專利名稱：：用新型腺病毒治療癌癥的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：概括而言，本發(fā)明涉及一種癌癥治療。具體而言，本發(fā)明涉及一種基于腺病毒的癌癥治療。
背景技術：
：在過去的60年中盡管診斷和治療都有進步，但每年與癌癥相關的死亡人數(shù)仍沒有下降。常規(guī)癌癥療法(外科手術，放射療法，化學療法)對早期患者的治愈率較高，但許多癌癥會復發(fā)且大部分晚期癌癥患者最終還是死于該疾病。常規(guī)癌癥療法的局限性不在于它們不能消除腫瘤，而在于消除腫瘤的同時對患者造成過度損傷。正是這種顧慮限制了外科切除手術的使用范圍、放射劑量和照射體積以及化療藥物的劑量和組合使用。若在腫瘤和正常組織之間的反應差異性沒有明顯提高(即治療指數(shù))，則治療效力的改進是沒有臨床價值的。但是，治療癌癥的改進方法和新型藥劑已提高了各種癌癥患者的存活時間和存活率。例如，改進的手術的和放射療法的程序可更有效地切除局部的腫瘤。然而，手術方法由于例如腫瘤的位置或轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的擴散而受到限制。放射療法也受其它限制放射劑量的因素的限制。具有一定抗輻射性的腫瘤在此劑量下不能被治愈。盡管單一的治療方法如放射療法，化學療法，手術或免疫療法可改善患者的病情，但組合使用這些方法可獲得更好的效果。尤其是，可定向于含有腫瘤的局部區(qū)域的放射療法和可提供全身治療模式的化學療法或免疫療法的組合治療對已發(fā)生或可能發(fā)生疾病擴散是有效的。不幸的是，放射療法的治療效力在腫瘤細胞具有一定抗輻射性時是受限的，因為劑量受到在輻射區(qū)域內(nèi)正常組織的耐受力的限制。因而，需要使癌癥腫瘤對放療的作用敏感化以便能更有效地降低患者體內(nèi)的腫瘤的嚴重性。另外，發(fā)展一種能更特異地隔離輻射區(qū)域的治療是有效的，從而防止放射治療對健康細胞的影響。在有關方式中，為減少某些化學療法的不需要的效應，使用腺病毒載體以所謂的"化療基因"轉(zhuǎn)化腫瘤細胞，所述"化療基因"能將無毒性物質(zhì)或"前體藥物"轉(zhuǎn)化成有毒的、有治療效果的形式。正在考慮利用幾種涉及基因治療的新方法來改進癌癥治療的治療指數(shù)。這些方法之一為所謂的"自殺基因療法"，該方法包括轉(zhuǎn)運和表達非哺乳動物的基因，該基因編碼的酶將無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成有毒的抗代謝藥。目前正處于臨床試驗評價的兩種"自殺基因"是大腸桿菌的胞嘧啶脫氨酶(CD)和I型單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-1TK)基因，它們分別賦予5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)的敏感性。這些基因靶向轉(zhuǎn)移至腫瘤后，前體藥物5-FC和GCV被局部地轉(zhuǎn)化成可導致大量腫瘤細胞死亡的有效化學治療藥劑(參見下面的參考文獻部分的列表中的參考文獻l(和它所引用的參考文獻))。因而，減輕了與常規(guī)化學療法相關的劑量限制性(dose-limiting)全身毒性。之前，已將細菌CD和野生型HSV-1TK基因偶聯(lián)以形成一種新型的CD/HSV-1TK融合基因(參見參考文獻部分列表中的參考文獻1)。CD/HSV-1TK融合基因可實現(xiàn)組合使用CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自殺基因療法。之前已證明CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自殺基因療法可使惡性腫瘤細胞對特定藥劑敏感，重要的是使它們對輻射敏感(參見參考文獻l-9)。使用一種含有原型CD/HSV-1TK融合基因(參考文獻IO)的新型的、溶瘤的和具有復制能力的腺病毒(Ad5-CD/TKr印)，在一些臨床前癌癥模型中(參考文獻10-13)和最近在人前列腺癌患者(參考文獻14和15)中己證明了具有復制能力的腺病毒介導的雙自殺基因療法不結合和結合放射療法的安全性和療效。在這些以人前列腺癌為對象的臨床試驗中，當與長達三周的5-FC和GCV(vGCV)前體藥物治療結合，同時不結合(參考文獻14)和結合(參考文獻15)常規(guī)劑量(70Gy)的三維適形放射治療(threedimensionalconformalradiationtherapy,3DCRT)時，所述Ad5-CD/TKrep病毒的安全劑量高達1012病毒顆粒(Vp)。而且，這類治療方案已表現(xiàn)出具有臨床效果的跡象(參考文獻14和15)。但是，盡管有這些進步，仍強烈需要包括用于癌癥治療的有效方法和組合物的發(fā)明。鑒于這些和其它不足開發(fā)了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明包括用于癌癥治療的、新型的和改進的方法和組合物，該方法和組合物包括一種能有效殺死哺乳動物癌細胞的新型病毒。該病毒產(chǎn)生一種可將無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的化療藥劑的新型蛋白。這類化療藥劑局部地產(chǎn)生并幫助病毒殺死癌細胞以及使癌細胞對輻射敏感。臨床前研究證明，無論單獨使用，還是與前體藥物療法和/或放射治療組合使用，所述病毒都能有效殺死各種人癌細胞。本發(fā)明包括一種新型的、"第二代"腺病毒(設計為"Ad5-yCD/ww汀KsR39^-ADP")，該病毒相對于之前已公開的原型Ad5-CD/Tkrep病毒具有至少兩種重要改進。Ad5-yCD/m^TKSR39re;-ADP含有一種改進的yCD/m"rTKSR39融合基因，該基因的產(chǎn)物可更有效地將5-FC和GCV前體藥物轉(zhuǎn)化成它們的活性化療藥劑。此外，Ad5-yCD/m^TKSR39^>ADP表達Ad5ADP蛋白，該蛋白明顯地提高了具有復制能力的腺病毒的溶瘤活性。相對于原型Ad5-CDITKrep病毒，Ad5-yCD/wwfTKSR39^-ADP已被證實在臨床前癌癥模型中有更高的病毒溶瘤和化學療法的活性。數(shù)據(jù)表明了含有Ad5-yCD/mWrTKSR39rep-ADP病毒的本發(fā)明在與5-FC和GCV前體藥物治療和放射療法結合使用時表現(xiàn)出低毒性和明顯的抗腫瘤活性。