)、 芳香劑、增香劑、著色劑、施用助劑以及它們的組合物。
〔0081〕組合物可以含有常見載體和賦形劑，如玉米淀粉或明膠、 乳糖、庶糖、微晶纖維素、甘露醇、磷酸二鈣、氯化鈉和藻酸。組合物 可以含有交聯(lián)羥甲纖維素鈉(crosarmellose sodium )、微晶纖維素、淀粉 羥乙酸鈉和藻酸。
〔0082 〕用于腸胃外施用的制劑可以處于水或非水等滲無菌注射溶 液、懸浮液或脂肪乳劑的形式，其包括化合物1的至少一種晶形。注射 所用的腸胃外形式必須是流動的，達到存在容易的可注射能力的程度。 這些溶液或懸浮液可以從無菌濃縮液、粉末或顆粒制備。晶體可以溶解 在載體如溶劑或媒介物中，例如，聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、 千醇、glycofurol、 N,N-二甲基乙酰胺、N-甲劑吡咯烷酮、甘油、鹽水、 葡萄糖、水、丙三醇、疏水載體和它們的組合。
〔0083〕晶體形式的制劑可以以懸浮液制備，用于腸胃外或非腸胃 外施用，例如，用于口服、鼻內(nèi)或局部施用。當(dāng)晶體形式的粒度減小是 必需的時候，其可以通過機械方法如磨碎或碾磨或者通過微粉化 (micromsation )來實現(xiàn)。結(jié)晶顆粒也可以利用本領(lǐng)域已知的設(shè)備和方 法來產(chǎn)生，例如利用連續(xù)流動池(continuous flow cells ),如在國際專利 申請WO/38811中所述。另外的賦形劑也可以用于懸浮液制備中，例如 懸浮劑、表面穩(wěn)定劑、分散劑等。懸浮劑的實例包括但不限于羧曱基纖維素、硅酸鎂鋁、黃蓍膠、膨潤土、曱基纖維素、微晶纖維素和聚乙二
醇。取決于施用方式，所需的最大顆粒平均大小可以變化，例如從約50 nm至約100iam。當(dāng)用于非腸胃外施用時，顆粒平均大小可以高于用于 腸胃外施用。
〔0084 〕用在腸胃外制劑中的賦形劑也包括而不限于穩(wěn)定劑(例如， 碳水化合物、氨基酸和聚山梨醇酯)、增溶劑(例如，西曲溴銨、多庫酯 鈉、甘油單油酸酯、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG))和表面活 性劑(例如聚山梨醇酯、聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(tocopherol PEG succinate)、泊洛沙姆和CremophorTM)、緩沖劑(例如，乙酸鹽、檸檬酸 鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、氨基酸及類似物)、抗氧化 劑和防腐劑(例如，BHA、 BHT、龍膽酸、維生素E、抗壞血酸以及含石危 物質(zhì)，如亞辟L酸鹽、亞石危酸氫鹽、偏亞石危酸氫鹽、石克代甘油、巰基乙酸 鹽及類似物)、張度劑(用于調(diào)節(jié)生理相容性)、懸浮或粘度劑(suspending or viscosity agents )、抗菌劑(例如，thimersol、氯化千乙氧銨、氯千烷銨、 苯酚、甲酚和氯代丁醇)、螯合劑和給藥助劑(例如，局部麻醉劑、抗炎 藥、抗凝塊藥、用于延長的血管縮小藥，以及增加組織滲透性的藥物)， 以及它們的組合。
〔0085 〕利用疏水載體的腸胃外制劑包括例如脂肪乳劑和含有脂 質(zhì)、脂肪球、媒介物、顆粒和脂質(zhì)體的的制劑。除上述賦形劑之外，脂 肪乳劑包括脂質(zhì)和水相以提添加劑，如乳化劑(例如，磷脂、泊洛沙姆、 聚山梨醇脂和聚氧乙烯蓖麻油)和滲透劑(例如氯化鈉、甘油、山梨醇木 糖醇和葡萄糖)。脂質(zhì)體包括天然的或衍生的磷脂以及任選變化穩(wěn)定劑如 膽固醇。
〔0086 〕化合物的腸胃外單位劑量形式可以是在無菌密閉密封的安 剖或無菌的預(yù)載注射器中的合適載體中的易于使用的晶體溶液。合適的 載體任選地包括任意上述賦形劑。
〔0087〕可選地，本發(fā)明晶體的單位劑量可以處于濃縮液、粉末或 顆粒形式，用于在遞送時在適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)上可接受的載體中當(dāng)場重構(gòu)。除 上述賦形劑之外，粉末形式任選包括填充劑(例如，甘露醇、甘氨酸、乳 糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、羥乙基淀粉、菲科爾和明膠)以及抗凍劑或 凍干斗呆護劑(cryo or lyoprotectants )。
〔0088〕例如，在靜脈內(nèi)(IV)應(yīng)用中，化合物1的晶形以及包括穩(wěn)定劑或表面活性劑在內(nèi)的任選的 一 種或多種添加劑的無菌制劑，可以被 溶解或懸浮在任意常用的靜脈內(nèi)流體中并通過輸注施用。靜脈內(nèi)流體包
括而不限于生理鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、5%葡萄糖或Ringer， s溶液。
〔0089〕在另一實例中，在肌內(nèi)制劑中，本發(fā)明晶體的無菌制劑可 以被溶解在藥物稀釋劑中并施用，所述藥物稀釋劑如注射用水(WFI)、 生理鹽水或5%葡萄糖?；衔?晶體的合適的不溶形式可以作為水基 體或藥學(xué)上可接受的油基體中的懸浮液進行制備和施用，所述藥學(xué)上可 接受的油基體例如長鏈脂肪酸的酯，如油酸乙酯。
〔0090〕對于口服應(yīng)用，固體劑型如片劑和膠嚢是特別有用的。也 可以設(shè)計持續(xù)釋放或腸包衣的制劑。對于兒科和老年醫(yī)學(xué)應(yīng)用，懸浮劑、 糖漿和可咀嚼片劑是特別合適的。對于口服施用，藥物組合物例如是片 劑、膠嚢、懸浮液或液體糖漿或酏劑、糯米紙嚢劑及類似物的形式。對 于普通的口服施用，賦形劑或添加劑包括但不限于惰性稀釋劑、填料、 崩解劑、粘結(jié)劑、濕潤劑、潤滑劑、甜味劑、芳香劑、著色劑和防腐劑。
〔0091 〕 口服藥物組合物優(yōu)選以含有治療有效量的活性成分的單位 劑量形式制造。此類劑型的實例是片劑和膠嚢。對于治療目的，除活性 成分之外，片劑和膠嚢可以含有常規(guī)載體，如惰性稀釋劑(例如，碳酸 鈉和碳酸釣、磷酸鈉和磷酸4丐，以及乳糖)、粘結(jié)劑(例如，阿拉伯樹膠、 淀粉、明膠、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(聚維碘酮(Providone))、山梨醇或 黃蓍膠曱基纖維素、羧曱基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及乙基纖維素)、 填料(例如，磷酸鉀、甘氨酸、乳糖、玉米淀粉、山梨醇或蔗糖)、潤滑 材料或潤滑劑(例如，硬脂酸鎂或其它金屬硬脂酸鹽、硬脂酸、聚乙二 醇、蠟、油、二氧化硅和膠態(tài)二氧化硅、硅流體或滑石)、崩散劑或崩解 劑(例如，馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和藻酸)、調(diào)味劑、著色劑或可接受的 濕潤劑。載體也可以包括包衣賦形劑(coating excipients ),如單硬脂酸 甘油酯或二硬脂酸甘油酯，以延遲在胃腸道中的吸收。
〔0092〕 口服液體制劑， 一般為水或油溶液、懸浮液、乳劑、糖漿 或酏劑的形式，其可以含有常規(guī)添加劑，如懸浮劑、乳化劑、非水劑 (non-aqueous agents )、防腐劑、著色劑和芳香劑。用于液體制劑的添 加劑的實例包括阿拉伯樹膠、杏仁油、乙醇、分鎦的椰子油、明膠、葡 萄糖糖漿、甘油、氫化可食用店肪、卵磷脂、曱基纖維素、對羥基苯曱 酸曱酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯、丙二醇、山梨醇或山梨酸?！?093 〕對于液體和固體口服制劑而言，也可以使用芳香劑如薄荷、 冬青油(oil of wintergreen )、櫻桃、葡萄、水果調(diào)味劑及類似物。添加 著色劑以使劑型在外觀上更美觀或者有助于識別產(chǎn)品，也可能是期望 的。對于局部應(yīng)用，本發(fā)明的晶體也可以以合適的形式制備，以便施用 于皮膚，或者鼻和咽喉的粘膜，并且本發(fā)明的晶體可以采用霜劑、藥膏、 液體噴霧或吸入劑、錠劑或涂喉劑的形式。此類局部制劑進一步可以包 括化合物如二曱亞砜(DMSO)以促進活性成分的表面滲透。對于施用于 眼或耳，化合物1的晶體形式可以在疏水或親水基體中以藥膏、霜劑、 洗劑、涂劑或粉末的液體或半液體形式配制。對于直腸給藥，本發(fā)明的 晶體可以以混合有常規(guī)載體如可可油、蠟或其它甘油酯的栓劑的形式施 用。
V 抑制腫瘤生長的方法
〔0094〕在一方面，本發(fā)明涉及抑制哺乳動物中癌細(xì)胞生長和/或增 殖的方法。在另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物中胂瘤的方法。哺乳 動物包括有蹄類動物(例如，綿羊、山羊、牛、馬、豬)和非有蹄類動物， 包括嚙齒動物、貓科、犬科和靈長類(即人和人類靈長類)。在優(yōu)選的實 施方式中，哺乳動物是人。
