專利名稱：用于預(yù)防hiv經(jīng)上皮傳播的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于阻止人類免疫缺陷病毒(“HIV”)傳播的方法、組合物和制品。在 一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑以及它們?cè)谧柚笻IV經(jīng)粘 膜表面而傳播中的應(yīng)用。參考本文引用了多篇文獻(xiàn)。這些文獻(xiàn)的完全引用見(jiàn)下。除非特別指明，這些文獻(xiàn)均全 文引入本文作參考。
背景技術(shù)：
理解病毒傳播的機(jī)制是防止HIV，這種獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的致病因子 擴(kuò)散的關(guān)鍵。限制AIDS的世界范圍內(nèi)大流行，很大程度上取決于阻止HIV進(jìn)一步傳播和擴(kuò) 散的能力。HIV-I性傳播的一個(gè)關(guān)鍵特點(diǎn)是最初與該病毒接觸的陰道或粘膜表面覆蓋著上皮 細(xì)胞，它們并非一般情況下與HIV-I感染相關(guān)的細(xì)胞。為了跨過(guò)這道屏障，病毒必須(1)直 接跨過(guò)上皮細(xì)胞或感染上皮細(xì)胞，(2)與能在上皮細(xì)胞間移動(dòng)的那些細(xì)胞結(jié)合，或(3)延伸 (extend)在上皮細(xì)胞間的那些可被感染的宿主細(xì)胞接觸。已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持所有這些可能 性。此前的研究提示，上皮細(xì)胞可被生殖性(productively)感染，但傳播至這些細(xì)胞或從 這些細(xì)胞開(kāi)始傳播需要直接與已感染的細(xì)胞或可感染的細(xì)胞接觸。HIV潛伏感染的白細(xì)胞，CD4白細(xì)胞和不相關(guān)個(gè)體的上皮細(xì)胞之間的物理接觸可 激發(fā)HIV-I快速裝配并釋放至供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的封閉空間。在這一過(guò)程中，單核 細(xì)胞形成與上皮膜親密接觸的微絨毛。隔離在這些部位的病毒體隨后通過(guò)內(nèi)在化而進(jìn)入上 皮細(xì)胞內(nèi)的吞噬體中。這些觀察得到其它很多項(xiàng)研究的支持，它們證實(shí)，細(xì)胞與細(xì)胞間的相 互作用是HIV-I有效傳播至上皮細(xì)胞和從上皮細(xì)胞有效傳播至其它部位的關(guān)鍵。ICAM-I是組成型表達(dá)于靜息態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞、靜息態(tài)單核細(xì)胞、靜息態(tài)上皮細(xì)胞以 及活化的T細(xì)胞上的一種單鏈糖蛋白粘附分子。ICAM-I的表達(dá)可由各種細(xì)胞因子包括 IFN-y ,TNF-α，和IL-I來(lái)誘導(dǎo)。CD18家族的細(xì)胞粘附分子介導(dǎo)免疫系統(tǒng)與炎癥系統(tǒng)的細(xì) 胞之間的相互作用。LFA-I (也稱為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1或⑶Ila/⑶18)可識(shí)別并結(jié) 合內(nèi)皮細(xì)胞表面的ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3。LFA-I的異二聚體結(jié)構(gòu)由一條α鏈以及一 條β鏈組成。作為整合蛋白家族的一個(gè)成員，LFA-I在多種細(xì)胞過(guò)程如遷移、抗原提呈、和 細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。例如，LFA-I介導(dǎo)白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，使得白細(xì)胞可從血液中遷移至組織中。ICAM-I是LFA-I的主要配體。ICAM-I通過(guò)一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域而錨著在內(nèi)皮 細(xì)胞上，它具有一個(gè)較短的胞漿尾，含有5個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，可在被HIV感染 的單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞上表達(dá)。美國(guó)專利5，891，841 ( “841專利”)涉及用細(xì)胞間粘附分子(ICAM-3)抑制HIV-I 所感染的細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)遷移至其它部位的方法。根據(jù)此“841專利”，對(duì)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì) 胞、和成纖維細(xì)胞表面的ICAM-I的誘導(dǎo)可介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的LFA-I依賴性粘附(第12欄，第 48-50行)。LFA-I和ICAM-I互為受體，它們?cè)凇?41專禾lj”中分別被稱為“受體”和“配體”。 同前。具體是，“841專利”涉及在HIV誘導(dǎo)的合胞體形成中ICAM-I與LFA-I之間的相互作 用。根據(jù)“841專利”，LFA-I對(duì)ICAM-I的親和力相對(duì)于ICAM-2和ICAM-3為最大(第14 欄，第9-16行)。美國(guó)專利5，674，982 ( “982專利”)涉及抗ICAM-I抗體通過(guò)干擾LFA-I與ICAM-I 之間的相互作用而降低鼻病毒的感染性的應(yīng)用。PCT申請(qǐng)W090/13316 Al涉及通過(guò)使被HIV 感染的白細(xì)胞具有與ICAM-I或⑶11/⑶18家族的一種分子結(jié)合的能力而抑制HIV-I感染 細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)中遷移而出的方法。這類粘附分子在與細(xì)胞結(jié)合的病毒或未與細(xì)胞結(jié)合的病毒的經(jīng)上皮傳播中的作 用尚無(wú)人提及。此前的方法和組合物都是通過(guò)阻斷ICAM-I與LFA-I的相互作用而阻止病 毒從循環(huán)系統(tǒng)遷移至遠(yuǎn)離最初感染部位的其它部位。ICAM-I，除了與LFA-I相互作用以外， 在暴露于HIV的部位或在病毒進(jìn)入機(jī)體的部位的病毒傳播中的作用，至今無(wú)人提及。目前需要的是用于在暴露于HIV的部位阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法和組合物。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了用于阻止HIV經(jīng)上皮傳播至動(dòng)物的方法、組合物、和制品?，F(xiàn)有涉及 ICAM-I的方法均是干擾ICAM-1/LFA-1結(jié)合和阻止病毒從循環(huán)系統(tǒng)，穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞，遷移至 機(jī)體組織中。本發(fā)明涉及在暴露于HIV的部位阻斷該病毒的經(jīng)上皮傳播，并阻止HIV感染 而不是在發(fā)生了感染后治療感染。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在暴露于HIV的部位用ICAM-I激動(dòng)劑/拮 抗劑阻斷該病毒經(jīng)上皮傳播的方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，對(duì)病毒傳播的阻斷不需要阻 斷ICAM-I與LFA-I的結(jié)合。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用含有ICAM-I激動(dòng)劑/ 拮抗劑的組合物或制品阻斷該病毒跨過(guò)粘膜表面而經(jīng)上皮傳播的方法，所述粘膜如生殖器 粘膜、陰道粘膜、直腸粘膜、口腔粘膜、胃腸道粘膜。本發(fā)明還提供了用能產(chǎn)生ICAM-I激動(dòng) 劑/拮抗劑的遺傳改造細(xì)菌接種粘膜表面的方法。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的藥用組合物， 其含有ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑及一種可藥用載體。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 含有ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑和一種基體(substrate)的制品。