專利名稱：用于預防hiv經(jīng)上皮傳播的組合物和方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及用于阻止人類免疫缺陷病毒(“HIV”)傳播的方法、組合物和制品。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及ICAM-1激動劑/拮抗劑以及它們在阻止HIV經(jīng)粘膜表面而傳播中的應用。
參考本文引用了多篇文獻。這些文獻的完全引用見下。除非特別指明，這些文獻均全文引入本文作參考。
背景技術(shù)：
理解病毒傳播的機制是防止HIV，這種獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子擴散的關鍵。限制AIDS的世界范圍內(nèi)大流行，很大程度上取決于阻止HIV進一步傳播和擴散的能力。
HIV-1性傳播的一個關鍵特點是最初與該病毒接觸的陰道或粘膜表面覆蓋著上皮細胞，它們并非一般情況下與HIV-1感染相關的細胞。為了跨過這道屏障，病毒必須(1)直接跨過上皮細胞或感染上皮細胞，(2)與能在上皮細胞間移動的那些細胞結(jié)合，或(3)延伸(extend)在上皮細胞間的那些可被感染的宿主細胞接觸。已有實驗證據(jù)支持所有這些可能性。此前的研究提示，上皮細胞可被生殖性(productively)感染，但傳播至這些細胞或從這些細胞開始傳播需要直接與已感染的細胞或可感染的細胞接觸。
HIV潛伏感染的白細胞，CD4白細胞和不相關個體的上皮細胞之間的物理接觸可激發(fā)HIV-1快速裝配并釋放至供體細胞與受體細胞之間的封閉空間。在這一過程中，單核細胞形成與上皮膜親密接觸的微絨毛。隔離在這些部位的病毒體隨后通過內(nèi)在化而進入上皮細胞內(nèi)的吞噬體中。這些觀察得到其它很多項研究的支持，它們證實，細胞與細胞間的相互作用是HIV-1有效傳播至上皮細胞和從上皮細胞有效傳播至其它部位的關鍵。
ICAM-1是組成型表達于靜息態(tài)內(nèi)皮細胞、靜息態(tài)單核細胞、靜息態(tài)上皮細胞以及活化的T細胞上的一種單鏈糖蛋白粘附分子。ICAM-1的表達可由各種細胞因子包括IFN-γ，TNF-α，和IL-1來誘導。CD18家族的細胞粘附分子介導免疫系統(tǒng)與炎癥系統(tǒng)的細胞之間的相互作用。LFA-1(也稱為淋巴細胞功能相關抗原-1或CD11a/CD18)可識別并結(jié)合內(nèi)皮細胞表面的ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3。LFA-1的異二聚體結(jié)構(gòu)由一條α鏈以及一條β鏈組成。作為整合蛋白家族的一個成員，LFA-1在多種細胞過程如遷移、抗原提呈、和細胞增殖中發(fā)揮作用。例如，LFA-1介導白細胞對內(nèi)皮細胞的結(jié)合，使得白細胞可從血液中遷移至組織中。ICAM-1是LFA-1的主要配體。ICAM-1通過一個跨膜結(jié)構(gòu)域而錨著在內(nèi)皮細胞上，它具有一個較短的胞漿尾，含有5個細胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，可在被HIV感染的單核細胞和上皮細胞上表達。
美國專利5,891,841(“841專利”)涉及用細胞間粘附分子(ICAM-3)抑制HIV-1所感染的細胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移至其它部位的方法。根據(jù)此“841專利”，對上皮細胞、內(nèi)皮細胞、和成纖維細胞表面的ICAM-1的誘導可介導淋巴細胞的LFA-1依賴性粘附(第12欄，第48-50行)。LFA-1和ICAM-1互為受體，它們在“841專利”中分別被稱為“受體”和“配體”。同前。具體是，“841專利”涉及在HIV誘導的合胞體形成中ICAM-1與LFA-1之間的相互作用。根據(jù)“841專利”，LFA-1對ICAM-1的親和力相對于ICAM-2和ICAM-3為最大(第14欄，第9-16行)。
美國專利5,674,982(“982專利”)涉及抗ICAM-1抗體通過干擾LFA-1與ICAM-1之間的相互作用而降低鼻病毒的感染性的應用。PCT申請WO90/13316A1涉及通過使被HIV感染的白細胞具有與ICAM-1或CD11/CD18家族的一種分子結(jié)合的能力而抑制HIV-1感染細胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移而出的方法。
這類粘附分子在與細胞結(jié)合的病毒或未與細胞結(jié)合的病毒的經(jīng)上皮傳播中的作用尚無人提及。此前的方法和組合物都是通過阻斷ICAM-1與LFA-1的相互作用而阻止病毒從循環(huán)系統(tǒng)遷移至遠離最初感染部位的其它部位。ICAM-1，除了與LFA-1相互作用以外，在暴露于HIV的部位或在病毒進入機體的部位的病毒傳播中的作用，至今無人提及。
目前需要的是用于在暴露于HIV的部位阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法和組合物。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了用于阻止HIV經(jīng)上皮傳播至動物的方法、組合物、和制品?，F(xiàn)有涉及ICAM-1的方法均是干擾ICAM-1/LFA-1結(jié)合和阻止病毒從循環(huán)系統(tǒng)，穿過內(nèi)皮細胞，遷移至機體組織中。本發(fā)明涉及在暴露于HIV的部位阻斷該病毒的經(jīng)上皮傳播，并阻止HIV感染而不是在發(fā)生了感染后治療感染。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了在暴露于HIV的部位用ICAM-1激動劑/拮抗劑阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法。在另一優(yōu)選實施方案中，對病毒傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用含有ICAM-1激動劑/拮抗劑的組合物或制品阻斷該病毒跨過粘膜表面而經(jīng)上皮傳播的方法，所述粘膜如生殖器粘膜、陰道粘膜、直腸粘膜、口腔粘膜、胃腸道粘膜。本發(fā)明還提供了用能產(chǎn)生ICAM-1激動劑/拮抗劑的遺傳改造細菌接種粘膜表面的方法。