〔0095〕如本文所用，術(shù)語"瘤"、"腫瘤疾病"、"瘤形成"、"癌"、 "腫瘤"和"增殖疾病"是指具有自發(fā)生長能力的細(xì)胞，即特征為迅速 增殖細(xì)胞生長的異常病況狀態(tài)，該細(xì)胞生長通常形成顯示部分或全部缺 乏正常組織的結(jié)構(gòu)組織和功能調(diào)和的不同的胂塊。這些術(shù)語意欲包括造 血腫瘤(例如，淋巴瘤或白血病)以及固體瘤(例如，肉瘤或癌)，包括所有 類型的初期癌和癌生長，或者致癌過程、轉(zhuǎn)移性組織(metastatic tissues) 或惡性變異細(xì)胞、組織或器官，與組織病理類型或入侵階段無關(guān)。造血 瘤是影響造血結(jié)構(gòu)(與血細(xì)胞形成有關(guān)的結(jié)構(gòu))免疫系統(tǒng)組分的惡性腫 瘤，其包括源于骨髓、淋巴或紅細(xì)胞系統(tǒng)的白血病(與血液和骨髓中的白 血球(白細(xì)胞)及它們的前體有關(guān))，和淋巴瘤(與淋巴細(xì)胞有關(guān))。固體瘤 包括肉瘤，其是發(fā)源于結(jié)締組織如肌肉、軟骨、血管、纖維組織、脂肪 或骨的惡性瘤。固體瘤也包括癌，其為起源于上皮結(jié)構(gòu)(包括外上皮細(xì)胞 (例如，胃腸道、肺和子宮頸的外皮和內(nèi)層)和鋪襯各種腺體(例如，乳房、 胰腺、曱狀腺)的內(nèi)上皮細(xì)胞)的惡性瘤。特別易受本發(fā)明方法治療影響的瘤的實例包括白細(xì)胞和肝細(xì)胞癌、肉瘤、脈管內(nèi)皮癌、乳癌、中樞神 經(jīng)系統(tǒng)癌(例如，星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、寡樹突神 經(jīng)膠質(zhì)瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤)、前列腺癌、肺及支氣管癌、喉癌、食道癌、 結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、胃腸癌、黑色素瘤、卵巢及子宮內(nèi)膜癌、腎及膀 胱癌、肝癌、內(nèi)分泌癌(例如，曱狀腺)和胰腺癌。
〔0096〕使化合物與癌細(xì)胞或組織接觸，或?qū)⒒衔镆氚┘?xì)胞或 組織中。 一般而言，用于體內(nèi)遞送藥物組合物(包括本發(fā)明的晶體形式) 的本發(fā)明方法利用本領(lǐng)域公知的遞送治療劑的方案，僅有的基本步驟修 改是用本發(fā)明的晶形代替本領(lǐng)域公知方案中的治療劑。含晶體制劑被施 用的途徑以及制劑、載體或媒介物將取決于位置以及瘤的類型。很多種 給藥途徑可以被采用。制劑可以通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)輸注或注射來施 用。例如，對于可到達的固體腫瘤或瘤，制劑可以通過直接注射到該腫 瘤或瘤中來施用。對于造血瘤，制劑可以進行靜脈內(nèi)或脈管內(nèi)施用。對 于體內(nèi)不易到達的瘤，如轉(zhuǎn)移(metastases)或腦腫瘤，制劑可以以如下
肺瘤和遠(yuǎn)距離的轉(zhuǎn)移，例如經(jīng)口、鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)。含晶體的制劑 也可以經(jīng)口、皮下、腹膜內(nèi)、局部(例如，用于黑色素瘤)、陰道(例如， 用于宮頸或陰道瘤)、經(jīng)鼻或通過吸入噴霧(例如，用于肺瘤)施用。
〔0097〕含結(jié)晶化合物1的制劑以足以抑制瘤細(xì)胞生長或增殖或者 治療瘤疾病的量施用。術(shù)語"抑制"是指遏制、殺死、停滯或破壞癌細(xì) 胞。根據(jù)本方法的哺乳動物癌細(xì)胞生長的抑制可以幾種方法監(jiān)測。體外 生長的癌細(xì)胞可以用晶體形式處理，并監(jiān)測相對于在無晶體形式的情況 下培養(yǎng)的相同細(xì)胞的生長或死亡。生長停止，或者生長率(即加倍率)例
如在100微摩爾下放慢50%或以上，表示癌細(xì)胞抑制(參見Anticancer Drug Development Guide: preclinical screening, clinical trials and approval; B.A. Teicher and P.A. Andrews, ed., 2004, Humana Press, Totowa, NJ)。 可 選地，癌細(xì)胞抑制可以通過向感興趣癌癥的動物;漢型施用藥物制劑來監(jiān) 測。試驗非人類動物癌癥模型的實例在本領(lǐng)域是已知的，并且在下面以 及本文中的實施例中予以描述。相對于未用制劑處理的對照動物的腫 瘤，在用制劑處理的動物中胂瘤生長停止(即大小無進一步的增加)或者 肺瘤大小降低(即至少58%的腫瘤體積)，表示顯著的腫瘤生長抑制(參見 Anticancer Drug Development Guide: preclinical screening, clinical trialsand approval; B.A. Teicher and P,A. Andrews, ed, 2004， Humana Press, Totowa, NJ)。
〔0098〕術(shù)語"治療"是指向哺乳動物施用或給予含結(jié)晶化合物1 的制劑，或者向來自哺乳動物的分離組織或細(xì)胞系施用或給予制劑，所 述哺乳動物患有瘤疾病、瘤疾病的癥狀或者具有易患瘤疾病的誘因 predisposition,目的是治愈、醫(yī)治、減輕、緩解、改變、改善、改進或 控制該疾病、疾病的癥狀或易患該疾病的誘因。術(shù)語"治療(treating)" 被定義為向哺乳動物施用的含結(jié)晶化合物1制劑的量足以導(dǎo)致哺乳動物 中瘤細(xì)胞的防止、減小或消除("治療有效量")。治療有效量和劑量的 時間安排將在個體基礎(chǔ)上確定，并且可以至少部分基于年齡、體重、性 別、飲食和接受對象的綜合健康等需要考慮的因素，疾病狀況的性質(zhì)和 嚴(yán)重度，以及先前的治療和所存在的其它疾病。其它因素也包括給藥途 徑和頻率，所施用藥物的活性，化合物的代謝穩(wěn)定性、作用時間和排泄， 藥物組合、受體對象對化合物的耐受性，以及瘤或增殖疾病的類型。在 一個實施方式中，化合物的治療有效量在哺乳動物體重的約0.01至約 750 mg/kg的范圍內(nèi)。在另一實施方式中，治療有效量在約0.01 mg/kg 體重/天至約300 mg/kg體重/天的范圍內(nèi)。在又一實施方式中，治療有效 量在10 mg/kg體重/天至約120 mg/kg體重/天的范圍內(nèi)。在人類患者的 情況下，上述實施方式的治療有效劑量也可以以每立方米毫克表達 (mg/m2)。對于不同哺乳動物的轉(zhuǎn)換系數(shù)可見于Freireich et al, Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, dog, monkey and man, Cancer Chemoth. Report, 1966, 50(4): 219-244)。當(dāng)可能 需要特殊要求時(例如，用于兒童患者)，上述治療有效劑量也可以在上 述范圍外。這些更高或較低的劑量在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
〔0099〕為監(jiān)測在人身上的肺瘤治療的功效，在治療開始之前和之 后測量肺瘤大小和/或肺瘤形態(tài)，如果腫瘤大小停止進一步生長或者如果 腫瘤的大小被減小例如至少10%或以上(例如，20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或甚至100%,即不存在胂瘤)，則治療^皮認(rèn)為是 有效的。存活延長、時間-對-疾病進展、部分應(yīng)答和客觀應(yīng)答率(objective response rate)是調(diào)查藥物的臨床活性的替代量度。腫瘤收縮(Tumor shrinkage)尋皮"^人為是治療凈爭定的響應(yīng)(treatment-specific response )。 該 系統(tǒng)受限于具有易進行精確測量的內(nèi)臟團的患者的要求。確定體內(nèi)腫瘤
29大小的方法隨肺瘤的類型而變，并且包括例如醫(yī)學(xué)成像或肺瘤學(xué)領(lǐng)域技
術(shù)人員熟知的各種成像技術(shù)(MRI、 CAT、 PET等)，以及組織學(xué)技術(shù)和 流式細(xì)胞術(shù)。對于某些類型的癌癥，對血清胂瘤標(biāo)記物的評價也用于評 價響應(yīng)(例如，用于前列腺癌的前列腺特異性抗原(PSA)，以及用于直腸 癌的癌胚抗原(CEA))。監(jiān)測癌生長的其它方法包括在血液中的細(xì)胞計數(shù) (例如，在白血病中)或骨疼痛的減輕(例如，前列腺癌)。
〔0100〕含結(jié)晶化合物1的制劑也可以每天施用一次，或者可以全 天內(nèi)在適當(dāng)?shù)拈g隔以兩次、三次、四次或更多次亞劑量施用。在這種情 況下，包含在各亞劑量中的化合物1的量必須相應(yīng)地更小，以便達到總 的日劑量。劑量單位也可以被混合用于在幾天內(nèi)輸送，例如，利用常規(guī) 的持續(xù)釋放的制劑，其在幾天的期間內(nèi)提供化合物的持續(xù)釋放。持續(xù)釋
