專利名稱：產生羧基端酰胺化肽的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及羧基端(C端)酰胺化肽的產生，所述羧基端(C端)酰胺化肽具有C端酰胺化了的賴氨酸，特別是具有GLP-1的生物學活性；涉及其化學或生物技術學前體和中間體；涉及其產生方法以及其用于產生藥品的用途。
患有糖尿病或肥胖癥人群的數量正在全世界以高增長速率增加。因此期望在這一疾病領域顯示高療效的藥物必須能以提高的質量和數量獲得。
專利申請US2004/0106547 A1描述了來自胰高血糖素樣肽抑制劑的肽，由于它們的血糖降低作用，在治療糖尿病或其它例如能導致肥胖癥的代謝性疾病中作為可能藥物而具有重要性。特別地，由于它們作用的生理學機制，目前期望糖尿病后遺癥將較不顯著或大大延遲。
發(fā)現在US2004/0106547 A1中描述的肽由于引入一個或多個C端賴氨酸殘基(末端的賴氨酸殘基被C端酰胺化)而特別有活性。
為了產生這些肽，在US2004/0106547 A1中提到了多種產生方法。一種方法涉及生物技術學方法，其中在酵母中細胞內表達后，從細胞分解產物分離靶標蛋白質。然而，微生物僅微量形成C端酰胺化的肽，因此如US2004/0106547 A1提出的生物技術學產生僅僅能非常費力地或高費用地實現。
作為備選，該申請描述了所討論肽的化學全合成。為此提出改進的Merryfield合成法，然而其依然是非常費力的并且具有高成本。其中的原因是這樣的事實，即用于合成的氨基酸必須首先產生和純化，然后在化學修飾后特異地在肽合成中用作反應物。在合成的最后，必須除去保護基且在將其配制為藥物前純化靶標肽或產物。因此化學全合成在巨大花費時可行，并且有極低的生態(tài)效益。
能夠在C端酰胺化肽的酶已知道很久。將這些酶稱作(Eipper等人，Mol.Endocrinol.1987 Nov；1(11)1987)肽基甘氨酸α-酰胺化酶(PAM)。此類PAM酶的產生和純化是本領域技術人員所熟悉的且已詳細描述；而且許多此類酶制品是可商購的(例如K Ohsuye等人，Cytotechnology 31，199985-94，US4708934、US5789234、US6255067、US6319685以及JP0177184)。
Bradbury等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.(1983)112(2)372-377)顯示PAM“在體外”優(yōu)選地識別其C端由氨基酸甘氨酸組成的肽作為底物。他們還說明在相鄰甘氨酸的N端位置的堿性氨基酸強烈地減緩PAM的反應速率。
現已發(fā)現PAM令人驚訝地很好地識別具有堿性氨基酸C端序列(特別是寡賴氨酸或聚賴氨酸序列)且還具有C端甘氨酸殘基的胰高血糖素樣肽的抑制劑衍生物作為底物。
因此令人驚訝地，根據本發(fā)明使得以相當低的成本來生物技術學產生酰胺化的肽，特別是如US2004/0106547 A1描述的此類酰胺化肽成為可能，由此可以通過單個酶步驟從其C端甘氨酸延伸的前體肽/蛋白質制備所需的產物。
在根據本發(fā)明的方法中，產生具有C端賴氨酸殘基的包含一個或多個堿性氨基酸的生物學活性肽，所述堿性氨基酸優(yōu)選為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸殘基，特別是賴氨酸殘基，其中最后的C端賴氨酸殘基是C端酰胺化的。通過根據本發(fā)明的方法產生的肽優(yōu)選地表現出GLP-1、胰高血糖素樣肽抑制劑4或其生物學活性類似物或其衍生物的生物學活性。
因此本發(fā)明特別使來自US2004/0106547的2號化合物的生物技術學產生成為可能。所述的2號化合物具有以下序列(Seq.ID No.1)NH2-HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKK-NH2因此式I的肽是本發(fā)明的目標(AS)n-XmYp(式I)，其中
AS為基因可編碼的一個或多個氨基酸；n為5-2000，優(yōu)選地為10-1000，特別地為15-500，十分特別優(yōu)選地為20-400；X為一個或多個堿性氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸，特別地為賴氨酸；m為1-15，優(yōu)選地為3-10，特別地為6-8；Y為一個或多個中性電荷氨基酸，優(yōu)選地為甘氨酸；且p為1-10，優(yōu)選地為1-5，特別地為1；其中n、m和p為整數且(AS)n和/或(AS)nXm優(yōu)選地為生物學活性肽或蛋白質。
