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膽固醇吸收抑制劑的制作方法

文檔序號:1117613閱讀:518來源:國知局

專利名稱::膽固醇吸收抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
:本發(fā)明涉及膽固醇的吸收抑制作用優(yōu)異的雙歧桿菌屬細菌和以這些雙歧桿菌屬細菌作為有效成分的膽固醇吸收抑制劑。
背景技術(shù)
:膽固醇存在于許多細胞中,其主要的生理功能為,作為脂蛋白質(zhì)和生物膜的構(gòu)成成分而維持細胞的功能,并作為膽汁酸和各種激素的原材料等發(fā)揮作用。但是,已知過度攝取膽固醇含量多的食品是血清中膽固醇增加和動脈硬化的原因,在膽固醇攝取機會多的現(xiàn)代飲食生活中,需求抑制其在機體內(nèi)的濃度。有報告,雙歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌的菌體有改善血中脂質(zhì)的作用(專利文獻1)。特別是關(guān)于長雙歧桿菌進行了研究,有報告長雙歧桿菌SBT2933R(FERMP—8743)具有優(yōu)異的效果(非專利文獻1),并提出將該菌體或培養(yǎng)物作為膽固醇升高抑制劑而利用(專利文獻2)。但是,一般而言,由于雙歧桿菌屬細菌不耐氧和體內(nèi)的胃酸及膽汁酸,因此,當口服攝取該菌體和培養(yǎng)物時,存在有在消化道的生存性差、大多不能得到充分的效果的問題。因此,需求生存性優(yōu)異的具有抑制血清膽固醇升高作用的雙歧桿菌屬細菌。但是,關(guān)于這樣的生存性優(yōu)異的雙歧桿菌屬細菌,己知的是,長雙歧桿菌SBT10254(FERMP-14820)(專利文獻3)和長雙歧桿菌(FERMBP-7787)(專利文獻4)的生存性優(yōu)異,顯示出抑制血清膽固醇升高的作用;而長雙歧桿菌BB536、短雙歧桿菌ATCC15700、動物雙歧桿菌ATCC25527(非專利文獻2)只不過顯示膽固醇沉降作用,目前的現(xiàn)狀是,這種生存性優(yōu)異且具有膽固醇抑制作用的微生物的選擇性小。另外,使用這些微生物的藥劑、食品,因為經(jīng)常不得不長期保存,所以要求高的保存穩(wěn)定性,但在現(xiàn)有己知的微生物中,多數(shù)在長期保存后生存性降低,特別是在非厭氧條件下保存后,生存性降低的居多。專利文獻l:曰本特開昭61—271223號公報專利文獻2:日本特公平6—96537號公報專利文獻3:日本專利第3384907號專利文獻4:日本特開平2003—238423號公報非專利文獻1:第6回日本匕、、7Y乂7菌i乂夕一學(xué)術(shù)集會予稿集,18頁,1987非專禾U文獻2:LettersinAppliedMicrobiology,Vol.21,149-151,1995
發(fā)明內(nèi)容因此,本發(fā)明的目的在于提供在消化道內(nèi)的生存性優(yōu)異、在腸道內(nèi)具有膽固醇吸收抑制作用、降低血中膽固醇等的脂質(zhì)代謝改善作用優(yōu)異、并且保存后的生存性高的雙歧桿菌屬細菌,以及使用該細菌的膽固醇吸收抑制劑。本發(fā)明的發(fā)明人為了達到上述目的而進行了反復(fù)深入的研究,結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn),動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種的膽固醇清除作用優(yōu)異,并且顯示出強耐酸性和耐膽汁酸性,在腸道內(nèi)也具有優(yōu)異的膽固醇吸收抑制作用,另外,保存后的生存性高,特別是即使在非厭氧條件下保存后也顯示出高生存性,從而完成了本發(fā)明。另外,在本發(fā)明使用的微生物中,動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392和假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393是本發(fā)明的發(fā)明人新發(fā)現(xiàn)的微生物。艮P,本發(fā)明提供一種以選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種中的1種以上的微生物作為有效成分的膽固醇吸收抑制劑。另外,本發(fā)明提供一種以選自動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253和動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117中的l種以上的微生物作為有效成分的膽固醇吸收抑制劑。另外,本發(fā)明提供一種以選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392和假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393中的1種以上的微生物作為有效成分的膽固醇吸收抑制劑。進而,本發(fā)明提供作為新微生物的動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394(FERMABP—10662)、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392(FERMABP—10660)或假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393(FERMABP—10661)。