在仔細研究以下的附圖和詳細描述后，本發(fā)明的其它方面對于本領域技術人員是顯而易見的?，F(xiàn)在將以舉例的方式參照附圖描述本發(fā)明，其中圖1是本發(fā)明Ad5-yCD/mw/TKsR39r印-ADP病毒的示意圖。圖2是顯示本發(fā)明ADP基因的優(yōu)勢的圖。圖3A和3B是顯示本發(fā)明的改進的yCD/m^TKsR39基因的優(yōu)勢的圖。圖4是顯示本發(fā)明ADP基因的優(yōu)勢的圖。圖5是Ad5-yCD/mwfTKSR39re/-ADP在前列腺內(nèi)LNCaPC4-2小鼠模型中的開普萊-米耳(Kaplan-Meier)生存曲線圖。具體實施例方式概括而言，本發(fā)明包括用于治療癌癥的方法和組合物。具體而言，本發(fā)明提供了一種當給予前體藥物時能殺死癌細胞并使殘余的癌細胞對輻射更敏感的治療方法。本發(fā)明的實施方式包括一種能產(chǎn)生可將無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成化療藥劑的蛋白的新型病毒。前體藥物可被局部地生成或與所述治療聯(lián)合被給藥。優(yōu)選地，病毒是一種溶瘤的并具有復制能力的病毒，例如但不限于Ad5-yCD/m"TKSR39w;-ADP。當被給予需要這種治療的患者時，所述腺病毒將至少兩種前體藥物轉(zhuǎn)化成化療藥劑。這些前體藥物包括但不限于5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV及其衍生物)。除了能將前體藥物轉(zhuǎn)化成化療藥劑之外，本發(fā)明的實施方式可使細胞對輻射敏感。通過敏化細胞，可采用更低劑量的輻射且不限制輻射的優(yōu)勢。而且，放射療法會更有效，因為癌細胞對輻射更敏感，而正常細胞不會更敏感，所以減少了癌癥治療的副作用。本發(fā)明的療法可與其它療法如外科手術，化學療法，激素療法和免疫療法聯(lián)合使用。在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明包括了一種新型的、溶瘤的和具有復制能力的腺病毒(Ad5-yCD/羅fTKsR39^-ADP)，該腺病毒含有酵母胞嘧啶脫氨酶(yCD)/突變的SR39I型單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(m""K^9)融合基因和5型腺病毒(Ad5)腺病毒死亡蛋白(ADP)基因。Ad5-yCD/w"/TKSR39re;-ADP在人癌細胞中復制并有效殺死人癌細胞。Ad5-yCD/m^TKSR39^p-ADP可產(chǎn)生一種能將兩種前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV和GCV衍生物)轉(zhuǎn)化成有效的化療藥劑的yCD/wwfTKsR39融合蛋白(是指雙自殺基因療法)。yCD/5-FC和HSV-1TKSR39自殺基因療法都顯示出有效的化療活性并使腫瘤細胞對離子輻射敏感。僅通過舉例方式，臨床前研究表明Ad5-yCD/w"rTKSR39re;>ADP病毒單獨地使用或與雙自殺基因療法和/或放射療法聯(lián)合使用時可有效殺死各種人癌細胞。在臨床應用中，Ad5-yCD/mw/TKSR39;-ADP病毒可作為單一療法獲得它的病毒介導溶瘤效果，它可與yCD/5-FC和HSV-1Ad5-TKSR39/GCV自殺基因療法聯(lián)合使用獲得組合的病毒溶瘤/化療效果，或它可與yCD/5-FC和HSV-1Ad5-TKSR39/GCV自殺基因療法以及放射療法聯(lián)合使用(稱為三模型療法)獲得組合的病毒溶瘤/化療/射線敏感效果。在人的癌癥治療中，三模型療法可與其它常規(guī)癌癥療法如外科手術，化學療法，激素療法和免疫療法組合。為進一步開發(fā)這種基于基因治療的方法作為癌癥療法，開發(fā)了一種新型的第二代腺病毒(Ad5-yCD/ww汀KsR39^p-ADP)，該腺病毒相對于原型Ad5-CD/Tkre;病毒具有至少兩種重要改進。Ad5-yCD/m^TKSR39^-ADP含有一種改進的yCD/mz^TK^9融合基因，該基因的產(chǎn)物可更有效地將5-FC和GCV前體藥物轉(zhuǎn)化成它們的活性化療藥劑。此外，Ad5-yCD/ww/TKSR39^/-ADP表達Ad5ADP蛋白，該蛋白明顯地提高了具有復制能力的腺病毒的溶瘤活性。相對于原型Ad5-CDITK/"印病毒，Ad5-yCD/ww"KSR39/^-ADP己被證實在臨床前癌癥模型中有更高的病毒溶瘤和化學療法的活性。通過病毒感染導入本發(fā)明的核苷酸，提供了超過其它所列方法的多種優(yōu)勢。由于病毒感染的特性可獲得更高的效率。而且，病毒高度特異化，并且一般感染特定的細胞類型并在特定的細胞類型中增殖。因而，在體內(nèi)或組織中培養(yǎng)或細胞混合培養(yǎng)時，病毒的天然特異性可使載體靶向特定的細胞類型。還可根據(jù)特定受體或配體改進病毒載體以通過受體介導改變靶特異性。還可在載體上添加附加特征以確保它的安全性和/或增強它的治療效果，這類特征包括但不限于，例如，可用于負選擇被重組病毒感染的細胞的標記。這種負選擇標記的一個實例是上述的TK基因，該基因賦予對抗生素9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤的敏感性。因此負選擇是一種控制感染的手段，因為可通過添加抗生素誘導其自殺。這種保護確保了如果例如發(fā)生了改變病毒載體或重組序列的突變，也不會發(fā)生細胞轉(zhuǎn)化。在一些實施方式中還包括限制特定細胞類型表達的特征。這類特征包括，例如，對所需要的細胞類型特異的啟動子和調(diào)控元件。此外，重組病毒載體可用于本發(fā)明核苷酸的體內(nèi)表達，因為它們提供了如橫向感染和靶向特異性的優(yōu)勢。橫向感染是例如逆轉(zhuǎn)錄病毒的生命周期中所固有的，它是通過單個被感染細胞產(chǎn)生許多子代病毒顆粒，該病毒顆粒出芽逸出并感染鄰近細胞。結果造成大面積迅速地被感染，而其中的大部分開始都不是被原始病毒顆粒所感染的。這與感染因子僅通過子體后代傳播的豎向型感染相反。還可產(chǎn)生不能橫向傳播的病毒載體。這種特性對于期望將特定基因僅導入局部的一些靶細胞中是有用的。