在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了用于阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的藥用組合物，其含有ICAM-1激動劑/拮抗劑及一種可藥用載體。在另一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了含有ICAM-1激動劑/拮抗劑和一種基體(substrate)的制品。優(yōu)選的基體包括宮頸環(huán)、避孕套和宮內(nèi)避孕器。
本發(fā)明的其它實施方案和優(yōu)點將在下文舉例說明，并可從這些說明中顯而易見，或可通過本發(fā)明的實踐而領悟。本發(fā)明的目的和優(yōu)點將通過所附權(quán)利要求書中具體指出的方法和組合物而實現(xiàn)。
附圖簡述

圖1A-B顯示與單核細胞結(jié)合的HIV-1Ba-L、與PBL(外周血淋巴細胞)結(jié)合的HIVBa-L、以及不與細胞結(jié)合的病毒跨過單層上皮細胞的能力。
圖2A-B顯示被HIV感染的單核細胞隨時間的傳播(A)和具有不同接種細胞數(shù)的情況下的傳播(B)。
圖3證實，人的宮頸上皮細胞單層提供了一道從單核細胞結(jié)合型HIV-1、PBL結(jié)合型HIV-1、或非細胞結(jié)合型病毒傳播非細胞結(jié)合型HIV-1的屏障。
圖4A-B證實，抗ICAM-1抗體阻斷單核細胞結(jié)合型HIV-1的傳播。當抗ICAM-1抗體針對LFA-1的β亞單位、E-鈣依粘連蛋白(cadherin)、CD103時，可阻斷單核細胞結(jié)合型HIV-1的傳播(4A)，同種型對照不能阻斷傳播(4B)。
圖5證實，抗ICAM-1抗體可體內(nèi)阻止細胞結(jié)合型HIV通過陰道傳播所致感染。在Hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi)，HIV的陰道傳播被抗ICAM-1單克隆抗體徹底阻斷。
圖6A-B證實，293T細胞不表達LFA-1。既不表達ICAM-1又不表達LFA-1的293T細胞感染了HIV后，所致的HIV經(jīng)上皮傳播可被抗ICAM-1抗體阻斷，說明在暴露部位阻止HIV傳播不需要ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
優(yōu)選實施方案詳述目前絕大多數(shù)HIV-1感染是性傳播、主要是異性傳播所致。雖然機械屏障，如避孕套，可非常有效地阻止性傳播，但這種依賴于男性的保護方法通常不被接受或使處于最大危險的婦女無法實施。絕大多數(shù)情況下，處于新HIV感染的最大危險的婦女來自發(fā)展中國家。然而，HIV-1感染在非洲和東南亞的快速傳播已增加了對防止STD傳播的預防性干預的最新緊迫需求。
本發(fā)明提供了在暴露于人類免疫缺陷病毒的部位使用ICAM-1激動劑/拮抗劑阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的組合物和方法。術(shù)語“ICAM-1激動劑/拮抗劑”指能阻斷或刺激與ICAM-1正常功能相關的事件的化合物或生物分子。術(shù)語“暴露部位”指動物機體上暴露于HIV的部分，如生殖器、口腔、直腸、眼組織、耳組織、皮膚等。根據(jù)本發(fā)明，對HIV傳播的阻斷無需阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
在一優(yōu)選實施方案中，將ICAM拮抗劑提供至動物的粘膜表面，包括但不限于生殖器、陰道、直腸、口腔或胃腸道的表面。粘膜表面具有通過性接觸、母嬰傳播途徑、以及其它機制而接觸HIV的潛在部位。ICAM激動劑/拮抗劑可應用于諸如避孕套或?qū)m內(nèi)避孕器等基體表面，或提供在各種形式，如陰道洗液(vaginal wash)、潤滑劑、殺精劑、沖洗劑(douche)、栓劑、母乳添加劑(breast milk supplement)、或嬰兒配方食品(infant formula)中。
抗體是多功能的預防性干預手段，特別適用于機體的各種部位，尤其粘膜表面。本發(fā)明的抗體可在HIV感染的流行病學中調(diào)節(jié)ICAM-1的功能。其它激動劑/拮抗劑，如反義核苷酸序列和核酶，也可用于調(diào)節(jié)ICAM-1的功能?？贵w是可在疾病的預防中應用的一種高度特異性殺微生物劑。粘膜抗體尤其有效，因為它們一般通過使病原體脫離上皮而發(fā)揮作用。此外，抗體結(jié)構(gòu)的多樣性使得能產(chǎn)生一種幾乎是無窮盡的全能型抗原結(jié)合特異性，這對產(chǎn)生針對具體病原體的特異性殺微生物劑很重要。
術(shù)語“抗體”在本文中指人類免疫球蛋白(Ig)、人源化動物免疫球蛋白、或衍生自植物的人源化免疫球蛋白的全部，所述Ig包括但不限于IgG，IgM，IgA，IgE，以及單價片段、二價片段、和多價片段等片段。優(yōu)選的抗體包括在植物中產(chǎn)生的二價IgG型和多價IgA型人類單克隆抗體(“植物抗體(plantibody)”)。另一種優(yōu)選抗體是抗人ICAM-1 IgG1。植物抗體系統(tǒng)可輕易地用于產(chǎn)生具有指定特異性的大量抗體。具有特殊化合價、類別的抗體，以及在IgA的情況下含有分泌型成分的抗體，都可在谷類植物中產(chǎn)生。