本發(fā)明的動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種,不僅具有優(yōu)異的膽固醇消除作用,而且耐酸性和耐膽汁酸性優(yōu)異,所以即使在腸道內(nèi)也發(fā)揮優(yōu)異的膽固醇吸收抑制作用,能夠用于降低血中膽固醇等改善脂質(zhì)代謝的目的。另外,這些微生物保存后的生存性高,特別是在非厭氧條件下保存后也顯示出高的生存性,所以本發(fā)明的吸收抑制劑能夠長期保存,而且也能夠非厭氧保存。具體實施方式作為本發(fā)明中所使用的假長雙歧桿菌球形亞種(Bifidobacteriumpseudolongumsubsp.globosum),例如,可以列舉假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393等。這些假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393、和本發(fā)明中所使用的微生物之一的動物雙歧桿菌動物亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)YIT10394,是本發(fā)明的發(fā)明人分離得到的新菌株,其為具有如下性質(zhì)的菌株膽固醇消除活性為70%以上;在人工胃液中的生存率為20%以上;并且在含有膽汁酸的培養(yǎng)基中的增殖性以克萊特值(Klettvalue)(菌體濁度)計,為100以上。該菌株具有以下的細菌學(xué)性質(zhì)。即,這些菌的細菌學(xué)性質(zhì)均為革蘭氏陽性多形性桿菌、不形成芽胞、非運動性、專性厭氧性、在37t:能夠生長,除以上所示的膽固醇消除活性、在人工胃液中的生存率和在含有膽汁酸的培養(yǎng)基中的增殖性以外,分別依次顯示出假長雙歧桿菌球形亞種、假長雙歧桿菌球形亞種、動物雙歧桿菌動物亞種具有的性質(zhì)。關(guān)于該新菌株的種的鑒定,根據(jù)如下在使用16SrDNA堿基序列的菌種鑒定中,YIT10392的16SrDNA堿基序列與假長雙歧桿菌球形亞種(accessionNo.D86194)顯示出99.6%的同源性;YIT10393的16SrDNA堿基序列與假長雙歧桿菌球形亞種(accessionNo.D86194)顯示出99.6%的同源性;YIT10394的16SrDNA堿基序列與動物雙歧桿菌動物亞種(accessionNo.D86185)顯示出99.7%的同源性。這里,使用16SrDNA堿基序列的菌種鑒定通過下述方法進行離心洗凈使用添加有0.5^葡萄糖的GAM培養(yǎng)基、在37"C下厭氧(二氧化碳置換)培養(yǎng)24h的菌液,得到菌體,將從該菌體提取的DNA作為模板,通過PCR法擴增16SrDNA的全長序列,由終止物標記(DyeTerminator)法測定擴增產(chǎn)物的堿基序列,將得到的堿基序列在數(shù)據(jù)庫中進行檢索。另外,這些菌株為新菌株的判斷根據(jù)為16SrDNA堿基序列與標準株不同,由RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA:隨機擴增多態(tài)性DNA)法得到的染色體DNA多態(tài)性分析的結(jié)果不同。動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394以微生物保藏編號FERMABP一10662、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392以微生物保藏編號FERMABP_10660、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393以微生物保藏編號FERMABP—10661,在平成18年8月14日移管至獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。移管前的保藏者也是相同的,保藏日是平成17年8月18日。另外,該保藏中心的地址為日本國茨城縣津輕市東l丁目l番地中央第6,郵政編碼305—8566。另外,本發(fā)明中所使用的動物雙歧桿菌乳酸亞種(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)JCM1253和動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117均能夠從JCM(JapanCollectionofMicroorganisms)禾口ATCC(AmericanTypeCultureCollection)得到,各自的ATCC編號是ATCC27536禾口ATCC27674。其中,作為本發(fā)明中所使用的微生物,優(yōu)選的是使用微生物制造發(fā)酵乳飲食品,在10°C、非厭氧條件(好氧條件)下保存21日后,該微生物的生存率為50%以上的微生物。另外,作為本發(fā)明的微生物,優(yōu)選膽固醇消除活性為70%以上的雙歧桿菌屬細菌,更優(yōu)選膽固醇消除活性為70%以上、在人工胃液中的生存率為20%以上、并且在含有膽汁酸的培養(yǎng)基中的增殖性以克萊特值(菌體濁度)計,為100以上的雙歧桿菌屬細菌。一般的雙歧桿菌屬細菌在人工胃液中的生存率是0幾個%左右,在含有膽汁酸的培養(yǎng)基中的增殖性以克萊特值(菌體濁度)計,為o幾十左右。由上述值篩選出來的具有高耐酸性和耐膽汁酸性的細菌,多數(shù)菌能夠以活菌狀態(tài)到達腸道內(nèi)。這里,膽固醇消除活性的算出,例如,能夠通過下述方法進行將微生物菌體與人工脂質(zhì)微團一起靜置時,按照通常方法測定上清的膽固醇,與不含菌體的上清的膽固醇量進行比較,代入下式中。膽固醇消除活性(%)=100—(含有菌體的上清的膽固醇量)/(不含菌體的上清液的膽固醇量)xl00另外,在人工胃液中的生存率,例如,能夠定義為在pH3.0的人工胃液中,37'C保存1小時時的生存率。