如上所述，病毒是非常特異的感染因子，在很多情況下已進化為可瓦解宿主的防御機制。通常地，病毒感染特定的細胞類型并在這類細胞中增殖。病毒載體的靶向特異性利用了它的天然特異性以特異地靶向預定細胞類型，從而將重組基因?qū)氡桓腥镜募毎１景l(fā)明方法中所用的載體取決于所需的待耙向的細胞類型，本發(fā)明方法中所用的載體是本領域技術人員所公知的。例如，在治療乳腺癌時采用對這類上皮細胞特異的載體。同樣地，在治療造血系統(tǒng)的疾病或病狀時，采用對血細胞及它們的前體特異的病毒載體，優(yōu)選對特定類型的造血細胞特異的病毒載體?？赏ㄟ^多種方式給予重組載體。例如，所述方法可利用病毒載體的靶向特異性從而不需要在病變位點局部給藥。但是，局部給藥可提供更快速更有效的治療。還可通過例如靜脈或皮下注射受試者進行給藥。注射之后，病毒載體將一直循環(huán)到以適當?shù)母腥景刑禺愋宰R別宿主細胞?？商鎿Q的給藥方式可以是通過直接局部接種到疾病或病狀的位點，或接種到給上述部位供應營養(yǎng)的血管系統(tǒng)中。局部給藥是有利的，因為不存在稀釋效應，因此只需要更小劑量就可實現(xiàn)在大多數(shù)耙細胞中的表達。此外，局部接種可減輕其它給藥形式所要求的靶向必要條件，因為可以采用感染被接種區(qū)域的所有細胞的載體。若需要僅在被接種區(qū)域的特定亞型的細胞中表達，則可采用對所需亞型的細胞特異的啟動子和調(diào)控元件以實現(xiàn)該目標。這種非靶向載體可以是例如病毒載體、病毒基因組、質(zhì)粒和噬菌粒等。還可采用轉(zhuǎn)染載體如脂質(zhì)體將上述的非病毒載體導入被接種區(qū)域的受體細胞中。這種轉(zhuǎn)染載體是本領域技術人員公知的?？砂凑樟己玫尼t(yī)療操作，并考慮患者個體的臨床癥狀，給藥的位點和方法，給藥時間安排，患者年齡，性別，體重和執(zhí)業(yè)醫(yī)生公知的其它因素來給予本發(fā)明化合物并確定其劑量。因而通過本領域公知的這些考慮因素來確定為了達到本發(fā)明治療目的的藥物"有效量"。該劑量必須能有效實現(xiàn)改善，所述改善包括但不限于改善存活率或更快速的恢復，或改善或消除癥狀和通過本領域技術人員以適當措施所選擇的其它指標。在本發(fā)明的實施方式中，本發(fā)明的化合物可通過多種方式給藥。應該注意的是，本發(fā)明的化合物可作為化合物給藥，并可單獨或作為活性成分與藥學可接受的載體，稀釋劑，佐劑和媒介物組合給藥。該化合物可經(jīng)口服，皮下或腸胃外包括靜脈內(nèi)給藥，動脈內(nèi)給藥，肌肉內(nèi)給藥，腹膜內(nèi)給藥，和鼻腔給藥以及鞘內(nèi)和灌注技術。也可采用化合物的埋植。受治患者是恒溫動物尤其是包括人在內(nèi)的哺乳動物。藥學可接受的載體，稀釋劑，佐劑和媒介物以及埋植載體通常是指不與本發(fā)明活性成分反應的、惰性的、無毒固體或液體填充劑，稀釋劑或包封材料。應該注意的是，治療人的療程一般長于本文中例舉的小鼠或其它實驗動物的療程，其治療時間的長度與疾病發(fā)展的程度和藥物效力成比例。劑量可以是在幾天的單劑量或多劑量。通常治療時間的長度與疾病發(fā)展的程度和藥物效力及受治患者的物種成比例。以腸胃外的方式給予本發(fā)明化合物時，通常將本發(fā)明化合物制成單位劑量的可注射劑型(溶液劑，懸浮液劑，乳液劑)。適宜于注射的藥物制劑包括滅菌水溶液或分散體和用于重制無菌注射液或分散體的滅菌粉末。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態(tài)聚乙烯醇等)、它們的適當混合物、和植物油?？赏ㄟ^例如采用包衣如卵磷脂，在分散體中維持所需顆粒大小和采用表面活性劑來保持適當?shù)牧鲃有?。還可采用非水媒介物如棉籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花油，或花生油和酯如肉豆蔻酸異丙酯作為化合物組合物的溶劑體系。此外，還可添加提高組合物的穩(wěn)定性、無菌性和等滲性的各種添加劑，包括抗微生物在內(nèi)的防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩沖液。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來確保抑制微生物的作用，例如對羥基甲苯酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸等。在許多情況下，還需要等滲劑，例如糖和氯化鈉等?？赏ㄟ^使用延遲吸收劑實現(xiàn)可注射藥物制劑的延長吸收，如單硬脂酸鋁和明膠。根據(jù)本發(fā)明，所用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑必需與所述化合物相容?？赏ㄟ^在所需量的適宜溶劑中將本發(fā)明操作中所采用的化合物與其它各種所需成分合并來制備無菌的可注射溶液。本發(fā)明的藥物制劑可通過含任何相容載體如各種媒介物、佐劑、添加劑和稀釋劑的可注射制劑給予患者；或本發(fā)明中所用化合物可通過緩釋的皮下埋植或靶向遞送系統(tǒng)以腸胃外的形式給予患者，所述靶向遞送系統(tǒng)如單克隆抗體、載體遞送、離子滲透、聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球體。許多其它的這類埋植、遞送系統(tǒng)和模式都是本領域技術人員公知的。在一個實施方式中，本發(fā)明化合物開始可通過靜脈注射給藥使血液中所述化合物的濃度到達適宜水平。然后通過口服劑型來維持患者體內(nèi)的所述化合物的水平，但是可根據(jù)患者癥狀和以上說明采用其它給藥形式。給藥量隨受治患者變化而變化。定義除非上下文特別說明或暗示，下列術語和短語的含義如下所述本文所用的術語"基因治療"是指將感興趣的遺傳物質(zhì)(如:DNA或RNA)轉(zhuǎn)入宿主以治療或預防遺傳性或獲得性疾病或癥狀表型。感興趣的遺傳物質(zhì)編碼一種產(chǎn)物(如蛋白質(zhì)、多肽、肽，功能RNA和反義分子(antisense))，該產(chǎn)物是體內(nèi)所需的。例如，感興趣的遺傳物質(zhì)可編碼一種具有治療價值的激素、受體、酶、多肽或肽。感興趣的遺傳物質(zhì)還可編碼自殺基因。通?？蓞⒖冀炭茣痘虔煼ā?genetherapy)(AdvancesinPharmacology40，AcademicPress,1997)。