優(yōu)選的基體包括宮頸環(huán)、避 孕套和宮內(nèi)避孕器。本發(fā)明的其它實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)將在下文舉例說(shuō)明，并可從這些說(shuō)明中顯而易見(jiàn)， 或可通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐而領(lǐng)悟。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將通過(guò)所附權(quán)利要求書(shū)中具體指出的 方法和組合物而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還涉及1. 一種阻斷HIV經(jīng)上皮傳播至動(dòng)物體內(nèi)的方法，其包括在所述動(dòng)物的暴露于所述HIV的部位處提供一種抗ICAM-I抗體。2.項(xiàng)1的方法，其中所述抗ICAM-I抗體是植物抗體。3.項(xiàng)1的方法，其中所述抗ICAM-I抗體是抗人ICAM-IIgGl抗體。4.項(xiàng)1的方法，其中所述ICAM-I抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。5.項(xiàng)4的方法，其中所述量為約20 μ g/ml-約1000 μ g/ml。6.項(xiàng)4的方法，其中所述量為約5mg/ml_約10mg/ml。7.項(xiàng)1的方法，其中所述動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。8.項(xiàng)1的方法，其中所述動(dòng)物是人類。9.項(xiàng)1的方法，其中所述抗ICAM-I抗體所用劑型選自乳膏、泡沫劑、口服液、固體、 噴霧劑、陰道洗液、陰道沖洗劑、栓劑、母乳添加劑、和嬰兒配方食品。10.項(xiàng)1的方法，其中所述抗ICAM-I抗體提供在一種載體中，該載體含有選自下組 的物質(zhì)潤(rùn)滑劑、表面活性劑、膠質(zhì)、有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、控 釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、和香料。11.項(xiàng)1的方法，其中所述對(duì)HIV與細(xì)胞結(jié)合后傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-I與 LFA-I的結(jié)合。12.項(xiàng)1的方法，其中所述暴露位點(diǎn)為粘膜表面。13.項(xiàng)12的方法，進(jìn)一步包括在所述粘膜表面接種已經(jīng)得到遺傳改造的細(xì)菌，其 中所述細(xì)菌能產(chǎn)生抗ICAM-I抗體。14.項(xiàng)12的方法，其中所述粘膜表面選自生殖器、陰道、直腸、口腔、和胃腸道的表面。15. 一種阻斷HIV與細(xì)胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的方法，其包括在動(dòng)物的陰道上皮上 提供一種抗ICAM-I抗體，其中所述對(duì)HIV與細(xì)胞結(jié)合后傳播的阻斷發(fā)生在所述動(dòng)物的陰道 上皮處。16. 一種能在暴露于HIV的經(jīng)上皮位點(diǎn)處阻斷所述HIV經(jīng)上皮傳播的組合物，其包 含一種抗ICAM-I抗體和一種賦形劑，其中所述抗ICAM-I抗體的量足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。17.項(xiàng)16的組合物，其中所述量為約20 μ g/ml-約1000 μ g/ml,18.項(xiàng)16的組合物，其中所述抗ICAM-I抗體是植物抗體。19.項(xiàng)16的組合物，其中所述抗ICAM-I抗體是抗人ICAM-I IgGl抗體。20.項(xiàng)18的組合物，其中所述植物抗體的量為約5mg/ml-約10mg/ml。21.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為母乳添加劑。22.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為嬰兒配方食品。23.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為陰道洗液。24.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為口服液。25.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為栓劑。26.項(xiàng)16的組合物，其中所述組合物為抗ICAM-I抗體，而所述賦形劑為一種可藥 用的載體。27.項(xiàng)26的組合物，其中所述賦形劑選自潤(rùn)滑劑、表面活性劑、膠、有機(jī)溶劑、乳化 劑、膠凝劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、和香料。
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28.項(xiàng)26的組合物，其中所述賦形劑為粘膜粘著劑。29. 一種用于阻斷HIV與細(xì)胞結(jié)合后經(jīng)上皮傳播的制品，其包括一種基體和一種 抗ICAM-I抗體。30.項(xiàng)29的制品，其中所述抗ICAM-I抗體浸透在所述基體中。31.項(xiàng)29的制品，其中所述抗ICAM-I抗體涂布在所述基體表面。32.項(xiàng)29的制品，其中所述基體選自海綿、避孕套、宮內(nèi)避孕器、宮頸環(huán)和隔膜。33.項(xiàng)29的制品，其中所述基體含有一種避孕用品。附圖簡(jiǎn)述圖IA-B顯示與單核細(xì)胞結(jié)合的HIV_lBa_L、與PBL(外周血淋巴細(xì)胞)結(jié)合的 HIVb“、以及不與細(xì)胞結(jié)合的病毒跨過(guò)單層上皮細(xì)胞的能力。圖2A-B顯示被HIV感染的單核細(xì)胞隨時(shí)間的傳播(A)和具有不同接種細(xì)胞數(shù)的 情況下的傳播⑶。圖3證實(shí)，人的宮頸上皮細(xì)胞單層提供了一道從單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1、PBL結(jié)合 型HIV-1、或非細(xì)胞結(jié)合型病毒傳播非細(xì)胞結(jié)合型HIV-I的屏障。圖4A-B證實(shí)，抗ICAM-I抗體阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-I的傳播。當(dāng)抗ICAM-I抗 體針對(duì)LFA-I的β亞單位、E-鈣依粘連蛋白(cadherin)、⑶103時(shí)，可阻斷單核細(xì)胞結(jié)合 型HIV-I的傳播(4A)，同種型對(duì)照不能阻斷傳播(4B)。圖5證實(shí)，抗ICAM-I抗體可體內(nèi)阻止細(xì)胞結(jié)合型HIV通過(guò)陰道傳播所致感染。在 Hu-PBL-SCID小鼠體內(nèi)，HIV的陰道傳播被抗ICAM-I單克隆抗體徹底阻斷。圖6A-B證實(shí)，293T細(xì)胞不表達(dá)LFA-I。既不表達(dá)ICAM-I又不表達(dá)LFA-I的293T 細(xì)胞感染了 HIV后，所致的HIV經(jīng)上皮傳播可被抗ICAM-I抗體阻斷，說(shuō)明在暴露部位阻止 HIV傳播不需要ICAM-I與LFA-I的結(jié)合。優(yōu)選實(shí)施方案詳述目前絕大多數(shù)HIV-I感染是性傳播、主要是異性傳播所致。雖然機(jī)械屏障，如避孕 套，可非常有效地阻止性傳播，但這種依賴于男性的保護(hù)方法通常不被接受或使處于最大 危險(xiǎn)的婦女無(wú)法實(shí)施。絕大多數(shù)情況下，處于新HIV感染的最大危險(xiǎn)的婦女來(lái)自發(fā)展中國(guó) 家。然而，HIV-I感染在非洲和東南亞的快速傳播已增加了對(duì)防止STD傳播的預(yù)防性干預(yù) 的最新緊迫需求。本發(fā)明提供了在暴露于人類免疫缺陷病毒的部位使用ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑阻 斷該病毒經(jīng)上皮傳播的組合物和方法。術(shù)語(yǔ)“ ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑”指能阻斷或刺激與 ICAM-I正常功能相關(guān)的事件的化合物或生物分子。術(shù)語(yǔ)“暴露部位”指動(dòng)物機(jī)體上暴露于 HIV的部分，如生殖器、口腔、直腸、眼組織、耳組織、皮膚等。根據(jù)本發(fā)明，對(duì)HIV傳播的阻斷 無(wú)需阻斷ICAM-I與LFA-I的結(jié)合。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，將ICAM拮抗劑提供至動(dòng)物的粘膜表面，包括但不限于生 殖器、陰道、直腸、口腔或胃腸道的表面。粘膜表面具有通過(guò)性接觸、母嬰傳播途徑、以及 其它機(jī)制而接觸HIV的潛在部位。ICAM激動(dòng)劑/拮抗劑可應(yīng)用于諸如避孕套或?qū)m內(nèi)避 孕器等基體表面，或提供在各種形式，如陰道洗液(vaginal wash)、潤(rùn)滑劑、殺精劑、沖洗 劑(douche)、栓劑、母乳添加劑(breast milk supplement)、或嬰兒配方食品(infant formula)中。