該值高表示在消化道內(nèi)的生存率高。另外,在含有膽汁酸的培養(yǎng)基中的增殖性,例如,能夠定義為以克萊特值(Klett-Summerson比色計,No.66濾色鏡)表示的在含有0.2%膽汁酸的培養(yǎng)基中,37'C培養(yǎng)24小時時的濁度。該值高表示在消化道內(nèi)的生存率、增殖率高。另外,微生物的屬名、種名和株名,因命名者不同而多種多樣,還因菌的再分類等,也是不確定的,雖然菌屬名、菌種名、菌株名不同,但作為微生物在實質(zhì)上相同的微生物,也包含在本發(fā)明的微生物中。即,例如,雖然動物雙歧桿菌乳酸亞種也曾被作為其他種,但是Masco等報告,將它們歸納為動物雙歧桿菌,作為其下位分類,分為動物雙歧桿菌動物亞種和動物雙歧桿菌乳酸亞種2個亞種(Int.j.Syst.Envoi.Microbiol54,1137-1143,2004),延用至今。因此,在本發(fā)明的動物雙歧桿菌動物亞種或動物雙歧桿菌乳酸亞種的范圍中,也分別包含以前被稱為動物雙歧桿菌或乳酸雙歧桿菌的菌。另外,動物雙歧桿菌乳酸亞種ATCC27536與動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253相同,動物雙歧桿菌乳酸亞種ATCC27674與動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117相同,分別包含在本發(fā)明的微生物中。另夕卜,在JCM和ATCC中,所有的菌株都被分類為動物雙歧桿菌動物亞種,但由于這2種菌株的16SrDNA的堿基序列與動物雙歧桿菌乳酸亞種(accessionNo.X89513)100%—致,所以在本發(fā)明中作為動物雙歧桿菌乳酸亞種。如后述的實施例所示的那樣,本發(fā)明的微生物具有膽固醇消除活性,使膽固醇、特別使血中膽固醇濃度下降,所以,以有效量含有本發(fā)明微生物的物質(zhì)作為膽固醇吸收抑制劑、特別是作為由腸道吸收膽固醇的抑制劑是有用的。本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑期待能夠用于降低血中膽固醇、降低甘油三酯、降低VLDL和LDL膽固醇、降低動脈硬化指數(shù)、升高HDL膽固醇等脂質(zhì)代謝的改善;因閉經(jīng)后的女性激素欠缺而頻發(fā)的高脂血癥的改善;動脈硬化發(fā)病危險的降低。另外,如后述的實施例所示的那樣,本發(fā)明的微生物顯示出耐酸性和耐膽汁酸性,所以,以有效量含有本發(fā)明微生物的物質(zhì)能夠作為口服用膽固醇吸收抑制劑使用。如后述的實施例所示的那樣,本發(fā)明的微生物在發(fā)酵乳飲食品中,即使在好氧條件下保存(非厭氧保存)日寸,也具有高生存率,因此,以有效量含有本發(fā)明微生物的物質(zhì)能夠作為好氧條件下保存(非厭氧保存)的膽固醇吸收抑制劑使用。保存溫度例如可以為一801CTC。在本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑中,作為有效成分含有的微生物,為選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種中的l種以上即可,這里,作為可以使用的微生物組合,例如,可以列舉選自動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253和動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117中的1種以上的組合;選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392和假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393中的l種以上的組合。另外,在本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑中,除了單獨或組合使用動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種以外,也可以將它們與其它微生物并用。作為這樣的微生物,例如,可以列舉動物雙歧桿菌動物亞種、動物雙歧桿菌乳酸亞種、假長雙歧桿菌球形亞種、青舂雙歧桿菌、角雙歧桿菌、星狀雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、鏈狀雙歧桿菌、齒雙歧桿菌、高盧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、假小鏈雙歧桿菌、假長雙歧桿菌假長亞種、豬雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等雙歧桿菌屬細菌;嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、約氏乳桿菌、巻曲乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、高加索酸奶乳桿菌、德氏乳桿菌德氏亞種、德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、唾液乳桿菌、路氏乳桿菌、馬里乳桿菌、食淀粉乳桿菌、消化乳桿菌、布氏乳桿菌、短乳桿菌、雞乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、麥芽香乳桿菌、類干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌等乳桿菌屬細菌;嗜熱鏈球菌等鏈球菌屬細菌;乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌乳亞種等乳球菌屬細菌;腸膜明串珠菌乳脂亞種等明串珠菌屬細菌;啤酒片球菌等片球菌屬細菌;糞腸球菌等腸球菌屬細菌;醋化醋桿菌等醋桿菌屬細菌;氧化葡糖桿菌等葡糖桿菌屬細菌;枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌屬細菌;啤酒糖酵母等糖酵母屬酵母;戴爾凱氏有孢圓酵母等有孢圓酵母屬酵母;乳酒假絲酵母等假絲酵母屬酵母;馬克斯克魯維氏酵母等克魯維氏酵母屬酵母;漢遜氏德巴利氏酵母等德巴利氏酵母屬酵母;異常畢赤氏酵母等畢赤氏酵母屬酵母;魯氏結(jié)合糖酵母等結(jié)合糖酵母屬酵母;米曲霉、日本毛霉、紫色紅曲霉、沙門氏柏干酪青霉、微小根毛霉、少根根霉等曲霉屬、毛霉屬、紅曲霉屬、青霉菌屬、根毛霉屬、根霉屬的霉菌等。