專利名稱：：作為sirna遞送媒介物的肽-dicer底物rna軛合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明一般涉及借助RNA千擾(RNAi)來治療疾患。更具體地^兌，本發(fā)明涉及小的抑制性核酸(siRNA)分子及其變體的靶向遞送，該siRNA及其變體能夠介導RNAi對抗基因的表達。這里所述的siRNA可軛合至一個或多個肽，其中軛合的肽有助于遞送，提高穩(wěn)定性，和/或減少siRNA的毒性。相關技術的描述將核酸遞送至動物和人(植物)是分子生物學和臨床研究的一個重要目的。更具體地說，當前在基因療法、反義療法以及RNA干擾(RNAi)至今，將核酸遞送至細胞中的最常見方法使用陽離子的脂質、電穿孔和病毒轉導以及應用機械的或生化的膜破裂和/或滲透(例如，應用洗滌劑、微注射或粒子槍)的許多方法。這些方法受各種缺點所困擾。例如，盡管陽離子脂質最常被用于DNA和小干擾RNA(siRNA)體外遞送，但是它們通常毒性大，因此不適于體內應用諸如治療疾病。至于病毒轉導，存在這^"的可能性，即用作遞送々某介物的復制缺陷病毒回復為野生型，因而變成了致病的。電穿孔飽受較差的基因轉移效率和細胞損傷的影響，因》匕限制了臨床應用。RNA干擾(RNAi)作為一種有前途的技術而出現，用于修飾才直物和動物細胞中的特異性基因表達，因此期望它提供有用的療法(工具)，以治療用修飾內源性基因表達所能治療的各種疾病或疾患。RNA千擾是指在動物中用短的干擾RNA(siRNA)介導序列特異性轉錄后基因沉默的過程，該siRNA通常是序列同源于部分靶向信使RNA(mRNA)的dsRNA。參見Fire等，淑,裂條,1998,和Hamilton等，Sc/置e廁:950-951,1999。在植物中的相應過程通常被稱作轉錄后基因沉默或RNA沉,f犬，在真菌中被稱作壓抑(quelling)。轉錄后基因沉默的過程被認為是一種進化性保守的細胞防御機制，用于阻止外來基因的表達，而且通常被不同的檔:物群和門所共享(Fire等，7>勵G麼f，75:358,1999)。將適宜的dsRNA引入細胞中導致內源性、同族mRNA(即，與^皮引入dsRNA共享實質上序列等同的mRNA)的破壞。dsRNA雙鏈體介導靶向基因沉默的機理被認為是兩步驟的過程。首先，dsRNA被核糖核酸酶III酶^皮稱作dicer斷裂為(降解為)小的干擾RNA(siRNA)(Hamilton等，同上；Berstein等，iVaf"化W9:363,2001)。衍生自dicer活性的短干^尤RNA主要地是具有兩個堿基3'懸垂的、長度為約21個至約23個核苷酸(Kim等，7Stowe說o&c/z.23(2):222,2005)。近來的證據表明，較長的dsRNA(長度為25-30個核普酸)可比定向于相同靶點、它們的較短對等物(21-mer)具有更大的基因沉默活性(Kim等，說o&c/2.23(2):222,2005)。此外，對于由21-merRNA介導siRNA基因沉默而言是頑固的某些靶點，可有效地用更長的27-mersiRNA雙鏈體沉默。這些更長siRNA雙鏈體的效能提高歸因于它們是Dicer核酸內切酶的底物(Kim等，A^we說o&c/2.23(2):222:2005)。因此，在治療劑方面，這些更長的dsRNA起到前體的作用，當用dicer加工時，它進入RISC復合體并且發(fā)揮靶向基因沉默介體的功能。第二步包括將siRNA摻入被稱作RNA誘導沉默復合體或"RISC"的多組分核酸酶復合體中。通過它們對siRNA雙鏈體反義鏈的互補性，RISC識別mRNA底物，而且通過結合到和啟動靶向mRNA的破壞(裂解)而實現基因表達的沉默。靶RNA的裂解發(fā)生在互補于siRNA雙鏈體反義鏈的區(qū)域中部(Elbashir等，Dev.75:188,2001)。在本領域中長期存在更佳工具和方法的需要，以便將核酸、肽和其他藥理學藥劑遞送至細胞，特別是鑒于現有細胞遞送技術受遞送試劑較差效率和/或毒性大所限制。存在改進方法和制劑的相關需要，以便以活性和持久的狀態(tài)遞送有效量，而且應用對選定細胞、組織或內腔無毒性的遞送々某介體從而介導基因表達的調節(jié)，這樣可改變靶向細胞的表型或疾病狀態(tài)。發(fā)明概述本發(fā)明通過提供特別是提高多核苷酸遞送的多肽/dicer底物dsRNA軛合物來作為治療疾病的治療性前藥遞送系統(tǒng)而解決了這些及其它相關需要。通過多肽遞送至細胞中后，前體siRNA被dicer酶切，使它從遞送肽中釋放出來，這樣隨后允許siRNA進入RISC復合物和靶特異性基因，用于轉錄后基因沉默。這里所描述的肽-dsRNA軛合物提供了一種有前途的新方法，用于改善dsRNA治療性前體進入細胞中的遞送，用于修飾內源性基因表達所能治療的廣泛疾病和疾患的治療。這里所描述的提高多核普酸遞送的多肽/dicer底物dsRNA輒合物通過延長它的體內壽命而有利地提高了dsRNA的保護和/或預防性能力。一方面，本發(fā)明提供了組合物，包括藥物組合物，其適合于對動物施用一種或多種雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述組合物包括一種或多種dsRNA分子和一種或多種肽，其中每個dsRNA分子包括約25至約30個堿基對，其中每個肽包括約5個至約40個氨基酸并且包括氨基酸序列KVLKQ(SEQIDNO:51)，而且其中所迷的dsRNA分子被輒合至所述的肽。在有些實施方案中，肽的氨基酸序列可以是選自由下列序列所組成的組KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:33);KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:42);VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:43);AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:44);KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:45);KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:46);KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:47);RKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:41);SYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:48);VYVYKVLKQ(SEQIDNO:49);YKVLKQ(SEQIDNO:50);和KVLKQ(SEQIDNO:51)。在其他的實施方案中，dsRNA具有2個或更多bp的5'懸垂，或者2個或更多bp的3'懸垂，其中該懸垂可以是在有義鏈和/或反義鏈中的一個或者兩個上。在更進一步的實施方案中，dsRNA沒有懸垂。在更進一步的實施方案中，dsRNA具有長度為約25bp至約29bp的鏈。在更進一步的實施方案中，dsRNA分子含有一個有義RNA鏈和一個反義RNA鏈，而且一個肽被輒合至反義鏈的5'端。另一方面，本發(fā)明提供了組合物，包括藥物組合物，其適合于對動物施用一種或多種siRNA分子，其中該組合物包括一種或多種siRNA分子和一種或多種肽，其中每個siRNA分子包括約25個至約30個4tt對的雙鏈核糖核苷酸，而且其中每個肽是約5個至約40個氨基酸并且包4舌^^酸序列KVLKQ(SEQIDNO:51)，而且其中所述肽被輒合至所述dsRNA。在一實施方案中，所述肽被輒合至結合到動物內細胞的分子。在另一實施方案中，所述siRNA分子包括同源于部分TNF-ot基因序列的序列。在另外其他的實施方案中，本發(fā)明提供了siRNA分子和那些siRNA的多肽軛合物，其中所述siRNA包括三條鏈，這里稱為A、Bl和B2(A:B1B2)，其中Bl和B2互補于A的非重疊區(qū)而且與其形成堿基只于(bp)。因此，對于這些實施方案中的siRNA分子，由B1和A退火所形成的雙鏈區(qū)是完全不同于由B2和A退火所形成的雙鏈區(qū)。A:B1雙鏈體可由"缺口(gap)"與A:B2雙鏈體分離開，所述"缺口"產生于在A鏈中被定^f立于A:B1雙鏈體與A:B2雙鏈體之間的至少一個未配對核苷酸，而且完全不同于在A、Bl和/或B2鏈其中一個或者兩個的3'端上的任何一個或多個未成對核苷酸?；蛘撸珹:B1雙鏈體可由"切口(nick)"與A:B2雙鏈體分離開，這樣在A鏈中沒有被定位于A:B1雙鏈體與A:B2雙鏈體之間的未配對核普酸，使得唯一的未配對核苷酸，如果有的話，是在A、B1和/或B2鏈其中一個或者兩個的3'端上。代表性地，根據本發(fā)明這些方面的siRNA包括總計約15個威基對至約40個堿基對；更代表性地，約18個至約35個堿基對；進一步更4戈表性地約20個至30個堿基對；和最代表性地21、22、23、24、25、26、27、28或29個堿基對。所述siRNA可任選地包括1個核香酸至5個核苷酸的單鏈3'懸垂。最代表性地，這種單鏈3'懸垂是1個、2個、3個或4個核苷酸。因此，本發(fā)明的這種三鏈siRNA包括一個A有義鏈或者一個A反義鏈，其中所述A鏈的長度為約15個核苷酸至約50個核苷酸；更代表性地所述A鏈的長度為約18個核苷酸至約40個核苷酸；進一步更代表性i也，所述A鏈的長度為約20個核香酸至約32個核苷酸；和最代表性地所述A鏈長度為21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或31個核苷酸。此外，本發(fā)明的三鏈siRNA包括兩個或多個B鏈，這里稱為，例如，B1和B2，其中每個B鏈互補于同源A鏈的非重疊區(qū)，而且其中第一B鏈(BI)是用一個切口或者一種或多種核苷酸的缺口與第二B鏈(B2)分離開。依賴于同源A鏈是否是有義鏈或反義鏈，每個B鏈將分別M義鏈或有義鏈。這里所述的每個B鏈(B1,B2，等)各自獨立地長度為約1個核苷酸至約25個核苷酸；更代表性地，長度為約4個核苷酸至約20個核香酸；進一步更代表性地長度為約5個核苷酸至約16個核苷酸；最代表性地長度為6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個核香酸。取決于所預期的確切應用，第一B鏈(B1)可以用切口或者用缺口與第二B鏈(B2)分離開。在那些實施方案中，其中B1和B2是用缺口分離開的，該缺口代表性地是約1個核苷酸至約25個核苷酸；更代表性地該缺口是約1個核苷酸至約15個核苷酸；進一步更代表性地該缺口是約1個核苷酸至約10個核苷酸；最代表性地該缺口是l個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個或9個核苷酸。每個B鏈可以，各自獨立地，用5'羥基(即，5'-0H)終止或者可以用5'磷酸(即5'-P04)終止。在其他方面，本發(fā)明提供了利用一種或多種有缺口或切口的雙鏈siRNA分子，和包括一種或多種有缺口或切口的雙鏈siRNA分子的《且合物的方法。在有些實施方案中，這里所述的方法包括下列步驟，(a)選取耙基因，其中所述耙基因是輩巴病毒基因，用于siRNA所介導的基因沉默；(b)設計和/或合成適宜的siRNA分子，用于耙病毒基因的siRNA所介導的基因沉默，其中所述siRNA分子包括有缺口或切口的雙鏈體，而且其中所述的缺口或切口出現在或者有義鏈中或者在反義鏈中；和(c)將所述siRNA施用于表達靶病毒基因的細胞，其中所述siRNA能夠特異性地結合至相應的靼病毒mRNA，因而降低它在細胞中的表達水平。在供選擇的實施方案中，這里所公開的方法包括下列的步驟，(a)選取用于siRNA所介導基因沉默的耙基因，其中所述耙基因是內源性基因和，任選地，其中所述內源性把基因包括一種或多種區(qū)別于相應野生型內源性基因的序列變異；(b)設計和/或合成適宜有缺口或切口的雙鏈siRNA分子，用于內源性把基因的siRNA所介導的基因沉默，其中所述siRNA分子包括有缺口或切口的雙鏈體，而且其中所述缺口或切口出現在或者有義鏈中或者在反義鏈中；和(c)將所述siRNA分子施用于表達內源性靶基因的細胞，其中所述siRNA能夠特異性地結合至相應的內源性靶mRNA,因而降低它在細胞中的表達水平。應當理解的是，本發(fā)明的方法不需要早期了解由有缺口或切口的雙鏈siRNA靶向的、每個可能基因變種的核苷酸序列。最初，siRNA的核普酸序列可以是選自耙基因的4呆守區(qū)。這里所公開的組合物和方法在減少各種靶病毒滴度方面是有用的，所述靶病毒包括，但不限于，逆轉錄病毒，諸如人免疫缺陷病毒(fflV)，以及呼吸道病毒，諸如人呼吸道合胞病毒，人偏肺病毒，人副流感病毒1，人副流感病毒2，人副流感病毒3，人葛']流感病毒4a，人副流感病毒4b,甲型流感病毒，乙型流感病毒，鼻病毒和丙型流感病毒。另一方面，本發(fā)明提供了一種抑制基因在動物中表達的方法，其包括對動物施用包括一種或多種雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子的組合物，該組合物包括藥物組合物，其中所述藥物組合物包括所述dsRNA分子和肽，其中每個dsRNA分子是約25個至約30個堿基對，其中每個肽是約5個至約40個M酸且，代表性地，包括氨基酸序列KVLKQ(SEQIDNO:51)，和其中每個dsRNA分子#:輒合至肽上。附圖和序列標識符的簡述圖1:具有多肽PN277被輒合至siRNAN163的dsCoP277nfR952和dsCoP277nflR950輒合物體外dicer消化產物的凝膠電泳。圖2:RP-HPLC分析非輒合siRNAN163雙鏈體的dicer核酸內切酶加工動力學。(A)未加工的N163雙鏈體，(B)用dicer核酸內切酶溫育1小時，(C)用dicer核酸內切酶溫育2.5小時，(D)用dicer核酸內切酶溫育5小時，和(E)用dicer核酸內切酶溫育7小時。圖3:RP-HPLC分析圖2中所示非軛合siRNAN163雙鏈體的dicer核酸內切酶加工動力學圖表。圖4:ESI畫MS分析非軛合N163的7小時dicer消化。圖5:ESI-MS分析具有多肽PN857被輒合至siRNAN163的、軛合siRNA的dicer核酸內切酶加工。(A)沒有dicer核酸內切酶存在的8小時空白對照和(B)8小時的dicer核酸內切酶消化軛合物。SEQE)NO:1是氨基酸序列KRRQRRR，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:2是氨基酸序列RQIKIWFQNRRMKWKK，一個適合于產生如這里所迷siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:3是氨基酸序列DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:4是氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性肽。SEQIDNO:5是氨基酸序列AAVLLPVLLPVLLAAP,—個適合于產生如這里所迷siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:6是^J^酸序列VTVLALGALAGVGVG,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:7是氨基酸序列GALFLGWLGAAGSTMGA,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性肽。SEQIDNO:8是氨基^列MGLGLHLLVLAAALQGA，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:9是tt酸序列LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:10是氨基酸序列GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性肽。SEQIDNO:11是氨基酸序列TPPKKKRKVEDPKKKK,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:12是氨基酸序列RRRRRRR，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:13是氨基酸序列KLALKLALKALKAALKLA,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:14是氨基酸序列GLFGAIAGFIENGWEG,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:15是氨基酸序列FFGAVIGTIALGVATA，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:16是氛基酸序列FLGFLLGVGSAIASGV，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:17是氨基酸序列GVFVLGFLGFLATAGS，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:18是氨基酸序列GAAIGLAWIPYFGPAA，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:19是氨基斷列HTGERPFMC,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:20是氨基酸序列ERPFVC，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:21是氨基酸序列SGERPFVC，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:22是氨基酸序列TGERPFIC,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:23是氨基酸序列RWHTGERPFLC，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:24是氨基酸序列WHTGERPFVC，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:25是氨基酸序列DRPFVC，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:26是氨基酸序列NKPFAC,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:27是氨基,列WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:28是氨基酸序列GKINLKALAALAKKIL,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:29是氛基酸序列RVIRVWFQNKRCKDKK，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:30是氨基酸序列GRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQGRKKRRQRRRPPQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:31是氨基酸序列GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:33是氨基酸序列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:35是核苷酸序列5'-AUGGUGUGGGUGAGGAGCACAUGGGUG-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:36是核香酸序列5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核普酸。SEQIDNO:37是氨基酸序列KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:41是氨基酸序列RKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:42是氨基酸序列KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:43是氨基酸序列VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:44是氨基酸序列AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:45是氨基酸序列KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性肽。SEQIDNO:46是氨基酸序列KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:47是氨基斷列KRSRKESYSVYVYKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:48是氨基酸序列SYSVYVYKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性肽。SEQIDNO:49是氨基酸序列VYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性肽。SEQIDNO:50是氨基酸序列YKVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:51是tt財列KVLKQ，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:52是氨基酸序列KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ,—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性肽。