出于多種原因，分泌型IgA聚合物在植物中的表達要優(yōu)于更傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)。sIgA的產(chǎn)生在植物中是一種單細胞系統(tǒng)，而在哺乳動物產(chǎn)生系統(tǒng)中需要兩種不同類型的細胞。植物抗體系統(tǒng)具有一種IgA聚合物支架，可在該支架中插入現(xiàn)有成熟抗體的cDNA。植物抗體與產(chǎn)生并維持在細胞培養(yǎng)中的抗體相比，還具有較高穩(wěn)定性，且較不易被誘變。能產(chǎn)生抗體的植物比傳統(tǒng)的雜交瘤細胞系保存時間長，可使維持成本縮減3-6個數(shù)量級。此外，植物抗體可無限增產(chǎn)，即從一棵植物至數(shù)千畝植物，并且無需考慮因細胞培養(yǎng)中潛在的病毒污染所帶來的安全性問題。
另一類優(yōu)選的抗體是sIgA，它是粘膜表面(包括陰道和宮頸)的一種常見抗體。該抗體與IgG類抗體在功能上的區(qū)別是，大多數(shù)吞噬細胞表面缺乏IgA的Fc受體，且sIgA不能通過經(jīng)典途徑固定補體。這些特性降低了sIgA的前炎性潛力，這種潛力是在諸如胃腸道或小支氣管等部位，當炎癥可能導致功能受損的情況下，一種非常有用的特征。sIgA的Fc受體較少以及補體結(jié)合能力較弱使得這類免疫球蛋白不太可能誘導與某些HIV-1特異性IgG相關的感染惡化問題。IgA區(qū)別于IgG的另一點是，它只與上皮細胞反應，這種反應通過表達于上皮細胞的basolateral表面的聚合物式Ig受體來介導。IgA二聚體與上皮細胞表面的這些受體結(jié)合，這些受體允許該抗體分子，以及與之結(jié)合的任何抗原，穿過上皮細胞而不被降解。該受體的一部分在IgA分子脫離上皮細胞后仍與IgA結(jié)合，產(chǎn)生IgA的分泌片。聚合物式Ig受體的功能成分在不同物種(包括小鼠和人類)之間高度保守。
在另一優(yōu)選實施方案中，提供了一種預防性藥用組合物，其含有ICAM-1激動劑/拮抗劑及一種可藥用載體?！翱伤幱幂d體”指適用于粘膜表面的載體或賦形劑?？蓪CAM-1激動劑/拮抗劑配制在任何合適的載體中，只要拮抗劑和載體相容。拮抗劑的活性應不被載體降低至不再阻斷HIV傳播的程度。載體可以為水性或非水性，如含醇類或為油性，或它們的組合，還可含有其它表面活性劑、軟化劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑、染料和活性成分如防腐劑、抗生素、避孕藥、殺精劑或藥用試劑。所述組合物可以是乳膏、泡沫劑、洗劑、軟膏劑、溶液、固體和噴霧劑。
優(yōu)選的載體適用于陰道、口腔、胃腸道、及直腸。特別優(yōu)選的載體為粘膜粘著劑。適當?shù)妮d體可包含有機溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑(moisturizer)、穩(wěn)定劑、濕潤劑(wetting agent)、控釋劑、多價螯合劑、染料、香料以及在粘膜給藥的藥用組合物中常用的其它成分。
本發(fā)明的組合物可以是能用于陰道的陰道洗液或沖洗劑。含有ICAM-1激動劑/拮抗劑的母乳添加劑和嬰兒配方食品優(yōu)選通過口腔粘膜表面為嬰兒提供ICAM-拮抗劑。
固體劑型包括栓劑、粉劑、和顆粒。在固體劑型中，所述組合物可與至少一種惰性稀釋劑如蔗糖、乳糖、或淀粉混合且還可包含潤滑劑、緩沖劑、以及本領域技術(shù)人員已知的其它成分。
在本發(fā)明的方法、組合物、以及制品中，ICAM-1激動劑/拮抗劑的實際用量可以變化，以便在暴露于病毒的部位或病毒進入的部位獲得具有所需預防性應答的量。相應地，對劑量水平的選擇取決于，接觸病毒的部位或病毒進入的部位的特點和位置，所需的預防性應答，給藥途徑，預防作用需要維持的時間以及其它因素。
用于本發(fā)明組合物、制品、和方法中的優(yōu)選的激動劑/拮抗劑是抗ICAM-1抗體?？贵w的有效濃度通常為約20-約2000μg/ml，但該濃度可根據(jù)具體情況變化?？笽CAM-1植物抗體的用量可達約5-10mg/ml。
本發(fā)明的ICAM-1激動劑/拮抗劑可用任何適當?shù)姆椒ńo藥。優(yōu)選將ICAM-1激動劑/拮抗劑局部應用于粘膜表面以防止HIV傳播。優(yōu)選使抗ICAM-1抗體包含在一種粘膜粘著劑賦形劑中而運送，該賦形劑能使免疫球蛋白活性維持一至數(shù)天。
本發(fā)明的激動劑/拮抗劑還可通過能表達抗ICAM-1激動劑/拮抗劑(如抗ICAM-1抗體、抗ICAM-1反義分子、ICAM-1抗原、或核酶)的遺傳改造型細菌來運送?！斑z傳改造型”細菌含有或轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒DNA載體或其它載體，如病毒載體，裸露的DNA或RNA，它們包含編碼抗ICAM抗體的核苷酸，抗ICAM反義核苷酸序列，或核酶。優(yōu)選的遺傳改造型細菌是屬于目標粘膜(即生殖道、口腔等)表面的正常菌群成員的那些。遺傳改造型細菌可用任何適當?shù)闹亟MDNA方法或本領域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生。
在另一優(yōu)選實施方案中，提供了含有一種基體以及一種ICAM-1激動劑/拮抗劑的制品。術(shù)語“支持物”指能浸透或涂布ICAM-1激動劑/拮抗劑并將ICAM-1激動劑/拮抗劑運送至機體的粘膜表面的物品，如海綿，避孕套，隔膜，宮內(nèi)避孕器，或?qū)m頸環(huán)。例如，避孕套可通過噴射方式將所述拮抗劑涂布在其表面，或在生產(chǎn)過程中用領域內(nèi)已知的方法將所述拮抗劑浸透在避孕套中。嬰兒奶嘴也可用類似的方法涂布。在另一優(yōu)選實施方案中，將抗ICAM-1抗體置于一種緩釋產(chǎn)品中來運送，如浸透了該抗體的宮頸環(huán)。