術語"體內(nèi)基因治療"是指將待轉(zhuǎn)移的遺傳物質(zhì)原位導入到受體生物的受體器官的靶細胞中。治療之后，基因改變的靶細胞原位表達轉(zhuǎn)染的遺傳物質(zhì)。若宿主基因有缺陷，這種治療還包括原位修復基因。術語"基因表達載體"是指任何能夠?qū)愒春塑账徇f送/轉(zhuǎn)移至宿主細胞內(nèi)的載體。表達載體可包括控制靶向的元件，核苷酸以細胞選擇的方式表達和轉(zhuǎn)錄是本領域公知的。應該注意的是基因的5'UTR和/或3'UTR可能被表達載體的5'UTR和/或3'UTR所取代。因此，如果需要，本文所用的表達載體可以不含有待轉(zhuǎn)移的實際的基因的5'非翻譯區(qū)(5'UTR)和/或3'UTR而僅含有特定的氨基酸編碼區(qū)。表達載體可包括控制異源物質(zhì)轉(zhuǎn)錄的啟動子，以及可以是能進行選擇性轉(zhuǎn)錄的組成型或誘導型啟動子。可選擇性地包括為了獲得必要轉(zhuǎn)錄水平可能需要的增強子。增強子通常是任意的非翻譯的DNA序列，該序列與編碼序列(順式)一起連續(xù)作用以改變由啟動子所控制的基本轉(zhuǎn)錄水平。表達載體還可包括一個選擇性基因。實施例1、Ad5-yCD/w^TKSR39/^-ADP腺病毒的說明在以下參考文獻部分列表中公開了Ad5-yCD/m^TKSR39re/-ADP腺病毒、yCD/w^TKsR39融合基因和ADP基因(SEQIDNOs.l-5)的完整和部分DNA和翻譯的蛋白質(zhì)序列。將從這類序列的角度介紹以下實施例。實施例中的Ad5-yCD/m^TKSR39^-ADP病毒(序列NO:l)是具有復制能力的5型腺病毒(對于本領域技術人員而言，該病毒的序列是公知的且易于獲得的)，該病毒的序列包括在El區(qū)的改進yCD/m^TKSR39融合基因和在E3區(qū)的Ad5ADP基因。圖1提供了Ad5-yCDAm^TKSR39"/-ADP的示意圖(在圖1中，"CMV"=人類巨細胞病毒啟動子；"SV40"=猴病毒40多腺苷序列；和"mu，^圖譜單位。)如圖1所示，CMV-yCD/m^TKSR39-SV40表達盒位于El區(qū)，取代了缺失的55kDaE1B基因。CMV-ADP-SV40表達盒位于E3區(qū)，取代了缺失的E3基因。Ad5-yCD/w^TKSR39r^-ADP在55kDaE1B基因中缺失了1255個堿基對(bp)(堿基2271-3524)(參見SEQIDNO:2)。通過本領域技術人員公知的方法，兩個翻譯提前終止密碼子(prematuretranslationstopcodon)被構建到55kDaElB基因中，產(chǎn)生截短的、無功能的并具有78個氨基酸的E1B蛋白。Ad5-yCD/w^TKSR39^/>ADP表達野生型Ad5ElA和19kDaE1B蛋白。插入yCD/m"fTKsR39融合基因(SEQIDNO:4)以取代缺失的55kDaE1B基因。yCD/m"TKSR39融合基因的表達是由人類巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動的，并利用了猴病毒40(SV40)多腺苷酸化元件。yCD/m^TKsK39融合基因編碼一個59kDayCD/ww/TKs!U9融合蛋白，該蛋白可以酶的方式將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉(zhuǎn)化成氟尿嘧啶(5-FU)并可將9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)及其衍生物轉(zhuǎn)化成它們相應的單磷酸鹽(如GCV-MP)。5-FU和GCV-MP的下游代謝產(chǎn)物是有效的DNA復制的抑制因子并可使正在分裂的細胞死亡。這些下游代謝產(chǎn)物還是有效的輻射敏化劑，可顯著地增強放射療法的治療效果(參考文獻1-14)。表達yCD/聽fTKsR39融合蛋白的細胞以及通過觀者效應的鄰近細胞被yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法殺死，并對離子輻射的殺傷效應敏感。Ad5-yCD/mwfTKSR39^>ADP還含有缺失了2.68kb(堿基28,133-30,181)的E3區(qū)，E3區(qū)影響抑制宿主免疫反應但不是病毒復制所必需的基因(參見SEQIDNO:3)。Ad5-yCD/w^TKSR39rep-ADP含有Ad5ADP表達盒，該表達盒取代了天然的Ad5E3基因。ADP基因(SEQIDNO:5)的表達是由人類巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動的并利用了猴病毒40(SV40)多腺苷酸化元件。產(chǎn)生了一個真正的111.6kDaAd5ADP蛋白，該蛋白可顯著增強具有復制能力的腺病毒的溶瘤活性。Ad5-yCD/mW"KSR39^;>ADP缺乏所有其它已知的Ad5E3基因(gpl9，10.4kDa，14.5kDa禾口14.7kDa基因)。2、Ad5-yCD/m"fTKSR39re;7-ADP腺病毒的構建用于構建Ad5-yCD/mw^TKSR39re/7-ADP的含有腺病毒序列的質(zhì)粒從Microbix(多倫多，加拿大)獲得。為了構建pCMV-yCD/m^TKSR39表達質(zhì)粒(左端載體)，通過鏈式聚合酶反應(PCR)以線性化的pET23d:HSVTK^39為模板擴增突變型的SR39HSV-1TK基因(參考文獻16)。以下引物對用于產(chǎn)生wwfTKSR39PCR產(chǎn)物。5'-GATCGGATCCCTCGAGATC2CTAGCATGGCTTCGTACCCCGGC隱3'(SEQIDNO:8)5'-GATCGAATTCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTC-3'(SEQIDNO:9)將得到的1128堿基對(bp)片段用5am/f/(GGATCC)+￡coR7(GAATTC)消化，在已去除原型CD/HSV-1TK融合基因的pCA14-CDglyTK-ElaElb(參考文獻10)的^^^/+五"7/位點間克隆，產(chǎn)生pCA14-CMV-m^TKSR39-ElaElb。通過PCR以線性化pBAD-ByCD為模板擴增酵母胞嘧啶脫氨酶基因(yCD)基因(參考文獻17)。以下引物對用于產(chǎn)生yCD的PCR產(chǎn)物。