SEQIDNO:53是核苷酸序列5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCUU-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:54是核苷酸序列3'-UUCGGACAUGGAGUAGAUGAG-5',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:55是核苷酸序列5'-GCCUCUUCUCCUUCCUGAUCGUGdGdC-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:56是核苷酸序列3'-GUCGGAGAAGAGGAAGGACUAGCACCG-5'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:57是核苷酸序列5'-GCCUGCUGCACUUUGGAGUGAUCdGdG-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:58是核普酸序列3'-GACGGACGACGUGAAACCUCACUAGCC-5'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:59是核苷酸序列5'-CCCAUGUGCUCCUCACCCACACCdAT-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:60是核苷酸序列3'-GUGGGUACACGAGGAGUGGGUGUGGUA-5'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:61是核苷酸序列5'-ACCUCAUCUACUCCCAGGUCCUCdTdT-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苦酸。SEQIDNO:62是核苷酸序列3'-CAUGGAGUAGAUGAGGGUCCAGGAGAA-5'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQK)NO:63是核苷酸序列5'-GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核香酸。SEQIDNO:64是核芬酸序列5'-GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:65是核普酸序列5'-AGACAGCGACCAAAAGAAUUCGGdAdU-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:66是核苷酸序列5'-AUCCGAAUUCUUUUGGUCGCUGUCUdTdT-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:67是核苷酸序列5'-AUGAAGAUCUGUUCCACCAUUGAdAdG-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:68是核苷酸序列5'-CUUCAAUGGUGGAACAGAUCUUCAUdTdT-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:69是核苷酸序列5'-GAUCUGUUCCACCAUUGAAGAACdUdC-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-狀輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:70是核苷酸序列5'-GAGUUCUUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽扼合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:71是核苷酸序列5'-UUGAGGAGUGCUGAUUAAUGAUdCdC-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:72是核苷^列5'-GGAUCAUUAAUCAGGCACUCCUCAAdTdT-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:73是核苷酸序列5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG-3'，一個適合于產生如這里所述siRNA-肽軛合物的示例性多核苷酸。SEQIDNO:74是核普酸序列5'-CAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT-3',—個適合于產生如這里所述siRNA-肽輒合物的示例性多核普酸。SEQIDNO:75是一個示例性25-merB鏈序列5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3'的核苷酸序列，適合于產生如這里表2中所述siRNA-肽輒合物。SEQIDNO:76是一個示例性27-merA鏈序列3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC-5'的核苷酸序列，適合于產生如這里表2中所述siRNA-肽軛合物。SEQIDNO:77-132是示例性多核苷酸的A、Bl和B2鏈核苷酸序列，用于產生如這里表2中所述有缺口的siRNA-肽輒合物。SEQIDNO:34、38-40、133和166是示例性多核普酸的A、Bl和B2鏈核苷酸序列，用于產生如這里所述有切口的siRNA-肽軛合物。發(fā)明的詳細描述本發(fā)明是基于這樣的觀察，短干擾核酸(siNA)或其前體，與提高多核苷酸遞送的多肽聯合使用，當#:體內施用于哺乳動物例如人時顯示改善的遞送性、提高的穩(wěn)定性和/或減小的毒性。因此，這里所公開的提高多核苦酸遞送的多肽可以是天然多肽或人工多肽，它們被選擇，主要是因為它們能夠提高多肽包括siNA以及它們前體的細胞內遞送或才聶取。本發(fā)明的siNA和組合物可以一起混合或者復合于、或者軛合至一種或多種提高多核苷酸遞送的多肽，以便形成提高siNA細胞內遞送的組合物，相比于用棵siNA(即，沒有遞送提高多肽存在的siNA)接觸靶細胞而得到的遞送。提高多核苷酸遞送的多肽選擇和設計在本發(fā)明的有些實施方案中，提高多核苷酸遞送的多肽是組蛋白，或者它的多肽或肽片段、衍生物、類似物，或者它的扼合物。在這些實施方案中，siNA是與一種或多種全長組蛋白或至少部分地對應于組蛋白部分序列的多肽一起混合、復合、或者輒合，例如一種或多種下列的組蛋白組蛋白Hl、組蛋白H2A、組蛋白H2B、組蛋白H3或組蛋白H4，或者它們的一種或多種多肽片段或者衍生物，該片段或衍生物包括組蛋白的至少部分序列，代表性地至少5-10個或10-20個天然(native)組蛋白的連續(xù)殘基。在更詳細的實施方案中，siRNA/組蛋白混合物、復合物或輒合物基本上不含兩親性化合物。在其他詳細的實施方案中，與組蛋白或多肽混合、復合或軛合的siNA包括雙鏈RNA,例如具有30個或更少核普酸并且是短千擾RNA(siRNA)的雙鏈RNA。在示例性實施方案中，組蛋白提高多核苷酸遞送的多肽包括組蛋白H2B，如這里下面所描述的、提高多核苷酸遞送的多肽(稱為PN73)所示例的。在另外的詳細實施方案中，提高多核苷酸遞送的多肽可以是聚乙二醇化的，用以改善穩(wěn)定性和/或有效性，尤其是在體內施用情況下。在本發(fā)明的另外實施方案中，所選擇的或者合理設計的提高多核苷酸遞送的多肽包括兩親性氨基酸序列。例如，所選擇有用的、提高多核香酸遞送的多肽包括形成疏水性序列域或基序的多個非極性或疏水性氨基酸殘基，它們被連接至形成帶電荷的序列域或基序的多個帶電荷氨基酸殘基，得到兩親性肽。在其他的實施方案中，所選擇的、提高多核香酸遞送的多肽包括蛋白轉導域或基序，以及融合肽域或基序。蛋白轉導域是能夠插入且優(yōu)選地通過(transitthrough)細胞膜的肽序列。融合肽是去穩(wěn)定化(destablized)脂質膜(例如，質膜或環(huán)繞內體的膜)、在低pH下可被增強的肽。示例性融合肽域或基序可見于多種多樣的病毒融合蛋白中以及在其他蛋白例如成纖維細胞生長因子4(FGF-4)中。為了合理地設計本發(fā)明提高多核苷酸遞送的多肽，蛋白轉導域被用作有助于核酸通過質膜進入細胞的基序。在有些實施方案中，被轉運的核酸會^^皮包封在內體中。內體的內部具有低的pH值，導致融合肽基序去穩(wěn)定化內體膜。內體膜的去穩(wěn)定化和破裂使得siNA釋放至胞質中，siNA可與RISC復合物聯合，并定向于它的耙mRNA。蛋白轉導域實例，用于任選摻入本發(fā)明提高多核苷酸遞送的多肽，包括1.TAT蛋白轉導域(PTD)(SEQIDNO:1)KRRQRRR;2.穿膜肽PTD(SEQIDNO:2)RQIKIWFWNRRMKWKK;3.VP22PTD(SEQIDNO:3)DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD;4.卡波氏(Kaposi)FGF信號序歹'J(SEQIDNO:4)AAVALLPAVLLALLAP,和(SEQIDNO:5)AAVLLPVLLPVLLAAP;5.人(33整合素信號序列(SEQIDNO:6)VTVLALGALAGVGVG;6.gp41融合序列(SEQIDNO:7)GALFLGWLGAAGSTMGA;7.凱門魚f(Q7/附""craco辦/w)Ig(v)輕鏈(SEQIDNO:8)MGLGLHLLVLAAALQGA;8.hCT畫衍生肽(SEQIDNO:9)LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP;9.轉運體(Transportan)(SEQIDNO:10)GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKEL;10.Loligomer(SEQIDNO:11)TPPKKKRKVEDPKKKK;11.精氨酸肽(SEQIDNO:12)RRRRRRR;和12.兩親性才莫型肽(SEQIDNO:13)KLALKLALKALKAALKLA。病毒融合肽融合域的實例，用于任選摻入本發(fā)明提高多核苷酸遞送的多肽，包括1.流感HA2(SEQIDNO:14)GLFGAIAGFIENGWEG;2.仙臺Fl(SEQIDNO:15)FFGAVIGTIALGVATA;3.呼吸道合胞病毒Fl(SEQIDNO:16)FLGFLLGVGSAIASGV;4.HIVgp41(SEQIDNO:17)GVFVLGFLGFLATAGS;和5.埃博拉GP2(SEQIDNO:18)GAAIGLAWIPYFGPAA。在本發(fā)明的另外實施方案中，本發(fā)明提供了提高多核苷酸遞送的多肽，它們摻入DNA結合域或基序，在本發(fā)明的方法和組合物中有助于多肽-siNA復合物的形成和/或提高siNA的遞送。在此上下文中示例性DNA結合域包括各種"鋅指"域，如用于DNA結合調節(jié)性蛋白和在下面表1中所鑒別的其他蛋白所描述的(參見，例如，Simpson等，丄說o/.C/zem.28011-28018,2003)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>*本表說明了雙鏈DNA結合的保守鋅指基序，表征為C-x(2,4)-C-x(12)-H-x(3)-H(SEQIDNO:32)基序模式，根據本發(fā)明，它本身可被用于選擇和設計另外的提高多核苷酸遞送的多肽。**表1中所示序列Spl、Sp2、Sp3、Sp4、DrosBtd、DrosSp、CeT22C8.5和Y4pBlA.4在這里分別標為SEQIDNO:19、20、21、22、23、24、25和26。在構建本發(fā)明提高多核苷酸遞送的多肽方面有用的可選擇DNA結合域包括，例如，HIVTat蛋白序列的部分(見，下面的實施例)。在下面于此所描述的本發(fā)明示例性實施方案中，通過將任意前述的結構元件、域或基序組合為有效地介導已提高遞送的siNA進入耙細胞的單個多肽，可合理地設計和構建提高多核香酸遞送的多肽。例如，TAT多肽的蛋白轉導域被融合至被稱作HA2的流感病毒血凝素蛋白的N-末端20個氨基酸，以產生一個示例性提高多核苷酸遞送的多肽。在本發(fā)明中提供了各種其他的、提高多核芬酸遞送的多肽構建體，證明了本發(fā)明的概念廣泛地適用于創(chuàng)建和使用各種各樣裝配的有效提高多核苷酸遞送的多肽，用于提高siNA遞送。在本發(fā)明中另外的示例性提高多核苷酸遞送的多肽可以是選自下列的肽WWETWKPFQCRICMRNFSTRQARRNHRRRHR(SEQIDNO:27);GKINLKALAALAKKIL(SEQIDNO:28),RVIRVWFQNKRCKDKK(SEQIDNO:29)，30)，GEQIAQLIAGYIDIILKKKKSK(SEQIDNO:31)，聚Lys-Trp，4:1，MW20,000-50,000;和聚Orn-Trp，4:1,MW20,000-50,000。在這里的組合物和方法中有用的、另外的提高多核苷酸遞送的肽包括全部的或部分的蜂毒肽(mellitin)蛋白序列。其他的示例性提高多核苷酸遞送的多肽凈支確定于下面的實例中。這些肽的任意一個或者組合可以是選擇的或者組合的，以便產生有效的提高多核苷酸遞送的多肽試劑，以誘導或有助于本發(fā)明方法和組合物中siNA的細萬包內遞送。包括提高多核苷酸遞送的多肽、siRNA和脂質的組合物在更詳細的方面，包括一種或多種siRNA和提高多核苷酸遞送的多肽的混合物、復合物和/或輒合物可任選地與陽離子脂質如LIPOFECTIN⑧組合(例如混合或復合)。在此上下文中，在此預料不到地揭示了，僅被復合或軛合至siRNA的提高多核苷酸遞送的多肽實現了siNA的遞送，足以用RANi介導基因沉默。在此進一步地揭示了，siRNA/4是高多核苷酸遞送的多肽復合物或軛合物，當與陽離子脂質如lipofectin混合或復合時，顯示介導siNA遞送和基因沉默的更大活性。為了產生包括提高多核普酸遞送的多肽、siRNA和陽離子脂質的這些組合物，首先可將siRNA與肽一起混合在適合的媒介如細胞培養(yǎng)基中，然后向得到的混合物加入陽離子脂質，以形成siRNA/遞送JlU陽離子脂質組合物。任選地，首先將肽和陽離子脂質一起混合在適合的々某介如細胞培養(yǎng)基中，隨后加入siRNA以形成siRNA/遞送肽/陽離子脂質組合物。在本發(fā)明的這些方面，有用的陽離子脂質實例包括N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨，1,2-雙(油酰氧基)-3-3-(三甲基銨)丙烷，1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基幾乙基溴化銨，和二甲基雙十八烷基溴化銨，2,3-雙油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二曱基-l-丙基三氟乙酸銨鹽，1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基酰胺，5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基酰胺，四甲基四棕櫚酰精胺，四甲基四油烯基精胺，四甲基四月桂烷基精胺，四甲基四肉豆蔻基精胺和四甲基二油烯基精胺。DOTMA(N-[l-(2,3-二油酰MO丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨)，DOTAP(1,2-雙(油酰氧基)-3,3-(三甲基銨)丙烷)，DMRIE(1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羥乙基溴化銨)或DDAB(二甲基雙十八烷基溴化銨)。多價陽離子脂質包括脂精胺類(lipospermine)，更具體地說，DOSPA(2，3-二油烯氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二曱基-l-丙基三氟乙酸銨鹽)和DOSPER(1,3-二油酰絲-2-(6羧基精胺基)-丙基-酰胺，以及二-和四-烷基-四-曱基精胺類，包括但不限于TMTPS(四甲基四棕櫚酰精胺)，TMTOS(四甲基四油烯基精胺)，TMTLS(四曱基四月桂烷基精胺)，TMTMS(四曱基四肉豆蔻基精胺)以及TMDOS(四甲基二油烯基精胺)、DOGS(雙十八基-酰胺基甘氨酰精胺(TRANSFECTAM⑧)。其他的有用陽離子脂質被描述于，例如，美國專利號6,733,777;美國專利號6,376,248;美國專利號5,736,392;美國專利號5,686,958;美國專利號5,334,761和美國專利號5,459,127。陽離子脂質任選地是與非陽離子脂質，特別是中性脂質，組合在一起，這類中性脂質例如脂質諸如DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)，DPhPE(二植烷酰磷脂酰乙醇胺)或膽固醇。組成為DOSPA與DOPE的3:1(w/w)混合物或者DOTMA與DOPE(LIPOFECTIN,Invitrogen)的1:1(w/w)混合物的陽離子脂質組合物，通常在本發(fā)明的轉染組合物中是有用的。優(yōu)選的轉染組合物是指誘導基本上轉染更高真核細胞系的那些。短干擾核酸(siNA)的選擇、設計和合成在示例性的實施方案中，本公開的特征為包括小核酸分子，諸如短干擾核酸(siNA),短干擾RNA(siRNA)，雙鏈RNA(dsRNA)，微RNA(mRNA),或者短發(fā)夾RNA(shRNA)的組合物，所述小核酸分子混合或復合于，或者軛合至提高多核苷酸遞送的多肽。如這里所用的，術語"短干擾核酸"、"siNA"、"短干擾RNA"、"siRNA"、"短干擾核酸分子"、"短干4尤寡核苷酸分子"或者"化學改性的短干擾核酸分子"，是指任一核酸分子，它能夠抑制或下調基因表達或病毒復制，例如，憑借以序列特異性方式介導RNA干擾"RNAi"或基因沉默。在示例性實施方案中，siNA是一種雙鏈多核苷酸分子，包括自我互補的有義和序列或其一部分的核苷酸序列，而所述有義區(qū)包括對應于(即，它是在序列方面基本上等同于)乾核酸序列或其部分的核苷酸序列。"siNA"表示小干擾核酸，例如siRNA,即短長度的雙鏈核酸(或者任選地它的較長前體)，而且在靶細胞中不是不可接受的毒性。在本發(fā)明中，有用的siNA長度在有些實施方案中被優(yōu)化為大約21至23bp的長度。盡管如此，在有用的siNA包括siRNA長度方面沒有特別的限定。例如，siNA最初能夠以前體的形式而被呈遞(presented)至細胞，即實質上不同于siNA的最終或已加工形式，它將存在下來并在遞送至靶細胞或遞送之后發(fā)揮基因沉默的活性。siNA的前體形式，例如，可以包括前體序列元件，它們^皮加工、被降解、被改變、或者被切割于或遞送的時間之后，以便產生在細胞中是活性的siNA從而介導基因沉默。因此，在有些實施方案中，在本發(fā)明中有用的siNA具有的前體長度為，例如，大約100-200個堿基對，50-100個堿基對，或者小于約50個堿基對，它能在耙細胞中產生活性的、已加工的siNA。在其他的實施方案中，有用的siNA或siNA前體長度大約為10至49bp，15至35bp，或約21至30bp。隨即公開的示例性siNA分子是化學合成的。寡核苷酸是應用本領域已知的方案而合成的，例如，如描述于Caruthers等，(酶學中的方法)Me&ocfe2":3-19,1992;Thompson等，國際PCT公布號WO99/54459;Wincott等，M/c/e,c^"必i仏23:2677-2684,1995;Wincott等,M^/20cfcMo/.說o.74:59，1997;Brennan等，說ofec/mo/.6A.33-45,1998;以及Brennan,美國專利號6,001,311。本發(fā)明可化學改性的siNA分子的合成包括(a)合成兩個互補鏈的siNA分子；(b)在適合獲得雙鏈siNA分子的條件下，一起退火這兩個互補鏈。在另一實施方案中，兩個互補鏈siNA分子的合成是借助固相寡核苷酸合成。在另一實施方案中，兩個互補鏈siNA分子的合成是借助固相串聯寡核苷酸合成。寡核苷酸(例如，某些已修飾寡核苷酸或者缺少核糖核苷酸的寡核苷酸部分)是應用本領域中已知的方案合成的，例如，如描述于Caruthers等，(酶學中的方法)MW/20A五"^vrao/ogy"7:3-19,1992;Thompson等，國際PCT公布號WO99/54459;Wincott等，M^/e/c爿"Ai"23.'2677畫2684,1995;Wincott等，M"/w^yAfo/.說o.7(59,1997;Brennan等，說0&c/7"0/61:33-45,1998;和Brennan,美國專利號6,001,311。RNA包括本發(fā)明有些siNA分子的合成，遵循通用的方法，例如，如描述于Usman等,J.爿m.Oiem.Soc./(9久7845，1987;Scaringe等，M/d"c"化/&5433,1990;和Wincott等，A^de/c爿"A":2677-2684,1995;Wincott等,A/"/jo^A^/.說o.74:59,1997.在本發(fā)明的有些實施方案中，如上面所注釋的，應用提高多核苷酸遞送的多肽，以有助于遞送比常規(guī)siNA更大的核酸分子包括siNA大的核酸前體。例如，這里的方法和組合物可被用于提高代表"前體"的更大核酸遞送至所期望的siNA，其中所述前體氨基酸，在遞送至靶細胞之前、過程中或之后，可被切割或以其他方式加工，以便形成活性siNA,用于在靶細胞中調節(jié)基因表達。例如，siNA前體多核苷酸可被選為環(huán)形、單鏈的多核苷酸，具有兩個或多個環(huán)狀結構和一個包括自我互補的有義和反義區(qū)的莖，其中所述反義區(qū)包括互補于靶核酸分子中核苷酸序列或其一部分的核苷酸序列，而所述有義區(qū)具有對應于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列，和其中所述環(huán)形多核苷酸可在體內或在體外一W口工，以便產生能夠介導RNAi的活性siNA分子。在哺乳動物細胞中，長于30個堿基對的dsRNA能夠活化dsRNA依賴型激酶PKR和2'-5'-寡腺苷酸合成酶，這通常是由干擾素誘導的。已活化PKR用磷酸化翻譯因子真核起始因子2oc(elF2a)抑制一般的翻譯，而2'-5'-寡腺苷酸合成酶通過RNaseL的活化而引起非特異性mRNA的降解。借助于它們的小尺寸(特別是指非前體形式)，通常地小于30個威基對，和最常用的約17-19、19-21或21-23個tt對，本發(fā)明的siNA避免了干擾素應答的激活。相比于長dsRNA的非特異性作用，siRNA可在哺乳動物系統(tǒng)中介導選擇性基因沉默。發(fā)夾RNA，具有一個短的環(huán)和在莖中具有19至27個堿基對，同樣選擇性地沉lt^因的表達，所述基因同源于雙鏈莖中的序列。哺乳動物能夠將短發(fā)夾RNA轉化為siRNA，以便介導選擇性基因沉默。RISC介導具有互補于siRNA雙鏈體反義鏈的序列的單鏈RNA切割。靶RNA的切割發(fā)生在互補于siRNA雙鏈體反義鏈的區(qū)域中部。研究已表明，21個核普酸的siRNA雙鏈體當包含兩個核苷酸3'-懸垂時是最活潑的。此外，用2'-脫氧(2'-H)或2'-0-曱基核苷酸完全取代一個或兩個siRNA鏈實質上降低了RNAi的活性，然而已有報道，用脫氧核苷酸(2'-H)取代3'-末端siRNA懸垂核苷酸是可耐受的。研究已表明，用脫氧核糖核苷酸替換具有2個核苷酸3'懸垂的21-mersiRNA雙鏈體3'-懸垂片段，對RNAi活性沒有不利的影響。已有才艮道，在siRNA的每一端上用脫氧核糖核普酸替換多達4個核普酸是良好可耐受的，然而完全用脫氧核糖核苷酸取代導致沒有RNAi活性。在本發(fā)明的一些實施方案中，dsRNA具有2個或多個bp的5'懸垂，或者2個或多個bp的3'懸垂，這里所述懸垂可以是在有義或者反義鏈上。在一些實施方案中，dsRNA沒有懸垂。在一些實施方案中，dsRNA具有長度為27bp至29個bp。