十分特別優(yōu)選地是根據Seq ID No.2的式I的化合物NH2-HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPSKK KKKKG (SeqID No.2)和具有至少60％，優(yōu)選地為80％，特別地為90％同源性的其生物學活性衍生物。
同樣地，本發(fā)明另外的目標是a)編碼本發(fā)明肽的核酸分子，優(yōu)選地為DNA、cDNA或RNA分子；b)包含本發(fā)明核酸分子的表達盒；c)包含本發(fā)明核酸分子或表達盒的載體，優(yōu)選地為表達載體，特別地為用于在酵母和/或細菌細胞中表達的表達載體；d)包含本發(fā)明核酸分子、表達盒或載體的宿主細胞，優(yōu)選地為細菌或酵母細胞，任選地還共表達酶PAM；e)能夠將RNA分子翻譯成蛋白質的體外表達系統(tǒng)。
同樣地本發(fā)明還有另一個目標是用于產生通式II的C端酰胺化肽的方法(AS)n-Xm-NH2(式II)其中AS為基因可編碼的一個或多個氨基酸；n為5-2000，優(yōu)選地為10-1000，特別地為15-500，十分特別優(yōu)選地為20-400；并且(AS)n和/或(AS)n-Xm是生物學活性肽或蛋白質，X為一個或多個堿性氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸，特別地為賴氨酸；m為1-15，優(yōu)選地為3-10，特別地為6-8；且n和m是整數并且其中a)在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，b)表達本發(fā)明的肽，c)任選地通過酶切割從適宜的前體肽中釋放本發(fā)明的肽；d)來自步驟b)的表達產物或來自步驟c)的中間體產物，任選地在純化后與α-酰胺化酶反應以提供通式II的化合物；且e)以適宜的方式純化通式II的化合物，優(yōu)選地通過制備層析方法。
但是本領域的技術人員知道已知的生物化學或生物物理學分離方法的組合同樣能得到所需的純化結果。
優(yōu)選地，根據本發(fā)明的方法用于產生C端酰胺化肽，其(用于)產生SeqID No.1的化合物。
首先，在本發(fā)明方法的上下文中，開發(fā)了微生物產生異源肽/蛋白質的能力。為此，將所需的肽/蛋白質序列翻譯成與宿主特異性啟動子序列偶聯的相應的DNA序列。根據表達策略，在此可以以這樣的方式表達靶標肽，即其是通過細胞直接或間接地作為融合蛋白質形成的，同時仍存在于細胞內。融合蛋白質可以在化學或酶加工成所需靶標蛋白質前直接地與PAM反應，或可以以相反的順序在通過與PAM反應而酰胺化前首先切割成融合片段。如果選擇了融合策略，則對于本領域技術人員來說很清楚的是融合配偶體必須通過橋連成員連接到一起，所述橋連成員允許以這樣的方式切割配偶體，即Lys-Xm-Gly延長的靶標肽N端在加工后正確存在。存在多種選擇用于設計橋連成員。如果例如選擇氨基酸甲硫氨酸，則能夠用鹵化氰化學切割。如果例如選擇序列為DDDDK的五肽作為橋連成員，則能夠用腸激酶切割。如果例如選擇序列為IEGR的四肽，則可通過因子Xa實現切割。通過適宜的設計，Genenase可以用作其N端以組氨酸起始的蛋白質的底物結合酶。在以下的實施例部分中描述了使用腸激酶的切割。
然而可選地，如果靶標肽是適合輸出的，則可以將它以融合蛋白質的形式或直接以天然形式釋放到培養(yǎng)基中。為此，可以使用通過基因工程修飾的細胞，特別是微生物的，優(yōu)選地為細菌的或酵母的。如果選擇細菌細胞作為表達系統(tǒng)，還可選擇將靶標蛋白質直接釋放或將包含靶標蛋白質的相應的融合蛋白質釋放到周質或培養(yǎng)基中。
原則上能夠用于此的宿主微生物和方法是本領域技術人員已知的。在很大程度上這些還能夠從許多供應商處商購。作為典型的例子，提及NewEngland Biolabs、Invitrogen和Roche公司。在此類公司的目錄說明書中有提供技術概況的文獻參考。
而且對本領域的技術人員來說還清楚，與生物技術學方法的技能一樣，得到使用的微生物的范圍在不斷擴展。本發(fā)明的目標還包括在這一方面專門的實施方案。
一般地，通過舉例，提及下列宿主/載體系統(tǒng)大腸桿菌(E.coli)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、沙門氏菌屬(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubeilis)或假單胞菌屬(Pseudomonas)型的細菌及乳酸克魯維酵母(K.lactis)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)和釀酒酵母(S.cerevisiae)型的酵母。