另外,本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑中所含的微生物,也可以是經(jīng)冷凍干燥的微生物,或者也能夠作為含有這些微生物的培養(yǎng)物利用,但不論是何種方式,微生物都優(yōu)選是活菌的狀態(tài)。本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑,能夠?qū)⑸鲜鑫⑸锱c固體或液體的醫(yī)藥用無毒載體混合,以常用的醫(yī)藥品制劑的劑型給藥。作為這樣的制劑,例如,可以列舉片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等固體制劑;溶液劑、懸浮劑、乳劑等液劑;凍干制劑等。這些制劑能夠通過制劑上的常用方法調(diào)制。作為醫(yī)藥用無毒載體,例如,可以列舉葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明膠、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑等常用的添加劑。另外,本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑,除直接攝取上述微生物或通過直接添加在食品中而攝取之外,能夠以飲食品的方式攝取。作為飲食品的優(yōu)選例子,可以列舉以活菌狀態(tài)含有本發(fā)明微生物的發(fā)酵乳、發(fā)酵豆乳、發(fā)酵果汁、發(fā)酵植物液、發(fā)酵米汁、發(fā)酵麥汁和來自動植物的材料的發(fā)酵飲食品(咸菜、豆醬、醬油、發(fā)酵茶、發(fā)酵香腸、發(fā)酵蛋黃醬、乳酪、咸魚肉等),這些飲食品能夠通過通常方法制造。例如,在制造發(fā)酵乳時,首先,在己滅菌的乳培養(yǎng)基中單獨或與其它微生物同吋接種培養(yǎng)動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種中的至少1種以上,將其均質(zhì)化處理,得到發(fā)酵乳基料。接著,添加混合另外調(diào)制的糖漿溶液,利用均質(zhì)器等均質(zhì)化,再添加香料,完成最終制品即可。這樣操作所得到的本發(fā)明的發(fā)酵乳,也能夠制造成為普通式、軟式、水果香料式、固體狀、液體狀、冷凍狀等任意形態(tài)的制品。另外,飲食品中也包括動物的詞料。發(fā)酵乳中的本發(fā)明微生物濃度,例如能夠設(shè)為1031013cfu/ml。此吋,在本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑中,能夠配合在通常的飲食品中所使用的食品材料,例如,能夠配合糖類、蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、維生素類、礦物質(zhì)類、蔬菜、谷物、果實等植物成分,血液、?L、肝臟、骨、肌肉等動物成分,細菌、霉菌、酵母、真菌等微生物成分或培養(yǎng)物成分,膠凝劑、固化劑、增粘劑、香料、著色劑、雙歧桿菌屬細菌增殖促進劑、乳酸菌增殖促進劑等。具體而言,可以列舉葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖果糖液糖、木糖、帕拉金糖、蜂蜜、楓糖漿、甜米酒等各種甜味料;山梨糖醇、木糖醇、赤蘚醇、乳糖醇、益壽糖、還原水飴、還原麥芽糖水飴等各種糖醇;三氯蔗糖、阿斯巴甜等各種高甜度的甜味料;甘草、甜菊、甘草酸糖苷等各種天然甜味料;蔗糖脂肪酸酯、甘油糖脂肪酸酯、卵磷脂等各種乳化劑;瓊脂、角蛋白、角叉藻聚糖、瓜爾膠、阿拉伯膠、黃原膠、果膠、剌槐豆膠等各種增粘(穩(wěn)定)齊U。此外,可以列舉多含塔格糖、乳糖、海藻糖、海藻糖(trehallose)、瓊脂寡糖、黑曲霉寡糖、半乳寡聚糖、寡聚果糖、寡聚木糖、棉子糖、水蘇糖、乳果糖、麥芽三糖、異麥芽寡糖、環(huán)糊精、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺等各種糖質(zhì);藻酸、藻酸鈉、墨角藻聚糖、馬尾藻多糖、furceran、海蘿聚糖、紫菜聚糖、aminaran、芽霉菌糖、塔拉膠、魔芋甘露糖膠、菊糖、殼多糖、殼聚糖、聚右旋糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、p-葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖、果聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、葡糖甘露聚糖、半乳甘露聚糖、甜菜纖維、燕麥纖維、小麥纖維、大豆纖維、米纖維、大麥纖維、黃原膠、玉米纖維、蘋果纖維、柑桔纖維、歐車前纖維、菠蘿纖維、洋李纖維、豌豆纖維、香蕉纖維、醋酸菌細菌纖維素、乳酸菌菌體細胞壁、雙岐桿菌屬細菌菌體細胞壁、酵母菌體細胞壁、納豆果聚糖、膠原、納豆聚谷氨酸等各種食物纖維或這些食物纖維的各種水解物;小麥麩、大麥麩、米麩、野燕麥麩、燕麥麩、黑麥麩、歐車前、米糠、糙米、菊苣、大豆豆腐渣、蘋果漿、抗性淀粉、大麥麥芽、玉米種子外皮、乳酸菌菌體、雙歧桿菌屬細菌菌體、啤酒酵母菌體、葡萄酒酵母菌體、葡萄酒粕、酒粕、醬油粕、啤酒粕、米曲、麥曲、豆曲、紅曲、黃曲、納豆粘質(zhì)物、葡萄種子提取物、蜂王漿、蜂巢蠟?zāi)z、小球藻、螺旋藻、裸藻、裙帶菜、海帶、馬尾藻、黑海帶、愛森藻、紫菜、腸滸苔、羊棲菜、石莼、海蘊等難消化性的膳食纖維的各種材料。