在一些實施方案中，dsRNA分子包舍一個有義RNA鏈和一個反義RNA鏈，而且肽被輒合至反義鏈的5'端?；蛘撸瑂iNA可被遞送，作為由編碼單個或多個siNA而且在革巴細胞中定向于它們表達的多核苷酸載體所表達的單個或多個轉錄產物。在這些實施方案中，在靶細胞中待被表達的siRNA最終轉錄產物的雙鏈部分可以是，例如，15個至49個bp,15至35個bp，或者約21至30個bp的長度。在示例性的實施方案中，siNA的雙鏈部分，這里雙鏈配成對，不限于已完全配對的核苷酸片段，而且可包含因錯配(相應的核苷酸不是互補的)的未配對、凸起(bulge)(在一條鏈上缺少相應的互補核苷酸)、懸垂等?？砂磁鋵Σ糠值某潭仁撬鼈儾桓蓴_siNA的形成。在更詳細的實施方案中，"凸起"可包括l至2個未配對核苷酸，而其中雙鏈配成對的siNA雙鏈區(qū)可包含約1至7個，或者約1至5個凸起。此外，在siNA雙鏈區(qū)中所包含的"錯配"部分可存在的數量為約1至7個、或約1至5個。最常見的錯配情況，其中一個核苷酸是鳥噪呤而另一個是尿嘧啶。這種錯配可歸因于，例如，在編碼有義RNA的對應DNA中從C到T、G到A或者它們混合的突變，此外其他的起因也考慮到了。此外，在本發(fā)明中，其中雙鏈配成對的siNA雙鏈區(qū)可包含在特定的大約數量范圍內的凸起和被錯配部分兩種。本發(fā)明siNA的末端結構可以是或者平頭的或者粘性的(懸垂的)，只要該siNA保留其沉默表達靶細胞基因的活性。粘性的(懸垂的)端結構不僅限于如別人所報道的3'懸垂。正相反，也可包括5'懸垂結構，只要它能夠誘導基因沉默作用例如用RNAi。另外，懸垂核苷酸的數量不限于已報道限度的2或3個核苷酸，還可以是任意的數量，只要該懸垂不損害siNA的基因沉默活性。例如，懸垂可包括約1至8個核苷酸，更常見地約2至4個核苷酸。具有粘性(懸垂的)端結構的siNA的長度可用在每個端上的已配對雙鏈體部分和任意懸垂部分來表達。例如一個帶有2-bp3'反義懸垂的25/27-mersiNA雙鏈體具有一個25-mer有義鏈和一個27-mer反義鏈，其中已配對的部分具有25bp長度。此外，由于懸垂序列可具有較低的對靶基因的特異性，所以它不必互補(反義的)或等同(有義的)于耙基因序列。此外，只要siNA能夠維持其在靶基因上基因沉默的作用，它可包含低分子量結構(例如天然的RNA分子諸如tRNA、rRNA或者病毒RNA，或者人工RNA分子)，例如，在一端的懸垂部分中。另外，siNA的末端結構可具有一個莖-環(huán)結構，這里雙鏈核酸其中一側的端是用連接子核酸例如連接子RNA所連接的。雙鏈區(qū)(莖-環(huán)部分)的長度可以是，例如，15至49bp，常見地15至35bp，和更常見i也約21至30bp。或者雙鏈區(qū)即在靶細胞中待被表達的siNA最終轉錄產物，其長度可以是，例如，大約15至49bp，15至35bp，或者約21至30bp的長度。當利用連接子片段時，在連接子長度方面沒有特別的限制，只要它不妨礙莖部分的配對。例如，對于莖部分的穩(wěn)定配對和DNA編碼之間重組的抑制而言，連接子部分可具有三葉草式tRNA結構。即使連接子具有也許妨礙莖部分配對的長度，有可能的是，例如構建包括內含子的連4妄子部分，這樣在前體RNA加工為成熟RNA的過程該內含子被切除，藉此使得莖部分配對。至于莖-環(huán)siRNA,不帶環(huán)狀結構的RNA每一端(頭或尾)可具有低分子量RNA。如上所述，這些較低分子量RNA可包括天然的RNA分子，諸如tRNA、rRNA或者病毒RNA，或者人工RNA分子。siNA還可包括具有互補于扭核酸分子中核苷酸序列或其一部分的核香酸序列的單鏈多核苷酸(例如，這種siNA分子不要求在siNA分子中存在對應于靶核酸序列或其一部分的核苷酸序列)，這里該單鏈多核苷酸可進一步地包括末端磷酸基團，諸如5'-磷酸(見，例如Martinez等，Ce〃.7^:563-574,2002,和Schwarz等，Mo/ea//『Ce〃70:537-568,2002)，或者如這里所用的，術語siNA分子不限于僅包含天然RNA或DNA的分子，還包括化學改性的核普酸和非核苷酸。在有些實施方案中，本發(fā)明的短干擾核酸分子缺少包含2'-羥基(2'-OH)的核苷酸。在有些實施方案中，短干擾核酸不要求存在介導RNAi、具有2'-羥基基團的核苷酸，因此本發(fā)明的短千擾核酸分子任選地不包括任何的核糖核苷酸(例如具有2'-OH基團的核苷酸)。但是，這種不要求在siNA分子中存在核糖核香酸以支持RNAi的siNA分子，可具有被連4婁的一個連接子或多個連接子，或者其他被連接或被聯合的基團、部分，或者包含一種或多種帶有2'-OH基團的核苷酸鏈。任選地，siNA分子可在約5、10、20、30、40或50%的核苷酸位置上包括核糖核苷酸。如這里所用的，術語siNA含義為等同于用于描述核酸分子的其他術語，該核酸分子能夠介導序列特異性RNAi，例如短干擾RNA(siRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)、微-RNA(mRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、短干擾寡核苷酸、短干擾核酸、短干擾修飾寡核苷酸、化學改性siRNA、轉錄后基因沉默RNA(ptgsRNA),及其他。在其他的實施方案中，用在本發(fā)明中的siNA分子可包括單獨的有義和反義序列或區(qū)，其中所述有義和反義區(qū)是由核苷酸或非核苷酸連4婁子分子共價地連接的，或者是由離子相互作用、氫鍵、范德華力相互作用、疏水性相互作用和/或堆積作用而交替地、非共價地連接的。"反義RNA"是具有互補于耙基因mRNA序列的RNA鏈，而且被認為通過結合至乾基因mRNA而誘導RNAi。"有義RNA"具有互補于反義RNA的序列，并且纟皮退火至它的互補反義RNA以便形成siRNA。這些反義和有義RNA已可用RNA合成儀常規(guī)地合成。如這里所用的，術語"RNAi構建體"是用于本說明書始終的通用術語，包括小干擾RNA(siRNA)、發(fā)夾RNA和在體內可被切割以形成siRNA的其他RNA類型。這里的RNAi構建體還包括表達載體(亦被稱作RNAi表達載體)，所述表達載體能夠引起在細胞中形成dsRNA或發(fā)夾RNA的轉錄物，和/或能體內產生siRNA的轉錄物。任選地，siRNA包括單鏈或雙鏈siRNA。siHybrid分子是一種具有類似于siRNA功能的雙鏈核酸。不同于雙鏈RNA分子，siHybrid是由一個RNA鏈和一個DNA鏈組成的。優(yōu)選地，所述RNA鏈是反義鏈即結合至乾mRNA的鏈。由DNA和RNA鏈雜交所產生的siHybrid具有一個已雜交的互補部分和優(yōu)選地至少一個3'懸垂端。應用于本發(fā)明中的siNA可從兩個單獨的寡核苷酸(這里一個鏈是有義鏈和另一個是反義鏈)進行裝配，其中所述反義和有義鏈是自我互補的(即，每個鏈包括互補于另一個鏈中核普酸序列的核苷酸序列；諸如反義鏈和有義鏈形成雙鏈體或雙鏈結構，例如其中雙鏈區(qū)是約19個堿基對)。反義鏈可包括互補于耙核酸分子中核普酸序列或其一部分的核苷酸序列，而有義鏈可包括對應于靶核酸序列的核苷酸序列或其一部分的核苷酸序列。或者，siNA可從單個寡核苷酸進行裝配，其中siNA的自我互補有義和反義區(qū)是用基于核酸或基于非核酸的連接子方式而連接的。在另外的實施方案中，用于根據本發(fā)明方法和組合物的細胞內遞送的siNA可以是帶有雙鏈體、不對稱雙鏈體、發(fā)夾或不對稱發(fā)夾二級結構的多核苷酸，具有自我互補有義和反義區(qū)，其中所述反義區(qū)包括互補于單獨靶核酸分子或其一部分的核香酸序列的核香酸序列，而有義區(qū)包括對應于靶核酸序列或其一部分的核普酸序列。在進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了三鏈的siNA,及其組合物，它們;故混合或復合于或者輒合至一種或多種提高多核苷酸遞送的多肽。這里所述siRNA分子包括三條鏈，A、Bl和B2(A:B1B2)，其中B1和B2鏈互補于同源A鏈的非重疊區(qū)而且與其形成堿基對(bp)，其中Bl鏈是用切口或者用缺口與對應的B2鏈分離開。這里所述siRNA分子能夠啟動RNA干擾級聯，導致靶信使RNA(mRNA)的表達修飾。這里所述siRNA分子包括三條或多條鏈諸如，示例，A、Bl和B2(A:B1B2),其中Bl和B2鏈互補于A的非重疊區(qū)而且與其形成堿基對(bp);其中由Bl和A退火所形成的雙鏈區(qū)是區(qū)別于且不重疊于由B2和A退火所形成的雙鏈區(qū)；和其中A:B1雙鏈體是通過一個"缺口"與A:B2雙鏈體分離開的，所述缺口由A鏈中至少一個未配對核苷酸所產生，它位于A:B1雙鏈體與A:B2雙鏈體之間，而且它不同于A、Bl、和/或B2鏈其中一者或者兩者的3'端上^ft意一個或多個未配對核苷酸?；蛘?，本發(fā)明中所述siRNA分子包括三條或多條鏈諸如，示例，A、Bl和B2(A:B1B2)，其中Bl和B2鏈互補于A的非重疊區(qū)而且與其形成堿基對(bp);其中由Bl和A退火所形成的雙鏈區(qū)是區(qū)別于且不重疊于由B2和A退火所形成的雙鏈區(qū)；和其中A:B1雙鏈體是由一個A:B1雙鏈體與A:B2雙鏈體之間的"切口"與A:B2雙鏈體分離開的。在一實施方案中，A:B1B2包括，總計，約14個堿基對至約40個堿基對。在這種實施方案中，A代表有義鏈而B1B2代表反義鏈。A長度為15-50個核苷酸，而Bl和B2各自獨立地為1-20個核苷酸；而且Bl+B2的組合長度為約8個核香酸至約40個核苷酸。在另一實施方案中，A:B1B2包括，總計，約16個威基對至約40個堿基對。在這種實施方案中，A代表有義鏈而B1B2代表反義鏈。A長度為20-40個核苷酸，而Bl和B2各自獨立地為1-15個核脊酸；而且Bl+B2的組合長度為約10個核普酸至約30個核苷酸。在另一實施方案中，A:B1B2包括，總計，約14個威基對至約40個堿基對。在這種實施方案中，A代表反義鏈而B1B2代表有義鏈。A長度為15-50個核苷酸，而Bl和B2各自獨立地為1-20個核苷酸；而且Bl+B2的組合長度為約8個核苷酸至約40個核苷酸。在另一實施方案中，A:B1B2包括，總計，約16個堿基對至約40個*對。在這種實施方案中，A代表反義鏈而B1B2代表有義鏈。A長度為20-40個核苷酸，而Bl和B2各自獨立地為1-15個核苷酸；而且Bl+B2的組合長度為約10個核苷酸至約30個核苷酸。如上所示，這里所公開的三鏈siRNA代表性地包括總計約15個tt對至約40個堿基對；更代表性地，約18個至35個堿基對；更加代表性地約20至30個堿基對；和最代表性地21、22、23、24、25、26、27、28或29個g對。在有些實施方案中，siRNA可任選地包括l個核苷酸至5個核苷酸的單鏈3'懸垂。最代表性地，這種單鏈3'懸垂是1、2、3或4個核苷酸。這種siRNA包括一個A有義鏈或者一個A反義鏈，其中A鏈的長度為約15個核苷酸至約50個核苷酸；更代表性地，A鏈的長度為約18個核苷酸至約40個核苷酸；更加代表性地，A鏈的長度為約20個核苷酸至約32個核苷酸；和最代表性地A鏈長度為21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31個核苷酸。本發(fā)明的siRNA另外地包括兩條或多條B鏈，這里稱為，例如B1和B2,其中每條B鏈互補于同源A鏈的非重疊區(qū)，而且其中第一B鏈(B1)可以通過切口或者一個或多個核苷酸缺口與第二B鏈(B2)分離開。取決于同源A鏈是有義鏈還毛良義鏈，每條B鏈分別M義鏈或者有義鏈。這里所述每條B鏈(B1，B2，等)各自獨立地長度為約1個核苷酸至約25個核苷酸；更代表性地長度為約4個核苷酸至約20個核香酸；更加代表性地長度為約5個核苷酸至約16個核苷酸；最代表性地長度為6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。一旦合成A、Bl和B2鏈就^皮退火，以形成siRNA分子。退火反應是由互補性決定的。第一B鏈(B1)可以通過切口或者缺口與第二B鏈(B2)分離開。因此，在A鏈上(因此在B鏈上不存在同源核苦酸)的核苷酸仍然是未配對而且在siRNA分子中出現缺口。缺口的大小取決于位于B1和B2鏈之間、A鏈中未配對核苦酸的數量。如果A鏈堿基與B1鏈和B2鏈配對，切口^f皮形成，這樣在A鏈上沒有核苷酸在Bl鏈與B2鏈之間的區(qū)域內保持未配對。在那些其中Bl和B2被缺口分開的實施方案中，所述缺口代表性地是約1個核苷酸至約25個核苷酸；更代表性地所述缺口是約1個核香酸至約15個核苷酸；更加代表性地所述缺口是約1個核香酸至約10個核苷酸；最代表性地所述缺口是l、2、3、4、5、6、7、8或9個核苷酸。每個B鏈可各自獨立地用5'羥基(即，5'-OH)終止或者可用5'磷酸(即，5'-P04)終止。代表性地，合成的RNA分子包含末端3'和5'輕基。因此，.第一B鏈的3'-OH可^l并置于緊鄰第二B鏈的5'-OH。在有些實施方案中，應用第二B鏈是較理想的，其中5'末端包含一個5'-P04，這樣第一B鏈的3'-OH被并置于緊鄰第二B鏈的5'-P04。在這種實例中，憑借將P04基團加至單鏈(ss)RNA分子、利用RNA激酶的催化活性、用本領域中熟知且易于獲得的方法，實現將磷酸添加至B鏈的5'端。在激酶反應完成后，A、B1和B2鏈彼此退火，這樣B鏈被導向5'B1pB23'。下面的siRNA分子代表了具體的、非限定性示例實施方案的帶缺口或切口siRNA分子，它們適合^支輒合至一種或多種如這里上述的多肽。i.缺口雙鏈體siRNA分子這里所述的有些示例性缺口雙鏈體siRNA分子是基于一個25-mer有義B鏈序列5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG隱3'(SEQIDNO:75)和一個27-mer反義A鏈序列3'國TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC國5'(SEQIDNO:76)。或者示例性缺口雙鏈體siRNA分子是基于一個25-mer反義B鏈序歹'J5'-GGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAUG-3'(SEQIDNO:75)和一個27-mer有義A鏈序列3'-TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC國5'(SEQIDNO:76)。這種示例性siRNA分子包括三條鏈A、Bl和B2(A:B1B2)，其中Bl和B2互補于A的非重疊區(qū)而且與其形成磁羞對(bp);其中由Bl和A退火所形成的雙鏈區(qū)不同于由B2和A退火所形成的雙鏈區(qū)；和其中A:Bl雙鏈體是由A鏈中一個"缺口"與A:B2雙鏈體分離開的，所述缺口是由A鏈中一個或多個未配對核普酸所產生的，它位于A:B1雙鏈體與A:B2雙鏈體之間，而且它不同于A、Bl和/或B2鏈其中一者或者兩者的3'端上任意一個或多個未配對核苷酸。在這些實施方案的有些方面，A:B1B2是由共約14至約24個堿基對組成；其中A鏈(有義)為約19個核苷酸至約27個核苷酸；而B1(反義)鏈和B2(反義)鏈各自獨立地是約1個核苷酸至約18個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約13個核苷酸至約23個核苷酸。在這些實施方案的其他方面，A:B1B2是由共約16至約22個堿基對組成；其中A鏈(有義)為約19個核苷酸至約23個核苷酸；而B1(反義)鏈和B2(反義)鏈各自獨立地是約1個核苷酸至約15個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約13個核苷酸至約23個核苷酸。在這些實施方案進一步的方面，A:B1B2是由共約14至約24個tt對組成；其中A鏈(反義)為約14個核苷酸至約27個核苷酸；而B1(有義)鏈和B2(.有義)鏈各自獨立地是約1個核苷酸至約18個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約18個核苷酸至約24個核苷酸。在這些實施方案另外其他的方面，A:B1B2是由共約14至約22個堿基對組成；其中A鏈(反義)為約16個核苷酸至約22個核苷酸；而Bl(有義)鏈和B2(有義)鏈各自獨立地是約1個核苷酸至約15個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約18個核苷酸至約22個核脊酸。根據這些實施方案的代表性siRNA表示于表2中。表2代表性siRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>應當認識到的是，A、Bl和B2鏈的準確核苷酸序列可以變化，條件是siRNA分子包括兩段連續(xù)的堿基對，每段連續(xù)的堿基對是用至少一個核苷酸的缺口所分開，該缺口對應于單個反義A鏈中或單個有義A鏈中一個或多個未配對堿基。ii.切口雙鏈體siRNA分子在下面列出的序列中"p"表示在帶有5'磷酸連接至B2鏈的RNA鏈中的切口。在下面列出的序列中"*"表示在沒有5'磷酸連接至B2鏈的RNA鏈中的切口。"p"和"*"還表示缺口的位置。在所有情況下，A鏈保持完整(無切口的)~在A鏈中出現的缺口將保留siRNA分子的正確序列排列(由于序列同源性)。在下面列出的序列中"r，(黑斜體)表示在那個位置上存在核糖胸腺嘧啶核苷(rT)分子。在下面列出的序列中"T"(黑體)表示在那個位置上存在脫氧核糖胸腺嘧咬核苷(dT)分子。連續(xù)的鏈，即沒有缺口或切口的那些，被在下面劃線。1.對照的dsRNA有義GGAUCUUAUUUCUUCGGAGTT-3'(SEQIDNO:133)反義CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT隱3，(SEQIDNO:134)2.沒有5'磷酸的切口有義鏈BlB2有義GGAUCUUAUUU承CUUCGGAGTT-3'(SEQIDNO:135和136)反義CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT-3'(SEOIDNO:137)A3.帶有5'磷酸的切口有義鏈BlB2有義GGAUCUUAUUUpCUUCGGAGTT國3,(SEQIDNO:138和139)反義CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT-3'fSEOIDNO:140)A4.帶有5'磷酸的切口有義鏈，兩條鏈全部用rT分子修飾BlB2有義GGA7iC7TA77Tt)C7TCGGAGTT國3'(SEQIDNO:141和142)反義C71CCGAAGAAArAAGATXXTT-3,(SEQIDNO:143)A5.沒有5'磷酸的切口有義鏈，兩條鏈全部用rT分子修飾BlB2有義GGA7lC7TArmCTTTOGAGTT-3'(SEQIDNO:144和145)反義C7TCGAAGAAATAAGA7TCTT-3'(SEQIDNO:146)A6.沒有5'磷酸的切口反義鏈，反義鏈全部地用rT分子4務飾，有義鏈未被修飾(對照)A有義GGA7UrrA7TTTCrTTOGAGTT-3'(SEQIDNO:147)反義C7lCCGAAGAA*ArAAGA7lCCTT-3'(SEQIDNO:148和149)BlB27.帶有5'磷酸的切口反義鏈，反義鏈全部地用rT分子修飾，有義鏈未凈皮修飾(對照)A有義GGA7C7TA7TJlCriTOGAGTT-3'(SEQIDNO:150)反義C7€CGAAGAApArAAGA7€CTT-3'(SEQIDNO:151和152)BlB28.ID:切口S-WT:帶有切口有義鏈的雙鏈體BlB2有義GGAUCUUAUUU*CUUCGGAGTT-3'(SEQIDNO:153和154)反義CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT-3'(SEQIDNO:155)A9.ID:切口S-WT:帶有切口有義鏈的雙鏈體；B2被5'磷酸化BlB2有義GGAUCUUAUUUpCUUCGGAGTT-3'(SEQIDNO:156和157)反義CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT-3'(SEQIDNO:158)A10.ID:切口S-RT:帶有切口有義鏈的雙鏈體；全部地被rTM'務飾BlB2有義GGA2T7TA7Tr*CrK:GGAGTT-3'(SEQIDNO:159和160)反義CTTCGAAGAAArAAGAKXTT-3'(SEQIDNO:161)A11.ID:切口S-RT:帶有切口有義鏈的雙鏈體；B2被5'磷酸化；全部地-故rT修飾BlB2有義GGA7CTrA7Tri)CJTCGGAGTT畫3'(SEQIDNO:162和163)反義CTTCGAAGAAArAAGATUCTT-3,(SEQIDNO:164)A12.ID:切口A-RT:帶有切口反義鏈的雙鏈體；全部地被rT修飾A有義GGAHC7TA7T7CT71CGGAGTT-3'(SEQIDNO:165)反義C7lCCGAAGAA承ArAAGA7i:CTT陽3'(SEQIDNO:166和34)BlB213.ID:切口A-RT:帶有切口反義鏈的雙鏈體；B2被5'磷酸化；全部地被rT修飾A有義GGA7€rrA7TTCTTlCGGAGTT-3'(SEQIDNO:38)反義C7TCGAAGAApArAAGAyiCCTT隱3,(SEQIDNO:39和40)BlB2iii.以連接子閉合的缺口或切口雙鏈體siRNA分子在另一實施方案中，根據本發(fā)明的缺口或切口雙鏈體siRNA分子可以是以連接子分子"閉合的"(closed)。所得到的分子應當更穩(wěn)定，即具有更高的Tm，而且對宿主細胞內的降解更具抗性。根據本發(fā)明，這種連接子的實例包括，但不限于，無堿基的連接子，例如無堿基的核苷酸，無磁基的丙二醇和許多小C6-型連接子。非核苷酸連接子可以是由無堿基的核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質、聚烴或者其他的聚合化合物(例如，聚乙二醇諸如具有2至100個乙二醇單元那些)所組成。具體的實例包括下列所描述的那些，Seela和Kaiser等,A^c/ezc^4c/必1990和A^c/e/c^4c^to.":3113,1987;Cload和Sch印aitz,丄爿柳.C/2e附.Soc."3:6324,1991;Richardson和Sch印artz,CTje附.Soc."3:5109,1991;Ma等，她c/ezcylc/Ai"":2585,1993和B/oc/ze/w^o^":1751,1993;Durand等，A^d^c爿"'A78:6353,1990;McCurdy等，A^c/柳Z血&M/c/eW<^/0:287,1991;Jschke等，T^ra/z^fraw丄故.3(301,1993;Ono等，說oc/emZ對7^:9914:1991;Arnold等，國際公布號WO89/02439;Usman等，國際公布號WO95/06731;Dudycz等，國際公布號WO95/11910以及Ferentz和Verdine,乂m.C/zew.Soc."3:4000，1991。"非-核苷酸"進一步地意味著能夠被摻入核酸鏈代替一個或多個核苷酸單元，包括糖和/或磷酸取代，并且使顯示它們酶活性的堿基保留的任意基團或化合物。