由于HIV主要通過性活動傳播，本發(fā)明的一個優(yōu)選方法包括在性活動期間或之前使本發(fā)明的激動劑/拮抗劑組合物與陰道上皮或其它粘膜表面接觸。優(yōu)選使用涂布或浸透了ICAM-1激動劑/拮抗劑的避孕套等避孕用品，或局部用藥組合物如膠質(zhì)或泡沫劑時，所用量足以防止HIV傳播和感染。當希望強化避孕效果時，可將所述組合物與一種殺精劑聯(lián)合使用。
在本發(fā)明的又一實施方案中，可將ICAM-1激動劑/拮抗劑固定在一種固體(如塑料、或類似材料)的表面，以便運送至暴露于HIV的部位。適當?shù)乃芰嫌?，聚氯乙烯、聚乙烯、聚氨基甲酸酯或硅以及常用于容器和奶瓶的其它物質(zhì)。奶瓶，包括配有奶嘴的奶瓶，或其它容器以及能裝生物流體的導管可用足量的ICAM-1激動劑/拮抗劑涂布，其量足以防止或阻斷與細胞結(jié)合的HIV的傳播。所述激動劑/拮抗劑還可在塑料聚合物的聚合期間摻入，然后以控釋形式從表面浸出。
具體ICAM-1激動劑/拮抗劑和組合物阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的能力可在跨孔(transwell)培養(yǎng)系統(tǒng)中評估。優(yōu)選的跨孔系統(tǒng)包含一種插件，其能將24孔板的孔通過一種可拆式網(wǎng)格分隔為上下兩個室，該網(wǎng)格含有直徑5m的孔。將人類宮頸上皮細胞系如ME180(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)在該可拆式網(wǎng)格上培養(yǎng)至長滿。使長滿的上皮細胞形成一道屏障，該屏障不可通透C14-菊粉，而且相對于與外周血淋巴細胞(PBL)結(jié)合的病毒，可選擇性通透與巨噬細胞結(jié)合的病毒。穿過這道上皮障礙而傳播的HIV將出現(xiàn)在跨孔系統(tǒng)的下層小室中。因此，可評估ICAM-1激動劑/拮抗劑阻斷HIV跨過這道支持已長滿之上皮細胞屏障的網(wǎng)格而傳播的能力。該跨孔系統(tǒng)允許快速而直接地檢查具有不同特異性的Mab阻斷與細胞結(jié)合的HIV-1跨過上皮細胞單層的能力。這類系統(tǒng)也可用于比較抗體類別和同種型之間的相對效力。
ICAM-1激動劑/拮抗劑還可在具有十分接近于真實傳播狀況的動物模型體內(nèi)進行評估。例如，Hu/PBL-SCID小鼠陰道傳播模型是研究HIV-1傳播的極好模型。移植到這種小鼠體內(nèi)的人類PMBC細胞在感染時(細胞移植的8-10天后)，其活化狀態(tài)類似于人的外周血單核細胞(PBMC)中所見，而明顯區(qū)別于通常用于培養(yǎng)HIV的組織培養(yǎng)中所見。此外，對傳播至Hu-PBL-SCID小鼠的變體的種系發(fā)生分析顯示，病毒傳播不是隨機的，具有巨噬細胞向性的病毒變體亞組被優(yōu)選傳播。這種傳播模式與某些人類中的完全一樣，在這些人體內(nèi)，只有非常有限范圍的巨噬細胞向性病毒從供體傳播至受體?？蓪CAM-1激動劑/拮抗劑應用于已暴露給HIV的Hu-PBL-SCID小鼠，以評估ICAM-1激動劑/拮抗劑阻斷HIV體內(nèi)傳播的能力。
本發(fā)明的教導在具體問題或環(huán)境中的應用是在本領域技術(shù)人員通過本文之教導而能實施的范圍之內(nèi)。本發(fā)明之產(chǎn)物及其應用方法的其它實例見于以下實施例。
實施例1分離無細胞的HIV以及被HIV感染的外周血淋巴細胞和單核細胞HIV-1Ba-L(Advanced Biotechnologies Inc.，Columbia，MD)是HIV的一種巨噬細胞向性、NSI、CCR5-應用型變體，其市售產(chǎn)品為1.0ml等份試樣(1×10650％組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)/ml)且保存在液氮中。應用于培養(yǎng)物之前將病毒原液新鮮解凍。
將已經(jīng)白細胞分離術(shù)處理過的血液在Ficoll Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)上離心而分離人的PBMC。將總PBMC用添加了100U/ml青霉素/100mcg鏈霉素、10ng/ml慶大霉素、和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640(培養(yǎng)基和所有添加物均來自Life Technologies，Grand Island，NY)稀釋成1×107/ml，然后鋪板于75或150cm2組織培養(yǎng)燒瓶(Corning ScientificProducts，Inc.，Cambridge，MA)中。在培養(yǎng)的最初12小時內(nèi)，將細胞重懸在添加了20％熱滅活的FCS(56℃45min，Gemini Bio-Products，Inc.Calabasas，CA)和10％熱滅活的A/B型人類血清(HS；Nabi，Boca Raton，F(xiàn)L)的上述RPMI-1640(后文稱cRPMI)中。收集單核細胞。棄去未粘附的PBMC；將粘附的細胞用冷HBSS(Life Technologies)從燒瓶中取出。通過測定表面抗原CD14的表達(FITC-標記的抗人CD14抗體，My-4；Coulter Immunotech，Hialeah，F(xiàn)L)，確定粘附細胞中＞95％是單核細胞。將單核細胞洗滌并以5×106/ml與1×103TCID50的HIV-1Ba-L重懸于25cm2燒瓶(Corning ScientificProducts，Inc.)中的5ml cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中，于37℃、5％CO2中培養(yǎng)。24小時后取出病毒培養(yǎng)液，細胞用cRPMI洗滌一次，添加新鮮的cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS。在感染后(pi)第3和第7天給培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基。用冷HBSS或0.02％EDTA(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)從燒瓶中取出單核細胞，用于在感染后第10天進行的實驗。