5'-GATCCTCGAGCCACCATGGTGACAGGGGGAATG畫3'(SEQIDNO:10)TATCTTC-3'(SEQIDNO:11)將得到的526bp片段用^Tzo/(CTCGAG)+M2e/(GCTAGC)消化，并在pCA14-CMV-wz^TKSR39-ElaElb的屈o/+Mze/位點之間克隆，產(chǎn)生pCA14-CMV-yCD/m^TKSR39-E1aE1b。為制備pBHG10-尸ac/woACMV-ADP(右端載體)，通過PCR擴增ADP基因，并將該基因在pBHGi(KPac/mod的Pac/禾n5Vra/位點之間克隆。pBHG10-戶ac/wod是pBHG10(Microbix;Toronto,Canada)的衍生物，并在E3區(qū)含有尸ac/和5Va/位點以方便定向克隆。pBHG10是一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括不含El區(qū)的188-1,339堿基和E3區(qū)的28,133-30,818堿基的整個5型腺病毒基因組。以野生型Ad5DNA為模板，產(chǎn)生含ADP基因的333bp的PCR產(chǎn)物。以下引物對用于產(chǎn)生ADPPCR產(chǎn)物。5'畫GATCGGATCCCCTGCTCCAGAGATGACCGGC陽3，(SEQIDNO:12)5'-GATCAAGCTTGGAATCATGTCTCAMAATC-3'(SEQIDNO:13)將得到的333bp的片段PCR產(chǎn)物用5aw/f/(GGATCC)+歷"必//(AAGCTT)消化，并克隆到用5"附///-歷"^7//消化的pCA14(Microbix;Toronto,Canada)中產(chǎn)生pCA14-ADP。通過PCR利用以下引物對產(chǎn)生完整的CMV-ADP-SV40polyA表達盒。5'-GATCATTTAAATAATTCCCTGGCATTATGCCCAGTA-3'(SEQIDNO:14)5'-GATCTTAATTAATCGATGCTAGACGATCCAGACATG-3'(SEQIDNO:15)在引物5'端的CMV啟動子的上游引入了限制性酶切位點(ATTTAAAT)，并且在引物3'端的SV40polyA區(qū)的下游引入了尸ac/限制性酶切位點(TTAATTAA)。用5Vva/和Pac/消化PCR產(chǎn)物，并克隆到產(chǎn)生pBGH10-戶ac/wo^CMV-ADP的經(jīng)5W^-尸ac/消化的pBGH10-尸ac/woc/。為制備Ad5-yCD/mwZTKSR39/^-ADP病毒，將pCA14-CMV-yCD/mW/TKSR39-ElaElb(10pg)通過尸vw/消化而線性化，并將獲得的產(chǎn)物與經(jīng)C/a/線性化的pBHG10-尸flc/wo&CMV-ADP(30iag)通過CaP04-DNA沉淀法一起共轉(zhuǎn)染至HEK293細胞(Microbix)中。在7-14天后獲得分離的噬斑，并在HEK293細胞中第二次純化噬斑。將來自于兩次純化噬斑的病毒用于感染HEK293細胞以產(chǎn)生病毒粗懸浮物，然后經(jīng)CsCl梯度純化腺病毒。3、含有ADP基因的Ad5-yCD/m^TKSR39rep-ADP在體外的優(yōu)勢以5x104細胞/孔的濃度將人類DU145前列腺癌細胞種到24孔板中，用梯度濃度的Ad5-CD/TKrep(第1行)和Ad5-yCDA"/TKSR39rep-ADP病毒(第2行)進行感染。5天后，固定細胞并以結晶紫染色。結果(如圖2所示，"Vp"=病毒顆粒)清楚地表明了含有Ad5ADP基因并表達ADP蛋白的具有復制能力的腺病毒(即Ad5-yCD/m^TKsR39r印-ADP)具有比缺乏ADP的腺病毒明顯更高的溶瘤活性。換言之，Ad5ADP基因的存在明顯增強了具有復制能力的腺病毒的溶瘤活性。這些結果表明了含有ADP基因的Ad5-yCD/w^TKSR39rep-ADP在體外的優(yōu)勢。4、含有yCD/mw/TK犯39基因的Ad5-yCD/m^TKSR3ADP在體外的優(yōu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>LNCaPC4-2細胞被模擬感染(第1和5行)，或用感染復數(shù)(MOI)值為10的Ad5陽CD/Tkrep(第2禾卩6行)，Ad5-yCD/mz^TKSR39re/-ADP(第3和7行)，Ad5-yCD/mwfTKsR39^;-hNIS(第4和8行)進行感染。72小時后，以["C]-胞嘧啶(第1-4行)和卩H]-5-FC(第4-8行)為底物檢測細胞的CD活性。結果如圖3A所示[(胞嘧啶(靠下的左箭頭)、尿嘧啶(靠上的左箭頭)、5-FC(靠上的右箭頭)和5-FU(靠下的右箭頭)]。如圖3A所示，與表達包含在原型Ad5-CD/Tkre/病毒中的CD/HSV-1TK融合基因的病毒相比，表達改進yCD/w"rrKSR39^基因的重組腺病毒(如Ad5-yCD/w^TKSR3ADP)表現(xiàn)出比更強的將5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU的能力，但不能將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。B、細胞病理效應試驗將細胞(106細胞，在60mm培養(yǎng)皿)模擬感染或用MOI值為3的Ad5-CD/Tkre;或Ad5-yCD/m^TKsR39^-ADP進行感染。第二天，將細胞重新種植到(24孔板)含多種濃度(pg/ml)的5-FC(第3-7和15-19孔，從左到右，從上到下)或GCV(第8-12和20-24孔，從左到右，從上到下)的培養(yǎng)液中。9天后用結晶紫染色細胞。結果(如圖3B所示)證明當與5-FC前體藥物治療組合使用時，與表達包含在原型Ad5-CD/Tkr印病毒中的CD/HSV-1TK融合基因的病毒相比，表達改進的yCD/m"汀Kre;基因的重組腺病毒(如Ad5-yCD/w^TKSR39w/-ADP)導致更多的細胞死亡。圖3A和3B的結果一起顯示了包含在Ad5-yCD/m"TKSR39/^-ADP中的yCD/TKSR39基因在體外的優(yōu)勢。該實施例的結果還證明了yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法可用于增強Ad5-yCD/mw"KsR,印-ADP病毒本身的治療效果。