抗體是多功能的預(yù)防性干預(yù)手段，特別適用于機(jī)體的各種部位，尤其粘膜表面。本 發(fā)明的抗體可在HIV感染的流行病學(xué)中調(diào)節(jié)ICAM-I的功能。其它激動(dòng)劑/拮抗劑，如反義 核苷酸序列和核酶，也可用于調(diào)節(jié)ICAM-I的功能。抗體是可在疾病的預(yù)防中應(yīng)用的一種高 度特異性殺微生物劑。粘膜抗體尤其有效，因?yàn)樗鼈円话阃ㄟ^(guò)使病原體脫離上皮而發(fā)揮作 用。此外，抗體結(jié)構(gòu)的多樣性使得能產(chǎn)生一種幾乎是無(wú)窮盡的全能型抗原結(jié)合特異性，這對(duì) 產(chǎn)生針對(duì)具體病原體的特異性殺微生物劑很重要。術(shù)語(yǔ)“抗體”在本文中指人類免疫球蛋白(Ig)、人源化動(dòng)物免疫球蛋白、或衍生自 植物的人源化免疫球蛋白的全部，所述Ig包括但不限于IgG，IgM, IgA, IgE,以及單價(jià)片段、 二價(jià)片段、和多價(jià)片段等片段。優(yōu)選的抗體包括在植物中產(chǎn)生的二價(jià)IgG型和多價(jià)IgA型 人類單克隆抗體(“植物抗體(Plantibody) ”)。另一種優(yōu)選抗體是抗人ICAM-I IgGl0植 物抗體系統(tǒng)可輕易地用于產(chǎn)生具有指定特異性的大量抗體。具有特殊化合價(jià)、類別的抗體， 以及在IgA的情況下含有分泌型成分的抗體，都可在谷類植物中產(chǎn)生。出于多種原因，分泌型IgA聚合物在植物中的表達(dá)要優(yōu)于更傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)。 slgA的產(chǎn)生在植物中是一種單細(xì)胞系統(tǒng)，而在哺乳動(dòng)物產(chǎn)生系統(tǒng)中需要兩種不同類型的細(xì) 胞。植物抗體系統(tǒng)具有一種IgA聚合物支架，可在該支架中插入現(xiàn)有成熟抗體的cDNA。植 物抗體與產(chǎn)生并維持在細(xì)胞培養(yǎng)中的抗體相比，還具有較高穩(wěn)定性，且較不易被誘變。能產(chǎn) 生抗體的植物比傳統(tǒng)的雜交瘤細(xì)胞系保存時(shí)間長(zhǎng)，可使維持成本縮減3-6個(gè)數(shù)量級(jí)。此外， 植物抗體可無(wú)限增產(chǎn)，即從一棵植物至數(shù)千畝植物，并且無(wú)需考慮因細(xì)胞培養(yǎng)中潛在的病 毒污染所帶來(lái)的安全性問(wèn)題。另一類優(yōu)選的抗體是slgA，它是粘膜表面(包括陰道和宮頸)的一種常見(jiàn)抗體。 該抗體與IgG類抗體在功能上的區(qū)別是，大多數(shù)吞噬細(xì)胞表面缺乏IgA的Fc受體，且slgA 不能通過(guò)經(jīng)典途徑固定補(bǔ)體。這些特性降低了 slgA的前炎性潛力，這種潛力是在諸如胃腸 道或小支氣管等部位，當(dāng)炎癥可能導(dǎo)致功能受損的情況下，一種非常有用的特征。slgA的 Fc受體較少以及補(bǔ)體結(jié)合能力較弱使得這類免疫球蛋白不太可能誘導(dǎo)與某些HIV-I特異 性IgG相關(guān)的感染惡化問(wèn)題。IgA區(qū)別于IgG的另一點(diǎn)是，它只與上皮細(xì)胞反應(yīng)，這種反應(yīng) 通過(guò)表達(dá)于上皮細(xì)胞的basolateral表面的聚合物式Ig受體來(lái)介導(dǎo)。IgA 二聚體與上皮細(xì) 胞表面的這些受體結(jié)合，這些受體允許該抗體分子，以及與之結(jié)合的任何抗原，穿過(guò)上皮細(xì) 胞而不被降解。該受體的一部分在IgA分子脫離上皮細(xì)胞后仍與IgA結(jié)合，產(chǎn)生IgA的分 泌片。聚合物式Ig受體的功能成分在不同物種(包括小鼠和人類)之間高度保守。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防性藥用組合物，其含有ICAM-I激動(dòng)劑/ 拮抗劑及一種可藥用載體?！翱伤幱幂d體”指適用于粘膜表面的載體或賦形劑?？蓪CAM-I 激動(dòng)劑/拮抗劑配制在任何合適的載體中，只要拮抗劑和載體相容。拮抗劑的活性應(yīng)不被 載體降低至不再阻斷HIV傳播的程度。載體可以為水性或非水性，如含醇類或?yàn)橛托裕蛩?們的組合，還可含有其它表面活性劑、軟化劑、潤(rùn)滑劑、穩(wěn)定劑、染料和活性成分如防腐劑、 抗生素、避孕藥、殺精劑或藥用試劑。所述組合物可以是乳膏、泡沫劑、洗劑、軟膏劑、溶液、 固體和噴霧劑。優(yōu)選的載體適用于陰道、口腔、胃腸道、及直腸。特別優(yōu)選的載體為粘膜粘著 劑。適當(dāng)?shù)妮d體可包含有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝劑、增濕劑(moisturizer)、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑 (wetting agent)、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料、香料以及在粘膜給藥的藥用組合物中常用的
8其它成分。本發(fā)明的組合物可以是能用于陰道的陰道洗液或沖洗劑。含有ICAM-I激動(dòng)劑/ 拮抗劑的母乳添加劑和嬰兒配方食品優(yōu)選通過(guò)口腔粘膜表面為嬰兒提供ICAM-拮抗劑。固體劑型包括栓劑、粉劑、和顆粒。在固體劑型中，所述組合物可與至少一種惰性 稀釋劑如蔗糖、乳糖、或淀粉混合且還可包含潤(rùn)滑劑、緩沖劑、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的 其它成分。在本發(fā)明的方法、組合物、以及制品中，ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑的實(shí)際用量可以變 化，以便在暴露于病毒的部位或病毒進(jìn)入的部位獲得具有所需預(yù)防性應(yīng)答的量。相應(yīng)地，對(duì) 劑量水平的選擇取決于，接觸病毒的部位或病毒進(jìn)入的部位的特點(diǎn)和位置，所需的預(yù)防性 應(yīng)答，給藥途徑，預(yù)防作用需要維持的時(shí)間以及其它因素。用于本發(fā)明組合物、制品、和方法中的優(yōu)選的激動(dòng)劑/拮抗劑是抗ICAM-I抗體?？?體的有效濃度通常為約20-約2000 μ g/ml，但該濃度可根據(jù)具體情況變化?？笽CAM-I植物 抗體的用量可達(dá)約5-10mg/ml。本發(fā)明的ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑可用任何適當(dāng)?shù)姆椒ńo藥。優(yōu)選將ICAM-I激動(dòng) 劑/拮抗劑局部應(yīng)用于粘膜表面以防止HIV傳播。優(yōu)選使抗ICAM-I抗體包含在一種粘膜 粘著劑賦形劑中而運(yùn)送，該賦形劑能使免疫球蛋白活性維持一至數(shù)天。本發(fā)明的激動(dòng)劑/拮抗劑還可通過(guò)能表達(dá)抗ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑(如抗ICAM-I 抗體、抗ICAM-I反義分子、ICAM-I抗原、或核酶)的遺傳改造型細(xì)菌來(lái)運(yùn)送?！斑z傳改造型” 細(xì)菌含有或轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒DNA載體或其它載體，如病毒載體，裸露的DNA或RNA，它們包含編碼 抗ICAM抗體的核苷酸，抗ICAM反義核苷酸序列，或核酶。優(yōu)選的遺傳改造型細(xì)菌是屬于目 標(biāo)粘膜(即生殖道、口腔等)表面的正常菌群成員的那些。遺傳改造型細(xì)菌可用任何適當(dāng) 的重組DNA方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法產(chǎn)生。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了含有一種基體以及一種ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑的 制品。