放制劑在本領(lǐng)域是熟知的。在該實施方式中，劑量單位含有相應(yīng)的多份 日劑量。有效劑量可以以單一給藥事件(例如，彈丸注射)或者以30分 鐘至約24小時內(nèi)的緩慢注射或輸注施用。制劑可以作為可達30天的治 療來施用。此外，用治療有效量的組合物治療對象可包括單治療或系列 治療(例如，四周的治療，重復(fù)3次，各治療之間具有2個月的間隔)。 對本發(fā)明所包括的化合物的有效劑量、毒性和體內(nèi)半衰期的估計利用常 規(guī)方法進行，或者在體內(nèi)測試的基礎(chǔ)上利用適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ瓦M行。
〔0101 〕包括哺乳動物和人在內(nèi)的對象中的腫瘤的治療可以通過以 單一藥物施用本發(fā)明的制劑進行，或者通過聯(lián)合外科和/或已知的抗癌治 療如放射療法和化學(xué)療法方案施用本發(fā)明的制劑進行。結(jié)晶化合物1可 以結(jié)合已知的抗癌化合物或化學(xué)治療藥物，或者除已知的抗癌化合物或 化學(xué)治療藥物之外來施用?；瘜W(xué)療法家族包括細(xì)胞的增殖抑制或細(xì)胞 毒素藥物、抗生素型藥物、烷基化劑、抗代謝物藥物、激素藥物、芳香 酶藥物、免疫藥物、干擾素型藥物、環(huán)加氧酶抑制劑(例如，C0X-2抑 制劑)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloprotease inhibitors )、端粒 末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生長因子受體藥物 (anti-growth factor receptor agents )、 抗HER藥物、抗EGFR藥物、抗 血管生成藥物、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、ms-raf信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、細(xì) 胞周期抑制劑、其它CDK抑制劑、微管單白結(jié)合藥物、拓樸異構(gòu)酶I 抑制劑、拓樸異構(gòu)酶II抑制劑及類似物?；瘜W(xué)治療藥物的實例包括但不 限于5-氟腺嘧啶、絲裂霉素C、氨曱蝶呤、羥基脲、亞硝基脲(例如，BCNU、CCNU)、環(huán)磷酰胺、丙卡巴肼、曱氮咪胺、三胺硫磷、atreptozocine、 替莫唑胺、enzastaurin、埃羅替尼、米托蒽醌、蒽環(huán)霉素(表阿霉素和 Doxurubicin)、 CPT-ll、喜樹石咸及其衍生物、依托泊甙、諾維本、長春 花堿、長春新堿、pregnasone、鉑化合物如卡鉑和順鉑、紫杉烷類如紫 杉酚和泰索帝；激素療法如他莫昔芬和抗雌激素；受體的抗體，如赫賽 汀和易瑞沙；芳香酶抑制劑、促孕劑和LHRH類似物；生物反應(yīng)纟務(wù)飾劑 如IL2和干4尤素；多藥逆轉(zhuǎn)劑(multidrug reversing agents )如環(huán)孢菌素 類似物PSC 833。(關(guān)于更多實例,參見The Merck Index, 12th edition (1996), Therapeutic Category and Biological Activity Index, lists under "Antineoplastic" sections)。
〔0102〕化合物1晶體在細(xì)胞培養(yǎng)或試驗動物中的毒性和治療功效 可以通過標(biāo)準(zhǔn)藥物步驟確定。如上述以及如在本文實施例中所述確定在 動物才莫型中的治療功效。進行毒性研究，以確定10%測試動物的致死劑 量(LD10)。在最大耐受劑量(MTD)下處理動物不產(chǎn)生死亡率或者20% 以上體重?fù)p失的最高劑量。在特定的胂瘤模型中使有效劑量(ED)與MTD 發(fā)生關(guān)聯(lián)，以確定化合物的治療指數(shù)。發(fā)現(xiàn)接近1.0的治療指數(shù)(MTD/ED) 對于一些化學(xué)治療藥物是可以接受的，傳統(tǒng)治療藥物的優(yōu)選治療指數(shù)是 1.25或更高。
〔0103〕從細(xì)胞培養(yǎng)試驗和動物研究得到的數(shù)據(jù)可以用于配制用于 人類的劑量范圍。本發(fā)明組合物的劑量一般將在包括MTD的循環(huán)濃度 范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變化，這取決于所采用的劑型和所利用的 給藥途徑。對于在本發(fā)明方法中所用的任何化合物而言，治療有效的劑 量可以從細(xì)胞培養(yǎng)試驗中進行最初的估計。在動物才莫型中可以配制劑 量，以得到化合物的循環(huán)血漿濃度范圍。此類信息可以用于更精確地確 定在人體中有用的劑量。血漿水平例如可以通過高效液相色譜測量。確 定化合物抗腫瘤功效的動物模型通常在小鼠上進行。鼠科腫瘤細(xì)胞從相 同的種類(同源模型)被皮下接種到小鼠的后肋，或者人腫瘤細(xì)胞被皮下 才妾種到嚴(yán)重耳關(guān)合免疫缺陷(severe combined immune deficient, SCID)小鼠 或其它免疫缺陷小鼠(棵鼠)(異種移植模型)的后肋中。
〔0104 〕小鼠遺傳學(xué)的進展已經(jīng)產(chǎn)生了大量用于研究包括癌在內(nèi)的 各種人類疾病的小鼠模型。由National Cancer Institute贊助的MMHCC (Mouse models of Human Cancer Consortium)網(wǎng)頁(emice.nci.nih.gov),才是供了已知癌癥模型的疾病-位點-特異性概略，并且具有到可檢索的
Cancer Models Database (cancermodels.nci.nih.gov )以及NCI-MMHCC小 鼠資料庫的鏈接。小鼠資料庫(Mouse repositories)也可發(fā)現(xiàn)于The Jackson Laboratory、 Charles River Laboratories 、 Taconic, Harlan, Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) National Network以及the European Mouse Mutant Archive。這類才莫型可用于^1合物1晶體的體內(nèi) 測試以及用于確定治療有效量。
實施例
〔0105〕除非另外說明，在下面實施例中使用的試劑和溶劑由 Sigma-Aldrich和/或Fisher Scientific供應(yīng)。除非另外說明，在說明書和 權(quán)利要求書中所用的所有表達成分?jǐn)?shù)量，性質(zhì)例如結(jié)晶條件、分子量、 熔點，X射線衍射圖數(shù)據(jù)諸如相對強度和距離值等的數(shù)字應(yīng)當(dāng)被理解為 在所有情況下通過術(shù)語"大約(about)"來修正。因此，除非進行相反 的說明，在本說明書和所附權(quán)利要求中所列舉的所有數(shù)值參數(shù)是近似 值。至少并且并不企圖將關(guān)于等價物理論的本發(fā)明限于權(quán)利要求書的范 圍，各數(shù)值參數(shù)應(yīng)當(dāng)至少根據(jù)主要特征的數(shù)量以及通過應(yīng)用常規(guī)普及的 技術(shù)進行解釋。盡管闡明本發(fā)明的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值， 但是在實施例、表和附圖中所提出的數(shù)值盡可能精確地報告。任何數(shù)值 可能固有地含有由試驗、試驗測量統(tǒng)計分析等的偏差導(dǎo)致一些誤差。
〔0106〕除非另外定義，在本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如 本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的一個普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管 類似于本文所述的那些的方法和材料可以用在本發(fā)明的實踐或試驗中， 然而在下面描述了合適的方法和材料。另外，所述材料、方法和實施例 僅僅是示例性的并且并非意圖進行限制。
實施例1:化合物1的制備和分離
〔0107〕用于本發(fā)明結(jié)晶中的化合物1產(chǎn)生和分離自"產(chǎn)生化合物 1的微生物"。在實施例1中提供的步驟僅僅被提供作為示例性步驟，并 非意圖是限定性的。
〔0108〕根據(jù)于2004年1月21日提交的美國申請序列號10/762,107 的實施例1和2中的步驟——該申請還以WO 2004/065591于2004年8
32月公開，利用單孢絲菌屬(Micromonospora )菌林[S01]046或046-ECO11 ， 其分別具有IDAC編號(IDAC accession number)為231203-01和 070303-01 (力口拿大國際保藏單位，(International Depository Authority of Canada (IDAC ) , Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada, R3E 3R2),獲得化合物1 。 〔0109〕另外，化合物l如下制備 l丄步驟1