Ad5-yCD/m^TKSR39^p-ADP含有一種新型的yCD/w"rTKSR39融合基因，該基因的產(chǎn)物與由原型Ad5-CD/Tkrep病毒產(chǎn)生的CD/HSV-1TK融合蛋白相比具有改進的催化活性。表達改進yCDAm^TKsK39融和蛋白的重組腺病毒表現(xiàn)出比表達原型CD/HSV-1TK融合蛋白的病毒更強的將5-FC轉(zhuǎn)化成5-FU的能力，將GCV轉(zhuǎn)化成GCV-MP的能力也可能增強。因而，可獨立和聯(lián)合使用yCD/5-FC禾口HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法以增強Ad5-yCD/m"/TKSR39^7-ADP病毒的腫瘤破壞效果。5、含有ADP基因的Ad5-yCD/w^TKSR3ADP在體內(nèi)的優(yōu)勢在第0、2和4天將101Gvp的Ad5-CD/Tkr印或Ad5-CD/TKr印-ADP注射入肌肉內(nèi)(腿)的C33A腫瘤(150-200mm3)(圖4中的箭頭)。在第5-11天給予5-FC(500毫克/千克/天)和GCV(30毫克/千克/天)(圖4中的陰影條)。每隔一天監(jiān)測腫瘤體積。預定終點是500mm3。存活定義為動物在第90天沒有腫瘤(治愈)或腫瘤〈500mm3。結果(如圖4和下表1所示)顯示了在體內(nèi)對腫瘤細胞的更強破壞，從而證明了含有ADP基因的Ad5-yCD/m"rrKSR39re;-ADP的優(yōu)勢。換言之，Ad5ADP基因的存在明顯增強了具有復制能力的腺病毒在體內(nèi)或體外的溶瘤活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>'半數(shù)存活時間按天數(shù)算。'Ad5-CD/TKr印-ADP對Ad5-CD/TKrc;:Ad5-CD/TKr印-ADP+5-FC+GCV對Ad5-CD/TKr印+5-FC+GCV6、Ad5-yCD/wWTKSR39re/>ADP在小鼠模型體內(nèi)的效力在第0天將約109vp的Ad5-yCD/m"fTKSR39re,ADP注射入患有前列腺內(nèi)LNCaPC4-2腫瘤(大小為約25-50mm"的雄性重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠(圖5中的箭頭)。在第3-9天給予5-FC(500毫克/千克/天)和GCV(30毫克/千克/天)(圖5中的陰影條)。每周測定血清中的前列腺特異性抗原(PSA)。預定終點是PSA-500ng/ml。結果(如圖5和下表2所示)顯示了在小鼠模型中利用本發(fā)明的Ad5-yCD/WWfTKSR39^/-ADP提高了半數(shù)存活時間和/或腫瘤治愈率。表2.Ad5-yCD/ww/TKSR39^-ADP在LNCaPC4-2腫瘤模型中的結果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>lAd5-yCD/wM,TKSR39^>ADP對PBS;bAd5-yCD/w^TKSR39w/-ADP+5-FC+GCV對PBS。7.利用yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV使人類癌細胞對輻射敏感如發(fā)明人之前的實驗所示(參見參考文獻1-14)，yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因可用于使人類癌細胞對輻射敏感。Ad5-yCD/wM/TKSR39^-ADP含有一個新型的yCD/m^TKsR39融合基因，該基因的產(chǎn)物的催化活性與由原型Ad5-CD/Tkr印病毒產(chǎn)生的CD/HSV-1TK融合蛋白相比有所改進。之前的研究證明了CD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因可使人類癌細胞對離子輻射敏感。因而，由于Ad5-yCD/m^TKSR39"p-ADP表達的是改進的yCD/m^TK犯39融合蛋白，它在體內(nèi)可導致更強的癌細胞輻射敏化作用。在整個本申請中，不同參考文獻標注以不同的文獻標號。下文提供了帶有完整引用出處的參考文獻列表。這些參考文獻的全文被引入本申請作為參考以更充分地描述本發(fā)明所屬領域的現(xiàn)狀。盡管通過前述的優(yōu)選和可選擇的實施方式和實施例詳細展示和描述本發(fā)明時，本領域技術人員可以理解的是本文所描述的發(fā)明的實施方式的各種替換形式也可被用于實施本發(fā)明，且不偏離下列權利要求所定義的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍。這就意味著由下列權利要求限定本發(fā)明的范圍，并且所述權利要求書范圍內(nèi)的方法和組合物，以及與它們等同的方法和組合物都在權利要求書的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的說明書應理解為包括本文所述的所有新穎的和非顯而易見的元素的組合，該申請或后續(xù)申請的權利要求包括這類元素任何新穎和非顯而易見的組合。前述的實施方式是例證性的，并且沒有單個特征或元素對于本申請或后續(xù)申請所要求的所有可能的組合是必不可少的。對于使用了"一種"或"第一"其等效形式的權利要求，應理解為這些權利要求包括了一種或多種這類元素的組合，既不必需也不排除兩種或多種這類元素。參考文獻列表1.Rogulski,K.R.,Kim,J.H.,Kim,S.H.,andFreytag,S.O.GliomacellstransducedwithanE.co//CD/HSV-1TKfusiongeneexhibitenhancedmetabolicsuicideandradiosensitivity.Gewe772er"8:73-85,1997.2.Kim，J.H.,Kim，S.H.，Brown，S丄.，andFreytag,S.O.Selectiveenhancementbyanantiviralagentoftheradiation-inducedcellkillingofhumangliomacellstransducedwithHSV-tkgene.Ca"ceri^y.，54:6003-6056,1994.3.Kim，J.H.，Kim,S.H.