還可以列舉鈣、鎂、鋅、鐵、錳、碘、硒、銅、鈷、白云石等各種礦物質(zhì)類或這些礦物質(zhì)的各種鹽類,檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、丙酮酸、葡糖酸、琥珀酸、富馬酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、丙酸、丁酸、磷酸、肌酸、蛋氨酸、半胱氨酸、谷氨酸等氨基酸等各種酸類或這些酸類的各種鹽類,谷胱甘肽、植酸鈣鎂、植酸、木質(zhì)素、聚卞谷氨酸及其分解物、皂苷、阿魏酸、Y-氨基丁酸、Y-谷維素、査耳酮、二氫黃酮、黃酮、黃酮醇、異黃酮、花色素、兒茶素、原花色素、茶葉多酚、姜黃、辣椒素、芝麻素酚、芝麻木酚素、茶黃素、(3二酮類、類胡蘿卜素類、烯丙基硫化合物、異硫氰酸酯類、萜烯類、葉綠素類、神經(jīng)鞘脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、n-3多不飽和脂肪酸類、n-6多不飽和脂肪酸類、共軛亞油酸類、磷脂質(zhì)類、植物甾醇類等各種成分、大豆球蛋白、伴大豆球蛋白等大豆蛋白質(zhì)、卵清蛋白、卵類粘蛋白等卵蛋白、酪蛋白、乳白蛋白、乳酰肝褐質(zhì)等乳蛋白和乳清蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、乳鐵蛋白等乳蛋白和乳清蛋白、酪蛋白磷酸肽、米膠蛋白等米蛋白、麥谷蛋白、麥醇溶蛋白等小麥蛋白、魚肉蛋白等各種蛋白類及其酶分解肽和酸分解肽類,維生素A、維生素B類、維生素C、維生素D類、維生素E、維生素K類、(3胡蘿卜素、視黃酸、葉酸等各種維生素類,黑升麻、西洋南瓜種子、石榴種子、西洋小連翹、西番蓮、纈草、野葛根、迷迭香、薄荷、荷蘭芹、金盞花、檸檬香油、艾蒿、紅花、蘿卜種子、咖啡樹、五加、葫蘆果實、柑橘科果皮、銀杏葉、棗、枸杞、甘草、靈芝、人參、巴西可可等的各種提取物類,綠茶、紅茶、烏龍茶、武靴葉茶、番石榴葉等各種植物提取物,胡椒、花椒、桂皮、沉金、鼠尾草、麝香草、羅勒、辣椒、肉豆蔻等各種香辣調(diào)味料。另外,可以列舉米、糙米、大麥、小麥、燕麥、黑麥、薏苡、筧、粟、稷、蕎麥、高粱、玉米等各種谷物的成分或這些谷物種子的各種發(fā)芽物成分,小豆、白小豆、金時豆、菜豆、豌豆、紫花豆、鷹嘴豆、黑大豆、綠大豆、綠豆、蠶豆、大福豆、明日葉、羽衣甘藍、郁金、馬鈴薯、甘薯、紫甘薯、山芋、南瓜、茄子、西紅柿、苦瓜、柿子椒、芝麻、巻心菜、花莖甘藍、菜花、萵苣、毛豆、姜、牛蒡、芹菜、蘿卜、辣根、鱷梨、胡蘿卜、菠菜、洋蔥、蒜、百合、韭蔥、紫蘇、蔥、韭菜、荷蘭防風(fēng)草、蕨菜、筍、香菇、蘑菇等各種蔬菜成分,檸檬、蘋果、葡萄、草莓、橙、柿子、番石榴、香蕉、藍莓、黑莓、紅莓苔、木莓、越橘、楊梅、費約果、樹番茄、黃褥花果、酸橙、扁平橘、甜瓜、桃、芒果、柚子、木瓜、波羅、梨、李子、葡萄柚、木梨、杏、橘子、石榴、西瓜、洋李、獼猴桃等各種果實成分,落花生、杏仁、椰子、腰果、澳洲堅果、可可、栗子、白果、核桃等各種堅果成分,牛奶、脫脂奶、乳清、奶油、發(fā)酵乳、酸奶、乳蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等各種乳制品及它們成分,清酒、葡萄酒、紹興酒、啤酒等釀造酒類,威士忌、白蘭地、伏特加等蒸餾酒類等。在利用雙歧桿菌屬細菌的發(fā)酵乳飲食品中,出于提高保存時的生存性的目的,主要使用以玻璃和鋁涂布紙等不透氧性的包裝劑構(gòu)成的容器,但如在后述實施例中所示的那樣,由于本發(fā)明的微生物具有高耐氧性,不需要嚴密的厭氧狀態(tài),所以,本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑的容器材料也能夠使用透氧性高的樹脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯等)。相比于以不透氧性包裝劑構(gòu)成的容器,使用這些樹脂的容器具有成本低、成型自由度高等優(yōu)點。作為本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑有效成分的微生物,如后述實施例中所顯示的那樣,顯示出優(yōu)異的耐酸性,所以,本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑能夠制成酸性,例如,能夠使其在25"C下的pH為27、特別是為36。作為本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑有效成分的雙歧桿菌屬細菌,以往一直作為食品被利用,其安全性也是被確認的,所以當將其作為膽固醇吸收抑制劑使用時,給藥量沒有嚴格的限制,但適當?shù)慕o藥量是作為活菌數(shù)每日105cfu1013cfu,特別優(yōu)選108cfu10l2cfu。實施例以下,列舉實施例和試驗例對本發(fā)明進行更具體地說明,但本發(fā)明并不限于此。〔試驗例1)(1)膽固醇消除活性以12000rpm、15分鐘、4。C的條件離心在m-ILS培養(yǎng)基(Int.J.FoodMicrobiol.81.131-1362003)中37'C厭氧培養(yǎng)24小時的培養(yǎng)液,以pH5.5的150mM磷酸緩沖液洗凈菌體。反復(fù)3次離心洗凈后,懸浮在150mM的磷酸緩沖液中,使?jié)岫?