術(shù)語(yǔ)“支持物”指能浸透或涂布ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑并將ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗 劑運(yùn)送至機(jī)體的粘膜表面的物品，如海綿，避孕套，隔膜，宮內(nèi)避孕器，或?qū)m頸環(huán)。例如，避孕 套可通過(guò)噴射方式將所述拮抗劑涂布在其表面，或在生產(chǎn)過(guò)程中用領(lǐng)域內(nèi)已知的方法將所 述拮抗劑浸透在避孕套中。嬰兒奶嘴也可用類似的方法涂布。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，將 抗ICAM-I抗體置于一種緩釋產(chǎn)品中來(lái)運(yùn)送，如浸透了該抗體的宮頸環(huán)。由于HIV主要通過(guò)性活動(dòng)傳播，本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方法包括在性活動(dòng)期間或之前 使本發(fā)明的激動(dòng)劑/拮抗劑組合物與陰道上皮或其它粘膜表面接觸。優(yōu)選使用涂布或浸透 了 ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑的避孕套等避孕用品，或局部用藥組合物如膠質(zhì)或泡沫劑時(shí)，所 用量足以防止HIV傳播和感染。當(dāng)希望強(qiáng)化避孕效果時(shí)，可將所述組合物與一種殺精劑聯(lián) 合使用。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，可將ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑固定在一種固體(如塑 料、或類似材料)的表面，以便運(yùn)送至暴露于HIV的部位。適當(dāng)?shù)乃芰嫌?，聚氯乙烯、聚乙烯?聚氨基甲酸酯或硅以及常用于容器和奶瓶的其它物質(zhì)。奶瓶，包括配有奶嘴的奶瓶，或其它 容器以及能裝生物流體的導(dǎo)管可用足量的ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑涂布，其量足以防止或阻 斷與細(xì)胞結(jié)合的HIV的傳播。所述激動(dòng)劑/拮抗劑還可在塑料聚合物的聚合期間摻入，然 后以控釋形式從表面浸出。
具體ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑和組合物阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的能力可在跨孔 (transwell)培養(yǎng)系統(tǒng)中評(píng)估。優(yōu)選的跨孔系統(tǒng)包含一種插件，其能將24孔板的孔通過(guò) 一種可拆式網(wǎng)格分隔為上下兩個(gè)室，該網(wǎng)格含有直徑5m的孔。將人類宮頸上皮細(xì)胞系如 ME180(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，R0ckville，MD)在該可拆式網(wǎng)格上培養(yǎng)至長(zhǎng)滿。使長(zhǎng)滿 的上皮細(xì)胞形成一道屏障，該屏障不可通透C14-菊粉，而且相對(duì)于與外周血淋巴細(xì)胞(PBL) 結(jié)合的病毒，可選擇性通透與巨噬細(xì)胞結(jié)合的病毒。穿過(guò)這道上皮障礙而傳播的HIV將出 現(xiàn)在跨孔系統(tǒng)的下層小室中。因此，可評(píng)估ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV跨過(guò)這道支持 已長(zhǎng)滿之上皮細(xì)胞屏障的網(wǎng)格而傳播的能力。該跨孔系統(tǒng)允許快速而直接地檢查具有不同 特異性的Mab阻斷與細(xì)胞結(jié)合的HIV-I跨過(guò)上皮細(xì)胞單層的能力。這類系統(tǒng)也可用于比較 抗體類別和同種型之間的相對(duì)效力。ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑還可在具有十分接近于真實(shí)傳播狀況的動(dòng)物模型體內(nèi)進(jìn) 行評(píng)估。例如，Hu/PBL-SCID小鼠陰道傳播模型是研究HIV-I傳播的極好模型。移植到這 種小鼠體內(nèi)的人類PMBC細(xì)胞在感染時(shí)(細(xì)胞移植的8-10天后)，其活化狀態(tài)類似于人的 外周血單核細(xì)胞(PBMC)中所見(jiàn)，而明顯區(qū)別于通常用于培養(yǎng)HIV的組織培養(yǎng)中所見(jiàn)。此 外，對(duì)傳播至Hu-PBL-SCID小鼠的變體的種系發(fā)生分析顯示，病毒傳播不是隨機(jī)的，具有巨 噬細(xì)胞向性的病毒變體亞組被優(yōu)選傳播。這種傳播模式與某些人類中的完全一樣，在這些 人體內(nèi)，只有非常有限范圍的巨噬細(xì)胞向性病毒從供體傳播至受體?？蓪CAM-I激動(dòng)劑/ 拮抗劑應(yīng)用于已暴露給HIV的Hu-PBL-SCID小鼠，以評(píng)估ICAM-I激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV 體內(nèi)傳播的能力。本發(fā)明的教導(dǎo)在具體問(wèn)題或環(huán)境中的應(yīng)用是在本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)本文之教導(dǎo) 而能實(shí)施的范圍之內(nèi)。本發(fā)明之產(chǎn)物及其應(yīng)用方法的其它實(shí)例見(jiàn)于以下實(shí)施例。實(shí)施例1分離無(wú)細(xì)胞的HIV以及被HIV感染的外周血淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞HIV-lBa_L(Advanced Biotechnologies Inc.，Columbia, MD)是 HIV 的一種巨噬細(xì) 胞向性、NSI、CCR5-應(yīng)用型變體，其市售產(chǎn)品為1. Oml等份試樣(1 X 10650%組織培養(yǎng)感染 劑量(TCID5ci)Ail)且保存在液氮中。應(yīng)用于培養(yǎng)物之前將病毒原液新鮮解凍。將已經(jīng)白細(xì)胞分離術(shù)處理過(guò)的血液在Ficoll Hypaque (Pharmacia, Piscataway, NJ)上離心而分離人的PBMC。將總PBMC用添加了 100U/ml青霉素/IOOmcg鏈霉素、 10ng/ml慶大霉素、和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640 (培養(yǎng)基和所有添加物均來(lái)自Life Technologies, Grand Island, NY)稀釋成 1 X 107ml，然后鋪板于 75 或 150cm2 組織培養(yǎng)燒 瓶(Corning ScientificProducts, Inc. , Cambridge, ΜΑ)中。在培養(yǎng)的最初 12 小時(shí)內(nèi)，將 細(xì)胞重懸在添加了 20%熱滅活的FCS (56°C 45min, Gemini Bio-Products, Inc. Calabasas, CA)和10%熱滅活的A/B型人類血清(HS;Nabi，Boca Raton, FL)的上述RPMI-1640 (后 文稱cRPMI)中。收集單核細(xì)胞。棄去未粘附的PBMC;將粘附的細(xì)胞用冷HBSS(Life Technologies)從燒瓶中取出。通過(guò)測(cè)定表面抗原⑶14的表達(dá)(FITC-標(biāo)記的抗人⑶14 抗體，My-4 ；Coulter Immunotech, Hialeah，F(xiàn)L)，確定粘附細(xì)胞中> 95%是單核細(xì)胞。將 單核細(xì)胞洗滌并以5X 106/ml與1 X IO3TCID50的HIV_lBa_L重懸于25cm2燒瓶(Corning ScientificProducts, Inc.)中的 5ml cRPMI-10% FCS 或 cRPMI-10% HS 中，于 37°C、5% CO2中培養(yǎng)。24小時(shí)后取出病毒培養(yǎng)液，細(xì)胞用cRPMI洗滌一次，添加新鮮的cRPMI-10%FCS或cRPMI-10% HS。在感染后(pi)第3和第7天給培養(yǎng)物添加新鮮培養(yǎng)基。用冷HBSS 或0.02% EDTA(Sigma Chemical Co.，St. Louis, MO)從燒瓶中取出單核細(xì)胞，用于在感染 后第10天進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。將PBL (外周血淋巴細(xì)胞)在添加了 ΡΗΑ(5μ g/ml, Sigma)的 cRPMI-10% FCS 中 以2X 106/ml的密度重懸48小時(shí)。