下面通過舉例，描述基于大腸桿菌K12和大腸桿菌B的系統(tǒng)的用途。而且本領域技術人員知曉通過舉例提到的這些系統(tǒng)提供了多種變化的可能性，例如它們源自選擇適宜的啟動子或其它調節(jié)核酸序列、所使用的宿主細胞和載體的遺傳特性(如DNA拷貝數、選擇培養(yǎng)基等)。對本領域的技術人員來說更加清楚文中所描述的實踐實施例僅僅代表與實際可行的可能性相關的很少的選擇。
當PAM酶與待酰胺化的前體蛋白質在同一個宿主細胞中共表達時出現了用PAM“體外”酰胺化的一種備選。這是通過在宿主特異性調節(jié)序列的控制下向宿主細胞中引入編碼PAM活性的基因序列實現的。這一表達序列既可以被穩(wěn)定地摻入到所討論的染色體DNA序列上，也可以與靶標蛋白質的表達質粒平行地存在于另一個質粒上，或者可以作為另一表達盒被整合到同一載體中，或者甚至可以在同一啟動子序列的調控下被克隆到與編碼靶標蛋白質的基因序列同相的多順反子表達單元中。
因此本發(fā)明包括用于產生式I的肽或其衍生物的生物技術學方法，所述的衍生物表現出與式I至少60％，優(yōu)選地至少80％，特別地至少90％的同源性。
根據本發(fā)明方法的特征在于產生合成肽前體的重組微生物，隨后可在酶存在下直接地或通過與一個或多個堿性氨基酸或其衍生物順序連接將所述肽前體轉化為與對應于式I的肽，所述堿性氨基酸按順序優(yōu)選地為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸殘基，特別地為賴氨酸，其中序列是C端酰胺化的。
本發(fā)明的另一目標還有根據本發(fā)明方法已經產生的本發(fā)明式I的化合物或式II的C端酰胺化肽，特別是Seq ID No.1或2的化合物的用途，其用于產生藥品或藥物制劑，優(yōu)選地用于治療碳水化合物代謝紊亂，特別優(yōu)選地用于治療糖尿病。
實施例實施例1.編碼AVE1-44-Gly的大腸桿菌特異性DNA序列的合成首先制備編碼肽AVE1-44-Gly(Seq ID No.2)的基因序列Seq ID No.3Seq ID No.3TTTTTTAAGCTTG CACGGTGAAG GTACCTTCAC CTCCGACCTG TCCAAACAGATGGAAGAAGA AGCTGTTCGT CTGTTCATCG AATGGCTGAA AAACGGTGGTCCGTCCTCCG GTGCTCCGCC TTCGAAAAAG AAGAAAAAGA AAGGT TGATAATAGCATGCA CGTGCGGCCG CACCTGGTCGA CGAATTCAAA AAAA使用PCR技術實現基因序列的合成。為此，通過化學DNA合成法合成下列5個引物。使用ExpediteTMDNA合成系統(tǒng)實現這一合成。
a)引物zp5u具有序列(Seq ID No.4)5′-TTTTTTAAGC TTGCACGGTG AAG-3′
Seq ID No.4包含有義鏈的區(qū)域1-23。
b)引物zp3a具有序列(Seq ID No.5)5′-CTTCCATCTG TTTGGACAGG TCGGAGGTGA AGGTACCTTCACCGTGCAAG CTTAAAAAA-3′Seq ID No.5包含反義鏈的區(qū)域1-59。
c)引物zp3b具有序列(Seq ID No.6)5′-GGACGGACCA CCGTTTTTCA GCCATTCGAT GAACAGACGAACAGCTTCTT CTTCCATCTG TTTGGACAG-3′Seq ID No.6包含反義鏈的區(qū)域40-108。
d)引物zp3c具有序列(Seq ID No.7)5-GTGCATGCTA TTATCAACCT TTCTTTTTCT TCTTTTTCGAAGGCGGAGCACCGGAGGACG GACCACCGTT TTTC-3′Seq ID No.7包含反義鏈的區(qū)域91-164。
e)引物zp3d具有序列(Seq ID No.8)5′-TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGCGGCCG CACGTGCATGCTATTATCAA CCTT-3′Seq ID No.8包含反義鏈的區(qū)域144-197。
使用這些引物在54℃標準條件下連續(xù)進行4個PCR發(fā)應，在反應1中使用引物zp3a與zp5u每種各100ng。PCR循環(huán)數為5。在第二個反應中，在10個循環(huán)中用引物zp5u與zp3b每種各100ng處理1/40的反應物。在反應3中，在另外10個循環(huán)中用引物zp5u和zp3c每種各100ng處理1/40反應2的產物。最后，在25個PCR循環(huán)中用從反應3得到的1/40的產物與引物zp5u和zp3d合成所需的DNA片段，并通過凝膠電泳檢驗其長度。將所需的DNA片段純化并且按照制造商的說明書(New EnglandBiolabs)先后與限制性酶EcoR1和Hind3反應。