所述基團或化合物可以是無堿基的，即它不包含通常被識別的核苷酸堿基，諸如腺苷，鳥嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶或胸腺嘧啶，例如在糖的Cl位上的。所述連接子的存在不會顯著地干擾RISC的活性。優(yōu)選地，施用包含連接子的本發(fā)明缺口或切口雙鏈體siRNA分子可引起基本上相同水平的RNA干擾，誠如當利用相應的無連接(non-linked敗口或切口雙鏈體siRNA分子所見到的。最優(yōu)選地，施用包含連接子的本發(fā)明缺口或切口雙鏈體siRNA分子可引起比當利用相應的無連接(non-linked)缺口或切口雙鏈體siRNA分子時RNA干擾水平的提高。小抑制性核酸(siNA)的化學改性在非限定性實例中，化學改性核苷酸引入至核酸分子中在克服被外源性遞送的天然RNA分子固有的體內穩(wěn)定性和生物利用度的潛在限制方面提供了一種強大的工具。例如化學改性核酸分子的應用能夠使較低劑量的特殊核酸分子獲得〗現定的治療效果，因為化學改性核酸分子在血清中趁向于具有更長的半衰期。另外，某些化學改性利用靶向于特定細胞或組織和/或改善核酸分子的細胞攝取而可以改善核酸分子的生物利用度。因此，即使化學改性核酸分子的活性相比于天然核酸分子被減少，例如，當相比于全部RNA核酸分子時，但^f務飾核酸分子的總活性因改善穩(wěn)定性和/或分子的遞送而可以是大于該天然分子的。與天然未修飾siNA不同，化學改性siNA還可使在人中激活干擾素活性的概率最小。這里所述siNA分子，本發(fā)明siNA分子的反義區(qū)可包括一個在所述反義區(qū)3'-端的硫代磷酸核苷酸間鍵合。在這里所述siNA分子的任一實施方案中，反義區(qū)可包括約一個至約五個在所述反義區(qū)5'-端的硫代磷酸核苷酸鍵合。在這里所述siNA分子的任一實施方案中，本發(fā)明siNA分子的3'-末端核苷酸懸垂可包括在核酸糖、堿基或骨架上被化學改性的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。在這里所述siNA分子的任一實施方案中，3'-末端核普酸懸垂可包括一個或多個通用堿基核糖核苷酸。在這里所述siNA分子的任一實施方案中，3'-末端核苷酸懸垂可包括一個或多個非環(huán)式核苷酸。例如，在非限定性實例中，本發(fā)明的特征是一種在一條siNA鏈中具有約1、2、3、4、5、6、7、8個或更多硫代磷酸核苷酸間鍵合的化學改性短干擾核酸(siNA)。在另一實施方案中，本發(fā)明的特征是一種在兩條siNA鏈中都各自具有約1、2、3、4、5、6、7、8個或更多硫代麟酸核苦酸間鍵合的化學改性短干擾核酸(siNA)。硫代磷酸核苷酸間鍵合可存在于siNA雙鏈體的一條或兩條寡核苷酸鏈中，例如在反義鏈、有義鏈或兩條鏈中。本發(fā)明的siNA分子包括一個或多個在有義鏈、反義鏈、或者兩條鏈的3'-端、5'-端或兩者上的硫代磷酸核苷酸間鍵合。例如，本發(fā)明的一種示例性siNA分子包括約1至約5個或更多(例如約1、2、3、4、5或更多個)在有義鏈、反義鏈、或者兩條鏈的5'-端上的連續(xù)硫代磷酸核苷酸間鍵合。在另一個非限定性實例中，本發(fā)明的一種示例性siNA分子包括一個或多個(例如l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多個)在有義鏈、反義鏈、或者兩條鏈中的嘧咬硫代磷酸核苷酸間鍵合。在另外一個非限定性實例中，本發(fā)明的一種示例性siNA分子包括一個或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多個)在有義鏈、反義鏈、或者兩條鏈中的嘌呤硫代磷酸核香酸間鍵合。siNA分子可包括一個環(huán)形核酸分子，其中該siNA的長度為帶有約18至約23(例如，約18、19、20、21、22或23)個威基對的約38至約70(例如，約38、40、45、50、55、60、65或70)個核苷酸，其中該環(huán)形寡核苷酸形成了具有約19個威基對和2個環(huán)的啞鈴形結構。環(huán)形siNA分子含有兩個環(huán)狀基序，其中該siNA分子的一個或兩個環(huán)狀部分是可生物降解的。例如，本發(fā)明的環(huán)形siNA分子被設計成這樣，siNA分子環(huán)狀部分的體內降解可產生帶有3'-末端懸垂(例如包括約2個核苷酸的3'-末端核香酸懸垂)的雙鏈siNA分子。存在于siNA分子中、優(yōu)選地在siNA分子反義鏈中、而且任選地在有義和/或反義與有義兩條鏈中的修飾核苷酸，包括具有類似于天然核糖核苷酸性質或特性的修飾核苷酸。例如，本發(fā)明的特征是siNA分子包括具有諾森(Northern)構象(例如，諾森(Northern)假旋轉環(huán)，參見例如，Saenger，《核酸結構的基本原理》(尸〃"cz》/^o/A^c/^'c爿czd^Sfra"w")，Springer-Verlag主編，1984)的修飾核苷酸。因此，存在于本發(fā)明siNA分子中、優(yōu)選地在本發(fā)明siNA分子反義鏈中、而且任選地在有義和/或反義與有義兩條鏈中的化學改性核苷酸，是抗核酸酶降解的，同時保持介導RNAi的能力。具有諾森構象的非限定性核苷酸實例包括鎖核酸(LNA)核普酸(例如，2'-0，4'-C-亞甲基-(D-核糖呋喃糖基)核苷酸)、2'-曱氧乙fL&(MOE)核苷酸、2'-曱基-硫基-乙基、2'-脫氧-2'-氟代核苷酸、2'-脫氧-2'-氯代核苷酸、2'-疊氮基核苷酸以及2'-0-曱基核苷酸。雙鏈siNA分子的有義鏈可具有一個末端帽部分例如在反義鏈3'-端、5'-端或3'與5'-兩個端上的倒置脫氧堿基部分。非限定性軛合物的實例包括在Vargeese等2003年4月30日提交的美國專利申請序列號10/427,160(以其全部內容加入這里作為參考)中，包括其附圖中，所描述的輒合物和配體。在另一實施方案中，軛合物通過可生物降解的連接子而被共價地連接到化學改性的siNA分子。在一實施方案中，軛合物分子是在化學改性siNA分子的有義鏈、反義鏈或兩條鏈的3'-端處被連接的。在另一實施方案中，軛合物分子是在化學改性siNA分子的有義鏈、反義鏈或兩條鏈的5'-端處被連接的。在另一實施方案中，軛合物分子是在化學改性siNA分子的有義鏈、反義鏈或兩條鏈的3'-端與5'-端兩個端、或者它們的任意組合處被連接的。在一實施方案中，本發(fā)明的軛合物分子包括這樣一種分子，它有助于化學改性siNA分子遞送至生物體系例如細胞中。在另一實施方案中，被連接到化學改性siNA分子的軛合物分子是聚乙二醇、人血清白蛋白或者一種能介導細胞攝取的細胞受體的配體。Vargeese等在2003年7月10日公開的美國專利申請公開號20030130186和2004年6月10日公開的美國專利申請公開號20040110296中，描述了本發(fā)明所預期到的、能被連接至化學改性siNA分子的具體軛合物分子實例。本發(fā)明siNA分子的所用軛合物類型以及軛合物程度可凈皮評估，關于改善siNA構建體的藥代動力學狀況、生物利用度和/或穩(wěn)定性，同時保持siNA介導RNAi活性的能力。因此，本領域的技術人員可以篩選用各種構建體修飾的siNA構建體，從而確定是否該siNA軛合復合物擁有已改善的性質同時保持例如本領域普遍知道的在動物才莫型中介導RNAi的能力。siNA可進一步地由將siNA有義區(qū)連接到siNA反義區(qū)的核香酸、非核苷酸、或混合核苷^/非核苷酸連接子所構成。在一實施方案中，核苷酸連接子可以是長度>2個核普酸例如長度為約3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸的連接子。在另一實施方案中，核苷酸連接子可以是一種核酸適體。如這里所用的"適體"或"核酸適體"是指一種特異性地結合至靶分子的核酸分子，其中該核酸分子具有序列，該序列包括一個以它的天然i殳定、靶分子所識別的序列?；蛘撸m體可以是一種結合到靶分子的核酸分子，而該耙分子不是天然地結合至核酸的。靶分子可以是感興趣的任意分子。例如，適體可被用于結合到蛋白的配體結合域，藉此防止天然配體與該蛋白相互作用。這是一個非限定性的實例，而且本領域的人員會認識到應用本領域普遍已知的:f支術可;f艮容易地產生其他實施方式(參見，例如，Gold等,ifev.":763,1995;Brody和Gold,說o&c/"o/.74:5:2000;Sun,Q/:Qp/w.Afo/.J72M2:100,2000;Kusser,/.說o&c/2"o/.74:27,2000;Hermann和Patel,S"ewce2S7:820,2000;以及Jayasena,C/Z剛ca/C/2e脂對745:1628,1999)。非核苷酸連接子可以是由無堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質、聚烴或其他聚合的化合物所組成(例如，聚乙二醇諸如具有2至100個乙二醇單元的那些)。具體的實例包括下列所描迷的那些Seela和Kaiser,池c/ez'cXc/^sto.78:6353,1990和她c/e/c75:3113，1987;Cload和Schepartz,爿附.C/2e附."3:6324,1991;Richardson和Schepartz,爿m.C/2em.Soc.1/3:5109,1991;Ma等，A^c/e/c乂c/Ai饑2/:2585,1993和萬,0c/2e附W7":H51,1993;Durand等，A/wc/e,cZc,^yi饑/&6353,1990;McCurdy等，//"c/my/fi^&M/c/eo打Vfey70:287，1991;Jschke等，7^ra/^draw3(301,1993;Ono等，說oc/je抓;^v30:9914:1991;Arnold等，國際公布號WO89/02439;Usman等，國際公布號WO95/06731;Dudycz等，國際公布號WO95/11910以及Ferentz和Verdine,丄乂附.Oem.Soc.7":4000,1991。"非-核苷酸"進一步地是指任意基團或化合物，能被摻入到核酸鏈中代替一個或多個核苷酸單元，包括糖和/或磷酸取代，而且使得保留的堿基顯示它們的酶活性。所述的基團或化合物可以是無堿基的，即它不含有常見的核苷酸堿基，例如在糖的CI位上的諸如腺苷、烏噤呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。施用包括提高多核苷酸遞送的多肽/siNA輒合物的組合物本發(fā)明遞送提高的多肽/siNA軛合物可被用于治療如這里所討論的或其他本領域已知的疾病或病癥。為了治療特殊的疾病或病癥，本發(fā)明遞送提高的多肽/siNA軛合物可以被施用于患者或者可被施用于對于本領域4支術人員而言是顯然的其他適宜細胞，在適于治療的條件下各自地或與一種以上化合物相組合地。例如，這里所述遞送提高的多肽/siNA輒合物可以被用于與其他已知的治療和/或治療劑聯合，以便治療各種各樣的病癥，特別是病毒感染?？梢子谂c本發(fā)明遞送提高的多l(xiāng)i/siNA軛合物相聯合的、其他治療劑的非限定性實例包括，例如，酶的核酸分子；別構核酸分子；反義的、誘殺物或適體核酸分子；抗體諸如單克隆抗體；小分子；以及其他有機的和/或無枳i的化合物，包括金屬、鹽和離子。因此，本發(fā)明描述了在一種可接受的載運體諸如穩(wěn)定劑、緩沖劑等中包括一種或多種遞送提高的多肽/siNA軛合物的組合物。所述遞送提高的多肽/siNA軛合物可以與或沒有與穩(wěn)定劑、緩沖劑等一起、以任一標準的方式^皮施用于患者，以便形成一種適于治療的組合物。當期望應用脂質體遞送機制時，可遵循形成脂質體的標準方案。本發(fā)明的組合物還可配制成制劑并且用作口服給藥的片劑、膠嚢劑或酏劑，直腸給藥的栓劑，可注射給藥的無菌溶液和混懸液，任一地與或沒有與本領域已知的其他化合物一起。遞送提高的多肽/siNA軛合物制劑包括上述化合物的鹽，例如酸加成鹽諸如鹽酸、氫溴酸、乙酸以及苯磺酸的鹽。藥物組合物或制劑是指以適合施用例如系統(tǒng)性施用至細胞或患者諸如人中的形式的組合物或制劑。適合的形式，部分地，取決于應用或進入的途徑，例如口服的、透皮的或者通過注射的。這些形式不應當阻止所述組合物或制劑達到靶細胞(即，帶負電荷核酸期望遞送的細胞)。例如，被注射至血流中的藥物組合物應當是可溶解的。其他因素是本領域已知的，并且包括防止組合物或制劑發(fā)揮其作用的諸如毒性和形式考慮。單獨的報道基因表達構建體可以與一種或多種遞送提高的多肽/siNA軛合物一起共轉染。特定遞送提高的多l(xiāng)^siNA軛合物減少每個所預期基因變體表達水平的能力，可以通過對比來自用或沒有用修飾siNA轉染細胞的已檢測報道基因活性來確定。核酸分子遞送的方法被描述于Akhtar等，7>朋血Ce/Z說a2:139,1992;"反義寡核香酸治療劑的遞送策略(DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics)"(主編Akhtar,1995);Maurer等，Mo/.她wi6r.歷o/129-140,1999;Hofland和Huang,7fo"必ooA:尸/2畫,/.737:165-192,1999;以及Lee等,爿CS外m;7.&k752:184-192,2000。Sullivan等，PCTWO94/02595,進一步描述了遞送酶核酸分子的通用方法。這些方案都可用于實際上任一核酸分子的遞送。如這里所用的，術語"系統(tǒng)性施用，，是指包括血流中藥物的體內系統(tǒng)性吸收或積聚隨后分布整個全身。引起系統(tǒng)性吸收的給藥途徑包括，不限于靜脈的、皮下的、腹膜內的、吸入、口服的、肺內的和肌內的。這些給藥途徑中每種都將所期望的帶負電荷聚合物，例如核酸，暴露于可進入的患病組織。藥物進入循環(huán)的速度已被證明是分子量或大小的函數。核酸分子可^皮施用于細胞，以對本領域技術人員而言已知的各種各樣方法，但不限于，包封在脂質體中；以離子電滲法；或通過摻入其他i某介體諸如水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米膠嚢、以及生物粘附性微玉泉；或經蛋白質性栽體(O'Hare和Normand,國際PCT公布號WO00/53722)。或者，核^/媒介物組合可經直接注射或經應用輸液泵而被局部地遞送。本發(fā)明核酸分子的直接注射可進行，無論是皮下、肌內還是皮內的，通過應用標準針頭與注射器方法，或以無針頭技術諸如在Conry等，C/i".Owceri"5:2330-2337,1999,和Barry等，國際PCT公布號WO99/31262中所描述的那些。這里所公開遞送提高的多肽/siNA軛合物可被用作藥劑。藥劑預防、調節(jié)患者中疾病狀態(tài)的出現或治療患者中的疾病狀態(tài)(以某種程度減輕癥狀，優(yōu)選地全部的癥狀)。如這里所用的，短語"藥學上可接受的制劑"是指包括允許本發(fā)明核酸分子有效地分布在最適合于它們所期望活性的實際位置中的組合物或制劑。適于與本發(fā)明核酸分子配制成制劑的非限定性試劑的實例包括P-糖蛋白抑制劑(諸如PluronicP85),它可提高藥物進入CNS(Jolliet-Riant和Tillement,Fm"必附.C//m.尸/2^附aco/.":16-26,1999);可生物降解的聚合物，諸如在大腦內植入后持續(xù)釋放遞送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)樣"求(Emerich等，Ce〃rra朋;/a"f8:47-58,1999)(AlkermesInc.,Cambridge,Mass);以及載藥的納米粒子，諸如由聚氰基丙烯酸丁酯所制造的那些，它們可遞送藥物通過血腦屏障而且能改變神經元攝取機理(尸ragiVeMra/wyc/20/7/2"mac0/說o/尸，/2/a^v23:941-949,1999)。應用包括本發(fā)明化合物的脂質體或其他藥物載運體可潛在地使藥物局部化，例如，在某些組織類型中，諸如網狀內皮系統(tǒng)(RES)的組織中。同樣地，能促進藥物與細胞諸如淋巴細胞和巨噬細胞的表面相締合的脂質體制劑是有用的。通過利用巨噬細胞的特異性以及淋巴細胞免疫識別異常細胞，這種方法可提供藥物對靶細胞的遞送提高。本發(fā)明核酸分子遞送策略的其他非限定性實例包括在Boado等，,尸/w簡.S7..1308-1315,1998;Tyler等，4刀:280誦284,1999;Pardridge等，iWAS":5592-5596,1995;Boado,A/v.Dn/gZ)e//veo^":73-107,1995;Aldrian-Herrada等，iV"c/e/cA:z必26:4910-4916,1998;以及Tyler等，iWJS96:7053-7058,1999中所描述的材料。本發(fā)明另外的特征是包括表面修飾脂質體組合物的應用，所述脂質體含有聚(乙二醇)脂質(PEG"務飾，或循環(huán)時間長的脂質體或隱形脂質體)。這些制劑提供了一種增加藥物在靶組織中積聚的方法。這類藥物載運體通過單核噬菌細胞系統(tǒng)(MPS或RES)而抗調理作用和消除，藉此使得血液循環(huán)時間更長而且提高包封藥物的組織暴露。Lasic等，Wev.95:2601-2627,1995;Ishiwata等，C/ae亂萬w//.W:1005-1011,1995。這種脂質體已被證明可能通過在血管再生的靶組織中外滲和捕獲而在腫瘤中選擇性地積聚。Lasic等，267:1275-1276,1995;Oku等，說oc&附.說op/2".723S:86-90,1995。循環(huán)時間長的脂質體提高了DNA和RNA的藥代動力學和藥效學，特別是相比于已知在MPS組織中積聚的常少見陽離子脂質體丄iu等，J.說o/.O^/w.42:24864-24870,1995;Choi等，國際PCT公布號WO96/10391;Ansell等，國際PCT公布號WO96/10390;和Holland等，國際PCT公布號WO96/10392。循環(huán)時間長的脂質體還可能更大程度地保護藥物不受核酸酶降解，相比于陽離子脂質體，因為它們避免在代謝積極主動的MPS組織如肝和脾中積聚的能力。本發(fā)明還包括為貯藏或施用而制備的組合物，它們包括在藥學上可接受載運體或稀釋劑中的藥學上有效量的所期望化合物。治療應用的可沖妄受載運體或稀釋劑是藥學領域中熟知的，而且被表述在，例如，《Remington，sPharmaceuticalSciences》，Mack出版7〉司，A.R.Gennaro主編，1985年。例如，本發(fā)明可提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染色劑和調味劑。這些包括苯曱酸鈉、山梨酸和對羥基苯甲酸酯。此外，本發(fā)明還可使用抗氧化劑和助懸劑。藥學上有效的劑量是預防、抑制疾病狀態(tài)的發(fā)生或治療疾病狀態(tài)(以某種程度緩解癥狀，優(yōu)選地所有的癥狀)所需的劑量。藥學上有效劑量取決于疾病的類型、所用的組合物、給藥的途徑、所治療哺乳動物的類型、所考慮特定哺乳動物的身體特征、共同存在的藥物以及在醫(yī)學領域中技術人員可認識到的其他因素。通常，數量為O.lmg/kg至100mg/kg體重/日的活性成分被施用，取決于帶負電荷聚合物的效力。本發(fā)明還包括為貯藏或施用而制備的組合物，它們包括在藥學上可接受載運體或稀釋劑中的藥學上有效量的所期望化合物。遞送核酸分子的#卜充或互補方法被描述于，例如，Akhtar等，7^m^Ce〃祝o.2:139,1992;《反義寡核苷酸治療劑的遞送策略》，Akhtar主編，1995;Maurer等,A/o/Mem^說o/.76:129-140,1999;Hofland和Huang,/fa"必.五x/.尸/anwaco/.737:165-192,1999;以及Lee等,爿GS^/wp.Sm752:184-192,2000。Sullivan等，國際PCT^^布號WO94/02595，進一步描述了遞送酶核酸分子的一般方法。這些方案可凈皮利用以便補充或互補本發(fā)明中所考慮的實際上任意核酸分子的遞送。核酸分子和提高多核苷酸遞送的多肽可用本領域技術人員已知的各種方法來施用于細胞，包括但不限于，在制劑中的施用，該制劑僅包括siNA和提高多核普酸遞送的多肽，或者它進一步地包括一種或多種額外的組份，諸如藥學上可接受的載運體、稀釋劑、賦形劑、佐劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑等。在某些實施方案中，siNA和/或提高多核苷酸遞送的多肽可被包封于脂質體中，以離子電滲法施用；或摻入其他媒介物諸如水凝膠、環(huán)糊精、可生物降解的納米膠嚢、生物粘附性微球或蛋白質性載體(參見，例如，O'Hare和Normand,國際PCT公布號WO00/53722)。或者，核^/肽/i某介物組合可經直接注射或經應用輸液泵而被局部地遞送。本發(fā)明核酸分子的直接注射可進行，無論是皮下、肌內還是皮內的，通過應用標準針頭與注射器方法，或以無針頭技術諸如在Conry等，C//".C朋cw5:2330-2337,1999,和Barry等，國際PCT公布號WO99/31262中所描述的那些。本發(fā)明的組合物可^皮有效地用作藥劑。藥劑預防、調節(jié)患者中疾病狀態(tài)或其他不利狀況的發(fā)生或嚴重性，或者治療患者中疾病狀態(tài)或其他不利狀況(以可檢測或可測量程度緩解一種或多種癥狀)。因此，在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物和方法，特征是存在或施用一種或多種多核酸，主要地一種或多種siNA，與提高多核苷酸遞送的多肽組合、復合或輒合，任選地用藥學上可4妄受載運體諸如稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑等配制成制劑。本發(fā)明通過提供短干擾核酸(siNA)分子而滿足了另外的目的和優(yōu)點，該siNA分子調節(jié)受治療者中特殊疾病狀態(tài)或其他不利狀況相關的基因表達。代表性地，siNA靶向于一種以提高水平被表達的基因，該提高的水平作為一種與受治療者疾病狀態(tài)或不利狀況相關的起因或貢獻因素。在此狀況下，siNA有效地下調該基因的表達至預防、緩解或者減少一種或多種相關疾病癥狀嚴重性或復發(fā)的水平。或者，對于耙基因的表達不必作為疾病或不利狀況的結果或后果而纟皮提高的各種獨特疾病模型，但是革巴基因下調通過降低基因的表達(即，降低靼基因的選定mRNA和/或蛋白產物的水平)而引起治療性結果?；蛘?，本發(fā)明的siNA可被靶向，以便降低一個基因的表達，這可引起"下游"基因的上調，該"下游"基因表達是由靶基因的一種產物或活性負調節(jié)的。在示例性實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法是有用的，作為治療性工具調節(jié)腫瘤壞死因子-a(TNF-a)從而治療或預防類風濕關節(jié)炎(RA)的癥狀。在此狀況下，本發(fā)明進一步地提供了關于應用小核酸分子、用RNA干擾(RNAi)調節(jié)TNF-a的表達和活性方面有用的化合物、組合物和方法。在更詳盡的實施方案中，本發(fā)明提供了小核酸分子諸如短千擾核酸(siNA),短干擾RNA(siRNA)，雙鏈RNA(dsRNA),微RNA(mRNA),和短發(fā)夾RNA(shRNA)分子，以及相關的方法，在調節(jié)TNF-a和/或TNF-a基因表達從而預防或緩解哺乳動物受治療者中RA癥狀方面它們是有效的。