A. 發(fā)酵
〔0110〕以1 x IOL批量在14.5 L發(fā)酵罐(BioFlo 110 Fe騰ntor, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA)中，利用在美國專利申請 10/762,107中所述的改進步驟，完成發(fā)酵。
〔0111〕小單孢菌(Micromonospora sp.)(儲藏編號IDAC 070303-01) 被保持在ISP2瓊脂(Difco Laboratories, Detroit, MI)的瓊脂平板上。通過 將小單孢菌的表面生長從瓊脂平板轉(zhuǎn)移到含有500 mL滅菌KH培養(yǎng)基 的2-L燒瓶中，制備生產(chǎn)相的接種物。每升KH培養(yǎng)基包含10 g葡萄糖、 20 g馬鈴薯糊精、5 g酵母提取物、5 g NZ-胺A和1 g CaC03,用水(pH 7.0) 補足1升。將培養(yǎng)物在設(shè)置在250 rpm下的旋轉(zhuǎn)振蕩器上于大約28。C溫 育約70小時。溫育后，將300 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到14.5 L含有10 L滅菌 生產(chǎn)培養(yǎng)基HI的發(fā)酵罐中。每升生產(chǎn)培養(yǎng)基HI由20 g馬鈴薯糊精、 30 g甘油、2.5 g Bacto-蛋白胨、8.34 g酵母提取物和3 g CaC03,(具有 0.3 mL硅酮消泡油(Chem Service)和0.05 ml Proflo oilTM (Traders protein) 作為消泡劑，僅在發(fā)酵罐中使用)組成，用蒸餾水制成1升，并調(diào)節(jié)至 pH 7.0。將培養(yǎng)物在28。C下溫育，溶解的氧(d02)在級聯(lián)回路(cascade loop)中控制在25%,其中攪拌在150-450 RPM之間變化，通氣設(shè)定在 0.5 V/V/M的固定速率下。
B. 化合物1的分離
〔0112〕在收獲時，培養(yǎng)肉湯(l x 10 L)的pH通過滴加20% H2S04 (硫酸)水溶液并伴隨連續(xù)攪拌調(diào)節(jié)至3.0。所得混合物被冷卻至4。C并在 該溫度下保持12h。冷卻的肉湯然后4皮離心(以3200 rpm進行20 min)， 以分離菌絲體?；厥盏木z體用曱醇提取(2 x300 mL的MeOH,用于每 100g菌絲體)。
〔0113〕提取之后，匯集甲醇提取物并在減壓下利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)至干燥。將該甲醇提取濃縮物在MeOH (每10 g濃縮物為100 mL)中 重構(gòu)，并將所得溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。向分液漏斗中的曱醇溶液中加 入蒸餾水(每10 g濃縮物為30 mL),接著加入己烷(每10 g濃縮物為50 mL)。通過旋渦使該混合物被溫和攪拌，以允許優(yōu)良的相接觸，但是避 免乳液形成。然后使混合物靜置，以便析相發(fā)生。棄去上面的己烷層。 將水甲醇層回收到分液漏斗中，并加入等體積的15% NaCl以及兩倍體 積的EtOAc (乙酸乙酯)。使所得混合物成旋渦，以允許優(yōu)良的相接觸， 并使其靜置，以便析相發(fā)生。回收上面的EtOAc層。向EtOAc層加入 DiaionTM HP-20樹脂，減壓下去除溶劑，以使溶質(zhì)與樹脂結(jié)合。
〔0114〕將溶質(zhì)結(jié)合的樹脂應(yīng)用于DiaionTM HP-20柱并用水洗脫以 去除水溶性組分，之后用60Q/oMeOH(v/v)水溶液洗脫以去除弱結(jié)合的雜 質(zhì)。然后用80%至90。/oMeOH水溶液的分步梯度洗脫目標(biāo)化合物。匯集 該80-90% MeOH水溶液餾分并真空濃縮至干燥，得到粗化合物1。將 100 mg的該粗化合物1消化在5 mL以5:2:10:5體積比例的氯仿、環(huán)己 烷、曱醇和水制備的混合物的上層相中。利用高速反電流(HSCC)系統(tǒng) (Kromaton Technologies, Angers, France), 其裝酉己有 200 mL 藥筒 (cartridge)并用該兩相系統(tǒng)的上層相預(yù)填充，使該樣品經(jīng)歷離心分裂 層析。HSCC以下層相作為流動相運行，化合物1在約二分之一柱體積 處被洗脫。收集餾分，并在商業(yè)Kieselgel60F254平板上通過等分試樣餾 分的TLC檢測化合物1。 通過在紫外線下觀察干燥的平板，或者通過 用含有在乙醇中的香草醛(0.75%)和濃硫酸(1.5%, v/v)的噴霧噴灑該平板 并隨后加熱該板，化合物可以被顯現(xiàn)。匯集含有化合物1的餾分并濃縮， 產(chǎn)生盡管是高度著色但是基本純的化合物1 1.2.步驟2 A.發(fā)酵
〔0115〕小單孢菌[S01U02]046 (IDAC 070905-01)被保持在GYM瓊 脂平板上。將表面生長轉(zhuǎn)移至三個2L的帶擋板的燒瓶中，每個燒瓶含 有500 mL滅菌KH培養(yǎng)基(參見實施例1.1A),并在定軌振蕩器上于28 ± 1.0。C生長70到72小時。匯集種子燒瓶并無菌轉(zhuǎn)移至28L容量接種物 發(fā)酵罐中。所轉(zhuǎn)移的體積對應(yīng)于接種物發(fā)酵罐中3%的KH培養(yǎng)基體積 (參見實施例1.1A,在發(fā)酵罐中，KH進一步包含消泡劑0.3mL硅酮消 泡油(Chem Service)和0.05 ml Proflo oil (Traders protein))。發(fā)酵在28± 1.0。C下進行48小時，其中連接到攪拌的溶解氧保持在25%。
〔0116〕將來自接種物發(fā)酵罐的全部體積轉(zhuǎn)移到750 L容量的中試 發(fā)酵罐中。所轉(zhuǎn)移的體積對應(yīng)于中試發(fā)酵罐中3.3%的培養(yǎng)基HI體積(參 見實施例1.1A,包括消泡劑)。發(fā)酵在28土1.0。C下進行96小時，其中 連接到攪拌的溶解氧保持在25%。 B.化合物1的分離
〔0117〕在收獲中試發(fā)酵罐之前，通過在連續(xù)攪拌下緩慢加入99% H2S04將肉湯的pH調(diào)節(jié)至pH 3。然后在發(fā)酵容器中將發(fā)酵培養(yǎng)物冷卻 到4土2。C,隨后將其轉(zhuǎn)移至收集槽中并在4士2。C保持16到72小時。然 后通過超濾(0.2微米濾膜)收集菌絲體，產(chǎn)生稠漿。
〔0118〕對于在菌絲體分離步驟之后獲得的每1 L菌絲體漿，利用 3 L甲醇。提取步驟包括通過超濾系統(tǒng)循環(huán)菌絲體-曱醇60 ± 10 min。 高循含速度使得菌絲體聚集物打散，并使溫度增加到42±3°C,提供了有 效的提取。 一旦菌絲體于提取溶劑適當(dāng)混合，超濾系統(tǒng)的閥被打開以允 許滲透物被收集(清澈的甲醇提取物)。將曱醇提取物送入阻留物容器 (retentate container),而剩余的菌絲體用第二等體積的甲醇再提取。該 步驟用第三等體積的曱醇重復(fù)一次。匯集該三次甲醇提取物，并在減壓 下蒸發(fā)，以產(chǎn)生稠的粗制濃縮物。
〔0119〕在室溫下，將鹽(NaCl 10% w/v)加入^L制濃縮物中，并將 混合物攪拌30土 10min以使鹽溶解。以3:1 (曱醇:濃縮物)的比例將甲醇 加入鹽化的粗制濃縮物中，并將混合物攪拌60土 10min。將所得混合物 在真空下過濾(0.5微米的膜)，以去除微粒物質(zhì)。將濾液轉(zhuǎn)移到分液漏斗 中接著加入己烷(每100 mL甲醇50mL庚烷，用于再溶解粗制濃縮物)。 分液漏斗的內(nèi)含物^皮充分?jǐn)嚢?0 ± 5 min,以確保水相和有才幾相的完全 接觸。攪拌之后，室溫下靜置混合物，以便析相發(fā)生。收集下面的水曱 醇層。將曱醇提取物用第二體積的庚烷(其量等于第一次提取中所用庚烷 體積的50%)再提取。匯集曱醇層。
〔0120〕從脫脂作用得到的曱醇層與HP2(^在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中混合 物，并將甲醇在減壓下蒸發(fā)，以使疏水組分與樹脂結(jié)合。將所負(fù)載的樹 脂加入到預(yù)填充的HP2(f柱上。用凈化水(IO ± 2柱體積)充分洗滌該柱， 以去除任何溶劑、鹽和未結(jié)合的水溶性有機組分。比化合物l較不疏水 的弱結(jié)合的雜質(zhì)用近似10 ± 2柱體積的甲醇水溶液(60:40 v/v甲醇:水)從柱中洗脫，直到柱洗脫物的顏色變清澈或者非常淺的黃色。然后使用
70:30曱醇:水溶液(3 ± 1柱體積)洗該柱。化合物1用曱醇水溶液(90:10 v/v 曱醇:水)洗脫，收集餾分。提交各90Q/Q洗脫餾分的樣品進行LC-UV分析 以確定化合物的含量。匯集含有大于1%的化合物1的估計總量的70% 和90%曱醇水溶液餾分并送入徹底清理的第二 HP2(^柱中，如前所述進 行。匯集所得到的含有大于1%的化合物1的估計總量的90:10v/v曱醇: 水餾分，并且在結(jié)晶之前濃縮至干燥。
實施例2:化合物1晶體的制備