平行地，用酶EcoR1與Hind3處理質粒pUC19(New England Biolabs)的DNA。用1.2％的瓊脂糖凝膠分離來自切割混合物的片段并且之后分離pUC19的殘留載體片段和從反應4得到的所需產物。在T4連接酶反應中16℃過夜將純化片段連接到一起。接下來用連接混合物轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞(Stratagene，菌株大腸桿菌XL10 Gold)并涂到含25mg/l的氨芐青霉素的瓊脂平板上。將質粒DNA從單個克隆中分離并通過DNA序列分析進行表征。
將所需片段的質粒DNA命名為pSCHPUCZP10。將它用作原材料用于產生表達載體，其用于在大腸桿菌K12細胞中合成根據本發(fā)明的前體肽。
實施例2編碼前體肽AVE1-44-Gly的表達載體的構建為了產生肽AVE1-44-Gly，將編碼序列引入來自Invitrogen公司(目錄號K360-01)的載體pThioHisA中。形成包含通過腸激酶識別序列DDDDK與前體肽AVE1-44-Gly連接的硫氧還蛋白的融合蛋白質。在PAM(WakoPure Chemicals Ind.Ltd.)存在時按照實施例7(下列)通過用腸激酶處理，將AVE1-44-Gly釋放并可隨后轉化為靶標蛋白質AVE1-44-NH2。
合成有下列序列的兩個引物有BamH1切割位點的引物Zp_thiohisf(Seq ID No.9)5′-TTTTTTGGAT CCGGTGATGA CGATGACAAG CACGGTGAAG GTACCTTC-3′有EcoR1切割位點的引物ZP_thiohisrev(Seq ID No.10)5′-TTTTTTGAAT TCGTCGACCA GGTGC-3′在標準條件下，用pSCHPUCZP10 DNA作為模板，在PCR反應中使用引物Zp_thiohisf與ZP_thiohisrev。產生PCR片段，其在用酶BamH1和EcoR1切割后在T4連接酶反應中直接被插入到相應地用BamH1和EcoR1打開的pTHIOHisA載體中。將感受態(tài)大腸桿菌BL21細胞用連接混合物轉化并涂到含25mg/l氨芐青霉素的選擇性瓊脂上。將質粒DNA從一些克隆中再分離并用PCR和隨后的DNA序列分析來分析。根據專利US5496924的實施例14，類似地檢測所需的命名為pTHIOHisAZP10-Gly的陽性克隆的融合蛋白質表達。以陽性表達分析為基礎，選出一個克隆并發(fā)酵以產生更大量的材料。形成的融合蛋白質包含通過腸激酶識別序列與AVE1-44-Gly連接的硫氧還蛋白(Seq ID No.12)。
其內容在此清楚地引用到本申請中作為參考的US5496924提出了原則上能夠產生適應需要的(made-to-measure)融合蛋白質的表達系統(tǒng)。系統(tǒng)的優(yōu)點在于可產生具有少量壓載含量(small ballast content)的融合蛋白質的事實。如果序列區(qū)段A-B通過腸激酶識別序列DDDDK與AVE1-44-Gly融合，則可得到有下列基因和氨基酸序列(Seq ID No.11和12)的融合蛋白質Seq ID No.11GGAAACAGAATTC ATGGCGCCGA CCTCTTCTTC TACCAAAAAG CTCAACTGCAACTGGAACA CCTGCTGCTG GACCTGCAGA TGATCCTGAA CGGTATCAACAACTACAAAA ACCCGAAACT GACGCGTATC GACGATGACG ATAAACACGGTGAAGGTACC TTCACCTCCG ACCTGTCCAA ACAGATGGAA GAAGAAGCTGTTCGTCTGTT CATCGAATGG CTGAAAAACG GTGGTCCGTC CTCCGGTGCTCCGCCTTCGA AAAAGAAGAA AAAGAAAGGT TGATAATAGC ATGCACGTGCGGCCGCAAGC TTAAAAAASeq ID No.12MAPTSSSTKK TQLQLEHLLL DLQMILNGIN NYKNPKLTRI DDDDKHGEGTFTSDLSKQME EEAVRLFIEW LKNGGPSSGA PPSKKKKKKG通過PCR技術實現編碼基因序列的制備。為此合成下列引物1)引物psw3_zpcolf(Seq ID No.13)5′-CGTATCGACG ATGACGATAA ACACGGTGAA GGTACCTTC-3′因此引物的序列包含了腸激酶識別位點和AVE1-44-Gly編碼序列的起始。