將PBL(外周血淋巴細胞)在添加了PHA(5μg/ml，Sigma)的cRPMI-10％FCS中以2×106/ml的密度重懸48小時。用1×103TCID50HIV-1Ba-L感染后，用培養(yǎng)單核細胞的類似方法培養(yǎng)PBL，區(qū)別在于PBL培養(yǎng)基含10U/mlIL-2(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。單核細胞和PBL受HIV-1感染的程度可通過用HIV-1 gag-特異性引物(正向引物5’-GCG-AGA-GCG-TCA-GTA-TTA-AGC-GG-3’，和反向引物5’-TCT-GAT-AAT-GCT-GAA-AAC-ATG-GG-3’)以及如前述的相應標準和對照進行有限稀釋PCR來確定。PCR產(chǎn)物可通過在1％瓊脂糖凝膠上電泳來觀察。
無細胞的病毒衍生自cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中被HIV-1Ba-L感染的單核細胞或被HIV-1Ba-L感染的PBL。離心并濾過0.2μm的注射器濾膜(Millipore，Bedford，MA)使上清不含細胞。無細胞的病毒可通過HIV p24ELISA(Dupont NEN，Boston，MA)定量，并通過與來自HIV陰性健康供體的PBMC共培養(yǎng)來確定TCID50。
實施例2人類宮頸上皮細胞跨孔培養(yǎng)將自發(fā)轉(zhuǎn)化的人類宮頸上皮細胞系ME-180(ATCC，Rockville，MD)培養(yǎng)在75cm2燒瓶中的cRPMI-10％FCS中，每3天通過用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)處理細胞而常規(guī)傳代。將ME-180細胞以2×105/0.1ml cRPMI-10％FCS或-10％HS/5.0μm鋪在12mm直徑的跨孔插件(insert)(Corning Scientific Products，Inc.)上。將跨孔中的ME-180細胞維持在37℃，5％CO2下。每2-3天換培養(yǎng)基。7天后，細胞在跨孔插件上形成極化的完整單層，這可利用歐姆計(ohmmeter)(Millipore)監(jiān)控橫跨上皮的阻抗和用熒光染料標記的抗ZO1抗體染色來證實，其中所述ZO1是一種在上皮細胞緊密連接處發(fā)現(xiàn)的蛋白(20)(1∶50稀釋，Zymed，San Francisco，CA)。插件上的ME-180單層隨時可用于在培養(yǎng)至第7-第10天時進行實驗。
實施例3經(jīng)上皮遷移和HIV-1的傳播如Bomsel所述進行經(jīng)上皮遷移試驗，有幾處改動。簡短說，將1×106被HIV-1Ba-L感染的單核細胞、1×106被HIV-1Ba-L感染的PBL、或單核細胞或PBL培養(yǎng)上清中的無細胞HIV-1添加至上皮細胞單層的頂側(cè)(apical side)。進行時間過程的分析，在將已感染的細胞添加至插件后的1-48小時之間收集頂側(cè)和基側(cè)(basal side)的培養(yǎng)基。在24小時的時候橫跨單層的傳播接近最大值，選此時間點進行所有后續(xù)實驗。單核細胞和PBL的活力通過臺盼蘭(Sigma)排除法來評估，然后將細胞添加至跨孔中，傳播24小時后，結(jié)果總是＞90％。用HIV-1 p24抗原ELISA試驗(Dupont NEN)定量頂側(cè)和基側(cè)上清液中HIV-1 p24抗原的量(靈敏度為12.5pg/ml-350pg/ml)。
實施例4
傳播阻斷研究將小鼠抗人ICAM-1抗體(20μg/ml；及其稀釋液；HA58(IgG1)，Pharmingen)，抗人E-鈣依粘連蛋白抗體(20μg/ml；67A4(IgG1)CoulterImmunotech，和E4.6(IgG1))、抗人CD103抗體(20μg/ml；2G5(IgG2a)，CoulterImmunotech，和αE7-1(IgG2a)、αE7-2(IgG1)和αE7-3(IgG1))、以及抗人CD18抗體(20μg/ml；L130(IgG1)，Becton Dickinson)、或它們各自的同種型對照添加至1×106被HIV感染的單核細胞或被HIV感染的293T細胞(含或不含ICAM-1)，然后將它們迅速添加至ME-180跨孔培養(yǎng)中。根據(jù)AIDS ClinicalTrials Group(ACTG)Antibody Selection Working Group為證實某種抗體在低至體內(nèi)可獲得的濃度(20-25μg/ml)時的效力而建立的標準，選擇抗體的最高濃度(20μg/ml)。37℃，5％CO2下培養(yǎng)24小時后，收集頂側(cè)和基側(cè)的上清液。用ELISA定量HIV-1p24抗原。
實施例5與單核細胞結(jié)合的HIV-1比與PBL結(jié)合的HIV-1或無細胞病毒更有效地跨過人的宮頸上皮細胞HIV-1感染的單核細胞、HIV-1感染的PBL、或衍生自單核細胞或PBL培養(yǎng)的無細胞的病毒(cfv)，將它們各自的cRPMI-10％FCS溶液，置于含有ME-180上皮細胞的鋪滿單層的跨孔培養(yǎng)物的頂端(apical)小室中。評估與單核細胞結(jié)合的、與PBL結(jié)合的、或無細胞的HIV-1跨過完整的人類宮頸上皮單層的程度(圖1A)。(cRPMI-10％FCS培養(yǎng)基(n＝8個供體，比較單核細胞和PBL以及PBL和cfv之間ap＜0.05；比較單核細胞和cfv之間bp＜0.001))。結(jié)果表示為來自ME-180跨孔培養(yǎng)物的基底(basal)上清液和各種接種物的HIV-1 p24抗原濃度(pg/ml)。