用1 X 103TCID5(1HIV*lBa_L感染后，用培養(yǎng)單核細(xì)胞的類似 方法培養(yǎng) PBL，區(qū)別在于 PBL 培養(yǎng)基含 10U/ml IL-2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)。單核細(xì)胞和PBL受HIV-I感染的程度可通過(guò)用HIV-I gag-特異性引物(正向引物5 ，-GCG-AGA-GCG-TCA-GTA-TTA-AGC-GG-3，，和反向引物 5，-TCT-GAT-AAT-GCT-GAA-AAC-ATG-GG-3’)以及如前述的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照進(jìn)行有限稀釋PCR來(lái)確定。PCR產(chǎn)物可通過(guò)在瓊 脂糖凝膠上電泳來(lái)觀察。無(wú)細(xì)胞的病毒衍生自cRPMI-10% FCS或cRPMI_10% HS中被HIV-lBa_L感染的單核 細(xì)胞或被HIV-lBa_L感染的PBL0離心并濾過(guò)0. 2 μ m的注射器濾膜(Millipore, Bedford, ΜΑ)使上清不含細(xì)胞。無(wú)細(xì)胞的病毒可通過(guò)HIV p24ELISA (Dupont NEN, Boston,MA)定量， 并通過(guò)與來(lái)自HIV陰性健康供體的PBMC共培養(yǎng)來(lái)確定TCID5tlt5實(shí)施例2人類宮頸上皮細(xì)胞跨孔培養(yǎng)將自發(fā)轉(zhuǎn)化的人類宮頸上皮細(xì)胞系ME-180(ATCC，Rockville，MD)培養(yǎng)在75cm2燒 瓶中的cRPMI-10% FCS中，每3天通過(guò)用0. 05%胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)處 理細(xì)胞而常規(guī)傳代。將 ME-180 細(xì)胞以 2X105/0. Iml cRPMI-10% FCS 或-10% HS/5. 0 μ m 鋪在 12mm 直徑的跨孔插件(insert) (Corning Scientific Products, Inc.)上。將跨孔中 的ME-180細(xì)胞維持在37°C，5% CO2下。每2_3天換培養(yǎng)基。7天后，細(xì)胞在跨孔插件上形 成極化的完整單層，這可利用歐姆計(jì)(ohmmeter) (Millipore)監(jiān)控橫跨上皮的阻抗和用熒 光染料標(biāo)記的抗ZOl抗體染色來(lái)證實(shí)，其中所述ZOl是一種在上皮細(xì)胞緊密連接處發(fā)現(xiàn)的 蛋白(20) (1 50稀釋，Zymed，San Francisco，CA)。插件上的ME-180單層隨時(shí)可用于在 培養(yǎng)至第7-第10天時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例3經(jīng)上皮遷移和HIV-I的傳播如Bomsel所述進(jìn)行經(jīng)上皮遷移試驗(yàn)，有幾處改動(dòng)。簡(jiǎn)短說(shuō)，將1 X IO6被HIV-lBa_L 感染的單核細(xì)胞、ι χ IO6被HIV-lBd感染的PBL、或單核細(xì)胞或PBL培養(yǎng)上清中的無(wú)細(xì)胞 HIV-I添加至上皮細(xì)胞單層的頂側(cè)(apical side)。進(jìn)行時(shí)間過(guò)程的分析，在將已感染的細(xì) 胞添加至插件后的1-48小時(shí)之間收集頂側(cè)和基側(cè)(basal side)的培養(yǎng)基。在24小時(shí)的 時(shí)候橫跨單層的傳播接近最大值，選此時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。單核細(xì)胞和PBL的活力 通過(guò)臺(tái)盼蘭(Sigma)排除法來(lái)評(píng)估，然后將細(xì)胞添加至跨孔中，傳播24小時(shí)后，結(jié)果總是> 90%。用HIV-I p24抗原ELISA試驗(yàn)(Dupont NEN)定量頂側(cè)和基側(cè)上清液中HIV_lp24抗 原的量(靈敏度為12. 5pg/ml-350pg/ml)。實(shí)施例4傳播阻斷研究將小鼠抗人ICAM-I 抗體(20 μ g/ml ；及其稀釋液；HA58 (IgGl)，Pharmingen)，抗 人E-鈣依粘連蛋白抗體(20μ g/ml ；67A4(IgGl)CoulterImmunotech，和Ε4· 6(IgGl))、抗人CD103 抗體(20 μ g/ml ；2G5 (IgG2a)，CoulterImmunotech,和 α Ε7-1 (IgG2a)、α Ε7-2 (IgGl) 和 ^^7-3(化61))、以及抗人0)18抗體(20 μ g/ml ；L130 (IgGl), Becton Dickinson)、或它 們各自的同種型對(duì)照添加至1 X IO6被HIV感染的單核細(xì)胞或被HIV感染的293T細(xì)胞(含 或不含ICAM-1)，然后將它們迅速添加至ME-180跨孔培養(yǎng)中。根據(jù)AIDS ClinicalTrials Group (ACTG)Antibody Selection Working Group為證實(shí)某種抗體在低至體內(nèi)可獲得的濃 度(20-25 μ g/ml)時(shí)的效力而建立的標(biāo)準(zhǔn)，選擇抗體的最高濃度(20 μ g/ml)。37°C，5% CO2 下培養(yǎng)24小時(shí)后，收集頂側(cè)和基側(cè)的上清液。用ELISA定量HIV-I p24抗原。實(shí)施例5與單核細(xì)朐結(jié)合的HIV-I比與PBL結(jié)合的HIV-I或無(wú)細(xì)胞,病毒效地,跨i寸人的 宮頸上皮細(xì)胞Hiv-I感染的單核細(xì)胞、HIV-I感染的PBL、或衍生自單核細(xì)胞或PBL培養(yǎng)的無(wú)細(xì) 胞的病毒(Cfv)，將它們各自的cRPMI-10% FCS溶液，置于含有ME-180上皮細(xì)胞的鋪滿單 層的跨孔培養(yǎng)物的頂端(apical)小室中。評(píng)估與單核細(xì)胞結(jié)合的、與PBL結(jié)合的、或無(wú)細(xì) 胞的HIV-I跨過(guò)完整的人類宮頸上皮單層的程度(

圖1A)。(cRPMI-10% FCS培養(yǎng)基(η = 8個(gè)供體，比較單核細(xì)胞和PBL以及PBL和cfv之間ap < 0. 05 ；比較單核細(xì)胞和cfv之間 bp <0.001))。結(jié)果表示為來(lái)自ME-180跨孔培養(yǎng)物的基底(basal)上清液和各種接種物 的 HIV-I p24 抗原濃度(pg/ml)。與單核細(xì)胞結(jié)合的病毒比與PBL結(jié)合的病毒跨過(guò)宮頸上皮的效力高約5倍。衍生 自任一種細(xì)胞類型的無(wú)細(xì)胞型病毒不能有效跨過(guò)該上皮單層，且通常在P24ELISA試驗(yàn)中 低于可檢測(cè)的極限。為明確無(wú)細(xì)胞的HIV-I是否能被Kage及其同事提到的FCS (胎牛血清)中的糖蛋 白抑制而不能跨過(guò)上皮單層，用已在含10% HS的CRPMI中培養(yǎng)的被HIV-I感染的單核細(xì)胞 或cfv (無(wú)細(xì)胞的病毒)進(jìn)行研究。在這些實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)在cRPMI-10% HS中的單核細(xì)胞結(jié) 合型HIV-I，比培養(yǎng)在cRPMI-10% FCS中的單核細(xì)胞結(jié)合型病毒更有效地跨過(guò)該上皮，也比 培養(yǎng)在 cRPMI-10% FCS 或 cRPMI-10% HS 中的 cfv 更有效(圖 IB) (cRPMI-10% FCS 或 HS 培養(yǎng)基(每一實(shí)驗(yàn)中η = 3，比較單核細(xì)胞(mono) FCS和mono HS之間ap < 0. 5，比較cfv FCS 和 cfv HS 之間 bp < 0. 05，比較 mono HS 和 cfv HS 之間 cp < 0. 005))。相對(duì)于在 10% FCS中測(cè)得的經(jīng)上皮傳播，培養(yǎng)在cRPMI-10% HS中的cfv能跨過(guò)完整上皮，但水平顯著低 于與細(xì)胞結(jié)合的病毒(P < 0. 005)(圖1B)。在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)估頂部上清液中HIV-I p24抗原，以便確定病毒從接種至上皮頂 側(cè)的被感染的單核細(xì)胞或PBL中釋放出的程度。培養(yǎng)在FCS或HS中的被HIV-感染的單核 細(xì)胞和被HIV-感染的PBL，它們的上清液中p24抗原的濃度在整個(gè)感染期間保持彼此相當(dāng) 的水平，未出現(xiàn)顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)。