在這些和相關治療性組合物和方法中，例如通過提供增強對核酸酶體內降解的抗性，和/或通過改善細胞的攝取，化學改性siNA的應用常常會改善改性siNA的性質，相比于天然siNA分子的性質。如根據這里所>開內容可易于確定的，具有多重化學改性的有用siNA會保留它們的RNAi活性。因此，本發(fā)明的siNA分子提供了各種治療性、診斷性、靶確認、基因組研究、遺傳工程以及藥物基因組應用的有用試劑和方法。本發(fā)明的此siNA可通過任何方式給藥，如以透皮方式或局部注射(如在銀屑病斑塊位點局部注射以治療銀屑病，或注射到患銀屑病關節(jié)炎或RA的病人的關節(jié)內)。在更詳細的實施方案中，本發(fā)明提供了制劑和方法用以施用治療有效量的定向抗TNF-a的mRNA的siNA，可有效地下調TNF-aRNA并因此減少或預防一種或多種TNF-a相關的炎性狀態(tài)。提供了可比較的方法和組合物，它們靶向一個或多個不同的與動物受治療者中所選取的疾病狀態(tài)相關的基因，包括許多已知其表達可異常上升，可作為與所選疾病狀態(tài)相關的病因或影響因素的許多基因中的任何一個。本發(fā)明的siNA/提高多核苷酸遞送多肽混合物可與其它用于靶疾病狀態(tài)的標準治療法聯合使用，例如與對抗炎性疾病如RA或銀屑病有效的治療劑l關合。在此背景下的有用的和有效的試劑的例子包括非甾體類抗炎藥(NSAID)、曱氨喋呤、金化合物、D-青霉胺、抗瘧藥、柳氮磺胺吡咬、糖皮質激素和其它TNF-a中和試劑如infliximab和entrac印t。本發(fā)明的帶負電荷的多核苷酸(如RNA或DNA)可以任何標準方式向患者施藥，可與或不與穩(wěn)定劑、緩沖劑等形成藥物組合物。當希望利用脂質體遞送機制時，可遵循形成脂質體的標準實驗方法。本發(fā)明的組合物也以用于口腔給藥的片劑、膠嚢或酏劑，用于直腸給藥的栓劑，可注射給藥的滅菌溶液、懸浮液或其它為本領域所熟知的組合物形式配制并^f吏用。本發(fā)明也包括此處描述的組合物的藥學可接受的制劑。這些制劑包括以上化合物的鹽，例如酸加成鹽如鹽酸、氬溴酸、乙酸和笨璜酸的鹽。藥理學組合物或制劑指組合物或制劑采取適合施藥的形式，例如向細胞或患者包括例如人的系統(tǒng)施藥。合適的形式部分取決于使用方式或進入途徑，例如口腔、透皮或通過注射。該形式應不阻礙組合物或制劑到達輩巴細胞(例如期望帶負電荷的核酸向其給藥的細胞)。例如，注射到血流中的藥理學組合物應為可溶解的。其它因素為本領域熟知，包括應考慮毒性。"系統(tǒng)給藥，，意為藥物在血流中的體內系統(tǒng)吸收或積累，隨后向全身分布?？梢鹣到y(tǒng)吸收的給藥途徑包括但不限于靜脈、皮下、腹膜內、吸入、口腔、肺內和肌內。這些給藥途徑中的每種都可將期望的帶負電荷的聚合物如核酸暴露于可接近的患病組織。已知藥物進入循環(huán)系統(tǒng)的速率是其分子量或大小的函數。利用脂質體或其它包括本發(fā)明化合物的藥物載體可潛在地局部化藥物，例如在特定組織類型中，如網狀內皮系統(tǒng)(RES)。能夠使藥物與例如淋巴和巨噬細胞表面偶聯的脂質體制劑也是有用的。此方法通過利用巨噬細胞和淋巴免疫識別非正常細胞如癌癥細胞的特異性優(yōu)勢而可增強向靶細胞的遞送。"藥學可接受的制劑"意為使本發(fā)明的核酸分子能夠向最適合它們的所需活性的機體部位有效分配的組合物或制劑。適合與本發(fā)明的核酸分子共同作為制劑的試劑的非限制性例子包括P-糖蛋白抑制劑(如PluronicP85)，它可促進藥物進入CNS(Jolliet-Riant和Tillement，C//".尸/z^Awaco/.16-26，1999);可生物降解的聚合物，如用于腦內植入后的持續(xù)釋放遞送的聚(DL-丙交酯-乙交酯)共聚物微球(Emerich，D.F.等，Ce〃7V謹/to&47-58,1999)(AlkermesInc.,Cambridge,Mass);栽藥的納米顆粒，如由聚氰基丙烯酸正丁酯制造的顆粒，它們可穿過血腦屏障給藥并可改變神經吸收才幾制(Prag.JVeMrap砂c/2op/jam^co/說o/.尸矽c/j/^o^3:941-949，1999)。其它用于本發(fā)明的核苷酸分子的給藥策略的非限制性例子包括以下文獻內描述的Boado等，/.尸/j"m.5W.S7:1308-1315，1998;Tyler等，F5^S丄故.4":280-284，1999;Pardridge等，92:5592-5596,1995;Boado，爿dv.Dn/gDe//ve^yiev.":73—107，1995;Aldrian—Herrada等，A^c/e,cA:/A化&26:4910-4916,1998;和Tyler等，尸AMSt/&4.7053-7058，1999。本發(fā)明也包括為貯藏或給藥而制備的組合物，其包括在藥學可接受的載運體或稀釋劑中的藥學有效量的所需化合物。用于治療用途的可接受的載運體和稀釋劑為藥劑學領域所熟知的，例如在Remington'sPharmaceuticalSciences,Mack出版^>司，A.R.Ge皿aro編，1985中有描述，在此以引用的方式并入本文。例如，可能提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和增味劑。這些包括苯甲酸鈉、山梨酸和對羥基苯曱酸酯。另外，也可能使用抗氧卩t劑和助懸劑。藥學有效劑量是指預防、抑制疾病狀態(tài)的出現或對其治療(將癥狀緩解至一定程度，較佳地為所有癥狀)所需要的劑量。藥學有效劑量取決于疾病類型、所用組合物、給藥途徑、所治療哺乳動物的類型、所考慮的特定哺乳動物的生理特征、并行用藥和熟悉醫(yī)學行業(yè)的人知道的其它因素。根據帶負電荷聚合物的效價，一般使用0.1mg/kg到100mg/kg體重/天活性成份的量。本發(fā)明的提高遞送多肽/siNA扼合物及其制劑可通過吸入或噴霧經口腔、局部、腸道外用藥，或以含傳統(tǒng)的非毒性藥學可接受的載運體、佐劑和/或賦形劑的劑量單位制劑經直腸給藥。此處使用的術語腸道外包括經皮、皮下、血管內(例如靜脈)、肌內或鞘內注射或輸注或類似技術。另外，提供了一種藥物制劑，其包括本發(fā)明的核酸分子和一種藥學可接受的載運體。本發(fā)明的一種或多種核酸分子可與一種或多種非毒性藥學可接受的栽運體和/或稀釋劑和/或佐劑聯合，且如有需要與其它活性成份聯合。含本發(fā)明的核酸分子的藥物組合物可采取適合口腔用藥的形式，例如為片劑、含片、錠劑、水或油懸浮液、可分散粉末或沖劑、乳液、硬或軟膠嚢、糖漿或酏劑。計劃做口腔使用的組合物可按照任何本行業(yè)熟知的方法制備，用于生產藥物組合物，且此組合物可含一種或多種甜味劑、增味劑、著色劑或防腐劑，以提供上品的和適口的藥劑制備物。片劑含活性成份外加非毒性的藥學可接受的適合片劑生產的賦形劑。這些賦形劑可為例如惰性稀釋劑，如碳酸鈞、碳酸鈉、乳糖、磷酸鉤或磷酸鈉；制粒劑和崩解劑，例如玉米淀粉或褐藻酸；粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。片劑可不包衣或用已知的技術包衣。在一些情形下可用已知技術進行某種包衣，以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而提供較長時期的持續(xù)作用。例如，可利用延時材料如單硬脂酸甘油酯或甘油二硬脂酸酯。用于口腔使用的制劑也可采用硬明膠膠嚢形式，此處的活性成份混合了惰性稀釋劑，例如碳酸釣、磷酸鉤或高冷土，或以軟明膠膠嚢形式，此處的活性成份混合了水或油介質，例如花生油、液體石蠟或橄欖油。懸浮液包含混合了活性成份和適合懸浮液生產的合適的賦形劑。此賦形劑為助懸劑，例如羧曱基纖維素鈉、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、西黃蓍膠和阿拉伯膠；分散劑或濕潤劑，可為天然石庠脂，例如卵磷脂或環(huán)氧烷經與脂肪酸的縮合產物，如聚氧乙烯硬脂酸，或環(huán)氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合物，如十七乙烯氧十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或環(huán)氧乙烷與脂肪酸和己糖醇書f生的偏酯的縮合物如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或環(huán)氧乙烷與從脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合物，例如聚乙烯脫水山梨醇單油酸酯。懸浮液也可含一種或多種防腐劑，例如乙基或正丙基對羥基苯甲酸酯，一種或多種著色劑，一種或多種增味劑，以及一種或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。油性懸浮液可通過在植物油中懸浮活性成份而配制，例如在花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油中，或在礦物油中，如液體石蠟。油性懸浮液可含增稠劑，例如蜂蠟、硬石蠟或十六醇?？杉犹鹞秳┖驮鑫秳?，以提供適口的口腔用制備物。這些組合物可加抗氧化劑如抗壞血酸以防腐。適合用于制備懸浮液的可分散的粉末和顆粒是通過在活性成份和分散劑或濕潤劑、助懸劑和一種或多種防腐劑中加入水以使它們混合。合適的分散劑或濕潤劑或助懸劑在上文已有示例。也可加另外的賦形劑，例如甜味劑、增味劑和著色劑。本發(fā)明的藥物組合物也可為水包油乳液。油相可為植物油或礦物油或它們的混合物。合適的乳化液可為天然樹膠，如阿拉伯膠或西黃蓍膠，天然磷脂，例如大豆、卵磷脂和從脂肪酸和己糖醇衍生的酯或偏酯，酐，例如脫水山梨醇單油酸酯，以及所述偏酯和環(huán)氧乙烷的縮合物，例如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。乳化物也可含甜味劑和增味劑。糖漿和酏劑可用甜味劑配制，例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。此制劑也可含緩和劑、防腐劑、增味劑和著色劑。藥物組合物可為滅菌的可注射液體或油質懸浮液。此懸浮液可按照該領域已知的技術利用上文提到的合適的分散劑或濕潤劑和助懸劑配制。滅菌的可注射制備物也可為在非毒性的腸道外可接受的稀釋劑或溶劑中的滅菌的可注射溶液或懸浮液，例如為1,3-丁二醇溶液?？赡苁褂玫目山邮苊浇槲锖腿軇樗?、Ringer's溶液和等滲氯化鈉溶液。另外，無菌的非揮發(fā)性油傳統(tǒng)上^皮用為溶劑或懸浮介質。任何溫和非揮發(fā)性油都可用于此目的，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可用于制備可注射物。本公開的提高遞送多肽/siNA輒合物也可以栓劑形式施藥，例如藥物的直腸施藥。此組合物可通過混合藥物與合適的非刺激性賦形劑制備，此賦形劑應在常溫下為固態(tài)，而在直腸的溫度下為液態(tài)，因此在直腸中可融解以釋力欠藥物。這類物質包括可可脂和聚乙二醇。本公開的提高遞送多肽/siNA軛合物可在無菌介質中腸道外施藥?？筛鶕玫拿浇槲锖蜐舛葘⑺幬飸腋』蛉芙庥诿浇槲镏?。有利地，可將佐劑如局麻藥、防腐劑和緩沖劑溶解于4某介物。從約0.1mg到大約140mg每千克體重每天的劑量水平對于上文所述的疾病的治療是有效的(每個患者大約0.5mg到大約7g每天)。用于生產單劑型包裝時，可與載運體材料組合的活性成份的量根據所治療宿主和施藥的特定方式而變化。劑量單位形式一般含大約1mg到大約500mg的活性成份。已知用于任何特定患者的特定劑量水平取決于一系列因素，包括所用的化合物的特定活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、用藥時間、給藥途徑、排泄率、藥物聯合和進行治療的特定疾病的嚴重性。當用于非人類的動物給藥時，也可將組合物加到動物伺料或^:用水中。配制動物飼料和飲用水組合物是較方便的，可使動物與其飲食一起服用治療學合適量的組合物。將組合物制為用于向銅料和飲用水中加入的預混料也務i方^f更。提高遞送多肽/siNA軛合物也可組合其它藥物化合物向患者施藥，以提高總治療效果。使用多種化合物治療某種疾病可提高有益效果而降低副作用。在一個實施方案中，發(fā)明的組合物適合將提高遞送多肽/siNA軛合物施藥到特殊細胞類型中，如肝臟細胞。例如，去唾液酸糖蛋白受體(ASGPr)為肝臟細胞獨有的，其結合支鏈半乳糖-末端糖蛋白，如去唾液酸粘蛋白(ASOR)?？衫每购怂崦富鶊F例如2'-M、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-O-曱基、2'-H對WuThesiNA修飾而對其精細改性，以增強其穩(wěn)定性。(見綜述Usman和Cedergren，〃:34，1992;Usman等，Wwc/w'c爿c/必Sjw;,3/:163,1994)。SiNA構建體可利用一般方法通過凝膠電泳純化或通過高壓液相色譜純化并在水中重懸。化學合成的具有修飾(堿基、糖和/或磷酸酯)的核酸分子可防止其被血清核糖核酸酶降解，提高其效價。例如見Eckstein等，國際公布號WO92/07065;Perrault等，A^we344:565，1990;Pieken等，Sc/ewce253:314，1991;Usman禾口Cedergren，r柳必說oc/^附.&,、/7:334,1992;Usman等，國際公布號WO93/15187;和Rossi等，國際公布號WO91/03162;Sproat,美國專利號5,334,711;Gold等，美國專利號6,300，074。所有以上引用文獻描述的各種化學修飾都可用于此處所述核苷酸分子的威基、磷酸酯和/或糖部分。本領域有數個例子描述了將糖、堿基和磷酸酯修飾引入核酸分子可顯著增強其對核酸酶的穩(wěn)定性和效價。例如，通過用核酸酶抗性基團修飾，可增強纟史修飾的寡核苷酸的穩(wěn)定性和/或增強其生物學活性，例如2'-氨基、2'-C-烯丙基、2'-氟、2'-0-曱基、2'-H、核脊酸t(yī)t修飾。見綜述Usman和Cedergren，7Y萬S〃:34，1992;Usman，等，A^c/e/c爿c,AS少ot/.W:163，1994;Burgin等，萬,oc/z微/對^35:14090，1996。核苷酸分子的糖修飾在本領域已有詳細描述。見Eckstein等，國際公布PCT號WO92/07065;Perrault等，W加ww344:565-568，1990;Pieken等，&z朋ce253:314-317，1991;Usman和Cedergren，7Ve"d^/"5/oc/2e附.17:334-339，1992;Usman等，國際公布PCT號WO93/15187;Sproat，美國專利號5,334,711和Beigelman等，丄5/0/.C7^附.270:25702，1995;Beigelman等，國際PCT公布號WO97/26270;Beigelman等，美國專利號5,716,824;Usman等，美國專利號5,627,053;Woolf等，國際PCT公布號WO98/13526;Thompson等，Karpeisky等，7^raf/e<irow丄e仏39:1131，1998;Earnshaw和Gait，5Zo/oi[y附m1(7Vwc/e/d/<iS"'ewc一48:39-55,1998;Verma和Eckstein,Jwww.iev.^wc/^/w.67:99-134，1998;和Burlina等，A/ed,C/jeTW.5:1999-2010,1997。這些出版物描述了將糖、威基和/或磷酸酯修飾物或類似物偶聯到核酸分子中而不改變催化作用的位點確定的一般方法和策略。對于這些所教內容，也可利用類似此處描述的改造方法修飾本發(fā)明的siNA核酸分子，只要siNA在細胞中促進RNAi的能力未受明顯抑制。雖然用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸鍵對寡核苷酸核苷酸間鍵進行化學修飾可提高穩(wěn)定性，但過度修飾可引起一定程度的毒性或活性降低。因此，當設計核酸分子時，應將這些核香酸間鍵的數量最少化。這些鍵濃度的減少可降低毒性，引起效價增強。Wu，J歷o/，C/2em.262:4429-4432，1987。這種糖蛋白或合成糖輒合物向受體結合的親和力強烈取決于寡糖鏈的支化程度，例如，三天線(triatennary)結構的結合比雙天線(biatennary)或單天線(monoatennary)鏈具有更大的親和力。Baenziger和Fiete,Cd/":611-620，1980，和Connolly等，/說o/.C/2em.257:939-945，1982。Lee和Lee通過利用N-乙酰-D-半乳糖胺作為糖部分，獲得了這種高特異性，其與半乳糖比較具有對受體的高親和力。G/_ycocow>gWe/.(317-328，1987。這種"集群效應"曾在甘露糖末端糖蛋白或糖輒合物的結合和吸收中描述過。Ponpipom等，/MedO^w.24:1388-1395，1981。利用半乳糖和半乳糖胺核香酸軛合物對外源化合物進行跨膜運輸可提供一種靶向施藥方法用于治療肝病，如HBV感染或肝癌。生物軛合物的使用也可減少治療所需的藥物化合物的劑量?？蛇M一步通過利用本發(fā)明的核酸生物輒合物調節(jié)治療生物利用度、藥效動力學和藥代動力學參數，以獲得這些分子的更高的特異性。在一個實施方案中，本發(fā)明特征為具磷酸酯骨架fl"飾的改性的siNA分子，其包括一個或更多硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸、磷酸三酯、嗎啉、酰胺氨基曱酸酯、羧甲基、乙酰酰胺(acetamidate)、聚酰胺、磺酸鹽、磺酰胺、氨基磺酸鹽、改性縮醛(formacetal)、硫代改性縮醛(formacetal)和/或烷硅替代物。見下文以獲得關于寡核苷酸骨架改性的綜述Hunziker和Leuman,"NucleicAcidAnalogues:SynthesisandProperties,inModemSyntheticMethods,"FC仏331-417,1995,和Mesmaeker等，"NovelBackboneReplacementforOligonucleotides,inCarbohydrateModificationsinAntisenseResearch,"y4CS，24-39，1994。遞送核苷酸分子的方法在以下文獻中有描述Akhtar等，7>^ACe〃:139，1992;DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,Akhtar編，1995;Maurer，等，A/o/，A^附&說oU6:129-140,1999;Hofland和Huang，Handb.尸/wttw"co/."7:165-192，1999;和Lee等，爿GS752:184-192,2000。Beigelman等，美國專利號6,395,713和Sullivan等，PCTWO94/02595進一步描述了遞送核苷酸分子的一般方法。這些實驗方案可用于實際上任何核酸分子的遞送?？赏ㄟ^許多熟悉本行業(yè)技術的人員知道的方法將核酸分子給藥到細胞內，包括但不限于裝入脂質體膠嚢，通過離子電滲，或通過和其它媒介物結合，如可生物降解的聚合物、水凝膠、環(huán)糊精(例子見Gonzalez等，說oawj'wga^Ozem.70:1068-1074，1999;Wang等，國際PCT公布號WO03/47518和WO03/46185)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球(例子見美國專利號6,447,796和美國專利申請公布號US2002130430)、可生物降解納米膠囊和生物粘附性微球，或通過蛋白質性載體(O'Hare和Normand，國際PCT公布號WO00/53722)?？蛇x地，通過直接注射或使用輸液泵對核酸/4某介物組合物進行局部遞送。本發(fā)明核酸分子無論進行皮下、肌內還是皮內直接注射，都可利用標準針和注射方法，或通過無針技術，如在Conry等，C//"Ca"cer5:2330-2337，1999和Barry等，國際PCT公布號WO99/31262中的描述。本發(fā)明的分子可被用作藥劑學試劑。藥劑學試劑對受治療者的疾病狀態(tài)可預防、調節(jié)其發(fā)生或治療(緩解癥狀至一定程度，優(yōu)選地為所有癥狀)。術語"配體"指任何化合物或分子，如藥物、肽、激素或神經遞質，其具有與其它化合物如受體直接或非直接相互作用的能力。與配體相互作用的受體可存在于細胞表面或可選地可為細胞內受體。配體與受體相互作用可導致生物化學反應，或僅為物理相互作用或偶聯。此處所用的"非對稱性發(fā)夾"意為線性siNA分子包括反義區(qū)域，即可包括核苷酸或非核香酸的環(huán)部分，和有義區(qū)域，其所包括的核苷酸比反義區(qū)域少，導致有義區(qū)域有足夠的互補核苷酸與反義區(qū)域配對且形成有環(huán)的雙鏈結構。例如，本發(fā)明的一種非對稱性發(fā)夾siNA分子可包括反義區(qū)域，其具有足夠在T細胞中介導RNAi的長度(如大約19到約22(如大約19、20、21或22)個核苷酸)和包括大約4到大約8個(如大約4、5、6、7或8)核苷酸的環(huán)區(qū)域，和有義區(qū)域，其具有大約3到大約18個(如大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)核苦酸與反義區(qū)域互補。非對稱性發(fā)夾siNA分子也可包括可被化學改性的5'末端磷酸基團。非對稱性發(fā)夾siNA分子的環(huán)部分可包括核苷酸、非核苷酸、連接子分子或此處描述的輒合分子。此處所稱的"非對稱性雙鏈體"意為siNA分子具有包括有義區(qū)域和反義區(qū)域的兩條分離的鏈，此處的有義區(qū)域包括的核苷酸比反義區(qū)域少，以致有義區(qū)域具有足夠的互補核苷酸與反義區(qū)域配對且形成雙鏈結構。例如，本發(fā)明的一種非對稱性雙鏈siNA分子可包括反義區(qū)域，其具有足夠在T細胞中介導RNAi的長度(如大約19到大約22(如大約19、20、21或22)個核苷酸)，和有義區(qū)域，其具有大約3到大約18個(如大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18)核苷酸與反義區(qū)域互補。"調控基因表達"意為使乾基因的表達上調或下調，包括細胞中mRNA的存在水平、或mRNA翻譯、或乾基因編碼的蛋白或蛋白亞基合成的上調或下調?；虮磉_的調控也可被發(fā)生上調或下調的乾基因決定或可為該靶基因編碼的一個或更多蛋白或蛋白亞基的存在、數量或活性，以致對象蛋白或亞基的表達、水平或活性高于或低于不存在調控者(如siRNA)時所觀察到的。例如，術語"調控"可意為"抑制"，但"調控"詞的使用不限于此定義。表達的"抑制"、"下調"或"減少"意為編碼一個或多個蛋白或蛋白亞基的基因、或RNA分子或等效RNA分子的水平的表達，或耙基因編碼的一個或更多蛋白或蛋白亞基的水平或活性，減少到低于不存在本發(fā)明的核酸分子(如siNA)時所觀測到的。在一個實施方案中，siNA分子的抑制、下調或減少意思為低于滅活的或衰減的分子存在時所觀察到的水平。在另一個實施方案中，siNA分子的抑制、下調或減少意思為低于例如具有錯義(scrambled)序列或錯配的siNA分子存在時所觀察到的水平。