與單核細胞結(jié)合的病毒比與PBL結(jié)合的病毒跨過宮頸上皮的效力高約5倍。衍生自任一種細胞類型的無細胞型病毒不能有效跨過該上皮單層，且通常在p24 ELISA試驗中低于可檢測的極限。
為明確無細胞的HIV-1是否能被Kage及其同事提到的FCS(胎牛血清)中的糖蛋白抑制而不能跨過上皮單層，用已在含10％HS的cRPMI中培養(yǎng)的被HIV-1感染的單核細胞或cfv(無細胞的病毒)進行研究。在這些實驗中，培養(yǎng)在cRPMI-10％HS中的單核細胞結(jié)合型HIV-1，比培養(yǎng)在cRPMI-10％FCS中的單核細胞結(jié)合型病毒更有效地跨過該上皮，也比培養(yǎng)在cRPMI-10％FCS或cRPMI-10％HS中的cfv更有效(圖1B)(cRPMI-10％FCS或HS培養(yǎng)基(每一實驗中n＝3，比較單核細胞(mono)FCS和mono HS之間ap＜0.5，比較cfv FCS和cfv HS之間bp＜0.05，比較mono HS和cfv HS之間cp＜0.005))。相對于在10％FCS中測得的經(jīng)上皮傳播，培養(yǎng)在cRPMI-10％HS中的cfv能跨過完整上皮，但水平顯著低于與細胞結(jié)合的病毒(P＜0.005)(圖1B)。
在多個時間點評估頂部上清液中HIV-1 p24抗原，以便確定病毒從接種至上皮頂側(cè)的被感染的單核細胞或PBL中釋放出的程度。培養(yǎng)在FCS或HS中的被HIV-感染的單核細胞和被HIV-感染的PBL，它們的上清液中p24抗原的濃度在整個感染期間保持彼此相當?shù)乃?，未出現(xiàn)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。
我們發(fā)現(xiàn)，在基底(basilar)上清中測得的HIV-1(用p24濃度表示)當與未被感染的單核細胞或受PHA刺激的PBL混合培養(yǎng)時具有感染性，隨時間的推移，培養(yǎng)物中p24抗原的量增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例6單核細胞以時間-依賴性且劑量-依賴性方式跨過宮頸上皮制備帶有ME-180的跨孔培養(yǎng)物，將cRPMI-10％HS中1×106個被HIV-感染的單核細胞添加至該上皮的頂部側(cè)以分析經(jīng)上皮傳播的動力學。被感染的單核細胞早在4小時的時候就可以測到經(jīng)上皮的遷移和/或經(jīng)上皮的HIV-1傳播(圖2A)，伴有基底p24水平的升高，直至48小時達到頂峰。類似地，將1×106個細胞，或其5倍稀釋液，添加至該上皮的頂側(cè)，取基底側(cè)上清液樣品檢測p24抗原的存在以確定能在上皮的基底側(cè)檢測到病毒所需的最小細胞接種量。當應用5,000個被HIV感染的單核細胞時，在基底培養(yǎng)基中一直能檢測到HIV p24抗原。如LD-PCR所測，其中1-5％的細胞被HIV-1感染(數(shù)據(jù)未顯示)，因此這意味著少至500個被感染細胞就可持續(xù)傳播HIV-1。在跨孔的頂側(cè)加入少至1,000個的單核細胞(感染率同樣為1-5％)，就可在基底側(cè)上清液中檢測到p24(圖2B)。
圖2所示實驗使用被HIVBa-L-感染的單核細胞在cRPMI-10％HS中的溶液進行。結(jié)果表示為基底上清中HIV-1 p24抗原的濃度(pg/ml)。圖中分別顯示了隨時間變化的實驗(n＝4)和隨接種量變化的實驗(n＝2)。+基底p24介于100-1,000pg/ml之間；++基底p24介于1,001-5,000pg/ml之間；+++基底p24介于5,001-30,000pg/ml之間；-基底p24低于檢測的極限(12.5pg/ml)。
實施例7完整的人類宮頸上皮限制了HIV-1的傳播此前曾顯示，位于跨孔插件中的人類宮頸上皮細胞單層形成了一種完整的極性表面，并提供了一種針對無細胞的HIV-1的明確屏障。以下實驗用于確定宮頸上皮單層和將跨孔小室分隔開的膜是否能提供一種限制HIV-1經(jīng)上皮傳播的屏障。為此，測定跨孔下層小室培養(yǎng)基中無ME-180存在時的p24抗原濃度。與由HIV-感染的單核細胞或HIV-感染的PBL所傳播的基底HIV-1 p24抗原的不同水平(如圖1所示)相比，在沒有宮頸上皮細胞的情況下，下層小室的跨孔培養(yǎng)物中測得的p24抗原的量在單核細胞結(jié)合型HIV-1、PBL-結(jié)合型HIV-1、或無細胞型病毒之間無顯著差異(p＞0.005)(圖3)。這些數(shù)據(jù)表明，膜的組成和孔徑大小不能限制HIV-1的傳播，反而是上皮細胞層的緊密連接以及被HIV-感染的細胞與上皮之間的假定相互作用決定了經(jīng)上皮傳播HIV-1的程度。
圖3所示數(shù)據(jù)分別表示為，插件膜上有或沒有ME-180上皮細胞時，跨孔培養(yǎng)物的基底側(cè)或下層小室上清液中的p24抗原(pg/ml)。圖中還顯示了另一個試驗(n＝3)，有或沒有ME-180的接種組之間的比較p＜0.05，沒有ME-180的接種組之間的比較p＞0.05。
實施例8抗ICAM-1抗體阻斷單核細胞結(jié)合型HIV-1的傳播為了檢查被HIV感染的單核細胞與上皮細胞之間的粘附作用是否經(jīng)上皮遷移和HIV-1傳播的關鍵，將針對數(shù)種粘附分子的抗體添加至跨孔培養(yǎng)物中。在被HIV感染的單核細胞以及培養(yǎng)中剩余的細胞進行實驗的同時添加針對ICAM-1、CD18、E-鈣依粘連蛋白、或αE-β7整合蛋白(CD103)的抗體(1-20μg/ml)。所選抗體能靶向已顯示參與免疫細胞與上皮細胞之結(jié)合的特異性配體-受體相互作用。