我們發(fā)現(xiàn)，在基底(basilar)上清中測(cè)得的HIV-1 (用p24濃度表示)當(dāng)與未被感 染的單核細(xì)胞或受PHA刺激的PBL混合培養(yǎng)時(shí)具有感染性，隨時(shí)間的推移，培養(yǎng)物中p24抗 原的量增加(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例6mmm^m - ItMt^目.齊！丨量-{衣賴+牛方式跨過(guò)宮5頁(yè)上皮制備帶有ME-180的跨孔培養(yǎng)物，將cRPMI-10% HS中1 X IO6個(gè)被HIV-感染的單核細(xì)胞添加至該上皮的頂部側(cè)以分析經(jīng)上皮傳播的動(dòng)力學(xué)。被感染的單核細(xì)胞早在4小時(shí) 的時(shí)候就可以測(cè)到經(jīng)上皮的遷移和/或經(jīng)上皮的HIV-I傳播(圖2A)，伴有基底p24水平的 升高，直至48小時(shí)達(dá)到頂峰。類似地，將IX IO6個(gè)細(xì)胞，或其5倍稀釋液，添加至該上皮的 頂側(cè)，取基底側(cè)上清液樣品檢測(cè)P24抗原的存在以確定能在上皮的基底側(cè)檢測(cè)到病毒所需 的最小細(xì)胞接種量。當(dāng)應(yīng)用5，000個(gè)被HIV感染的單核細(xì)胞時(shí)，在基底培養(yǎng)基中一直能檢 測(cè)到HIV p24抗原。如LD-PCR所測(cè)，其中的細(xì)胞被HIV-I感染(數(shù)據(jù)未顯示)，因此 這意味著少至500個(gè)被感染細(xì)胞就可持續(xù)傳播HIV-I。在跨孔的頂側(cè)加入少至1，000個(gè)的 單核細(xì)胞(感染率同樣為1-5% )，就可在基底側(cè)上清液中檢測(cè)到p24(圖2B)。圖2所示實(shí)驗(yàn)使用被HIVBa-L-感染的單核細(xì)胞在cRPMI_10% HS中的溶液進(jìn)行。 結(jié)果表示為基底上清中HIV-I p24抗原的濃度(pg/ml)。圖中分別顯示了隨時(shí)間變化的實(shí) 驗(yàn)(η = 4)和隨接種量變化的實(shí)驗(yàn)(η = 2)。+基底ρ24介于100-1，000pg/ml之間；++基 底 p24 介于 1，001-5, 000pg/ml 之間；+++ 基底 p24 介于 5，001-30，000pg/ml 之間；-基底 P24低于檢測(cè)的極限(12. 5pg/ml)。實(shí)施例7完整的人類宮頸上皮限制了 HIV-I的傳播此前曾顯示，位于跨孔插件中的人類宮頸上皮細(xì)胞單層形成了一種完整的極性表 面，并提供了一種針對(duì)無(wú)細(xì)胞的HIV-I的明確屏障。以下實(shí)驗(yàn)用于確定宮頸上皮單層和將 跨孔小室分隔開(kāi)的膜是否能提供一種限制HIV-I經(jīng)上皮傳播的屏障。為此，測(cè)定跨孔下層 小室培養(yǎng)基中無(wú)ME-180存在時(shí)的p24抗原濃度。與由HIV-感染的單核細(xì)胞或HIV-感染 的PBL所傳播的基底HIV-I p24抗原的不同水平(如圖1所示)相比，在沒(méi)有宮頸上皮細(xì)胞 的情況下，下層小室的跨孔培養(yǎng)物中測(cè)得的P24抗原的量在單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-1、PBL-結(jié) 合型HIV-1、或無(wú)細(xì)胞型病毒之間無(wú)顯著差異(ρ > 0.005)(圖3)。這些數(shù)據(jù)表明，膜的組 成和孔徑大小不能限制HIV-I的傳播，反而是上皮細(xì)胞層的緊密連接以及被HIV-感染的細(xì) 胞與上皮之間的假定相互作用決定了經(jīng)上皮傳播HIV-I的程度。圖3所示數(shù)據(jù)分別表示為，插件膜上有或沒(méi)有ME-180上皮細(xì)胞時(shí)，跨孔培養(yǎng)物的 基底側(cè)或下層小室上清液中的P24抗原(pg/ml)。圖中還顯示了另一個(gè)試驗(yàn)(n = 3)，有或 沒(méi)有ME-180的接種組之間的比較ρ < 0. 05，沒(méi)有ME-180的接種組之間的比較ρ > 0. 05。實(shí)施例8抗ICAM-I抗體阻斷單核細(xì)胞結(jié)合型HIV-I的傳播為了檢查被HIV感染的單核細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的粘附作用是否經(jīng)上皮遷移和 HIV-I傳播的關(guān)鍵，將針對(duì)數(shù)種粘附分子的抗體添加至跨孔培養(yǎng)物中。在被HIV感染的單核 細(xì)胞以及培養(yǎng)中剩余的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的同時(shí)添加針對(duì)ICAM-1、CD18、E-鈣依粘連蛋白、或 αΕ-β7整合蛋白(⑶103)的抗體(l-20yg/ml)。所選抗體能靶向已顯示參與免疫細(xì)胞與 上皮細(xì)胞之結(jié)合的特異性配體_受體相互作用。ICAM-I在被HIV感染的單核細(xì)胞和上皮細(xì)胞上表達(dá)?？笽CAM-I抗體阻斷單核細(xì) 胞結(jié)合型HIV-I的傳播，如上皮細(xì)胞單層基底側(cè)的p24抗原量所示(圖4A)。CD18分子是 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)性抗原LFA-I的β亞單位，其結(jié)合ICAM-I并參與HIV誘導(dǎo)的合胞體形 成?？耿?8抗體及其同種型對(duì)照不能阻斷HIV-I的經(jīng)上皮傳播(圖4Α)。為了測(cè)定對(duì)經(jīng)上皮傳播的抑制作用是否特異性針對(duì)ICAM:LFA-1相互作用，檢驗(yàn)了抗E-鈣依粘連蛋白和CD103的抗體在跨孔系統(tǒng)中抑制HIV-I傳播的能力。E-鈣依粘連蛋 白表達(dá)在上皮細(xì)胞表面，其配體⑶103表達(dá)在單核細(xì)胞以及一個(gè)PBL亞類的表面。抗E-鈣 依粘連蛋白抗體、抗CD103抗體、以及它們各自的同種型對(duì)照不能阻斷HIV-I的經(jīng)上皮傳播 (圖4，A和B)。經(jīng)測(cè)定，被HIV感染的單核細(xì)胞與這些實(shí)驗(yàn)中使用的抗體一起保溫不改變 從被感染細(xì)胞釋放出的病毒量，如保溫24小時(shí)后頂部上清液中所測(cè)(數(shù)據(jù)未顯示)。將抗 E-鈣依粘連蛋白(20mg/ml)、抗CD103 (20mg/ml)、抗 CD18 (LFA-I) (20mg/ml)、鼠 IgGl (20mg/ ml)和鼠IgG2a(20mg/ml)抗體與被感染的單核細(xì)胞一起添加至跨孔培養(yǎng)物中，對(duì)HIV-I的 經(jīng)上皮傳播沒(méi)有影響。圖4的結(jié)果表示為基底側(cè)上清液中的HIV-I 24抗原，？<0.05。實(shí)施例9抗ICAM-I MAB抑制HIV-1在HU-PBL-SCID小鼠中的陰道傳播單克隆抗體在HU-PBL-SCID小鼠中可提供對(duì)抗HIV-I的保護(hù)作用，如此前的三項(xiàng) 研究所示。但是，這些研究無(wú)一涉及抗ICAM-I抗體或提到對(duì)抗病毒之陰道傳播的保護(hù)作 用。在所有例子中，Mab可有效對(duì)抗攜有其所針對(duì)的特異性表位的病毒，但不能對(duì)抗異源 HIV-I變體而提供交叉保護(hù)。如表1所示，陰道中應(yīng)用抗ICAM-I的Mab徹底阻斷了 SCID小鼠模型中細(xì)胞結(jié)合 型HIV-I的陰道傳播。結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(ρ = 0.03，單側(cè)Fisher真實(shí)性(exact)檢 驗(yàn)；ρ = 0. 06，雙側(cè)Fisher真實(shí)性檢驗(yàn))。表1 實(shí)施例10Mmm^m Hiv的經(jīng)hit傳播的陽(yáng)斷不需要陽(yáng)斷!CAM-!與LFA-I的結(jié)合對(duì)并不在其表面表達(dá)ICAM-I的293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以確定對(duì)細(xì)胞結(jié)合型HIV的 經(jīng)上皮傳播的阻斷是否需要阻斷ICAM-I與LFA-I的結(jié)合。結(jié)果表明，被感染的293T細(xì)胞 能夠跨過(guò)上皮細(xì)胞屏障傳播HIV-1，而這種傳播(如跨孔系統(tǒng)的基底小室中HIV-I p24抗原 的濃度所測(cè))可被抗ICAM-I抗體阻斷(表2)。表2 <0. 001，比較p24濃度的差異