在660nm的吸光度)為3(菌數(shù)為108109cfo/ml),調(diào)制菌體懸浮液。另外,將菌體懸浮液以121t:高壓滅菌處理15分鐘,調(diào)制死菌體懸浮液。在150mM的磷酸緩沖液(pH7.0)中懸浮2g牛膽汁粉末、921mg膽固醇、135mg溶血卵磷脂、90.2mg單油酸、702.2mg油酸,進行12分鐘超聲波處理后,以100,000G在25t:超離心18小時,回收微團層,調(diào)制人工脂質(zhì)微團。相對lml菌體懸浮液(菌數(shù)為108109cfij)加入150pi人工脂質(zhì)微團,在37匸靜置。18小時后,以DeterminerTC555(KyowaMedics生產(chǎn))測定以12000卬m、4°C、離心15分鐘的上清的膽固醇。作為對照,對不含菌體的磷酸緩沖液也進行同樣的操作,由下式算出膽固醇消除活性。另外,對死菌體懸浮液也同樣算出了膽固醇消除活性。膽固醇消除活性(%)=100—(含有菌體的上清的膽固醇量)/(不含菌體的上清的膽固醇量)xiOO(2)耐酸性在以鹽酸調(diào)制為pH3的50mM的Na2HP04溶液10ml中加入O.lml以GAM培養(yǎng)基(日水)培養(yǎng)到固定時間的菌液,在37t:下處理1小時,由下式算出生存率。生存率(%)=(酸處理后的活菌數(shù))/(酸處理前的活菌數(shù))xlOO(3)耐膽汁酸性在添加有0.2%的膽汁酸的GAM培養(yǎng)基3ml中,接種30jil以GAM培養(yǎng)基培養(yǎng)到固定時間的菌液。24小時后,以Klett-Summerson比色計(No.66濾色鏡)測定菌體濁度。上述(1)(3)的試驗結(jié)果表示在表l中。[表l]各菌的膽固醇消除活性、耐酸性、耐膽汁酸性的測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>NT表示未試驗。在耐酸性中,生存率為1%以下時,表示為<1。在耐膽汁酸性中,在添加有膽汁酸的GAM培養(yǎng)基中幾乎不產(chǎn)生時,以目測判斷,用一表示。如表1中所示的那樣,本發(fā)明的動物雙歧桿菌動物亞種、動物雙歧桿菌乳酸亞種和假長雙歧桿菌球形亞種顯示出高的膽固醇消除活性,耐酸性、耐膽汁酸性優(yōu)異。另外,由于死菌體不具有膽固醇消除活性,所以可知這些菌以活菌狀態(tài)顯示活性。其次,為了了解膽固醇從上清消除是由沉淀引起的還是由轉(zhuǎn)變和分解引起的,測定了沉淀部分的膽固醇,明確從上清消除的膽固醇沒有被轉(zhuǎn)變和分解,而是存在于沉淀物中。以上結(jié)果提示,上清中的膽固醇被菌體攝取而沉淀、或者通過菌體具有的膽汁酸解離作用等使脂質(zhì)微團崩解、沉淀的可能性。〔試驗例2〕對動物血中脂質(zhì)和肝臟脂質(zhì)的影響將含有0.03%酵母提取物的10%脫脂奶粉培養(yǎng)基以12rC滅菌15分鐘,接種1。/。假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393,厭氧培養(yǎng)24小吋。在同樣的培養(yǎng)基中接種2%該培養(yǎng)液,以37"C厭氧培養(yǎng)4654小時。這樣調(diào)制的發(fā)酵乳中所含的活菌數(shù)是3.7xl08cfu/ml。將該發(fā)酵乳冷凍干燥,以表2所示的組成調(diào)制食餌。這里,食餌中的活菌數(shù)為是1.0xl06cfu/ml。另一方面,作為對照,將含有0.03。/。酵母提取物的10%脫脂奶粉培養(yǎng)基以12rC滅菌15分鐘后,將不接種菌而冷凍干燥的物質(zhì)作為未發(fā)酵乳,以表2表示的組成調(diào)制食餌。[表2]給予動物的食餌的組成(%)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>接著,將以8周齡購入的Wistar系的卵巢摘除大鼠(日本SLC)或假手術(shù)大鼠預(yù)飼養(yǎng)1周后,以AIN-93G精制飼料馴化1周,根據(jù)體重分為表3所示的實驗組。[表3]實驗組<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>ham:假手術(shù),OVX:卵巢摘除,SM:未發(fā)酵乳,F(xiàn)SM:發(fā)酵乳在室溫24士rc、濕度55士5i:、能夠自由攝取各自的組對應(yīng)的食餌和水的條件下,將這樣分組的大鼠在各支架籠中用試驗飼料飼養(yǎng)34日。每日的活菌數(shù)攝取量是約10、fu/只。接著,取出投餌器,4小時后進行戊巴比妥麻醉,采取腹主動脈血,并沖洗后摘取肝臟。肝臟在分析前保存在一2(TC,血液以3000rpm離心15分鐘,分離血漿。肝臟在冷凍千燥后,采用Folch的方法(J.Biol.Chem.226,497-509,1957)提取。分另ll使用DeterminerTC555(KyowaMedics)、TriglycerideE-testWako(和光純藥)求出在這樣得到的血漿和肝臟提取物中所含有的總膽固醇、甘油三酯的量。另外,使用HDL-cholesterolE-testWako(和光純藥)求出在血漿中所含的HDL膽固醇量。再通過從總膽固醇量減去HDL膽固醇量,求出血漿中所含的VLDL+LDL膽固醇量。以得到的結(jié)果為基礎(chǔ),對卵巢摘除組進行雙因素方差分析,求出p。另外,針對與假手術(shù)組給予同樣食餌的卵巢摘除組進行t檢驗。得到的結(jié)果表示在表46中。值以平均值士SD表示。另外,在表46中,所謂交互作用,表示發(fā)酵乳和半乳寡聚糖之間的交互作用。