〔0121〕結(jié)晶方法并不限于使用化合物1的分離、粗制或粉末形式， 晶體形式也可以用于結(jié)晶過程中，以產(chǎn)生相同或不同的形式。相同的晶 形也可以從其它溶劑系統(tǒng)或者在不同的條件下獲得，本文所示例的步驟 僅僅用于闡述的目的。
〔0122〕根據(jù)實施例得到的化合物1的凍干粉末被用于制備形式I 的晶體和形式II的晶體(除2.1C使用粗制材料之外)。形式III的晶體從 形式I或II的晶體制備。
2丄晶形U曱醇/水V3步)
〔0123〕注意痕量的形式II晶體有時存在于從甲醇和水混合物中 產(chǎn)生的形式I的晶體中。當(dāng)用PEG(乙二醇)和PG(丙二醇)——各自在水 中的濃度為3% w/v——的混合物處理約0.8 mg/mL的化合物1時，也觀 察到形式I晶體產(chǎn)生
〔0124〕 A.來自實施例1.1B中HSCC純化的凍干化合物1 (24 mg) 稱重于20mL玻璃瓶中，并溶解在2mL甲醇中，產(chǎn)生淺褐色溶液。使 該溶液在巴斯德吸管中經(jīng)過Norit (活性炭)的塞子以使溶液脫色。獲得 淺黃色溶液，加入幾滴曱醇，將提交調(diào)整到2mL。將脫色溶液用水滴定， 直到溶液剛好變混濁為止。在滴定過程中使用連續(xù)的旋渦。對于約72 %的最終曱醇含量而言，所加入的水的總體積是大約700 mL。在水浴 中將混濁的懸浮液加熱至55°C,以產(chǎn)生清澈的飽和溶液。從水浴中移 走該清澈溶液并使其冷卻至室溫。隨著溶液的冷卻，過飽和溶液產(chǎn)生， 從中晶體開始形成。此刻溶液的溫度是大約31-33°C。使溶液在黑暗中 于室溫下靜置72小時，以便發(fā)生完全結(jié)晶，之后在燒結(jié)的玻璃漏斗中 進行過濾和洗滌。將晶體過夜凍干，產(chǎn)生20.5mg結(jié)晶化合物1 (形式I)?！?125〕 B.所使用的可選步驟如下稱重來自HSCC純化(實施 例1.1B)的凍干化合物1 (130mg),并溶解在30mL甲醇中，產(chǎn)生淺褐 色溶液。使該溶液經(jīng)過NoritTM (由200 mg Norit和400 mg Celite作為助
濾劑制成)的短柱以使溶液脫色，使用真空壓力以促進溶液穿過柱的流 動。獲得淺黃色溶液。使用另外5 mL熱曱醇來洗脫柱。從柱中收集的 體積是34.2 mL。使脫色溶液冷卻至室溫，并用水滴定，直到溶液開始 變混濁為止。在滴定過程中使用連續(xù)的旋渴。對于72%的最終曱醇含量 而言，所加入的水的總體積是大約13 mL。在水浴中將混濁的懸浮液加 熱至50。C,以產(chǎn)生清澈的飽和溶液。從水浴中移走該清澈溶液，并在水 的燒杯(燒杯中的水具有5(TC的初始溫度)中使其逐漸冷卻至室溫。在安 靜地靜置約30分鐘之后(燒杯中的溫度是35°C),在溶液中開始出現(xiàn)晶 體。使溶液在黑暗中于室溫下靜置過夜，然后放入水箱(4。C)中進行完全 結(jié)晶。在燒結(jié)的玻璃漏斗中通過過濾收集晶體，并用冷的(4匸)20%曱醇 水溶液洗滌。將晶體過夜凍干，產(chǎn)生116.3 mg結(jié)晶化合物1 (形式I)。
〔0126〕 C.可選步驟也用于制備形式I的晶體。所使用的材料得自 Diaion HP-20步驟(實施例1.1B,在HSCC之前)。將約1000 mg凍干的 粗制化合物1提取物(約70。/。純度)溶解在曱醇(30mL)中，產(chǎn)生深褐色有 色溶液(幾乎黑色)。使該溶液經(jīng)過NoritTM(由2gNorit和2gCelite作為 助濾劑制成)的短柱，使用真空以促進溶液的流動。起初，溶液作為淺黃 色溶液/人柱中洗脫，^f旦是在洗脫結(jié)束時，顏色變?yōu)辄S褐色。用20mL熱 甲醇洗NoritTM柱。用曱醇將溶液的體積調(diào)整到50 mL,產(chǎn)生黃綠色溶液。 使溶液冷卻至室溫，并用水滴定至濁點，以逐滴的方式并伴隨連續(xù)的旋 渦(對于約71%的甲醇濃度，需要20mL水)。在水浴中將混濁的懸浮液 加熱至50。C,以產(chǎn)生清澈的飽和溶液。從水浴中移走所得的清澈溶液， 并在水的燒杯(燒杯的初始溫度是5(TC)中使其逐漸冷卻至室溫。在安靜 地靜置過夜之后，針狀晶體開始出現(xiàn)(15小時后出現(xiàn)晶體)。向溶液中加 入水滴以確定結(jié)晶過程是否完成(當(dāng)加入水時，濁度意味著結(jié)晶未完 成)。沒有觀察到顯著的濁度，因此將該溶液在水箱(4。C)中貯存5小時。 使用燒結(jié)的剝漏斗通過真空過濾收集晶體，并用水冷的20%甲醇水溶液 洗滌。將回收的晶體(形式I)凍干，產(chǎn)生350 mg晶體(通過NMR和HPLC, 純度>98%)。
2.2.晶形IU乙醇/水)
37〔0127〕 A.來自HSCC純化(實施例1.1B)的凍干化合物1(110 mg)稱重于20 mL瓶中，并用10 mL乙醇溶解，產(chǎn)生褐色溶液。用水并 伴隨連續(xù)漩渦將溶液滴定至濁點(使用14mL水，產(chǎn)生39%乙醇濃度)。 在水浴中將混濁的懸浮液加熱至50°C，以產(chǎn)生清澈的過飽和溶液。從水 浴中移走該清澈溶液并使其冷卻至室溫。在安靜地靜置約2小時后，片 狀的銀色晶體斑點出現(xiàn)在溶液中。結(jié)晶過程完成之后，如前所述回收晶 體并稱重?；厥樟?95mg的晶體(形式II)量。該晶體具有銀灰色的顏色。
〔0128〕 B.可選地，在來自實施例1.2B的HP2(^-純化的物質(zhì)上進 行結(jié)晶。 將HP2(^-純化的物質(zhì)溶解在95%乙醇中，至濃度為大約24 ±3g/L。加入凈化水，得到17.5±2.5 g/L于70%乙醇中的"儲液"。將 該溶液加至在壇容器制備的、預(yù)熱至大約30土2。C的33%乙醇溶液中。 利用設(shè)定在10mg/min/10L結(jié)晶體積下的溶劑輸送系統(tǒng)，伴隨連續(xù)攪拌， 實現(xiàn)"儲液，，的添加。大約6土0.5h之后，用10mg化合物l晶體接種 結(jié)晶槽。 一旦儲液已經(jīng)完全輸送到結(jié)晶溶液中，使系統(tǒng)熟化約12.0±0.5 h。在熟化期，以0.1 x結(jié)晶溶液的體積的速率向槽中加入凈化水(0.15 x 結(jié)晶溶液總體積)。凈化水加入之后，在晶體收獲之前，將所得的結(jié)晶溶 液熟化另外16.0 ± 0.5h。利用中等規(guī)格的燒結(jié)玻璃漏斗通過過濾收集晶 體。
2.3 晶形II (異丙醇/水)
〔0129〕來自HSCC純化(實施例1.1B)的凍干化合物1 (21 mg) -故稱重于硼硅酸鹽玻璃管(13 x 100 mm)中，并用800 pL異丙醇溶解。 通過加入水使溶液接近濁點(使用1500 iuL水，產(chǎn)生35%異丙醇濃度)。 溶液在4-8。C保持過夜，以使晶體形成?；厥站w并稱重。回收率為大 約75%。
2.4 晶形III (退火過程)
〔0130〕晶形III是通過退火形式I或形式II的晶體產(chǎn)生的，其利 用多種溫度并在多種條件如空氣或惰性氣氛下或者在減壓下進行。結(jié)果 斗既括如下。
A.實施例步驟
C0131〕利用Edwards RV8泵(或者在真空爐中)，在減壓(l-4托)下， 于等溫60。C溫度的烘箱中，使化合物1形式II的晶體樣品(l mg至30 g) 干燥6小時。使樣品冷卻至室溫，并且如在實施例3、 4、 5和6中所述分析得到的晶形III。
B.通用干燥(退火)步驟及結(jié)果
〔0132〕當(dāng)在空氣氣氛下于60、 70、 80、 90或IO(TC的溫度下加熱 時，所有形式I和II的樣品被轉(zhuǎn)變?yōu)樾问絀II,而沒有可觀察到的分解(通 過&NMR、 TGA、 XRPD和溶解度)。在溶劑消除溫度之上進行退火過 程。當(dāng)晶體在氮下或在減壓下被脫火時，達160。C時未觀察到降解。也 顯示，在低達5(TC的溫度下退火進展緩慢。
〔0133〕作為實施例，當(dāng)使用60、 70和9(TC的溫度時，隨后的DSC 分析給出分別為185.5、 184.5和183.4。C的熔點以及分別為84.6、 66.8 和64.9 J/g的質(zhì)量焓(mass enthalpy)。當(dāng)在空氣氣氛下使用12(TC的溫 度(熔點174。C,質(zhì)量焓39.7 J/g)時，觀察(NMR和溶解度)到輕微的降解 (小于4%)。
〔0134〕當(dāng)使用下述步驟時(a)如實施例1.2中的發(fā)酵和分離；(b) 如實施例2.2B中的形式II晶體的產(chǎn)生；和(c)如實施例2.4A中的退火(干 燥)，產(chǎn)生形式m，總結(jié)果是每450L發(fā)酵為大于50g晶形III。
〔0135〕當(dāng)將化合物1以大約8-10 g/L的濃度溶解在體積比為大約 5:10:2:5的氯仿/甲醇/環(huán)己烷/水的混合物的下層相(HSCC，下層流動相) 中，在rotavap (旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)上伴隨溫和升溫濃縮至干燥時，也觀察到 晶形III。
實施例3:晶形I、 II和III的概述特征
〔0136〕發(fā)現(xiàn)根據(jù)實施例2制備的化合物1的形式I、 II和III的晶 體具有如在該實施例和實施例4、 5和6中所述的性質(zhì)。