2)引物psw3_zpcolrev(Seq ID No.14)5′-GTGTTTATCG TCATCGTCGA TACGCGTCAG TTTCGG -3′因此序列對應于合成的白介素-2序列，根據US5496924的表1其包含氨基酸34-38和2/3的氨基酸甲硫氨酸的密碼子。其余的引物序列與引物psw3_zpcolf重疊。
3)pBprimef1(Seq ID No.15)5′-TGAGCGGATA ACAATTTCAC AC-3′引物與在質粒pK50(US5496924的圖33)中包含的EcoR1切割位點上游雜交。
4)有Hind3切割位點的psw3_zp10colrev(Seq ID No.16)5′-TTTTTTAAGC TTGCGGCCGC ACGTGCATGC TATTATCAAC CTTC-3′兩個PCR平行進行。一個在50℃時用引物對pBprimef1和psw3_zpcolrev在質粒pK50的DNA上進行，并且另一個反應在54℃用引物對psw3_zpcolf和psw3_zp10colrev在質粒pTHIOHisAZP10-Gly的DNA上進行。在凝膠電泳分離后純化PCR產物，將每一整分試樣以1∶1的比例混合并且之后在第三次PCR中用引物對pBprimef1和psw3_zp10colrev反應。將PCR產物用酶EcoR1和Hind3處理并在T4連接酶反應中插入到平行地用這些酶打開的質粒pK50中。將感受態(tài)大腸桿菌BL21細胞用連接混合物轉化并涂到含25mg/l氨芐青霉素的選擇性瓊脂上。從一些克隆中再分離質粒DNA并用PCR和隨后的DNA序列分析法分析。將陽性克隆命名為pBZP100且用于融合蛋白質表達的檢測。
通過質譜并且通過SDS-PAGE分析表達產物并通過蛋白質序列分析確定N端。選擇適宜的克隆用于大量材料的發(fā)酵。
實施例3在實施例2中構建的菌株的發(fā)酵在發(fā)酵罐中，在無機鹽培養(yǎng)基中或復雜培養(yǎng)基中(見實施例1)在30℃或37℃且在pH為7.0時培養(yǎng)用不同的編碼靶標肽衍生物(融合蛋白質)的質粒載體轉化的大腸桿菌BL21細胞。用NH4+溶液(在水中26％)實現pH調節(jié)。通過將培養(yǎng)物肉湯中的溶解氧保持在30％不變的調控策略來確保培養(yǎng)物的通氣。對于在無機鹽培養(yǎng)基中的進料分批過程，在分批階段完成后裝入葡萄糖溶液(60％w/v)(8g/L/hr到26g/L/hr)。通過加入IPTG(1-4mM終濃度(f.c.))實現蛋白質表達的誘導。誘導持續(xù)6-8小時。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測靶標蛋白質的表達。
按照下列描述的實施在大腸桿菌BL21/pBZP100中AVE1-44-Gly(-融合蛋白質)的表達從儲存在-80℃的大腸桿菌BL21細胞的永久培養(yǎng)物中取100μl細胞懸液并在0.5L預培養(yǎng)基中在37℃振蕩孵育10-16小時。用適宜量的預培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐中的主培養(yǎng)物到OD600為0.01到0.05的接種密度。
預培養(yǎng)基5g/L細菌用胰蛋白胨10g/L酵母提取物
5g/L NaCl主培養(yǎng)基基于葡萄糖作為碳源的確定成分的無機鹽培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)(JeffreyH MillerExperiments in Molecular Genetics，Cold Sprmg HarborLaboratory(1972))在消耗完最初存在于主培養(yǎng)基中的葡萄糖后，補入葡萄糖溶液。觀察到通過加入IPTG(1mM終濃度)誘導的蛋白質表達和在誘導后融合蛋白質的最大表達。
使用例如來自Novex公司的SDS-PAGE分析系統(tǒng)(NuPageNovex12％凝膠系統(tǒng)，InvitrogenTM)，根據制造商的說明書分析在不同培養(yǎng)時間點從發(fā)酵罐中回收的細胞懸液的OD600nm為0.02的部分。