[表4]以假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393調(diào)制的發(fā)酵乳對生長的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>**、在假手術(shù)/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組和卵巢摘除/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組之間有0.01、0.001的有意義的差別。NS:無有意義的差別如表4中所示,卵巢摘除的大鼠和假手術(shù)組比較,如已報告(J.Comp.Physiol.Physicol88:183-193,1975)的那樣,體重和攝食量增大,但在卵巢摘除組中,不能確認寡聚糖的有無和給予發(fā)酵乳所帶來的影響,成長良好。[表5]以假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393調(diào)制的發(fā)酵乳對血中脂質(zhì)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*:在假手術(shù)/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組和卵巢摘涂/未發(fā)酵孚L/無寡聚糖組之間,有0.05的有意義的差別。TC:總膽固醇(mg/dl),TG:甘油三酯(mg/dl),HDL—C:HDL膽固醇(mg/dl),VLDL+LDL—C:VLDL+LDL膽固醇(mg/dl),AI:動脈硬化指數(shù)(VLDL+LDL—C/HDL—C)NS:無有意義的差別另外,如在表5中所示,以假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393調(diào)制的發(fā)酵乳的效果,在血中的膽固醇、甘油三酯、VLDL+LDL膽固醇、動脈硬化指數(shù)中均得到確認,所有項目均降低。特別是VLDL+LDL膽固醇的下降顯著。另外,在統(tǒng)計學(xué)上沒有觀察到寡聚糖對這些項目的效果和發(fā)酵乳與寡聚糖的交互作用,但寡聚糖和發(fā)酵乳并用給藥組的血中總膽固醇、甘油三酯、VLDL+LDL膽固醇、動脈硬化指數(shù)的值顯示最低值。已知半乳寡聚糖被雙歧桿菌屬細菌特異地利用。因此,通過給予含有半乳寡聚糖的發(fā)酵乳,假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393在腸道內(nèi)增殖,表現(xiàn)出有效降低血中脂質(zhì)的效果。另外,已知摘除卵巢使血中總膽固醇升高,作為閉經(jīng)后高脂血癥模型是有用的。根據(jù)卵巢摘除/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組和假手術(shù)組的數(shù)據(jù)比較,顯示本次試驗中的卵巢摘除手術(shù)是成功的。[表6]以假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393調(diào)制的發(fā)酵乳對肝臟脂質(zhì)的影響假手術(shù)未發(fā)酵乳無寡聚糖卵巢繼劉方差分析的結(jié)果未發(fā)酵乳發(fā)酵乳(p<)無寡聚糖有寡聚糖無寡聚糖有寡聚糖發(fā)酵乳寡聚糖交互作用肝臟重量(g)6.5±0.67.9土0"7.5±0.77.6±1.07.3±0.5NSNSNS總膽固醇(mg/g)7.4±0.87.1±0.37.0±0.47.3±0.47.3±0.4NSNSNS總膽固醇(mg/liver)13.6±1.616.6±1.4*16.0±1.316.0±2.615.4±0.43NSNSNS甘油三酯(mg/g)72.1±12.7137.7±26.5**138.4±28.8117.7±29.0103.3±11.10.05NSNS甘油三酯(mg/liver)132.4±23.8325.8±80.3"319.1±97.7268.4±113.9220.4±29.6NSNSNS*、**:在假手術(shù)/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組和卵巢摘除/未發(fā)酵乳/無寡聚糖組之間,依次有0.05、0.01的有意義的差別。NS:無有意義的差別如在表6中所示,有無寡聚糖和是否給予發(fā)酵乳對肝臟膽固醇含量沒有影響,脂質(zhì)沒有向肝臟積蓄。雖然給予發(fā)酵乳在肝臟中沒有觀察到甘油三酯在統(tǒng)計學(xué)上的有意義的差別,但每lg肝臟的甘油三酯含量下降。如上所述,根據(jù)以假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393調(diào)制的發(fā)酵乳使血中總膽固醇、甘油三酯、VLDL+LDL膽固醇、動脈硬化指數(shù)下降,可知其不僅對膽固醇代謝具有改善功能,而且對各種血中脂質(zhì)的脂質(zhì)代謝具有改善功能,并具有降低動脈硬化發(fā)病危險的效果。(試驗例3〕在發(fā)酵乳中的生存率的研究在10%脫脂乳中添加0.03%酵母提取物,滅菌,分別接種2%的本發(fā)明細菌(動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393),在37。C下培養(yǎng)至pH5.1土1.0,制造5種發(fā)酵乳。另夕卜,作為對照,使用長雙歧桿菌ATCC15707,同樣地制造發(fā)酵乳。在厭氧保存時向玻璃試管中、在非厭氧保存(好氧保存)時向聚丙烯管中分別注入10ml調(diào)制的發(fā)酵乳,在l(TC保存12周。在厭氧保存時,在N2氣流下以丁基橡膠栓密封,在非厭氧保存時,松弛地蓋上聚丙烯管的蓋子。培養(yǎng)結(jié)束時的pH和活菌數(shù)表示在表7中,非厭氧保存下的菌數(shù)變化表示在表8中,厭氧保存下的菌數(shù)變化表示在表9中。