〔0137〕在溶液中，沒有晶體形式存在，因此物化溶液特征，即化 合物1的結(jié)晶多晶型物和基本純的非晶形的& NMR光譜和紫外線光 譜應(yīng)當(dāng)是相同的。針對化合物1的所有晶體形式所得到的^NMR光譜 與化合物1的結(jié)構(gòu)以及在于2204年1月21日提交的美國申請序列號 10/762,107——其于2004年8月以WO 2004/065591公開——中所述的 NMR光i普一致。
〔0138〕 一般而言，化合物1的基本純的晶體顯示為灰色至銀灰色 晶體。晶體的外觀取決于它們的純度(而不是它們的結(jié)晶度)，這一般取 決于化合物1原材料的純度。較不純的晶形(例如，90-94%)表現(xiàn)出非常淺的褐色。
實施例4:晶形I、 II和III的XRPD圖
4.1 通用步驟
〔0139〕在根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟制備的樣品上進行X射線粉末衍射分析 (XRPD)。利用書t射計D5000-Siemens/Bruker AXS ，利用輻射源Co 1.79091埃和Si檢測，進行X射線分析。利用l-2mg硅作為參比標(biāo)準(zhǔn)， 在室溫下，樣品不旋轉(zhuǎn)的情況下，以27 2。/0.02mm的恒定往返，在硅 板上的2-4 mg晶體樣品上收集數(shù)據(jù)。在3至70°的6角下收集X射線強 度，增量角為0.01°/秒。
4.2 結(jié)果
〔0140〕形式I、 II和III以如在例如圖l(a)至(d)衍射圖中所示的x 射線粉末衍射圖(XRPD)為特征，該衍射圖分別收集自形式III、形式II (i-PrOH/水)、形式I和形式II(EtOH/水)。在表l中所列的值是最主要的 值并且以 "2-6角，，的度數(shù)(土 1%)和相對強度"RI"表達(SH雖，M= 中等，W—弱，V—夂常，及其組合，例如VS-非常強)。
表1
晶形I、 II和III的X射線粉末衍射CXRPD)圖(士 1%)
形式I形式II形式m
2-eRI2-eRI2-eRI
4.14S承4.16VS3.96VS
5.14vs8.32M7.86w
10.34M12.50M11.80s
15.20S16.70M15.74M
20.78M20.94M23.64M
22.80W25.20S27.62M
26.02M29.48W…——
31.20M33.82W——
*痕量的晶形II
〔0141〕從曱醇/水結(jié)晶得到的晶體分析(表1，圖l(c))顯示，形式i的晶體有時被發(fā)現(xiàn)含有痕量的形式n晶體。
〔0142〕在乙醇/水或異丙醇/水中結(jié)晶產(chǎn)生形式II的晶體(表1,分 別為圖l(d)和圖1(b))。從i-PrOH/水或EtOH/水中產(chǎn)生的形式H在XRPD 圖案上沒有顯示出任何顯著的差異，并且被認(rèn)為是相同的。
〔0143〕同樣，發(fā)現(xiàn)所有晶體形式(形式I和II)在干燥時轉(zhuǎn)變?yōu)榈?br>
三種形式(形式m)，與結(jié)晶所使用的溶劑無關(guān)。對晶體退火后得到的
XRPD結(jié)果的分析在所有情況下顯示出形式III的晶體(表1,圖l(a))。
在退火步驟只回，形式i和n都轉(zhuǎn)變?yōu)樾问絤的晶體?；衔飅粉末，
盡管被認(rèn)為是部分非晶形的(參見DSC試驗，實施例5和圖2),以一定
的結(jié)晶度為特征。其結(jié)晶部分主要是由形式I晶體組成，并且，在第一
次轉(zhuǎn)變之后，部分粉末變成形式m晶體，如在所有其它情況中所觀察到的。
實施例5:晶形I、 II和III的DSC 5.1 通用歩驟
〔0144〕利用具有DSC室(DSC cell)的TA Instruments Q1000-DSC (序列號1000-0024)掃描儀，進行示差掃描量熱法分析。冷凍冷卻系統(tǒng)連 接至DSC儀器，使得樣品被冷卻至-90。C。如25所建議，利用銦金屬溫 度標(biāo)準(zhǔn)(Indium Metal Temperature Standard),校準(zhǔn)DSC儀器。高容量 不銹鋼鍋(帶由蓋和密封，TA Instrument Cat. No. 900825.902)被用作樣 品容器。使用三種不同的條件設(shè)置(A, B, C),這取決于期望的測量參數(shù) 或結(jié)果。
〔0145〕A.在10-12 mg樣品上完成Tg(玻璃化轉(zhuǎn)變溫度)測定(至少 部分非晶形粉末)，利用下面的條件冷卻至A(TC (速率20°C/min); 加熱直到160。C(速率20。C/min);等溫步驟(160。C, 30分鐘);冷卻至-60 °C (速率20°C/min);以及加熱至210°C (速率20°C/min)。利用該步 驟產(chǎn)生圖2的溫語圖，但是僅顯示第二加熱上升，即在20。C/min的溫度 斜i皮下從-60。C至210°C。
〔0146〕 B.通過從室溫加熱至210°C (速率5°C/min),在5-6 mg 樣品上完成以一級轉(zhuǎn)變測定(晶體和粉末形式)。利用相同的條件在1.5-2 樣品上確定熔解溫度和質(zhì)量焓。
〔0147〕C.在5-6 mg樣品上并利用下面的條件確定晶體類型變化(晶
41體和粉末形式的退火)加熱直到160°C (速率5°C/min);等溫步驟(160 。C，120分鐘)；冷卻至室溫(速率5°C/min);以及加熱至210°C (速率 5。C/min)。
5.2 結(jié)果
表2
非晶形粉末與晶形I、 II和III的性質(zhì)
粉末形式I形式n形式III
外觀褐色銀灰色銀灰色銀灰色
熔點b181°C183。Ca183 °Ca183 °C
一級轉(zhuǎn)變(S)120-145°C~ 80。C和 100-140°C100-140°CN/A
玻璃化轉(zhuǎn)變(Tg)-15°CN/0N/ON/O
a. 形式I和II在熔點之下轉(zhuǎn)化為形式m (在下面進行解釋)
b. 由DSC確定的開始溫度(土5。C)。 N/A:不適用
N/O:未觀察
〔014 8 〕對包括非晶形粉末在內(nèi)的所有形式進行示差掃描量熱法溫 譜圖。與此提供了示例性DSC掃描(圖2至5),所得到的結(jié)果總結(jié)在表 2中。非晶形粉末的DSC(步驟A,圖2)顯示約-15。C的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度 (Tg)，該Tg發(fā)現(xiàn)與具有烴鏈的化合物的非晶形一致，例如，約-50'C至-60 °C的Tg是具有飽和烴鏈的化合物所期望的。所觀察的值低于標(biāo)準(zhǔn)最小值 50°C，但是更優(yōu)選IO(TC,以避免在口服固體藥物制劑中存在物理轉(zhuǎn)態(tài) 轉(zhuǎn)變超時的風(fēng)險(例如，參見Bechard and Down (1992), Pharmaceutical Research, vol 9, no 4, 521-528)。
〔0149〕在形式I的DSC溫鐠圖中(步驟B，圖3(a))， 一般而言， 在熔點以下觀察到兩次一級轉(zhuǎn)變。在8(TC左右觀察到第一次轉(zhuǎn)變，而第 二次轉(zhuǎn)變在約100至14(TC的范圍內(nèi)。在形式I中觀察到的第一次轉(zhuǎn)變 可能是由溶劑消除引起的。
〔0150〕在形式n的DSC溫譜圖中(步驟B,圖4(a)),在熔點以下 觀察到一級轉(zhuǎn)變。該轉(zhuǎn)變顯示在約100至14(TC的范圍內(nèi)的溫度下?！?151〕在形式I和II中觀察到的約100至14(TC的轉(zhuǎn)變對應(yīng)于產(chǎn) 生更穩(wěn)定的形式III而不發(fā)生降解的3-維分子重排，如通過XRPD圖和 NMR所示(無降解產(chǎn)物)。
〔0152〕形式III的DSC溫譜圖(步驟B，圖3(b)和4(b))顯示在熔 點之下無一級轉(zhuǎn)變。這進一步證實，關(guān)于形式I和II在熔點之下所觀察 到一級轉(zhuǎn)變與3-維分子重排有關(guān)。在通過不同溫度下熱處理形式I和II 得到的形式III晶體上進行DSC試驗。圖5(a到d)顯示了形式II (來自乙 醇)在減壓下分別在110、 90、 70和60。C退火之后得到的結(jié)果。
〔0153〕形式I、 n和III的熔解溫度都給出了相同的結(jié)果，即通過 DSC的約183°C 土5。C的起始溫度。因為它們在熔點之下轉(zhuǎn)化為形式m, 所以所觀察到的熔點實際上是形式III熔解時的溫度。
〔0154〕在氮氣下也進行了其它試驗，如包括退火步驟的DSC掃 描(在160。C等溫下，步驟C)，以進一步表征晶形I和II及粉末形式。 觀察與上述結(jié)果一致。
〔0155〕形式III的熔解溫度，當(dāng)使用毛細(xì)管U.S.P裝置(特別是根 據(jù)包含在美國藥典(United States Pharmacopeia)中的要求所設(shè)計的)測 量時，給出了 184'C的平均結(jié)果，具有2。C的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實施例6:晶形I、 II和III的熱解重量分析法 6.1 通用步驟