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子基因表達的抑制、下調或減少高于其不存在時?；?沉默"指通過在細胞中靶向抑制基因表達使之部分或徹底發(fā)生功能丟失，也可稱為"敲低(knockdown)"。根據環(huán)境情況和要說明的生物學問題，它可優(yōu)選地為部分減少基因表達?？蛇x地，可能期望盡可能減少基因表達。沉默的程度可通過本領域熟悉的方法確定，其中一些在國際公布號WO99/32619中作了總結。依靠分析方法，基因表達的定量使得本發(fā)明的特定實施方案所可能期望的各種程度的抑制都可檢測，包括預防性和治療性方法，其將能夠敲低用mRNA水平或蛋白水平或活性表示的把基因表達，例如等于或高于基礎水平(即正常水平)或其它對照水平的10%、30%、50%、75%、90%、95%或99%,包括可能與靶向治療的特定疾病狀態(tài)或其它狀態(tài)相關的上升的表達水平。短語"抑制耙基因的表達"指本發(fā)明的siNA啟動乾基因的基因沉默的能力。為檢測基因沉默的程度，將表達特定構建體的感興趣器官或培養(yǎng)的細胞的樣品或測定樣與不表達該構建體的對照樣品比較。將對照樣品(未表達構建體)指定為100%的相對值。當測定的相對于對照的值為大約90%，經常為50%,且在特定實施方案中為25-0%時，即達到了對靶基因表達的抑制。合適的檢測手段包括例如利用本領域技術人員所知道的技術檢測蛋白或mRNA水平，如點印跡、northern印跡、原位雜交、ELISA、免疫沉淀、酶功能，以及本領域技術人員所熟知的表型檢測。"受治療者"意為生物體、組織或細胞，其可包括作為受治療者或作為供體的器官，或被移植細胞的受體，或其本身為siNA遞送的對象的細胞。因此"受治療者"可指生物體、器官、組織或細胞，包括體外或活體外器官、組織或細胞受治療者，本發(fā)明的核苷酸分子可向其施藥且用此處描述的提高多核苷酸遞送的多肽可增強遞送效果。示例性的受治療者包括，哺乳動物個體或細胞，例如人類患者或細胞。此處所用的"細胞"為使用其通常的生物學意義，且不是指多細胞生物體整體，例如不特指一個人。細胞可存在于生物體中，如鳥、才直物和哺乳動物如人、奶牛、山羊、類人猿、猴子、豬、狗和貓。細胞可為原核的(例如細菌細胞)或真核的(例如哺乳動物或植物細胞)。細胞可為體細胞或生殖細胞系起源的，全能性或多能性的，可分裂的或不分裂的。細胞可由配子或胚胎、干細胞或完全分化的細胞衍生而來或包括這些細胞。"載體"意為用于遞送期望的核酸的任何基于核酸和/或病毒的技術。"包括"意為包括但不限于"包括"詞后的內容。因此，術語"包括"的使用表示所列的要素是需要的或必需的，但其它要素是可選的，可能存在或不存在。"由...組成"意為包括且限于短語"由...組成"后的內容。因此，短語"由...組成"表示所列的要素是需要的或必需的，且不可能存在其它要素。"基本上由...組成"意為包括任何此短語后所列的要素，且局限于不千擾或有助于在公開中為所列要素特指的活性或作用的其它要素。因此，短語"基本上由...組成"表示所列的要素是需要的或必需的，但其它要素是可選的，且可能存在或不存在，這取決于它們是否影響所列要素的活性或作用。"RNA"意為包括至少一個核糖核普酸殘基的分子。"核糖核苷酸"意為在P-D-呋喃核糖部分的2'位置具有羥基基團的核普酸。術語"RNA，，包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA如部分純化的RNA、基本上純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA，以及通過添加、缺失、替換和/或改變^個或更多核苷酸而與自然出現的RNA不同的改變的RNA。此改變可包括非核普酸物質的加入，如加到siNA的末端或內部，例如在RNA的一個或更多核苷酸上。本發(fā)明的RNA分子的核苷酸也可包括非標準核苷酸，如非自然出現的核苷酸或化學合成的核苷酸或脫氧核苷酸。這些改變的RNA可稱為類似物或自然出現的RNA的類似物。"高度保守序列區(qū)域"意為耙基因的一個或更多區(qū)域的一段核苷酸序列，其在不同代或不同生物系統(tǒng)中不顯著變化。"有義區(qū)域"意為siNA分子的一段核苷酸序列，其與該siNA分子的反義區(qū)域互補。另外，siNA分子的有義區(qū)域可包括與靶核酸序列具有同源性的核酸序列。"反義區(qū)域"意為siNA分子的一段與耙核酸序列具有同源性的核苷酸序列。另外，siNA的反義區(qū)域可以任選地包括一段與siNA分子的有義區(qū)域具有互補性的核酸序列。"靶核酸"指表達或活性將受調節(jié)的任何核酸序列。靶核酸可以是DNA或RNA。"互補"指核酸可通過傳統(tǒng)的Watson-Crick或其它非傳統(tǒng)類型結構與另一核酸序列之間形成氬鍵。當涉及本發(fā)明的核酸分子時，核酸分子與其互補序列的結合自由能足以使該核酸的相關功能發(fā)生，例如RNAi活性。核酸分子的結合自由能的確定方法為本領域所熟知(例如見Turner等，CS//說o/.ZJ厶1987，123-133頁；Frier等，Prac.M7f.爿cadSc/.9373-9377，1986;Turner等，,C/e附.Soc.川9:3783-3785，1987)?；パa百分比表示一個核酸分子的鄰近殘基和第二個核酸序列之間能夠形成氳鍵(例如Watson-Crick配對)的百分比(例如，第一條寡核苷酸的10個核苷酸中有5、6、7、8、9或10個核苷酸與第二條含10個核苷酸的核酸序列配對，分別代表50%、60%、70%、80%、90%和100%互補)。"完全互補"是指一條核酸序列的所有鄰近殘基可與第二條核酸序列的同樣數量的鄰近殘基之間形成氬鍵。此處所用的術語"通用堿基"指核苷酸堿基類似物，其可與每個天然DNA/RNA堿基形成威基對，它們之間的斥力纟艮小。通用堿基的非限制性例子包括C-苯基、C-萘基和其它芳香族衍生物、肌苷、吡咯曱酰胺和硝基吡p各衍生物如本領域所熟知的3-硝基吡咯、4-硝基巧l咮、5-硝基吲哚和6-硝基吲咮(例子見Loakes,A^c/e/c爿dAi^searc/z":2437-2447，2001)。此處所用的"無環(huán)核苷酸"指任何具有無環(huán)核糖糖的核苷酸，例如其任何核糖碳(Cl、C2、C3、C4或C5)為獨立的或組合地缺失于核苷酸。此處所用的術語"可生物降解的"指在生物系統(tǒng)內進行的降解，例如酶促降解或化學降解。此處所用的術語"生物學活性分子"指可在系統(tǒng)內誘發(fā)或改性一種生物學反應的化合物或分子。生物學活性siNA分子的非限制性的例子，或為單獨的或與本發(fā)明所預期的其它分子組合，包括治療活性分子如抗體、膽固醇、激素、抗病毒藥、肽、蛋白質、化療藥物、小分子、維生素、輔因子、核苷類、核普酸、寡核苷酸、酶核苷酸、反義核酸、三鏈形成寡核苷酸、2，5-A嵌合體、siNA、雙鏈RNA、等位酶、適體、誘倂及其類似物。本發(fā)明的生物學活性分子也包括能夠調控其它生物學活性物質的藥代動力學和/或藥物動力學的分子，例如脂和聚合物如多胺、聚酰胺、聚乙二醇和其它聚醚。此處所用術語"磷脂"指包括至少一個磷基團的疏水性分子。例如，磷脂可包括一個含磷基團和飽和或不飽和烷基基團，任選地以OH、COOH、氧代、胺，或取代的或未取代的芳基基團取代。"帽子結構"意為化學改性結構，其結合于寡核苷酸的兩端(例子見Adamic等，美國專利號5,998,203,此處通過引用的方式并入本文)。這些末端改性結構可保護核酸分子，防止其被核酸外切酶降解，且有助于其遞送和/或在細胞中的局部化。帽子結構可存在于5'末端(5'帽子)或3'末端(3'帽子)或可于兩個末端都存在。在非限制性例子中，5'帽子包括但不限于甘油基、反向脫氧脫堿基殘基(部分)；4',5'-亞甲基核苷酸；1-(|3-D-赤式呋喃芽糖(erythrofiiranosyl))核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳環(huán)核苷酸；1,5-脫水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；a-核苷酸；改性堿基核苷酸；二硫代磷酸酯連接子；蘇式-戊呋喃芽糖核普酸；無環(huán)3',4'-斷核苷酸；無環(huán)3,4-二羥丁基核苷酸；無環(huán)3,5-二羥戊基核苷酸；3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向脫堿基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向脫堿基部分；1，4-丁二醇磷酸酯；3'-磷酰胺酯；己基磷酸酯；氨基己基石岸酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；橋連或非橋連甲基膦酸部分。3'帽子的非限制性例子包括但不限于甘油基、反向脫氧脫堿基殘基(部分)；4',5'-亞曱基核苷酸；1-(卩-D-赤式呋喃芽糖(erythrofiiranosyl))核芬酸、4'-硫代核芬酸；碳環(huán)核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羥丙基磷酸酯；1,5-脫水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；a-核苷酸；改性tt核苷酸；二硫代磷酸酯；蘇式-戊呋喃芹糖核苷酸；無環(huán)3',4'-斷核苷酸；3，4-二幾丁基核苷酸；3,5-二羥戊基核苷酸；5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向脫堿基部分；5'-磷酰胺酯；5'-硫代磷酸酯；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-氨基；橋連或非橋連5'-磷酰胺酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，橋連或非橋連曱基膦酸和5'-巰基部分(更詳細例子見Beaucage和Lyer,re,ra/7e(iraw49:1925,1993;此處以引用的方式并入本文)。術語"非核普酸，，指《壬意的基團或者化合物，其可在一個或多個核苷酸單元的位置上被合并到核酸鏈，包括糖和/或磷酸取代基，且允許剩下的堿基顯示它們的酶活性。該基團或化合物為脫堿基的，因為它不含普通的可識別的核苷酸堿基，如腺脊、鳥噤呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶且因此在l'-位缺乏堿基。在此用到的"核苷酸"為本領域所認識的包括本領域所熟知的天然堿基(標準的)和修飾堿基。這些威基通常位于核苷酸糖分子的l'-位。核苷酸通常包括堿基、糖和磷酸基團。該核香酸可未祐修飾或在糖、磷酸和/或堿基分子位置被修飾(也指可互換的如核酸類似物、修飾的核苷酸、非天然核苷酸、非標準的核苷酸和其它；見，如Usman和McSwiggen，Eckstein,等，國際PCT公布號WO92/07065;Usman,等，國際PCT公布號WO93/15187;Uhlman&Peyman，見前，所有的文獻在此以參考的方式并入本文)。本領域存在許多修飾核苷酸威基的例子，如在Limbach等，Mic/ezcA:z'必ie&":2183，1994中總結的。對堿基的修飾的一些非限制性的例子可^皮引入到核酸分子中，包括肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、M苯基、5-烷基胞苷(如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(如，核糖胸苷)、5-卣尿苷(如，5-溴尿苷)或6-氮雜嘧啶或6-烷基嘧啶(如，6-甲基尿嘧啶)、丙炔基和其它的(Burgin,等人，說0d2em"f0;35:14090，1996;Uhlman&Peyman，見前)。在此方面"修飾堿基"指在l'位的腺苷、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧咬之外的核苷酸威基或它們的等同物。"乾位，，指在靶RNA中的一個序列，其被"靶向"用于在反義區(qū)域內含互補于耙序列的序列的siNA構建體介導的酶切。"酶切可探測水平"指對靶RNA的酶切(和裂解的產物RNA的形成)到在隨機降解靶RNA產生的RNA的背景下足以發(fā)現酶切產物的程度。1-5%的靶RNA的酶切產物足以在用多數探測方法的背景下被探測到。"生物體系"指，試驗材料，在純化或非純化形式下，從生物源，包括但不局限于人、動物、植物、昆蟲、細菌、病毒或者其它來源，其中該體系包括RNAi活性必需的成分。術語"生物體系"包括，如，細胞、組織或生物體，或其提取物。術語生物體系也包括可用于體外建立的重組的RNAi體系。在此用到的術語"可生物降解的連接子"指核酸或非核酸連接子分子，其被設計成可生物降解的連接子以連接一個分子到另一分子上，舉例來說，一個生物活性分子到本發(fā)明的一個siNA分子上或本發(fā)明的siNA分子的有義和反義鏈上。此可生物降解的連接子被設計以便其穩(wěn)定性可為了特定的目的而被調節(jié)，如傳遞到特定的組織或者細胞類型。基于核酸的可生物降解連接子分子的穩(wěn)定性可用多種化學成分調節(jié)，舉例來說，核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸和化學改性的核苷酸，如2'-0-曱基、2'-氟基、2'-氨基、2'-0-氨基、2'-C-烯丙基、2'-0-烯丙基和其它的2'-改性的或堿基改性的核苷酸。此可生物降解的核酸連接子可為二聚體、三聚體、四聚體或更長的核酸分子，舉例來說，核苷酸長度約為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的寡核芬酸，或可包括磷脧基連接的單條核苷酸，舉例來說，磷酰胺酯或磷酸二酯。此可生物降解的核酸連接子分子也可包括核酸骨架、核酸糖或核酸堿基改性。"脫堿基的"指糖分子缺乏威基或在l'位的威基位置具有其它的化學基團，參見例如Adamic等人的美國專利第5,998,203號。"非改性的核苷酸"指腺普、胞嘧啶、鳥。票呤、胸腺嘧啶或尿嘧咬，連接到p,D-核-呔喃糖的r碳上。"改性的核香酸"指任意的核苷酸堿基，其含在非改性的核苷酸堿基、糖和/或磷酸酯的化學結構上的修飾。改性的核普酸的非限制性的例子在式I-"/11和/或在此描述的其它的改性中顯示。如在本發(fā)明中描述的與2'-改性的核苷酸的連接，通過"氨基"指2'-NH2或2'-0-NH2，其可^皮改性或不被改性。這樣的改性基團在，舉例來i兌，Eckstein等人的美國專利號5,672,695和Matulic-Adamic等人的美國專利號6,248,878中被描述。siNA分子可與陽離子脂質體配合，被脂質體包裹，或以其它方式遞送到靶細胞或組織。此核酸或核酸配合物可摻入或不摻入生物大分子，通過注射、輸液泵或支架局部給藥。在另一實施方案中，聚乙二醇(PEG)可共價地連接到本發(fā)明的siNA化合物，到提高多核苷酸遞送的多肽上，或兩者上。連接的PEG可為任意的分子量，優(yōu)選的從約2,000到約50,000道爾頓(Da)。有義區(qū)域可通過連"t矣子分子連^妄到反義區(qū)域，如多核苷酸連接子或非核苷酸連接子。"反向重復"指包括具定位為當重復被轉錄時能形成雙鏈siRNA的有義和反義成分的核酸序列。反向重復可任選的包括連"^妄子或異源序列，如重復的兩個成分間的自切割酶。反向重復的成分具有足以形成雙鏈RNA的長度。典型的，反向重復的每個成分長度為約15到約100個核苷酸，優(yōu)選的約20-30個堿基核苷酸，優(yōu)選的長度約20-25個核苷酸，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長度。"核酸"指單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核普酸和其聚合物。此術語包含此核酸，其包括已知的核普酸類似物，改性的骨架殘基或鍵合，為合成的、自然發(fā)生的和非自然發(fā)生的，與參考核酸具有相似的結合特性，以相似于參考核苷酸的方式代謝。這些類似物的例子包括，不具限制性，硫代磷酸酯、磷酸胺酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-0-甲基核糖核普酸、肽核酸(PNA)。"大的雙鏈RNA"指任意的具有大于約40個威基對(bp)大小的雙鏈RNA，舉例來說，大于100bp或更多的尤其是大于300bp的。大dsRNA的序列可為mRNA的片段或整個mRNA。大的dsRNA的最大的大小在》匕沒有受限制。此雙鏈RNA可包括改性的堿基，在該位置可對磷酸糖骨架或對核苷改性。這樣的改性可包括氮或硫雜原子或任意的其它的本領域所熟知的改性。此雙鏈結構可通過自身互補RNA鏈形成，如通過發(fā)夾或微RNA或通過將兩個不同的互補RNA鏈退火形成。"重疊，，指兩個RNA片革爻具有在一條鏈上的多個核苷酸重疊的序列，此多個核香酸(nt)數可少如2-5個核香酸或具5-10個核苷酸或更多。"一個或多個dsRNA"指基于序列，相互不同的dsRNA。"耙基因或mRNA"指任意感興趣的基因或mRNA。實際上任意的以前的通過遺傳或序列分析識別的基因可為靼。乾基因或mRNA可包括發(fā)育基因和調控基因，也可為代謝的或結構基因或編碼酶的基因。乾基因可在觀察到表型的那些細胞中表達或在以直接或間接影響表型表征的方式在生物體中表達。靶基因可為內源的或外源的。這些細胞包括成年的或胚胎動物或含配子的植物體內的任意的細胞或任意的如在永生細胞系或原代培養(yǎng)細胞中產生的分離的細胞。在本說明書和隨附的權利要求書中，單數形式"a"、"an"和"the"含多種指示除非在文中另外清楚地限定。在此特定的實施例完全為了例證且不意于限制如在權利要求書中描述的本發(fā)明的范圍。雖然在此用到了特別的術語和數值，這些術語和數值可-故理解作范例而不用于限制本發(fā)明的范圍。在本公開中引用的所有的出版物和參考資料為一切目的在此以參考的方式完整的并入本文。實施例上面的公開大體上描述了本發(fā)明，其通過下列實施例被進一步示例。描述的這些實施例完全是為了例證，且不意于限制本發(fā)明的范圍。雖然在此運用了特別的術語和數值，但是這些術語和數值應理解為示例性的且^j"本發(fā)明范圍是非限制性的。實施例1運用的試驗方案和方法siRNA/多肽輒合物的合成多肽和RNA都用標準的固相合成法制備。多肽和RNA分子必須用特，異性分子使得它們共價相互連接，從而功能化。對于多肽來說，N末端用3-馬來酰亞胺丙酸功能化。然而，我們認識到，其它的官能團如溴或石典乙酰部分也能起作用。對RNA分子有義鏈的5'端或反義鏈的5'端用l-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物連接子功能化。RNA寡聚物溶于加有2ml緩沖液A(20mMTris-HCl，pH6.8,50%甲酰胺)的0.5mL水中。接著加入多肽PN277，其導致沉淀形成，加入1mL的2MTEAA緩沖液后沉淀溶解。反應完成后，減壓下去除溶劑，且將生成的固體在緩沖液A(20mMTris-HCl,pH6.8,50%曱酰胺)中溶解。將材料加載到AmershamResourceQ柱上且以6mL/分鐘用5倍柱體積的緩沖液A沖洗。以6mL/分鐘的流速用15倍柱體積的緩沖液B(20mMTris-HCl,pH6.8，50%甲酰胺，1MNaCl)從15-60%線性梯度運行完成分離。純化的軛合物用slidalyzer透析卡(3.5KMWCO)相對PBS脫鹽?；谠赬=260nm時計算的摩爾吸光系數用分光光度計法測定軛合物的量。用RP-HPLC對此軛合物的純度的分析在后面顯示。在50mM的乙酸鉀、1mM的乙酸鎂和15mM的HEPESpH7.4中，在90。C加熱2分鐘后于37。C溫育1小時，將軛合到多肽的反義RNA鏈退火到它的互補有義RNA鏈。用非變性(15%)聚丙烯酰胺凝膠電泳和溴化乙錠染色確證雙鏈RNA軛合物的形成。本發(fā)明的一個siRNA/多肽軛合物的例子在實施例3中顯示。示例軛合物的制備1:肽PN277(H2B13-48)(SEQIDNO:37)和反義鏈CN950asen(N163asen)(SEQIDNO:60)的5'的軛合物具下列結構寡聚CN950asen溶于加有2mL的緩沖液A(20mMTris-HCl，pH6.8,50%甲酰胺)的0.5mL水中。然后加入肽(PN0277),其導致沉淀形成，在加入1mL2M的TEAA緩沖液后沉淀被溶解。反應完成后，減壓下去除溶劑且將產生的固體在緩沖液A中溶解(20mMTris-HCl,pH6.8，50%甲酰胺)。將材料加載到AmershamResourceQ柱上且以6mL/分鐘用5倍柱體積的緩沖液A沖洗。通過以6mL/分鐘的流速用15倍柱體積的緩沖液B(20mMTris-HCl,pH6.8，50%甲酰胺，1MNaCl)從15-60%線性梯度運行完成分離。用slidalyzer透析卡(3.5KMWCO)相對PBS對純化的軛合物脫鹽?；谠赹260nm時計算的摩爾吸光系數用分光光度計法測定軛合物的量。用RP-HPLC確定此軛合物的純度。通過在90。C加熱2分鐘后于37。C溫育1小時，肽輒合物反義鏈和互補反義鏈在50mM的乙酸鉀、1mM的乙酸鎂和15mM的HEPESpH7.4中退火。用非變性(15%)聚丙烯酰胺凝膠電泳和溴化乙錠染色確證雙鏈RNA軛合物的形成。示例扼合物的制備2:用以上示例軛合物的制備l中描述的方法和程序合成下列的輒合物肽PN277(SEQIDNO:37)和寡聚CN952sen(N163sen)(SEQIDNO:59)的軛合物具有下列結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage77</formula>肽PN277和寡聚CN740sen(SEQIDNO:63)的Dicer底物27-mer軛合物具有下列結構<formula>formulaseeoriginaldocumentpage78</formula>肽PN277和寡聚CN741asen(SEQIDNO:64)的Dicer底物29-mer輒合物具有下列結構細胞和細胞培養(yǎng)小鼠尾成纖維細胞衍生自C57BL/6J小鼠或tg197hTNF-a轉基因小鼠的尾巴。取下尾巴并用刀片切成小段。用PBS清洗小段3次，然后用0.5mg/ml膠原酶、100單位/ml青霉素和100pg/ml鏈霉素在搖床中于37。C溫育以分裂組織。然后在具有補充物(如上面描述的)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)尾巴小段。從ATCC(#CRL-2200)獲得的組成型表達LacZ的9L/lacZ細胞為大鼠膠質肉瘤成纖維細胞，也在具有補充物(如上描述)的DMEM培養(yǎng)基中生長。在含4mML-谷氨酸鹽、非必需氨基酸和10%胎牛血清的Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM)中維持分離的人類單核細胞。將小鼠尾成纖維細胞(MTF)在含lmM丙酮酸鈉、非必需氬基酸和20%胎牛血清的補充物的Dulbecco改良的必需培養(yǎng)基(DMEM)中維持。所有的細胞于37。C和5%C02中培養(yǎng)，補充有含100單位/ml青霉素、100昭/ml鏈霉素和0.25mg/ml兩性霉素B(InvitrogenCarlsbad,CA)的抗生素混合物。