[表7]各菌株在培養(yǎng)結(jié)束時的pH和活菌數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如在表8中所示的那樣,在非厭氧條件(好氧條件)保存中,對照中使用的長雙歧桿菌ATCC15707在3周后減少至9.2xl03cfo/ml,在8周后不能被檢出。與此相對,本發(fā)明的雙歧桿菌屬細菌,對于任意的菌株,即使保存3周后也不低于lxl08Cfu/ml,與培養(yǎng)結(jié)束時比較的生存率為50%以上。另夕卜,即使保存12周,動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117也不低于lxl08cfo/ml,其余3種菌株(假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393、動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394)也僅減少12個數(shù)量級左右。如在表9中所示的那樣,在厭氧條件保存下,保存3周后,長雙歧桿菌ATCC15707的菌數(shù)減少到1/10左右,但本發(fā)明的雙歧桿菌屬細菌幾乎維持培養(yǎng)結(jié)束時的菌數(shù)。假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393、動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394即使保存12周,菌數(shù)也僅減少1/21/6左右,動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117即使保存12周后,菌數(shù)也幾乎是相同?!蔡幏嚼?〕片劑的制造以下述處方混合各種成分,造粒、干燥、整粒后,壓片制造片劑。(處方)(mg)本發(fā)明的細菌菌體的干燥物1〕20微晶纖維素100乳糖80硬脂酸鎂0.5甲基纖維素12u:冷凍干燥假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392的活菌體而得到?!蔡幏嚼?)發(fā)酵乳飲料的制造在15%的脫脂乳中添加3%的葡萄糖,殺菌,接種1%的假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393,以35。C厭氧培養(yǎng)24小時,得到210g發(fā)酵乳基料。另一方面,在水中溶解97g砂糖、0.2g乳化鐵,使總重量為790g,滅菌,得到糖漿。將如上述操作得到的發(fā)酵乳基料與糖漿混合,添加lg香料后,以15Mpa均質(zhì)化,填充在容器中,得到發(fā)酵乳飲料。得到的發(fā)酵乳飲料的外觀、風(fēng)味都很良好,剛制造后的活菌數(shù)為2.5xl08cfu/ml。另外,1(TC保存21日后的活菌數(shù)為1.4xl08cfu/ml,保存穩(wěn)定性也很良好?!蔡幏嚼?)清涼飲料的制造根據(jù)下述處方,按照通常方法混合各種成分,均質(zhì)化而得到清涼飲料。將得到的清涼飲料充填在褐色瓶中后,以鋁蓋封口,實施加熱處理。得到的清涼飲料的外觀、風(fēng)味都很良好,保存穩(wěn)定性也很良好。(處方)(g)本發(fā)明的細菌菌體的干燥物"5香料0.8水100還原淀粉糖化物24果糖18":冷凍干燥動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394的活菌體而得到。權(quán)利要求1.一種膽固醇吸收抑制劑,其特征在于以選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種中的1種以上的微生物為有效成分。2.—種膽固醇吸收抑制劑,其特征在于以選自動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117中的1種以上的微生物為有效成分。3.—種膽固醇吸收抑制劑,其特征在于以選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392和假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393中的l種以上的微生物為有效成分。4.動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394(FERMABP-10662)、假長雙歧桿菌球形亞種YIT10392(FERMABP-10660)或假長雙歧桿菌球形亞種YIT10393(FERMABP-10661)。全文摘要本發(fā)明提供在消化道內(nèi)的生存性優(yōu)異、在腸道內(nèi)具有膽固醇吸收抑制作用、降低血中膽固醇等的脂質(zhì)代謝改善作用優(yōu)異、并且保存后的生存性高的雙歧桿菌屬細菌,以及使用該細菌的膽固醇吸收抑制劑。本發(fā)明的膽固醇吸收抑制劑以選自動物雙歧桿菌動物亞種YIT10394、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM1253、動物雙歧桿菌乳酸亞種JCM7117和假長雙歧桿菌球形亞種中的1種以上的微生物作為有效成分。文檔編號A61P3/06GK101257910SQ20068003292公開日2008年9月3日申請日期2006年9月7日優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日發(fā)明者早川弘子,石川文保,飯野透申請人:株式會社益力多本社
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