〔0156〕利用TA Instruments Q500-TGA (序列號0500-0006)進行 熱解重量分析法(TGA)。如制造商所要求，就溫度和重量校準(zhǔn)該儀器。 利用Certified Weight (1級和E2級)進行重量校準(zhǔn)。利用Nickel Wire Curie Point Temperature Standard (序列號CRM2-184)校準(zhǔn)溫度。鈿100 ju L 鍋(TA Instrument Catalog No. 952018.906)一皮用作樣品容器。利用下面的 條件收集數(shù)據(jù)溫度斜坡為20°C/min,從9到550。C;在550。C時氮氣 流變?yōu)榭諝饬?，以促進氧化和最終降解；溫度斜坡為20°C/min,從550 到700°C ,目的是達到~ 100%重量損失。
6.2 結(jié)果
〔0157〕從晶形I、 II (來自乙醇/水)和III的熱解重量分析法(TGA) 得到的結(jié)果的實例示于圖6和7中。形式I和II (例如，分別為圖6(b) 和7(b))的TGA顯示第一次轉(zhuǎn)變之前約6%的重量損失而沒有降解(如通過NMR和XRPD圖所示)，這意味著存在溶劑消除(例如，水、曱醇、 乙醇或異丙醇)。對于晶形I和II而言，重量損失發(fā)生在IO(TC之下。
〔0158〕在溶劑消除之后，晶體開始其向另一晶體類型的轉(zhuǎn)變(形式
m)。在溶劑消除之后與熔點之間未出現(xiàn)重量損失。形式i和n的第二重 量損失發(fā)生在熔點之后，這是由熔化的化合物的降解引起的。
〔0159〕分別由形式I或II退火得到的形式III的TGA示于圖6(a) 和7(a)中，其顯示在熔點之前無重量損失，這證實了溶劑消除導(dǎo)致形式 I和II中的第一次重量損失。關(guān)于形式I和II,在達到熔點之后觀察到 重量損失，這表明發(fā)生了分解。
實施例7:水中的溶解度測定
通過溶解度測試確定熱力學(xué)最穩(wěn)定的形式。 一般而言，最穩(wěn)定的 形式表現(xiàn)出較低的溶解度性質(zhì)。利用HPLC-MS方法(與質(zhì)譜儀連接的高 效液相色譜裝置)，評價晶形I和晶形II的每個樣品以及形式III的兩個 樣品(從形式I和形式II的干燥獲得)在水中的藥物溶解度。攪拌晶體的 飽和水溶液并且在環(huán)境溫度下保持24小時。以3600 rpm離心溶液，通 過HPLC-MS分析等分試樣的上清液。結(jié)果示于下面的表3中。
表3
在水中的溶解度(在24小時之后，未處于平衡)
晶形溶解度(jug/mL)
形式1(MeOH/水)6.59
形式II (EtOH/水)3.98
形式m (退火的形式i)0.65
形式ni(退火的形式n)<LOD*
承LOD:檢測限度為10ng/mL〔0160〕示于表3中的結(jié)果表明，晶形III明顯比晶形I和II更穩(wěn) 定。來自兩種不同來源的形式III呈現(xiàn)出溶解度差異，這可以通過下述 事實解釋溶解度試驗不是在平衡下進行，而是在經(jīng)過24小時的固定 時期后進行的?！?161〕在此所引用的所有專利、專利出版物和公開的參考文獻以 其全部通過參考并入本文。在發(fā)生沖突的情況下，將遵循本說明書，包 括定義。盡管本發(fā)明已經(jīng)參考其優(yōu)選實施方式進行具有的說明和描述， 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其中可以進行各種形式和細(xì)節(jié)的改變，而不 背離被所附權(quán)利要求書包括的本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
1.化合物1的晶體形式，所述化合物1具有結(jié)構(gòu)式
2. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖 l(a)、 1 (b)、 1 (c)或1 (d)所示的X射線衍射圖。
3. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖 3(a)或4(a)所示的示差掃描量熱法(DSC)溫譜圖。
4. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖 3(b)、4(b)或圖5(a)至5(d)中任一圖所示的示差掃描量熱法(DSC)溫譜圖。
5. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖 6(b)或7(b)所示的熱解重量分析法(TGA)溫譜圖。
6. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖 6(a)或7(a)所示的熱解重量分析法(TGA)溫譜圖。
7. 化合物1的晶體形式，所述化合物1具有結(jié)構(gòu)式<formula>formula see original document page 2</formula>其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖1 (c)所示的X射線衍射圖。
8.化合物1的晶體形式，所述化合物1具有結(jié)構(gòu)式其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖l(b)或l(d)所示的x射線衍射圖。
9.化合物1的晶體形式，所述化合物1具有結(jié)構(gòu)式其中所述晶體形式產(chǎn)生基本如圖1 (a)所示的X射線衍射圖。
10. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其特征在于X射線粉末衍射圖 中的下述的角位置(2 6角± 1 %):a) 5.1°、 10.3°、 15.2°、 20.8。、 22.8°、 26.0。和31.2。(形式I);b) 4.2。、 8.3。、 12.5。、 16.7°、 20.9。、 25.2°、 29.50和33.8。(形式II);或c) 4.0。、 7.9。、 11.8。、 15.7。、 23.6。和27.6。(形式III)。
11. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其特征在于X射線粉末衍射圖 中的下述角位置(2 6角± 1 %) : 5.140、 10.34。、 15.20。、 20.78。、 22.80。、 26.02°和31.20。(形式I)。
12. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其特征在于X射線粉末衍射圖 中的下述角位置(2 6角± 1 %) : 4.16。、 8.32。、 12.50。、 16.70。、 20.94。、 25.20°、 29.48。和33.82° (形式11)。
13. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其特征在于X射線粉末衍射圖 中的下述角位置(26角士 1 %) : 3.960、 7.86。、 11.800、 15.740、 23.64。 和27.62。(形式III)。
14. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式是能夠通過用包含至少一種低碳烷基醇的溶劑系統(tǒng)處理化合物1而得到。
15. 如權(quán)利要求14所述的晶體形式，其中所述溶劑系統(tǒng)包括水和選 自曱醇、乙醇和異丙醇的低碳烷基醇。
16. 如權(quán)利要求14或15所述的晶體形式，其中所述低碳烷基醇選 自甲醇、乙醇和異丙醇。
17. 如權(quán)利要求14至16中任一項所述的晶體形式，其中所述低碳 烷基醇是曱醇。
18. 如權(quán)利要求14至16中任一項所述的晶體形式，其中所述低碳 烷基醇是乙醇。
19. 如權(quán)利要求14至16中任一項所述的晶體形式，其中所述低碳 烷基醇是異丙醇。
20. 如權(quán)利要求1所述的晶體形式，其中所述晶體形式能夠通過在 約50。C至約110。C的溫度下干燥第一晶體形式而得到。
21. 如權(quán)利要求20所述的晶體形式，其中所述干燥在約30分鐘至 約24小時的干燥期間完成。
22. 如權(quán)利要求21所述的晶體形式，其中所述干燥期間是約2小時 至約12小時。
23. 如權(quán)利要求20至22中任一項所述的晶體形式，其中所述第一 晶體形式是形式I。
24. 如權(quán)利要求20至22中任一項所述的晶體形式，其中所述第一 晶體形式是形式II。
25. 如權(quán)利要求1至24中任一項所述的晶體形式，其處于基本純的 形式。
26. 如權(quán)利要求1至25中任一項所述的晶體形式，其處于本質(zhì)純的形式。
27. 如權(quán)利要求1至26中任一項所述的晶體形式，其中所述晶體形式是基本結(jié)晶的。
28. 如權(quán)利要求1至27中任一項所述的晶體形式，其中所述晶體形式是本質(zhì)結(jié)晶的。
29. 如權(quán)利要求1至28中任一項所述的晶體形式，其中所述晶體形式具有灰色至銀灰色晶體的外觀。
30. 如權(quán)利要求4、 6、 9和13中任一項所述的晶體形式，其中所述晶體形式基本沒有化合物1的其它晶形。
31. 制備如權(quán)利要求1所述的晶體形式的方法，其包括下述步驟a) 獲得分離的化合物1;b) 用包含低碳烷基醇的溶劑系統(tǒng)處理化合物1;和c) 從上清液中分離化合物1晶體。