由于ICAM-I不在293T細(xì)胞表面表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)，抗ICAM-I抗體阻斷傳播的 能力必須通過(guò)與ME180宮頸上皮細(xì)胞系(已知其表達(dá)ICAM-1)表面的ICAM-I的相互作用。 流式細(xì)胞儀分析表明，293T細(xì)胞不表達(dá)LFA-I (圖6A-B)。由于293T細(xì)胞缺乏LFA-I，抗 ICAM-I抗體不能通過(guò)阻斷ICAM-I與其對(duì)應(yīng)受體LFA-I之間的相互作用而阻斷傳播。實(shí)施例11抗ICAM-I MAB不引起陰道炎件應(yīng)答有一種潛在的擔(dān)心是，陰道內(nèi)給與能針對(duì)免疫應(yīng)答中起作用的配體的抗體可能激 發(fā)局部炎性應(yīng)答。為了了解該問(wèn)題，我們每天2次，連續(xù)14天在正常BALB/c小鼠陰道內(nèi)給 與20mg/ml抗小鼠ICAM-I的IgG2a型Mab、20mg/ml無(wú)關(guān)的IgG2a型Mab、或5mg傷寒沙門 菌(Salmonella typhimirium)脂多糖?？笽CAM-I Mab在所處理的小鼠陰道上皮中未顯示毒性。實(shí)施例12MAB均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中Mab均未從陰道內(nèi)給藥處被吸收至血清中。這一點(diǎn)可能使針對(duì)宿主抗原的Mab具 有潛在的臨床應(yīng)用意義。三只SCID小鼠每天2次接種20mg正常小鼠IgG，共10天。在第 4天、第7天、和第10天注射后的剛剛2小時(shí)后，用靈敏度為0. lmg/ml的ELISA試驗(yàn)分析小 鼠血清中小鼠Ig濃度的增加。小鼠Ig的基線值范圍為0-4mg/ml。在任何一只小鼠中，在 所分析的任何時(shí)間點(diǎn)，均未觀察到小鼠抗體濃度的增加。參考文獻(xiàn)1. Fultz, P. N. , H. M. McClure, H. Daugharty, A. Brodie, C. R. McGrath, B. Swenson, 和D. P. Francis. 1986.人類免疫缺陷病毒(HIV)經(jīng)陰道傳播至黑猩猩，J. Infect. Dis. 154 896.2. Burkhard, M. J. , L. A. Obert, L. 0 "Neil，L. J. Diehl，和 E. A. Hoover. 1997.細(xì)胞 結(jié)合型及無(wú)細(xì)胞型貓科動(dòng)物免疫缺陷病毒的粘膜傳播，AIDS Res. Hum. Retrovir. 13 347.3. Miller, C. J. , N. J. Alexander, S. Sut jipto, A. A. Lackner, A. Gettie, A. G. Hendrickx, L. J. Lowenstein, M. Jennings，禾口 P. A. Marx. 1989.猴免疫缺陷病毒的生殖 器粘膜傳播人類免疫缺陷病毒異性傳播的動(dòng)物模型，病毒學(xué)雜志(J. Virol. )63 =4277.4.Zacharopoulos，V.R，M.-E.PerottijPD.M.Phillips· 1997.細(xì)胞遷移在 HIV-1 性傳播中的作用，Curr. Biol. 7 :R534.5. Fortin, J. -F. ，R Cant in, G. Lamontagne，禾口 Μ· Tremb lay. 1997.慘入在 I 型人 類免疫缺陷病毒中的宿主衍生性ICAM-I糖蛋白具有生物學(xué)活性并能增強(qiáng)病毒的感染力， 病毒學(xué)雜志71 =3588.6. Fortin, J. -F.，R，，R CantinjP M. Tremblay. 1998.表達(dá)活化型 LFA-1 的 T 細(xì) 胞更易被攜有宿主編碼的ICAM-I的I型人類免疫缺陷病毒顆粒感染，病毒學(xué)雜志72 21057. Rizzuto, C. D.，和 J. G. Sodroski. 1997.病毒體 ICAM-1 對(duì)人類免疫缺陷病毒的 感染力以及其對(duì)中和作用的敏感性的貢獻(xiàn)，病毒學(xué)雜志71 =4847.8. Bomsel, M. 1997.感染性人類免疫缺陷病毒跨過(guò)致密的人類上皮細(xì)胞系屏障的 跨細(xì)胞作用(transcytosis)，Nat. Med. 3 :42·9. D' Souza, Μ. P.，D. Livnat, J. A. Bradac，和 S. H. Bridges. 1997.通過(guò)中和試驗(yàn)評(píng)估I型人類免疫缺陷病毒原代分離物的單克隆抗體篩選臨床試驗(yàn)候選抗體時(shí)的性能標(biāo) 準(zhǔn)，J. Infect. Dis. 175 1056.10. Kage, A.，E. Shoolian, K. Rokos, M. zel, R. Nuck, W. Reutter, Ε. K，，ttgen，禾口 G. Pauli. 1998.無(wú)細(xì)胞的I型人類免疫缺陷病毒以及gp 120包被的微粒的上皮吸收和轉(zhuǎn) 運(yùn)，病毒學(xué)雜志72 =4231.11. Fais, S. ， P. Borghi, G. Gherardi, M. Logozzi, F. Belardelli,禾口 S. Gossani. 1996. I型人類免疫缺陷病毒在人類原代單核細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞極化、細(xì)胞間粘附 分子-1的再分配和多形核巨細(xì)胞的產(chǎn)生，但不在單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)上述結(jié) 果，Lab. Invest. 75 :783·12. Vermot-Desroches, C. , D. Rigal, S. Escaich, J. Bernaud, C. Pichoud, J. P. Lamelin,和C. Trepo. 1991.參與HIV-I誘導(dǎo)的合胞體形成的人類CDlla/CD18分子 (LFA-1，淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1)的功能性表位分析，Scand J. Immunol. 34 461.13. Anderson, D. J.，和 Ε· J. Yunis. 1983. AIDS 中的“特洛伊木馬(TrojanHorse) ” 白細(xì)胞，N. Engl. J. Med. 309 :984·14. Levy，J. Α. 1988. AIDS 的傳播感染細(xì)胞的情況(the case of theinfected cell). J. A. M. A. 259 :3037.15. Collins，K. B.，B. K. Patterson，G. J. Naus，D. V. Landers 禾口 P. Gupta. 2000.開(kāi) 發(fā)一種體外器官培養(yǎng)模型以便研究HIV-I在女性生殖道中的傳播，Nat. Med. 6 475.16. Agracetus. 1994.植物生物反應(yīng)器系統(tǒng)，Agraceuts，Inc.17. Bomsel, Μ. , Μ. Heyman, H. Hocini , S. Lagaye, L. Belec, C. Dupont, 禾口 C. Desgranges. 1998.抗HIV包膜蛋白dlgA或IgM對(duì)HIV跨過(guò)致密上皮屏障的跨細(xì)胞作用 的胞內(nèi)中和效應(yīng)，免疫(Immunity). 9 :277_287·18. Bourinbaiar, Α. S.，和D. Μ. Phillips. 1991.人類免疫缺陷病毒從單核細(xì)胞向 白勺# ，J Acquir Immune Defic Syndr. 4 56-63.19. Butini, L. , A. R. De Fougerolles, M. Vaccarezza, C. Graziosi, D. I. Cohen, Μ. Montroni, Τ. Α. Springer, G. Pantaleo,和 Α. S. Fauci. 1994.細(xì)胞間粘附分子(ICAM)-I ICAM-2和ICAM-3在人類免疫缺陷病毒介導(dǎo)的合胞體形成中作為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子1 的對(duì)應(yīng)受體而發(fā)揮作用，歐洲免疫學(xué)雜志(EurJ Immunol). 24:2191-5.20.de Fougerolles，A. R.，X. Qin，和 Τ· A. Springer. 1994.免疫應(yīng)答中細(xì)胞間 粘附分子(ICAM)-3的功能鑒定以及與ICAM-I和ICAM-2的比較，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J Exp Med). 179 :619_29.21. de Fougerolles, A. R，和 T. A. Springer. 1992.細(xì)胞間粘附分子 3，即靜息態(tài) 淋巴細(xì)胞上淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子1的粘附作用的第三種對(duì)應(yīng)受體，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志175 185-90.22. Dustin, M. L.