人類單核細胞的分離和純化來自健康供應者的新鮮人類血液樣品從GoldenWestBiologicals(Temecula，CA)購買。在收到后馬上將血液樣品用PBS以1:1的比率稀釋用于分離單核細胞。外周血單核細胞(PBMC)最初通過Ficoll(Amersham,Piscataway,NJ)梯度法從全血分離。進一步用MiltenyiCD14陽性選擇試劑盒(MILTENYIBIOTECGmbH，德國)按照制造商說明書從PBMC純化出單核細胞。在用抗-CD14抗體(BDBioscience,SanJose，CA)染色細胞后，用流式細胞術鑒定得知單核細胞制品的純度高于95%。在誘導和敲低分析前，純化的人類單核細胞在完全培養(yǎng)基中(上面描述的)維持過夜。人類單核細胞活化通過加入0.1-1.0ng/ml的脂多糖LPS(Sigma,StLouis,MO)到細胞培養(yǎng)物中刺激腫瘤壞死因子a(TNF-a)產生而進行人類單核細胞的活化。與LPS溫育3小時后收集細胞且根據制造商的說明書通過Quantigene分析(Genospectra，Fre證ont，CA)測定mRNA的水平。根據制造商的試驗方案，用ELISA(BDBiosciences,SanJose,CA)測定誘導后TNF-a水平的變化。人類TNF-a敲低分析mRNA(bDNA)和蛋白質(ELISA)將單核細胞接種于具100K個細胞/100nl/孔的OptiMEM(Invitrogen,Carlsbad,USA)的96孔板以進行TNF-a敲低試驗。將肽和siRNA與OptiMEM混合5分鐘，然后加入胎牛血清(FBS)到混合物中至3%FBS的最終濃度。根據制造商的試驗方案，用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)轉染細胞。所有的轉染通過將細胞于37。C和5%(302溫育3個小時，然后去掉轉染試劑，補充完全培養(yǎng)基給細胞且培養(yǎng)過夜而進行。根據制造商的說明書進行bDNA分析(來自Genospectra,Fremont,CA的Quantigene分析)。來自細胞培養(yǎng)基的樣品直接用于ELISA分析。從通過眼窩放血收集的全血分離出的血漿樣品用于包括轉基因小鼠的實驗分析。根據制造商的說明書以1:2的稀釋物用ELISA測定血漿hTNF-a的水平(R&D系統(tǒng)，Minneapolis，畫)。流式細力包檢測流式細胞檢測分析用BeckmanCoulterFC500細胞分析儀(Fullerton,CA)進行。根據運用的熒光探針(FAM或Cy5用于siRNA且FITC或PE用于CD14)校正儀器。碘化丙咬(Fluka，StLouis，MO)和膜聯蛋白V(BDBioscience,SanJose，CA)用作細胞生存力和細胞毒性的指標。Dicer介導的siRNA降解分析siRNA和siRNA/多肽扼合物與Dicer核酸內切酶(StratageneCat.#240100)溫育以檢測它們是否易被降解。按照制造商的方案進行。簡而言之，消化反應在10[iL總體積中進行，且允許于37。C溫育過夜。過夜溫育后，消化混合物的2^iL的樣品與2X的上樣染料混合，且通過在含尿素和15%TBE非變性的聚丙烯酰胺凝膠的15%TBE上的凝膠電泳進行分析。用LC-MS監(jiān)測Dicer對RNA的降解LC-MS運行條件是用XTerraC18柱、2.5nm、2.1x50mm(Waters公司)，控溫在65。C。流動相為100mM六氟異丙醇、7mM三乙胺和1000/0甲醇洗提液。40分鐘過程中梯度為5-16%。洗提液分流入PDA中且WatersMicromassZQESI單-quad質語儀在陰離子模式下運行。毛細管電壓為3.0kV且錐孔電壓為45V。脫溶劑在300。C進行，輔以600L/小時N2。源控制在90°C。采樣掃描率為1秒鐘1000-2000m/z。實施例2篩選具hTNF-a敲低活性的Dicer核酸內切酶底物siRNA本實施例例證了本發(fā)明的示例性siRNA,其被篩選以使hTNF-a基因表達水平有效降低。瞄準hTNF-a基因的重要性是因為當在人類或其它哺乳動物患者中超表達時，該基因與調節(jié)類風濕關節(jié)炎(RA)的發(fā)生或發(fā)展有關。因此，靶向的降低hTNF-a基因表達可用于治療RA。近來的證據表明長為25-30個核苷酸的RNA雙鏈體,相對于短的RNA雙鏈體，可達到超過100倍的降低靶基因表達水平的效果。這種增強的敲低活性歸因于這些較長的siRNA雙鏈體為dicer核酸內切酶(RNAseIII)的底物。下表3顯示siRNA雙鏈體長度范圍為21到27個核苷酸。通過序列特異性轉錄后基因沉默hTNF-a基因篩選出了YC12和N161-N164。最初的篩選過程包括用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,Ca)轉染列表于表3的單獨的siRNA到LPS刺激的人類單核細胞。表3耙向于hTNF-a的siRNA<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>CN740有義(5'-3')SEQIDNO635'陽GCCUGUACCUCAUCUACUCCCAGGUCC陽3'CN741反義(5'-3')SEQIDNO645'-GGUCCUGGGAGUAGAUGAGGUACAGGCUU-3'YC12和N161-N164的序列以5'-3'有義(上)和3'-5'反義(下)的方式在表3中列出。用Lipofectamine2000(InvitrogenCarlsbad，Ca)以0.16nM、0.8nM、4nM和20nM濃度轉染YC12和N161-N164中的每一種。表4總結了以百分率表示的每種siRNA的TNF-a敲低活性。Qneg代表隨機的siRNA序列且作為陰性對照。觀察到的Qneg敲低活性標準化為100%(100%基因表達水平)且每種siRNA的敲低活性以相對于陰性對照的方式表示。表4中的數據顯示，與QnegsiRNA陰性對照相比，siRNAN161、N162和N164對TNF-amRNA的水平沒有顯著影響。相比之下，siRNAY12減少TNF-amRNA的水平到66°/。的Qneg陰性對照水平，而siRNAN163減少TNF-amRNA的水平到57%的Qneg陰性對照水平。表4中的數據顯示dicer底物siRNAN163和YC12有效地降低了人類單核細胞中hTNF-amRNA的水平。選擇了siRNAN163用于進一步的表征。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>實施例3siRNA/多肽輒合物有效地減少hTNF-amRNA在人類單核細胞中的水平本實施例證明，當本發(fā)明的dicer底物siRNA與示例性的本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽軛合時，有效地減少hTNF-amRNA表達水平。在下表5中總結性顯示了siRNA/多肽扼合物的敲低活性。實施例2中表4顯示的數據表明當用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,Ca)轉染時，siRNANl63有效減少了hTNF-amRNA水平，且因此siRNAN163為優(yōu)秀的用于治療和/或預防一種或多種TNF-a相關的炎性狀態(tài)的候選者。然而，陽離子脂質體可具細胞毒性，因此在治療疾病時，不適合用于體內遞送運用。由此，為克服陽離子脂質體介導的遞送的缺陷，將本發(fā)明的示例性的N163siRNA軛合到提高多核苷酸遞送的多肽上，當用作遞送々某介物時，該軛合物具有最小的至沒有細胞毒性。將遞送多肽軛合到siRNA序列的dicer底物形式(27-mer)上可在RISC加載前，使多肽從siRNA上去除，這樣減少了多肽會抑制RISC活性的可能性。實質上，這些輒合物有效地遞送前體siRNA到細胞質且一旦加工，就進行有效的敲低期望的耙基因的介導。本發(fā)明的示例性的提高多核苷酸遞送的多肽(PN277)衍生于人類組蛋白2B(H2B)蛋白質的氨基酸序列，且它的一級結構如下PN277NH2-KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKEFYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQIDNO:37)軛合物的產生是通過共價連接本發(fā)明示例性的提高多核苷酸遞送的多肽PN277到本發(fā)明的示例性N163siRNA的有義鏈的5'端或反義鏈的5'端。siRNA/多肽扼合物的例子如下多肽PN277共軛到N163siRNA(dsCoP277nfR950;SEQIDNO:37和35)反義鏈的5'端。N163siRNA的有義鏈未顯示。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage84</formula>軛合到在此用作陰性對照的QnegsiRNA的有義鏈的5'端的多肽PN277未顯示。在本實施例中，上述的每一siRNA/多肽軛合物，包括QnegsiRNA/多肽輒合物，以1nM、10nM、100nM和200nM的濃度與人類單核細胞溫育。表5匯總了以百分率表示的每種siRNA/多肽扼合物的TNF-a敲低活性。將觀察到的Qneg敲低活性標準化為100%(100%基因表達水平)。且每種siRNA的敲低活性以相對陰性對照的百分率表示。表5中的數據表明N163siRNA雙鏈體軛合到提高多核苷酸遞送的多肽有效地減少了hTNF-amRNA的表達水平，不考慮多肽是否共價連接到N163siRNA分子的有義鏈的5'端或反義鏈的5'端。更具體地，siRNA/多肽軛合物dsCoP277nfR952減少hTNF-amRNA水平到Qneg/多肽軛合物陰性對照mRNA水平的62%,而dsCoP277nfR950減少hTNF-amRNA水平到Qneg/多肽軛合物陰性對照mRNA水平的38%。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表5中顯示的數據揭示了這一驚人且未預料到的發(fā)現，當軛合到本發(fā)明的示例性的提高多核苷酸遞送的多肽時，本發(fā)明的示例性的dicer底物siRNA有效地P條低了hTNF-amRNA表達水平。而且輒合物敲低活性超過了通過lipofectamine遞送的相同的siRNA的敲j氐活性。實施例4軛合到提高多核苷酸遞送多肽的siRNA由Dicer核酸內切酶力口工這一實施例證實dicer核酸內切酶(RNaseIII)降解軛合到提高多核苷酸遞送多肽的siRNA。在本實施例中，在實施例3中顯示的三種siRNA/多肽扼合物(Qneg，dsCoP277nfR950和dsCoP277nfR952)在存在或不存在dicer核酸內切酶時溫育。此外，不具提高多核苷酸遞送多肽的N163siRNA雙鏈體在存在或不存在Dicer核酸內切酶時溫育。目的是檢測siRNA是否為dicer介導的降解的靶且多肽是否從共價連接的siRNA雙鏈體上去除，其在阻止多肽介導的對siRNARISC加載的抑制很重要。對復合物RISC的抑制可能阻止扭基因的轉錄后基因沉默。通過聚丙烯酰胺凝M^電泳的對比在圖1中顯示。在圖1中，非dicer溫育的和dicer溫育的QnegsiRNA/多肽軛合物，如預想的那樣，都遷移為相同分子量的單一條帶，表明在存在或不存在dicer核酸內切酶時QnegsiRNA/多肽輒合物不被降解。在聚丙烯酰胺凝膠上，在不存在dicer核酸內切酶時，本發(fā)明的示例性的N163siRNA(非多肽)遷移為單一條帶。然而，當其與dicer核酸內切酶溫育時，觀察到了稍短的N163siRNA雙鏈體，所依證據是與未溫育的N163siRNA相比為稍微小的分子量的條帶。在通過反義鏈(dsCoP277nfR950)的5'端，共價連接到提高多核苷酸遞送的多肽的示例性的N163siRNA和通過有義鏈(dsCoP277nfR952)的5'端，共價連接到提高多核苷酸遞送的多肽的N163siRNA之間，觀察到差異性的降解。兩種siRNA/多肽軛合物在不存在dicer時都如預料的那樣，遷移為表明沒有降解的等分子量的明顯的條帶。然而，在存在dicer核酸內切酶時，觀察到dsCoP277nfR952(有義鏈鍵合)兩種不同分子量的條帶。第一條帶的分子量與未降解的dsCoP277nfR952相等且第二條具等同于dicer降解了的N163siRNA(非多肽)的分子量，其表明共價連接的N163siRNA從多肽中分離。高分子量的條帶(即，未降解的N163siRNA/多肽)的密度高于低分子量條帶(即，降解的N163siRNA/多肽)的大約2倍，其表明大部分dsCoP277nfR952(有義鏈鍵合)未降解。相比之下，dsCoP277nfR950(反義鏈鍵合)表現出高的易受dicer介導的降解的性質，所依證據為相對弱的大小與未降解的dsCoP277nfR950相等的條帶和更強的分子量與dicer降解的N163siRNA(非多肽)的大小相等的條帶。相比dsCoP277nfR952(有義鏈鍵合)，siRNA/多肽dsCoP277nfR950(反義鏈鍵合)具相對高的易受dicer介導的P爭解的水平，與dsCoP277nfR950(反義鏈鍵合；參考實施例2)中觀察到的更高的敲低能力高度相關。因為較高的siRNA/多肽dicer易感性預示著降低的多肽介導的對復合物RISC干擾能力，且因此預示較高的對耙基因的沉默。這些數據表明軛合到本發(fā)明的提高多核苷酸遞送的多肽的示例性siRNA易受dicer介導的降解，且代表理想的為了沉默耙基因的目的用于有效遞送治療前體siRNA到細胞中的候選者。Dicer核酸內切酶降解siRNAN163產生21-merRNA。圖2顯示非軛合siRNAN163雙鏈體的dicer核酸內切酶加工動力學的RP-HPLC分析。在圖2(A)中顯示未加工的N163雙鏈體的RP-HPLC。在圖2(B-E)中顯示與dicer核酸內切酶溫育(B)l小時、(C)2.5小時、(D)5小時和(E)7小時的N163雙鏈體的RP-HPLC。這些數據在圖3的制圖中顯示。通過ESI-MS分析確定了如在圖2(E)中顯示的通過dicer核酸內切酶消化siRNAN1637小時后的RNA的特征，如在圖4中顯示的。圖4顯示對應于N163的21-mer有義鏈dicer裂解產物的在質量為6606.6處的峰和對應于N163的21-mer反義鏈dicer裂解產物的在質量為6965.7處的峰。通過ESI-MS分析法確定了dicer核酸內切酶降解軛合的siRNAN163后的RNA的特征，如圖5所示。在圖5中顯示了dicer核酸內切酶加工具輒合到siRNAN163的多肽PN857的軛合siRNA的ESI-MS。本發(fā)明的示例性的提高多核苷酸遞送的多肽PN857源于人類組蛋白2B(H2B)的M酸序列且其主要的結構如下PN857Mal誦KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ-酰胺(SEQIDNO:52)多肽PN857輒合到N163siRNA的反義鏈的5'端。在圖5(A)中，獲得了不存在dicer核酸內切酶的軛合物雙鏈體的對照溫育結果。圖5(A)顯示了對應于N163的27-nt的反義鏈與多肽PN857的軛合物的質量為13436.2的峰和對應于N163的25-nt的有義鏈的質量為7835.3的峰。在圖5(B)中，獲得了存在dicer核酸內切酶時，將軛合物雙鏈體溫育8小時的結果。圖5(B)顯示質量為13436.1的對應于N163的27-nt反義鏈與多肽PN857的軛合物，質量為7835.6的對應于N163的25-nt的有義鏈，質量為6966.3的對應于輒合的N16327-mer的21-mer反義鏈dicer裂解產物，和質量為6607.6的對應于N16325-mer的21-mer有義鏈dicer裂解產物的峰。實施例5Dicer底物siRNA/多肽軛合物不引起千4t素反應本實施例證實了，當與人類單核細胞溫育時，本發(fā)明的示例性的siRNA/多肽輒合物不引起干擾素反應。干擾素的反應性為用siRNA轉染細胞的潛在的不良反應。因此，進行了體外研究以評價siRNA/多肽dsCoP277nfR950(反義鏈鍵合)和dsCoP277nfR952(有義鏈鍵合)是否引發(fā)干擾素反應。QnegsiRNA/多肽輒合物(CoP840)作為陰性對照，而干擾素-1(IFN-1)用作陽性對照。以lnM、10nM、100nM和200nM的濃度測試每種軛合物。用分子標記MIPla分析干擾素反應性。如所期望那樣，QnegsiRNA/多肽輒合物不誘導MIPla表達，且陽性對照IFN-1誘導的MIPla表達量顯著。軛合物dsCoP277nfR950和dsCoP277nfR952誘導MIPla水平與QnegsiRNA/多肽陰性對照相似，表明在表現出有效的TNF-a敲低活性的濃度內，這些軛合物不引發(fā)干擾素反應性(參考表5，實施例3)。實施例6在24孔板上轉染Vero細胞本實施例公開引導siRNA到靶細胞的方法。Vero細胞在含10。/。FBS、2mLL-谷氨酸、10nMH鄰es、100單位/ml青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中生長。轉染前一天，對數期培養(yǎng)的Vero細胞以50,000個細胞/孔接種于24孔板。轉染前，為所有的siRNA劑量準備好合適的L2K(Lipofectamine2000;Invitrogen)原液。將L2K逐步的混合到OptiMEM⑧細胞培養(yǎng)基(Invitrogen)且加到稀釋的siRNA中。于室溫下溫育混合物15-30分鐘以形成轉染復合體。溫育結束后，吸出培養(yǎng)物上清液且將含10%FBS的150nlDMEM培養(yǎng)基加入每個孔中。接著將150nl的每一轉染復合物一式三份地加入每個孔中。輕輕的來回搖動以混合培養(yǎng)板。于37。C溫育3小時后，去除上清液且每孔中加入lml完全培養(yǎng)基。溫育細胞過夜且用顯微鏡檢測熒光以便探測Cy5-siRNA。第二天，通過每孔加入1.5plHoescht原液用HoeschtDNA染色法7于細月包染色以便探測毒性。輕輕旋轉孔板且于37'C溫育15分鐘。立即通過Cy5和UV濾光鏡用熒光顯微鏡檢測細胞。用相差檢測轉染復合物對細胞的毒性。實施例7血凝素分析(HA分析)本實施例公開了血凝素分析可用于計算從感染了病毒的細胞產生的病毒的滴度。血凝素分析(HA)用于定量細胞上清液中的病毒。一些病毒科，如感冒病毒，具有表面或包膜蛋白，能凝聚(粘著)人類或動物紅細胞(RBC)且在RBC表面結合N-乙酰神經氨酸。因為每種病毒具有許多細胞表面蛋白，一種病毒可翻附多于一種RBC。這個情況的結果為結合病毒的RBC可被病毒交叉連接，導致形成一種RBC"格架(lattice)，，類型。一旦格架形成了，可以計算凝聚的RBC且可測定病毒滴度。相對于未用siRNA轉染的細胞中的病毒滴度，轉染了siRNA的細胞中的病毒的滴度下降，表明siRNA分子千擾了目標病毒一個或多個基因的表達。制備0.5%雞紅細胞的PBS溶液，每20ml用于4個板。轉移100nl的來自每個樣品的培養(yǎng)上清液到v形底的96孔平板的第一行的每個孔中。處理不同樣品時更換吸頭。如果有無菌要求在組織培養(yǎng)箱中操作。用多道可調移液器，在除了得到病毒上清液的第一行的平板的其它的孔中每孔加入50|ilPBS。用多道可調移液器從第一行中吸取50pl培養(yǎng)上清液且與第二行的50nlPBS混合。用移液管上下吸取3次。用多通道移液器從第二行吸取50pi的稀釋的樣品且與第三行的50plPBS混合。用移液管上下吸取3次。重復4到5次直到到達最后一行。去掉50pl的稀釋樣品。加入50nl0.5%雞紅細胞到每個孔中。在冰上溫育平板l小時。讀取HA結果且計算病毒滴度。實施例824-孔Vero細胞轉染/感染滴度敲低篩選分析本實施例公開了可用于測定本發(fā)明的有切口的或有缺口的雙鏈體siRNA能否下調一個或多個病毒乾基因的表達。在此實施例中，哺乳動物的細胞用有切口的或有缺口的同源于病毒RNA的雙鏈體siRNA轉染。轉染后，轉染的細胞用含一個或多個序列同源于依照本發(fā)明的轉染的siRNA分子的基因的病毒感染。按照實施例6的方法用有切口的或有缺口的雙鏈體siRNA轉染Vero細胞。在siRNA和Vero細胞溫育快結束時，為轉染步驟制備病毒稀釋液。稀釋病毒樣品以便達到期望的感染復數(MOI)。病毒樣品在PBS/BSA/PS中稀釋，且將合適量的病毒溶液加入到每個孔中。于37。C溫育1小時后，將一定量的轉染培養(yǎng)基(含0.3%BSA、2mLL-谷氨酸、10nMHepes和100單位/ml青霉素/鏈霉素外加胰蛋白酶的DMEM培養(yǎng)基)加入到每個孔中。于37。C溫育48小時。溫育結束后，收集上清液且于4。C貯存。根據實施例7通過進行HA分析測量siRNA引導的病毒RNA干擾。實施例9篩選具敲低活性的流感特異性dicer核酸內切酶底物siRNA本實施例舉例說明呈現在此的示例性流感特異性siRNA,因為其能有效的降低感染的Vero細胞中流感病毒滴度而被篩選出來。相對于用非靶向對照siRNA轉染的細胞中的病毒滴度，用流感特異性轉染siRNA的細胞中病毒滴度的降低的重要性是其表明流感特異性的siRNA分子干擾了靶病毒一個或多個基因的表達。下面的表6顯示對流感特異的siRNA雙鏈體，其以5'-3'有義(上)和5'-3'反義(下)方式列出。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>轉染前一天，于每孔100fill0o/oFBS/DMEM培養(yǎng)基中，以1.5乂104個細胞每孔接種Vero細胞到96孔平板上。100、20或5nM的每種流感特異性siRNA或非革巴向對照siRNAQneg與Lipofectamine2000(Invitrogen)的0.3nl(1mg/mL原液)混合且在室溫下于25pl的OptiMEM(總體積XGibo)溫育20分鐘。去除接種的Vero細胞的每孔的上清液，且加入75nl10%DMEM完全培養(yǎng)基。然后加入于OptiMEM中的25plsiRNA/Lipofectamine混合物到每孔中。每種條件下各孔測試三次。制備了不具轉染條件的另外的對照孔。轉染后3小時，去除培養(yǎng)基。用含0.3o/。BSA/10mMHEPES/PS的100nllxPBS清洗每孔lx。以MOI=0.1加入30nl的PR8流感病毒到每孔中用于感染。在室溫下搖動平板l個小時。因為轉染后細胞開始分離，所以從孔邊小心加入含0.3%BSA/10mMHEPES/PS+4[lg/ml胰蛋白酶的100plDMEM到每個孔中。平板于37。C、5%C02中溫育48小時。每孔中的50nl上清液通過HA分析法進行兩次測試。DX2852、DX2855、DX2858、DX2861、DX2956和G1498流感特異性dicer底物siRNA和非靶向對照siRNAQneg中的每一種，以5nM、20nM和100nM濃度，與Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)混合，且用于轉染接種的Vero細胞。轉染后，以0.1MOI(感染復數)用PR8流感病毒感染細胞。為了對產生的病毒定量，通過血凝素(HA)分析法對從含感染細胞的孔中得到的上清液進行測試，如實施例7描述的那樣。