ICAM-1在被HIV感染的單核細胞和上皮細胞上表達。抗ICAM-1抗體阻斷單核細胞結(jié)合型HIV-1的傳播，如上皮細胞單層基底側(cè)的p24抗原量所示(圖4A)。CD18分子是淋巴細胞功能相關性抗原LFA-1的β亞單位，其結(jié)合ICAM-1并參與HIV誘導的合胞體形成。抗CD18抗體及其同種型對照不能阻斷HIV-1的經(jīng)上皮傳播(圖4A)。
為了測定對經(jīng)上皮傳播的抑制作用是否特異性針對ICAMLFA-1相互作用，檢驗了抗E-鈣依粘連蛋白和CD103的抗體在跨孔系統(tǒng)中抑制HIV-1傳播的能力。E-鈣依粘連蛋白表達在上皮細胞表面，其配體CD103表達在單核細胞以及一個PBL亞類的表面。抗E-鈣依粘連蛋白抗體、抗CD103抗體、以及它們各自的同種型對照不能阻斷HIV-1的經(jīng)上皮傳播(圖4，A和B)。經(jīng)測定，被HIV感染的單核細胞與這些實驗中使用的抗體一起保溫不改變從被感染細胞釋放出的病毒量，如保溫24小時后頂部上清液中所測(數(shù)據(jù)未顯示)。將抗E-鈣依粘連蛋白(20mg/ml)、抗CD103(20mg/ml)、抗CD18(LFA-1)(20mg/ml)、鼠IgG1(20mg/ml)和鼠IgG2a(20mg/ml)抗體與被感染的單核細胞一起添加至跨孔培養(yǎng)物中，對HIV-1的經(jīng)上皮傳播沒有影響。圖4的結(jié)果表示為基底側(cè)上清液中的HIV-1 p24抗原，p＜0.05。
實施例9抗ICAM-1 MAB抑制HIV-1在HU-PBL-SCID小鼠中的陰道傳播單克隆抗體在Hu-PBL-SCID小鼠中可提供對抗HIV-1的保護作用，如此前的三項研究所示。但是，這些研究無一涉及抗ICAM-1抗體或提到對抗病毒之陰道傳播的保護作用。在所有例子中，Mab可有效對抗攜有其所針對的特異性表位的病毒，但不能對抗異源HIV-1變體而提供交叉保護。
如表1所示，陰道中應用抗ICAM-1的Mab徹底阻斷了SCID小鼠模型中細胞結(jié)合型HIV-1的陰道傳播。結(jié)果具有統(tǒng)計學顯著性(p＝0.03，單側(cè)Fisher真實性(exact)檢驗；p＝0.06，雙側(cè)Fisher真實性檢驗)。
表1
實施例10對細胞結(jié)合型HIV的經(jīng)上皮傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合對并不在其表面表達ICAM-1的293T細胞進行轉(zhuǎn)染，以確定對細胞結(jié)合型HIV的經(jīng)上皮傳播的阻斷是否需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。結(jié)果表明，被感染的293T細胞能夠跨過上皮細胞屏障傳播HIV-1，而這種傳播(如跨孔系統(tǒng)的基底小室中HIV-1 p24抗原的濃度所測)可被抗ICAM-1抗體阻斷(表2)。
表2
*p＜0.001，比較p24濃度的差異由于ICAM-1不在293T細胞表面表達(數(shù)據(jù)未顯示)，抗ICAM-1抗體阻斷傳播的能力必須通過與ME180宮頸上皮細胞系(已知其表達ICAM-1)表面的ICAM-1的相互作用。流式細胞儀分析表明，293T細胞不表達LFA-1(圖6A-B)。由于293T細胞缺乏LFA-1，抗ICAM-1抗體不能通過阻斷ICAM-1與其對應受體LFA-1之間的相互作用而阻斷傳播。
實施例11抗ICAM-1 MAB不引起陰道炎性應答有一種潛在的擔心是，陰道內(nèi)給與能針對免疫應答中起作用的配體的抗體可能激發(fā)局部炎性應答。為了了解該問題，我們每天2次，連續(xù)14天在正常BALB/c小鼠陰道內(nèi)給與20mg/ml抗小鼠ICAM-1的IgG2a型Mab、20mg/ml無關的IgG2a型Mab、或5mg傷寒沙門菌(Salmonella typhimirium)脂多糖?？笽CAM-1 Mab在所處理的小鼠陰道上皮中未顯示毒性。
實施例12MAB均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中Mab均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中。這一點可能使針對宿主抗原的Mab具有潛在的臨床應用意義。三只SCID小鼠每天2次接種20mg正常小鼠IgG，共10天。在第4天、第7天、和第10天注射后的剛剛2小時后，用靈敏度為0.1mg/ml的ELISA試驗分析小鼠血清中小鼠Ig濃度的增加。小鼠Ig的基線值范圍為0-4mg/ml。在任何一只小鼠中，在所分析的任何時間點，均未觀察到小鼠抗體濃度的增加。
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上述說明和實施例僅為舉例說明實現(xiàn)本發(fā)明的目標、特征和優(yōu)勢的優(yōu)選實施方案，并非意圖將本發(fā)明限制在該范圍內(nèi)。落在后續(xù)權(quán)利要求書的精神和范疇之內(nèi)的本發(fā)明任何修飾可以被認為是本發(fā)明的部分。
權(quán)利要求