實施例4融合蛋白質的純化BZP-AVE1-44-Gly融合蛋白質的分離將生物量200g的重組大腸桿菌菌株重懸在300ml Tris緩沖液(50mMTris/HCl，pH 7.4；1mM EDTA)中。用兩倍高壓勻漿(Rannie高壓勻漿器，1000bar)進行細胞分解。通過離心除去勻漿物中的不溶成分。將上清液在壓力下過濾(Sartorius 0.22μm過濾器，111型)并且應用到預先用緩沖液(50mM Tris/HCl pH 7.3；1mM EDTA)平衡的層析柱上(Source S，Amersham Biosciences)。在上樣后用平衡緩沖液(2倍柱體積)實現洗滌步驟，接著是用10％高鹽緩沖液(50mM Tris/HCl pH 7.3；1M NaCl，1mMEDTA)的另外的洗滌步驟。通過用超過5倍柱體積的高鹽緩沖液來應用鹽梯度實現分級分離。通過SDS凝膠電泳(NuPageNovex 12％凝膠系統(tǒng)，Invitrogen)檢測單獨級分的融合蛋白質含量。將含有融合蛋白質的級分合并在5-10倍之間濃縮(Millipore超濾器，10kDa截留膜)。通過將緩沖液轉換為腸激酶緩沖液(50mM Tris/HCl pH 7.4；50mM NaCl，2mM CaCl2)直接將濃縮液用于蛋白酶切割反應，或在切割反應前通過凝膠過濾(Superdex 75，Amersham Biosciences)進一步純化濃縮液。
按照制造商的說明書，用溶于腸激酶緩沖液(20mM Tris/HCl，50mMNaCl，2mM CaCl2pH 7.4)中的腸激酶(Invitrogen)實現融合蛋白質的切割。
實施例5含有Seq ID No.3的硫氧還蛋白融合蛋白質的純化將生物量200g的重組大腸桿菌菌株重懸在50mM Tris緩沖液(pH 7.4；1mM EDTA)中。用兩倍高壓勻漿(Rannie高壓勻漿器，1000bar)進行細胞分解。通過離心除去勻漿物中的不溶成分。將上清夜在壓力下過濾(Sartorius 0.22μm過濾器，111型)并且應用到預先用緩沖液(50mMTris/HCl pH 7.4；1mM EDTA)平衡的層析柱上(Source Q，AmershamBiosciences)。在上樣后用平衡緩沖液(2倍柱體積)實現洗滌步驟，并且通過用超過6倍柱體積的高鹽緩沖液(50mM Tris/HCl pH 7.4；0.3M NaCl，1mM EDTA)應用鹽梯度來實現分級分離。通過SDS凝膠電泳(NuPageNovex 12％凝膠系統(tǒng)，Invitrogen)檢測單獨級分的融合蛋白質含量。將含有融合蛋白質的級分合并并且5到10倍濃縮(Millipore超濾器，10kDa截留膜)。通過凝膠過濾層析(gel filtration chromatography，Superdex 75，Amersham Biosciences)進一步分級分離濃縮液。用濃縮的融合蛋白質溶液將預先平衡的柱子(50mM Tris/HCl pH 7.4；200mM NaCl)充填到最多5％的柱體積。通過用平衡緩沖液漂洗實現洗脫。通過SDS凝膠電泳(NuPageNovex 12％凝膠系統(tǒng)，Invitrogen)再次檢測單獨級分的融合蛋白質含量。合并相關級分，濃縮到大約5mg/ml(具有10kD截留的Vivaspin濃縮器，Vivascience)，并通過滲濾單元(Vivascience)實現將緩沖液轉換為腸激酶緩沖液(20mM Tris/HCl pH 7.4；50mM NaCl)。
然后類似于實施例4，用腸激酶實現AVE1-44-Gly前體階段的加工。
實施例6腸激酶切割反應的切割產物的分離在用腸激酶切割融合蛋白質后，通過離子交換層析(Source 30S，Amersham Biosciences)將切割產物彼此分離。通過加入氯化鈉將溶液的離子強度調節(jié)到大約10mS/cm。在將蛋白質溶液應用到預先平衡的柱子(20mM Tris/HCl，pH 7.4；用NaCl調節(jié)到電導率為大約10mS/cm)上后，將未結合的物質用緩沖液(20mM Tris/HCl，pH 7.4；用NaCl調節(jié)到電導率為大約10mS/cm)洗出。通過應用超過10倍柱體積的梯度到500mM NaCl實現AVE1-44-Gly肽的洗脫。
通過SDS凝膠電泳、HPLC和質譜實現含有AVE1-44的級分或AVE1-44的前體階段的鑒定。將適當的級分合并并且在去除有機溶劑后凍干。
最后，為了確認氨基酸序列，通過Edman法全測序分離的AVE1-44-Gly。
實施例7AVE1-44-Gly到AVE1-44-NH2的轉化按照制造商關于反應條件的說明書用PAM酶(肽基甘氨酸酰胺化酶，Wako Pure Chemicals Ind.，Ltd.(訂貨號161-16971))進行反應。