，Kolozsvary,A.,Brown,S丄.，Kim，O.B.，andFreytag,S.O.Selectiveenhancementofradiationresponseofherpessimplexvirusthymidinekinasetransduced9Lgliosarcomacellsz>vzYroandv/vobyantiviralagents,/"f./i<3(i/a/.Oco/.5Zo/.P/yAS.,33:861-868,1995.4.Khil，M.,Kim，J.H.，Mullen,C.A.，Kim，S.H.，andFreytag，S.O,Radiosensitization'by5-fluorocytosineofhumancolorectalcarcinomacellsinculturetransducedwithcytosinedeaminasegene.C"".Ca"cer2:53-57，1996.5.Kim，S.H.，Kim，J.H.，Kolozsvary,A.，Brown,S丄.，andFreytag,S.O.Preferentialradiosensitizationof9LgliomacellstransducedwithHSV-TKgenebyacyclovir.J.7Vewraowco/"33:189-194,1997.6.Gable,M.，Kim，J.H.,Kolozsvary,A.，Khil，M.,andFreytag,S.O.Selectivez'wWvoradiosensitizationby5-fluorocytosineofhumancolorectalcarcinomacellstransducedwiththe五.co//cytosinedeaminasegene./"A/0腳/.編.41:883-887，1998.7.Rogulski，K,R.，Zhang,K.,Kolozsvary,A.,Kim，J.H.,andFreytag,S.O.Pronouncedantitumoreffectsandtumorradiosensitizationofdoublesuicidegenetherapy.C/f".C騰erL，3:2081-2088,1997.8.Kim,J.H.,Kolozsvary,A.,Rogulski,K.R.,Khil,M.,andFreytag,S.O.Selectiveradiosensitizationof9Lglioma,inthebraintransducedwithdoublesuicidefusiongene.C朋.</5We"Mw.4:364-369，1998.9.Xie,Y.，Gilbert,J.D.，Kim，J.H.，andFreytag，S.O.Efficacyofadenovims-mediatedCD/5-FCandHSV-1TK/GCVsuicidegenetherapiesconcomitantwithp53genetherapy.C7/w.C朋cer5:4224-4232,1999.10.Freytag，S.O.,Rogulski,K.R.，Paielli,D丄.，Gilbert,J.D.，andKim，J.H.Anovelthree-prongedapproachtoselectivelykillcancercells:concomitant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ATTCGCCGCGTTTACGGGCTACTTGCCAATACGGTGCGGTATCTGCAGTGC腦ll卯120012101220123012401250體200780003880.6勢溢也被51/57:a;Gc肌蕩cGTGccGGcccccGAcGGAcLugS咖MpGSpr-c1TcYGjToY-c1cccGoToM『boc」c加ResDaAFApHo-RARDI卯H3RDEpAoG3LNTGpTppGAcccccGGcccAGccGAGGcccGG1G}coo7lbLcGoG2c1cccc!Z!c1Gcoc:r燈9cGAGccccccGAGAccc匿c置GG國cc沉cGJcoGp.GEraAGRp5鄰oA乂o5JI34Gn3w『pGo，w2VwAoTsGGc3GGGwGToR8G2，GGSoD34ERwsGGAANYoDooI4Gp-A<uE7>4pAccGGccGc順加ccccccccGccccccG4FTFTDGpo4o34o4PoRT!2r-J1cG31o711311oLLADcGApsGcccc臥c置.GGccGcccGccccPi丁o2c1Gc5c12o1<uDYDFHMsRc5c雖My249ADT1G碰4"cGcccTOccAGc麵cGccRcfGTGArcSDcMewIcpcIAcscSp_5VGKGGcsMQc<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>SEQIDNO:6MetGiyThrGlyGlyMetAlaSerLysTrpAspGinLysGlyMetAsp151015lieAlaTyrGluGluAlaAlaLeuGlyTyrLysGluGlyGlyValPro202530lieGlyGlyCysLeuHeAsnAsnLysAspGlySerValL印GlyArg354045GlyHisAsnMetArgPheGinLysGlySerAlaThrLeuHisGlyGlu505560lieSerThrLeuGluAsnCysGlyArgLeuGluGlyLysValTyrLys65707580AspThrThrLeuTyrThrThrLeuSerProCysAspMetCysThrGly859095AlalielieMetTyrGlylieProArgCysValValGlyGluAsnVal100105110AsnPheLysSerLysGlyGluLysTyrLeuGinThrArgGlyHisGlu115'120.125ValValValValAspAspGluArgCysLysLyslieMetLysGinPhe130135140lieAspGluArgProGinAspTrpPheGluAsplieGlyGluGlyGly145150155160GlyGlyGlyGlyGlyGlyGlyAlaSerMetAlaSerTyrProCysHis165170175GinHisAlaSerAlaPheAspGinAlaAlaArgSerArgGlyHisSer180185190AsnArgArgThrAlaLeuArgProArgArgGinGinGluAlaThrGlu195200205ValArgLeuGluGinLysMetProThrLeuLeuArgValTyrlieAsp210215220GlyProHisGlyMetGlyLysThrThrThrThrGinLeuLeuValAla225230235240LeuGlySerArgAspAsplieValTyrValProGluProMetThrTyr245250255TipGinValLeuGlyAlaSerGluThrlieAlaAsnlieTyrThrThr260265270GinHisArgLeuAspGinGlyGlulieSerAlaGlyAspAlaAlaVal275280285ValMetThrSerAlaGinHeThrMetGlyMetProTyrAlaValThr290295300AspAlaValLeuAlaProHisValGlyGlyGluAlaGlySerSerHis305310315320AlaProProProAlaLeuThrliePheLeuAspArgHisProlieAla325330335PheMetLeuCysTyrProAlaAlaArgTyrLeuMetGlySerMetThr340345350ProGinAlaValLeuAlaPheValAlaLeulieProProThrLeuPro355360365GlyThrAsnlieValLeuGlyAlaLeuProGluAspArgHislieAsp370375380ArgLeuAlaLysArgGinArgProGlyGluArgLeuAspLeuAlaMet3853%395400LeuAlaAlalieArgArgValTyrGlyLeuLeuAlaAsnThrValArg405410415TyrLeuGinGlyGlyGlySerTipTipGluAspTrpGlyGinLeuSer420425430GlyThrAlaValProProGinGlyAlaGluProGinSerAsnAlaGly435440445ProArgProHisHeGlyAspThrLeuPheThrLeuPheArgAlaPro450455460GluLeuLeuAlaProAsnGlyAspLeuTyrAsnValPheAiaTrpAla465470475480LeuAspValLeuAlaLysArgLeuArgProMetHisValPhelieLeu485490495AspTyrAspGinSerProAlaGlyCysArgAspAlaLeuLeuGinLeu500505510ThrSerGlyMetValGinThrHisValThrThrProGlySerliePro515520525ThrlieCysAspLeuAlaArgThrPheAlaArgGluMetGlyGluAla530535540Asn545SEQIDNO:7MetThrGlySerThrlieAlaProThrThrAspTyrArgAsnThrThr151015AlaThrGlyLeuThrSerAlaLeuAsnLeuProGinValHisAlaPhe202530ValAsnAspTrpAlaSerLeuAspMetTrpTrpPheSerlieAlaLeu354045MetPheValCysLeulielieMetTrpLeulieCysCysLeuLysArg505560ArgArgAlaArgProProlieTyrArgProlielieValLeuAsnPro65707580HisAsnGluLyslieHisArgLeuAspGlyLeuLysProCysSerLeu85卯95LeuLeuGinTyrAsp100權利要求1.一種含有酵母胞嘧啶脫氨酶/突變的SR39I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶融合基因的核苷酸序列的分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸含有如SEQIDNO4所示的核苷酸序列。2、一種重組腺病毒，該重組腺病毒包括分離的多核苷酸，該分離的多核苷酸含有酵母胞嘧啶脫氨酶/突變的SR39I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶融合基因的核苷酸序列并且含有5型腺病毒的腺病毒死亡蛋白基因，其中，所述5型腺病毒的腺病毒死亡蛋白基因含有如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列。3、一種含有由分離的多核苷酸編碼的氨基酸序列的分離的多肽，所述分離的多核苷酸含有酵母胞嘧啶脫氨酶/突變的SR39I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶融合基因的核苷酸序列，該分離的多肽能夠?qū)⑶绑w藥物5氟胞嘧啶和9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤轉(zhuǎn)化成活性化療藥劑，該分離的多肽含有如SEQIDNO:6所示的氨基酸序列。4、一種包括分離的多核苷酸的重組腺病毒，所述分離的多核苷酸含有酵母胞嘧啶脫氨酶/突變的SR39I型單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶融合基因的核苷酸序列和5型腺病毒的腺病毒死亡蛋白基因，所述重組腺病毒含有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明包括一種能有效殺死哺乳動物癌細胞的新型病毒。該病毒產(chǎn)生一種可將無毒性前體藥物轉(zhuǎn)化成有效的化療藥劑的新型蛋白。這些化療藥劑局部地產(chǎn)生并幫助病毒殺死癌細胞以及使癌細胞對輻射敏感。在臨床前研究中已證明，無論單獨使用，還是與藥物前體治療和/或放射治療聯(lián)合使用，所述病毒都能有效殺死各種哺乳動物癌細胞。本發(fā)明可提供一種能安全有效地治療人類癌癥的方法。文檔編號A61K31/70GK101374853SQ200780003880公開日2009年2月25日申請日期2007年1月30日優(yōu)先權日2006年1月30日發(fā)明者D·柏耶利,K·巴頓,S·O·弗賴塔格,金在浩申請人:亨利福特保健系統(tǒng)公司