1.一種阻斷HIV經(jīng)上皮傳播至動物體內(nèi)的方法，其包括在所述動物的暴露于所述HIV的部位處提供一種抗ICAM-1抗體。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗體是植物抗體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗體是抗人ICAM-1 IgG1抗體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述ICAM-1抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述量為約20μg/ml-約1000μg/ml。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述量為約5mg/ml-約10mg/ml。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述動物是哺乳動物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述動物是人類。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗體所用劑型選自乳膏、泡沫劑、口服液、固體、噴霧劑、陰道洗液、陰道沖洗劑、栓劑、母乳添加劑、和嬰兒配方食品。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗ICAM-1抗體提供在一種載體中，該載體含有選自下組的物質(zhì)潤滑劑、表面活性劑、膠質(zhì)、有機溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、控釋劑、多價螯合劑、染料、和香料。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述對HIV與細胞結(jié)合后傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1與LFA-1的結(jié)合。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述暴露位點為粘膜表面。
13.權(quán)利要求12的方法，進一步包括在所述粘膜表面接種已經(jīng)得到遺傳改造的細菌，其中所述細菌能產(chǎn)生抗ICAM-1抗體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述粘膜表面選自生殖器、陰道、直腸、口腔、和胃腸道的表面。
15.一種阻斷HIV與細胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的方法，其包括在動物的陰道上皮上提供一種抗ICAM-1抗體，其中所述對HIV與細胞結(jié)合后傳播的阻斷發(fā)生在所述動物的陰道上皮處。
16.一種能在暴露于HIV的經(jīng)上皮位點處阻斷所述HIV經(jīng)上皮傳播的組合物，其包含一種抗ICAM-1抗體和一種賦形劑，其中所述抗ICAM-1抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述量為約20μg/ml-約1000μg/ml，
18.權(quán)利要求16的組合物，其中所述抗ICAM-1抗體是植物抗體。
19.權(quán)利要求16的組合物，其中所述抗ICAM-1抗體是抗人ICAM-1IgG1抗體。
20.權(quán)利要求18的組合物，其中所述植物抗體的量為約5mg/ml-約10mg/ml。
21.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為母乳添加劑。
22.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為嬰兒配方食品。
23.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為陰道洗液。
24.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為口服液。
25.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為栓劑。
26.權(quán)利要求16的組合物，其中所述組合物為抗ICAM-1抗體，而所述賦形劑為一種可藥用的載體。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述賦形劑選自潤滑劑、表面活性劑、膠、有機溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、控釋劑、多價螯合劑、染料、和香料。
28.權(quán)利要求26的組合物，其中所述賦形劑為粘膜粘著劑。
29.一種用于阻斷HIV與細胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的制品，其包括一種基體和一種抗ICAM-1抗體。
30.權(quán)利要求29的制品，其中所述抗ICAM-1抗體浸透在所述基體中。
31.權(quán)利要求29的制品，其中所述抗ICAM-1抗體涂布在所述基體表面。
32.權(quán)利要求29的制品，其中所述基體選自海綿、避孕套、宮內(nèi)避孕器、宮頸環(huán)和隔膜。
33.權(quán)利要求29的制品，其中所述基體含有一種避孕用品。
全文摘要
本發(fā)明提供了用ICAM－1激動劑/拮抗劑阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的方法，組合物和制品。所述ICAM－1激動劑/拮抗劑在暴露至病毒的位點阻斷病毒傳播。對病毒傳播的阻斷不需要阻斷ICAM－1對LFA－1的結(jié)合。所述ICAM－1激動劑/拮抗劑可應用于粘膜表面，避孕用品表面或內(nèi)部或口服液如母奶添加劑和嬰兒配方食品中。
文檔編號A61K9/08GK1402797SQ00811362
公開日2003年3月12日 申請日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月24日
發(fā)明者理查德·B·馬卡姆, 克里斯騰·V·卡納 申請人:約翰·霍普金斯大學