配制下列溶液1μM CuSO45mM KI3mM抗壞血酸鈉230U/ml過氧化氫酶(牛，Fluka)600U/ml PAM(Wako Chemicals)具0.001％Triton X-100的0.1M Tris/HCl pH 7.0將溶液在37℃預孵育1小時并隨后加入AVE1-44Gly蛋白質溶液(Tris/HCl pH 7.0，，終濃度80μg/ml)。然后在37℃進一步孵育反應混合物。通過在不同時間取樣追隨反應過程。在最大轉化時通過加入50mM EDTA溶液終止反應。
然后通過離子交換層析(Shodex Co.，柱型號IEC CM-825(8×75mm))分離反應混合物。對此柱應用下列梯度洗脫液A-40mMol磷酸鹽緩沖液pH 7+20％乙腈洗脫液B-50mMol磷酸鹽緩沖液pH 7+1M NaCL以2ml/min或1ml/min的流過速率在室溫操作柱子。
收集洗脫的級分(在280nm處檢測)并通過MALDI-MS確定相關肽的質量。用BRUKER Reflex IV型儀器進行質譜分析。將樣品直接用于MALDI-MS分析，或用50％TAaq([1+1]0.1％TFA+50％乙腈)稀釋到大約50pmol/μl的濃度。
確定預期的AVE1-44-NH2的質量?？梢詫⒌玫降漠a物應用于進一步的藥物用途。
此后可以按照本領域技術人員己知的方式，通過向生物學活性肽或肽衍生物中加入適宜的藥物制劑添加劑來產生藥物制劑。
序列表序列表<110>塞諾菲-安萬特德國有限公司<120>產生羧基端酰胺化肽的方法<130>DEAV2004/0076<140>
<141>
<160>16<170>PatentIn版本2.1<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽；MOD_RES K44酰胺化<400>1His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys35 40<210>2<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>2His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly35 40 45<210>3<211>198<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>3ttttttaagc ttgcacggtg aaggtacctt cacctccgac ctgtccaaac agatggaaga60agaagctgtt cgtctgttca tcgaatggct gaaaaacggt ggtccgtcct ccggtgctcc120gccttcgaaa aagaagaaaa agaaaggttg ataatagcat gcacgtgcgg ccgcacctgg180tcgacgaatt caaaaaaa 198<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4ttttttaagc ttgcacggtg aag23<210>5<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5cttccatctg tttggacagg tcggaggtga aggtaccttc accgtgcaag cttaaaaaa 59<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6ggacggacca ccgtttttca gccattcgat gaacagacga acagcttctt cttccatctg60tttggacag69<210>7<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7gtgcatgcta ttatcaacct ttctttttct tctttttcga aggcggagca ccggaggacg60gaccaccgtt tttc 74<210>8<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8ttttttgaat tcgtcgacca ggtgcggccg cacgtgcatg ctattatcaa cctt 54<210>9<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9ttttttggat ccggtgatga cgatgacaag cacggtgaag gtaccttc 48<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10ttttttgaat tcgtcgacca ggtgc 