32. 如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述步驟(a)包括i) 在導(dǎo)致化合物I產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)產(chǎn)生化合物1的微生物；和ii) 從所述微生物中分離化合物1。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述產(chǎn)生化合物1的微生物是 細(xì)菌。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)菌是放線菌。
35. 如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述放線菌是單孢絲菌屬或鏈 霉菌屬種。
36. 如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述放線菌是分別具有IDAC 編號070303-01、 231203-01和070905-01的單孢絲菌菌株046-ECO11 、 [S01]046或[S01U02]046。
37. 制備如權(quán)利要求l、 4、 6、 9和13中任一項所述的晶體形式的 方法，其包括如下的步驟a) 得到化合物1的第一基本晶體形式；b) 在約5(TC至約170。C的溫度下干燥步驟(a)的所述第一晶體形式， 以產(chǎn)生晶體形式。
38. 如權(quán)利要求37所述的方法，其中步驟(a)包括下述步驟i) 得到化合物1;ii) 用包含低碳烷基醇的溶劑系統(tǒng)處理在(a)中得到的化合物l;和iii) 從上清液分離化合物1第一晶體形式。.
39. 如權(quán)利要求37或38所述的方法，其中干燥步驟(b)在惰性氣氛 下進行。
40. 如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述惰性氣氛選自減壓或氮氣氛。
41. 如權(quán)利要求37至40中任一項所述的方法，其中所述干燥步驟 (b)在約5CTC至約ll(TC的溫度下進行約30分鐘至約24小時的期間。
42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述溫度是在約4小時至12小時的期間內(nèi)約55。C至IO(TC
43. 如權(quán)利要求31 、 32或38所述的方法，其中所述溶劑系統(tǒng)進 一步包括水。
44. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述溶劑系統(tǒng)包括水和甲醇。
45. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述溶劑系統(tǒng)包括水和乙醇。
46. 如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述溶劑系統(tǒng)包括水和異丙西孚。
47. 如權(quán)利要求31-36中任一項所述的方法，其中所述晶體形式是 形式I。
48. 如權(quán)利要求31-36中任一項所述的方法，其中所述晶體形式是 形式II。
49. 如權(quán)利要求37-42中任一項所述的方法，其中所述第一晶體形 式是形式I。
50. 如權(quán)利要求37-42中任一項所述的方法，其中所述第一晶體形 式是形式II。
51. 如權(quán)利要求37-42、 49和50中任一項所述的方法，其中段落(b) 所述的晶體形式是形式III。
52. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求1至29中任一項 所述的晶體形式和藥學(xué)上可接受的載體。
53. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求2至13中任一項 所述的晶體形式和藥學(xué)上可接受的載體。
54. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求10所述的晶體形 式和藥學(xué)上可接受的載體。
55. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求11所述的晶體形 式和藥學(xué)上可接受的載體。
56. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求12所述的晶體形 式和藥學(xué)上可接受的載體。
57. 藥物組合物，其包括治療有效量的如權(quán)利要求13所述的晶體形 式和藥學(xué)上可接受的載體。
58. 權(quán)利要求52至57中任一項所述的藥物組合物，其中所述藥物 組合物為口服懸浮液或固體口服制劑的形式。
59. —種治療肺瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用治療有效量的如權(quán)利要求1至29中任一項所述的晶體形式。
60. —種治療肺瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用 治療有效量的如權(quán)利要求2至13中任一項所述的晶體形式。
61. —種治療腫瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用 治療有效量的如權(quán)利要求10所述的晶體形式。
62. —種治療肺瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用 治療有效量的如權(quán)利要求11所述的晶體形式。
63. —種治療胂瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用 治療有效量的如權(quán)利要求12所述的晶體形式。
64. —種治療肺瘤癥狀的方法，其包括向需要此類治療的患者施用 治療有效量的如權(quán)利要求13所述的晶體形式。
65. 如權(quán)利要求59-64中任一項所述的方法，其中所述腫瘤癥狀包 括肺癌、結(jié)腸直腸癌(包括結(jié)腸癌)、CNS癌(包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤)、卵巢癌、 腎癌、前列腺癌、乳癌、造血癌(包括白血病)和黑色素瘤。
66. 如權(quán)利要求1至29中任一項所述的晶體形式在制備用于治療腫 瘤癥狀的藥物中的用途。
67. 如權(quán)利要求2至13中任一項所述的晶體形式在制備用于治療腫 瘤癥狀的藥物中的用途。
68. 如權(quán)利要求10所述的晶體形式在制備用于治療腫瘤癥狀的藥 物中的用途。
69. 如權(quán)利要求11所述的晶體形式在制備用于治療腫瘤癥狀的藥 物中的用途。
70. 如權(quán)利要求12所述的晶體形式在制備用于治療腫瘤癥狀的藥 物中的用途。
71. 如權(quán)利要求13所述的晶體形式在制備用于治療腫瘤癥狀的藥 物中的用途。
72. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求1至29中任一項所述的晶體形式， 以及關(guān)于在腫瘤癥狀治療中使用的說明。
73. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求2至13中任一項所述的晶體形式， 以及關(guān)于在腫瘤癥狀治療中使用的說明。
74. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求10所述的晶體形式，以及描述關(guān)于 在腫瘤癥狀治療中4吏用的說明的書面文件。
75. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求11所述的晶體形式，以及描述關(guān)于 在胂瘤癥狀治療中使用的說明的書面文件。
76. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求12所述的晶體形式，以及描述關(guān)于 在胂瘤癥狀治療中使用的說明的書面文件。
77. 商業(yè)包，其包含如權(quán)利要求13所述的晶體形式，以及描述關(guān)于 在胂瘤癥狀治療中使用的說明的書面文件。
78. 如權(quán)利要求1至29中任一項所述的晶體形式，用于治療腫瘤癥狀。
79. 如權(quán)利要求2至13中任一項所述的晶體形式，用于治療腫瘤癥狀。
80. 如權(quán)利要求10所述的晶體形式，用于治療肺瘤癥狀。
81. 如權(quán)利要求11所述的晶體形式，用于治療腫瘤癥狀。
82. 如權(quán)利要求12所述的晶體形式，用于治療腫瘤癥狀。
83. 如權(quán)利要求13所述的晶體形式，用于治療腫瘤癥狀。
全文摘要
本發(fā)明涉及ECO-4601的晶體形式以及提供它們的方法。本發(fā)明進一步涉及包含所述晶體形式的藥物組合物以及該晶體形式作為藥物的應(yīng)用方法。
文檔編號A61K31/551GK101541327SQ200780003903
公開日2009年9月23日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月31日
發(fā)明者E·魯, F·耶博亞, J·麥卡爾平, M·蘭杰, M·哈維, P·莫里斯 申請人:塔利昂制藥公司