，0. Carpen, ^P T. A. Springer. 1992. LFA-I 與 ICAM-1 受體對(duì)移動(dòng) 及細(xì)胞與細(xì)胞間接觸區(qū)域的調(diào)節(jié)，免疫學(xué)雜志(J Immunol.) 148 =2654-63.23. Fiedler, U.，和U. Conrad. 1995.轉(zhuǎn)基因煙草種子中工程化抗體的高水平產(chǎn)生 和長(zhǎng)期保存，生物技術(shù)(Biotechnology). 13 1090-1093.24. Fortin, J. F. ，R. Cantin, G. Lamontagne，禾口 M. Tremblay. 1997.慘入在 I 型人類免疫缺陷病毒中的宿主衍生性ICAM-I糖蛋白具有生物學(xué)活性并能增強(qiáng)病毒的感染力， 病毒學(xué)雜志71 3588-96.25. Gauduin, M. C. ， P. W. Parren, R. Weir, C. F. Barbas, D. R. Burton,禾口 R. A. Koup. 1997.用人類單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫可保護(hù)hu_PBL_SCID小鼠抵抗HIV-I原代 分離物的攻擊，Nat Med. 3 1389-93.26. Gauduin, M. C.，J. T. Safrit, R. Weir, Μ. S. Fung，和 R. A. Koup. 1995.單克隆抗 體介導(dǎo)的針對(duì)I型人類免疫缺陷病毒感染的暴露前和暴露后保護(hù)作用，J Infect Dis. 171 1203-9.27. Hiatt, Α.，R. Caffertey^P K. Bowdish. 1989.抗體在轉(zhuǎn)基因植物中的生成，自 然 342 76-78.28. Hiatt, A.，和J. K. -C. Ma. 1992.通過(guò)工程化方法整合至植物中的單克隆抗體， FEBS Letters. 307 :71_75.29. Ma, J. K. -C. ， A. Hiatt, Μ. Hein, N. D. Vine, F. Wang, P. Stabila,
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權(quán)利要求
包含抗ICAM 1抗體或ICAM 1抗原，或者包含能夠產(chǎn)生所述抗ICAM 1抗體或ICAM 1抗原的遺傳改造的細(xì)菌的組合物，用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播。
2.權(quán)利要求1的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組合物， 其中所述組合物包含抗ICAM-I抗體。
3.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述抗ICAM-I抗體由植物產(chǎn)生。
4.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述抗體是抗-人ICAM-I IgGl抗體。
5.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述組合物包含約ι μ g/ml-約1000 μ g/ml的抗ICAM-I抗體。
6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播 的組合物，其中所述組合物包含約5mg/ml-約10mg/ml的抗ICAM-1抗體。
7.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述組合物用于向哺乳動(dòng)物施用。
8.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述組合物用于向人施用。
9.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組 合物，其中所述組合物可用于阻斷HIV經(jīng)上皮傳播而無(wú)需阻斷ICAM-I與LFA-I的結(jié)合。
10.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的 組合物，其中所述實(shí)際或可能暴露于HIV的部位是粘膜表面。
11.權(quán)利要求10的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組合 物，其中所述實(shí)際或可能暴露于HIV的部位是選自下組的粘膜表面生殖器表面、陰道表 面、直腸表面、口腔表面、和胃腸道表面。
12.權(quán)利要求11的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組合 物，其中所述實(shí)際或可能暴露于HIV的部位是陰道上皮。
13.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的 組合物，其中所述組合物是局部組合物、口服溶液、固體藥物組合物，噴霧劑、陰道洗液、陰 道沖洗劑、栓劑、母乳添加劑、或嬰兒配方食品。
14.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的 組合物，其中所述組合物是控制釋放配制物，其允許抗ICAM-I抗體在至少1天的時(shí)間釋放。
15.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的 組合物，其中所述抗體或抗原在可藥用的載體中提供。
16.權(quán)利要求15的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的組合 物，其中所述載體包含選自下組的材料潤(rùn)滑劑、表面活性劑、膠質(zhì)、有機(jī)溶劑、乳化劑、膠凝 劑、增濕劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑、控釋劑、多價(jià)螯合劑、染料和香料。
17.任一前述權(quán)利要求的用于在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的 組合物，其中所述抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原在粘膜粘著劑(mucoadhesive gel)中提供。
18.以足以阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的量包含能夠在實(shí)際或可能暴露于HIV的部位阻斷所述傳播的抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原，或者以所述量包含能夠產(chǎn)生所述抗ICAM-I抗體或 ICAM-I抗原的遺傳改造的細(xì)菌的組合物，其中所述組合物是噴霧劑、陰道洗液、陰道沖洗 劑、栓劑、母乳添加劑、或嬰兒配方食品。
19.包含如下基體的物品，該基體是a)用包含抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原的組合物浸漬或涂覆的；b)用能夠產(chǎn)生所述抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原的細(xì)菌涂覆的； 其中所述基體選自下組海綿、避孕套、宮內(nèi)避孕器、宮頸環(huán)和隔膜。
20.包含如下基體的物品，該基體a)用包含抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原的組合物浸漬或涂覆的；b)用能夠產(chǎn)生所述抗ICAM-I抗體或ICAM-I抗原的細(xì)菌涂覆的； 其中所述基體是避孕用品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防HIV經(jīng)上皮傳播的組合物和方法，具體地，本發(fā)明提供了用ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑阻斷HIV經(jīng)上皮傳播的方法，組合物和制品。所述ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑在暴露至病毒的位點(diǎn)阻斷病毒傳播。對(duì)病毒傳播的阻斷不需要阻斷ICAM-1對(duì)LFA-1的結(jié)合。所述ICAM-1激動(dòng)劑/拮抗劑可應(yīng)用于粘膜表面，避孕用品表面或內(nèi)部或口服液如母奶添加劑和嬰兒配方食品中。
文檔編號(hào)A61K9/02GK101912610SQ201010144099
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2000年6月23日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月24日
發(fā)明者克里斯滕·V·卡納, 理查德·B·馬卡姆 申請(qǐng)人:約翰·霍普金斯大學(xué)