表7總結了每種siRNA對流感基因表達的敲低活性，以病毒滴度的減少百分率表示(1-(用流感siRNA處理的HA單位粉用對照siRNA處理的HA單位數)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表7中的數據顯示流感特異性dicer底物siRNADX2956有效地減少了用流感病毒感染的Vero細胞中的流感滴度。DX2956顯示了如G1498相似這些數據證明，當用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，Ca)轉染時，siDNADX2956有效減少流感mRNA水平且因此為治療或預防流感感染的優(yōu)秀的候選者。雖然為了理解更清楚，前述的發(fā)明已經以實施例的方式詳細地進行了描述，但是對技術人員很明顯的是某些變化和修飾可在以示例而不是限制的方式呈現的隨附的權利要求的范圍內實施。在上下文中，各種出版物和其它參考文獻以節(jié)約描述的方式在前迷的公開中被引用。這些參考文獻的每一篇為一切目的，以參考的方式在此^:完整的包含在內。然而，應注意請日之前，而且發(fā)明者依據先前的發(fā)明保留這一公開要求優(yōu)先權的權利。權利要求1.一種組合物，其包括(a)雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子，其中所述鏈具有約25到約30個堿基對的長度，所述堿基對可為相同的或不同的；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述肽含氨基酸序列KVLKQ(SEQIDNO51)；其中所述dsRNA分子軛合到所述肽。2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA為siRNA。3.根據權利要求2所述的組合物，其中所述siRNA含同源于人類TNF-a基因序列的一部分的序列。4.根據權利要求2所述的組合物，其中所述siRNA舍同源于病毒基因序列的一部分的序列。5.根據權利要求4所述的組合物，其中所述病毒基因的來源為流感病毒。6.根據權利要求1所述的組合物，其進一步包括載體。7.根據權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA具有2bp3'反義鏈懸垂。8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA具有2bp3'有義鏈懸垂。9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA不具懸垂。10.根據權利要求1所述的組合物，其中所述鏈具有約25到約29個堿基對的長度，所述堿基對可為相同的或不同的。11.根據權利要求1所述的組合物，其中所述dsRNA分子由有義RNA鏈和反義RNA鏈組成，且所述肽軛合到所述反義鏈的5'端。12.根據權利要求1所述的組合物，其中所述肽的所述氨基酸序列選自下組KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:33);KKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:42);VTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:43);AQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:44);KDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:45);KKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:46);KRSRKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:47);RKESYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:41);SYSVYVYKVLKQ(SEQIDNO:48);VYVYKVLKQ(SEQIDNO:49);YKVLKQ(SEQIDNO:50);和KVLKQ(SEQIDNO:51)。13.根據權利要求1所述的組合物，其中所述肽軛合到結合動物細胞的分子。14.一種用于改善與TNF-a相關的炎癥的方法，其包括將改善量的權利要求1-13任一項所述的組合物給藥于動物。15.根據權利要求14所述的方法，其中所述炎癥發(fā)生在關節(jié)炎中。16.根據權利要求14所述的方法，其中所述炎癥發(fā)生在銀屑病中。17.—種用于抑制基因在動物中表達以改善炎癥的方法，其包括將雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子的組合物給藥到所述動物，其中此藥學組合物包括所述dsRNA分子和肽，其中所述dsRNA分子包括約25到約30個堿基對，其中所述肽包括約5到約40個氨基酸且包括氨基酸序列KVLKQ(SEQIDNO:51);且其中所述dsRNA分子軛合到所述肽。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述炎癥發(fā)生在關節(jié)炎中。19.根據權利要求17所述的方法，其中所述炎癥發(fā)生在銀屑病中。20.—種用于改善與流感病毒相關感染的方法，其包括將改善量的根據權利要求1所述的組合物給藥到動物。21.—種組合物，其包括(a)小的抑制性核酸(siRNA)分子，所述siRNA分子包括約15個核普酸至約50個核苷酸的第一條RNA鏈(A鏈)、約1個核普酸至約25個核苷酸的第二條RNA鏈(Bl鏈)，和約1個核芬酸至約25個核芬酸的第三條RNA鏈(B2鏈)；其中所述dsRNA分子扼合到肽；其中所述Bl鏈和所述B2鏈中的每一條互補到所述A鏈的非重疊區(qū)域；其中第一雙鏈區(qū)域(A:Bl)通過退火所述B1鏈和所述A鏈形成；和其中第二雙鏈區(qū)域(A:B2)通過退火所述B2鏈和所述A鏈形成；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子輒合到所述肽。22.根據權利要求21所述的組合物，其中所述A:Bl雙鏈體通過切口或者缺口從所述A:B2雙鏈體分離，其中所述缺口產生自所述A鏈中至少一個未配對的核苷酸，所述未配對的核苷酸位于所述A:Bl雙鏈體和所述A:B2雙鏈體之間。23.根據權利要求22所述的組合物，其進一步包括一個或多個未配對的核苷酸，所述未配對的核苦酸在所迷A鏈、所述B1鏈和/或所述B2鏈的一條或兩條上的3'端。24.根據權利要求22-23中的任一權利要求所述的組合物，其中所述A鏈為約18個核香酸到約40個核苷酸。25.根據權利要求24所述的組合物，其中所述A鏈為約20個核苷酸到約32個核苷酸。26.根據權利要求25所述的組合物，其中所述A鏈為21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31個核苷酸。27.根據權利要求22-23中任一權利要求所述的組合物，其中所述A:Bl雙鏈體和所述A:B2雙鏈體總共包括約15個>^對到約40個堿基對。28.根據權利要求27所述的組合物，其中所述A:B1雙鏈體和所述A:B2雙鏈體總共包括約18個堿基對到約35個堿基對。29.根據權利要求28所述的組合物，其中所述A:B1雙鏈體和所述A:B2雙鏈體總共包括約20個堿基對到約30個堿基對。30.根據權利要求29所述的組合物，其中所述A:B1雙鏈體和所述A:B2雙鏈體總共包括21、22、23、24、25、26、27、28或》9個威基對。31.根據權利要求23所述的組合物，其中所述siRNA分子包括一個或兩個1個核苷酸到5個核苷酸的單鏈3'懸垂。32.根據權利要求22-23中的任一權利要求所述的組合物，其中所述A鏈包括核苷酸序列3'TTCCUAGAAUAAAGAAGCCUCUGUUAC5'(SEQIDNO:76)。33.根據權利要求22所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'GGAUCU3'(SEQIDNO:77)。34.根據權利要求22所述的組合物，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'ACAAUG3'(SEQIDNO:90)。35.根據權利要求22所述的組合物，其中所述A:Bl雙鏈體通過切口從所述A:B2雙鏈體分離。36.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B2鏈以5'羥基終止。37.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'GGAUCUUAUUU3'(SEQIDNO:135)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'CUUCGGAGTT3'(SEQIDNO:136)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(SEQIDNO:137)。38.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈包括核普酸序列5'GGATCTTATTT3'(SEQIDNO:144)，其中所述B2鏈包括核苦酸序列5'CTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:145),且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:146)。39.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAA3'(SEQIDNO:148),其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'ATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:149)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:147)。40.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈包括核普酸序列5'GGAUCUUAUUU3'(SEQIDNO:153)，其中所述B2鏈包括核芬酸序列5'CUUCGGAGTT3'(SEQIDNO:154)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(SEQIDNO:155)。41.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTT3'(SEQIDNO:159),其中所述B2鏈包括核苦酸序列5'CTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:160)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:161)。42.根據權利要求35所述的組合物，其中所述Bl鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAA3'(SEQIDNO:166)，其中所述B2鏈包括核苦齡列5'ATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:34)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:165)。43.根據權利要求35所述的組合物，其中所述B1鏈以5'磷酸終止。44.根據權利要求43所述的組合物，其中所述B1鏈包括核普酸序列5'GGAUCUUAUUU3'(SEQIDNO:138)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'CUUCGGAGTT3'(SEQIDNO:139)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(SEQIDNO:140)。45.根據權利要求43所述的組合物，其中所迷Bl鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTT3'(SEQIDNO:141)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'CTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:142),且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:143)。46.根據權利要求43所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAA3'(SEQIDNO:151),其中所述B2鏈包括核苷,列5'ATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:152)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:150)。47.根據權利要求43所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'GGAUCUUAUUU3'(SEQIDNO:156)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'CUUCGGAGTT3'(SEQIDNO:157)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CUCCGAAGAAAUAAGAUCCTT3'(SEQIDNO:158)。48.根據權利要求43所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTT3'(SEQIDNO:162)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'CTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:163),且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAAATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:164)。49.根據權利要求43所述的組合物，其中所述B1鏈包括核苷酸序列5'CTCCGAAGAA3'(SEQIDNO:39)，其中所述B2鏈包括核苷酸序列5'ATAAGATCCTT3'(SEQIDNO:40)，且其中所述A鏈包括核苷酸序列5'GGATCTTATTTCTTCGGAGTT3'(SEQIDNO:38)。50.—種組合物，其包括(a)小的抑制性核酸(siRNA)分子，所述siRNA分子包括三條鏈A、Bl和B2(A:B1B2);其中A:BlB2包括總共約14個威基對到總共約24個堿基對；其中A代表有義鏈而BlB2代表反義鏈；其中A為約19個核苷酸到約25個核普酸；其中Bl和B2每個獨立地為約1個核苷酸到約15個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約13個核苷酸到約23個核香酸；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子軛合到所述肽。51.—種組合物，其包括(a)小的抑制性核酸(siRNA)分子，所述siRNA分子包括三條鏈A、Bl和B2(A:BlB2);其中A:BlB2包括總共約16個》威基對到總共約22個堿基對；其中A代表有義鏈而BlB2代表反義鏈；其中A為約19個核苷酸到約23個核苷酸；其中Bl和B2每個獨立地為約1個核苷酸到約15個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約13個核苷酸到約23個核苷酸；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子軛合到所述肽。52.—種組合物，其包括(a)小的抑制性核酸(siRNA)分子，所述siRNA分子包括三條鏈A、Bl和B2(A:BlB2);其中A:BlB2包括總共約14個堿基對到總共約24個堿基對；其中A代表反義鏈而BlB2代表有義鏈；其中A為約14個核普酸到約24個核苷酸；其中Bl和B2每個獨立地為約1個核苷酸到約15個核苷酸；和其中Bl+B2的組合長度為約18個核苷酸到約24個核苷酸；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子輒合到所述肽。53.—種組合物，其包括(a)小的抑制性核酸(siRNA)分子，所述siRNA分子包括三條鏈A、Bl和B2(A:BlB2);其中A:BlB2包括總共約14個威基對到總共約22個堿基對；其中A代表反義鏈而BlB2代表有義鏈；其中A為約16個核苷酸到約22個核苷酸；其中Bl和B2每個獨立地為約1個核苷酸到約15個核苷酸；其中Bl+B2的組合長度為約18個核苦酸到約22個核苷酸；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子輒合到所述肽。54.—種組合物，其包括(a)根據權利要求21和50-53中任一權利要求所述的siRNA分子，其中所述siRNA分子有效地減少選自由逆轉錄病毒、呼吸道合胞病毒、人類偏肺病毒、人類副流感病毒和流感病毒組成的組的靶病毒的滴度；和(b)包括約5到約40個氨基酸的肽，其中所述siRNA分子軛合到所述肽。55.根據權利要求21和50-53中任一權利要求所述的組合物，其中所述肽包括選自由以下組成的組的氨基酸序列KRRQRRR(SEQIDNO:1)、RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQIDNO:2)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD(SEQIDNO:3)、AAVALLPAVLLALLAP(SEQIDNO:4)、AAVLLPVLLPVLLAAP(SEQIDNO:5)、VTVLALGALAGVGVG(SEQIDNO:6)、GALFLGWLGAAGSTMGA(SEQIDNO:7)、MGLGLHLLVLAAALQGA(SEQIDNO:8)、LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQIDNO:9)、GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(SEQIDNO:10)、TPPKKKRKVEDPKKKK(SEQIDNO:11)、RRRRRRR(SEQIDNO:12)、KLALKLALKALKAALKLA(SEQIDNO:13)、GLFGAIAGFIENGWEG(SEQIDNO:14)、FFGAVIGTIALGVATA(SEQIDNO:15)、FLGFLLGVGSAIASGV(SEQIDNO:16)、GVFVLGFLGFLATAGS(SEQIDNO:17)、GAAIGLA曹YFGPAA(SEQIDNO:18)、HTGERPFMCSEQIDNO19ERPFVCSEQIDNO20ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPEVC(SEQIDNO:21)ACSCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPEVC(SEQIDNO:22)RCTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPEVC(SEQIDNO:23)TCDCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPEVC(SEQIDNO:24)ACTCPNCKEGGGRGTNLGKKKQHICHIPGCGKVYGKTSHLRAHLRWHSGERPEVC(SEQIDNO:25)PQISLKKKIFFFIFSNFRGDGKSRIHICHLCNKTYGKTSHLRAHLRGHAGSGERPEVC(SEQIDNO:26)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>56.一種用于減少靶病毒滴度的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇siRNA介導的基因沉默的乾基因，其中所述耙基因為輩巴病毒基因；(b)設計和/或合成合適的siRNA分子用于所述靶病毒基因的siRNA介導的基因沉默，其中所迷siRNA分子中的每一種包括有缺口或切口的雙鏈體且其中所述缺口或切口出現在所述siRNA雙鏈體的有義鏈或反義鏈中；(c)軛合所述siRNA到包括約5到約40個氨基酸的肽；和(d)將所述siRNA分子施用到表達所述靶病毒基因的細胞，其中該siRNA分子肽軛合物能特異性結合相應的靶病毒mRNA因而減少其在細胞中的表達水平。57.—種用于減少內源基因表達的方法，所述方法包括以下步驟(a)選擇siRNA介導的基因沉默的乾基因，其中所述乾基因為內源基因；(b)設計和/或合成合適的有缺口或切口的雙鏈體siRNA分子用于所述內源靶基因的siRNA介導的基因沉默，其中所述siRNA分子包括有缺口或切口的雙鏈體且其中所述缺口或切口出現在所述siRNA分子的有義鏈或反義鏈中；和(c)輒合所述siRNA到包括約5到約40個氨基酸的肽；和(d)將所述siRNA分子施用到表達所述內源把基因的細胞，其中所述siRNA分子肽軛合物能特異性結合相應的內源靶mRNA因而減少其在細胞中的表達水平。58.根據權利要求1-13中任一權利要求所述的組合物，其用作改善與TNF-a相關炎癥的藥劑。59.根據權利要求58所述的組合物，其中所述炎癥發(fā)生在關節(jié)炎中。60.根據權利要求58所述的組合物，其中所述炎癥發(fā)生在銀屑病中。61.根據權利要求1所述的組合物，其用作改善與流感病毒相關感染的藥劑。62.根據權利要求1-13中任一權利要求所述的組合物在制備改善與TNF-a相關炎癥的藥劑中的應用。63.根據權利要求62所述的應用，其中所述炎癥發(fā)生在關節(jié)炎中。64.根據權利要求62所述的應用，其中所述炎癥發(fā)生在銀屑病中。65.根據權利要求1所述的組合物在制備改善與流感病毒相關感染的藥劑中的應用。全文摘要本發(fā)明提供了包括雙鏈核糖核酸(dsRNA)分子和約5個至約40個氨基酸的肽的組合物，其中dsRNA分子軛合至所述的肽。dsRNA鏈可具有的長度為約25個至約30個堿基對，這些堿基對可以是相同的或不同的。或者siRNA可包括至少三條鏈(即，至少兩條有義鏈和一條反義鏈或者至少兩條反義鏈和一條有義鏈)，其中所述至少兩條有義鏈或者至少兩條反義鏈是由至少一個核苷酸切口或缺口所分隔開。文檔編號A61K47/48GK101355970SQ200680050395公開日2009年1月28日申請日期2006年11月3日優(yōu)先權日2005年11月4日發(fā)明者保羅·?？瓶恕ぜs翰遜,勒娜特·法莫,史蒂文·C·夸伊,小邁克爾·E·休斯頓,崔坤元,穆罕默德·艾哈邁迪安,薩莎·J·邁爾,陳力山,陳郁靜申請人:Mdrna有限公司