25<210>11<211>321<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的DNA<400>11ggaaacagaa ttcatggcgc cgacctcttc ttctaccaaa aagactcaac tgcaactgga60acacctgctg ctggacctgc agatgatcct gaacggtatc aacaactaca aaaacccgaa120actgacgcgt atcgacgatg acgataaaca cggtgaaggt accttcacct ccgacctgtc180caaacagatg gaagaagaag ctgttcgtct gttcatcgaa tggctgaaaa acggtggtcc240gtcctccggt gctccgcctt cgaaaaagaa gaaaaagaaa ggttgataat agcatgcacg300tgcggccgca agcttaaaaa a 321<210>12<211>90<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成的肽<400>12Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu1 5 10 15His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr20 25 30Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu35 40 45Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val50 55 60Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala65 70 75 80Pro Pro Ser Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly85 90
<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>13cgtatcgacg atgacgataa acacggtgaa ggtaccttc 39<210>14<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>14gtgtttatcg tcatcgtcga tacgcgtcag tttcgg 36<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>15tgagcggata acaatttcac ac 22<210>16<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>16ttttttaagc ttgcggccgc acgtgcatgc tattatcaac cttc 4權利要求
1.通式I的化合物(AS)n-XmYp(式I)，其中AS為基因可編碼的一個或多個氨基酸；n為5-2000，優(yōu)選地為10-1000，特別地為15-500，十分特別優(yōu)選地為20-400；X為一個或多個堿性氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸，特別地為賴氨酸；m為1-15，優(yōu)選地為3-10，特別地為6-8；Y為一個或多個中性電荷氨基酸，優(yōu)選地為甘氨酸；p為1-10，優(yōu)選地為1-5，特別地為1；其中n、m和p為整數且(AS)n和/或(AS)nXm優(yōu)選地為生物學活性肽或蛋白質。
2.如權利要求1所述的化合物，其通過Seq ID No.2定義以及與Seq IDNO.2具有至少60％同源性的生物學活性衍生物。
3.核酸分子，其編碼如權利要求1-2定義的化合物。
4.如權利要求3所述的核酸分子，其為DNA或RNA。
5.如權利要求3-4中的一項或多項所述的核酸分子，其為cDNA。
6.表達盒，其包含如權利要求3-5的一項或多項所述的核酸分子。
7.載體，其包含如權利要求3-5中的一項或多項所述的核酸分子或如權利要求6所述的表達盒，其中所述載體任選地包含調節(jié)序列。
8.如權利要求7所述的表達載體。
9.用于在細菌或酵母中表達的如權利要求7-8中的一項或多項所述的載體。
10.宿主細胞，其包含a)如權利要求3-5中的一項或多項所述的核酸分子，b)如權利要求6所述的表達盒，或c)如權利要求7-9中的一項或多項所述的載體。
11.如權利要求10所述的宿主細胞，其為細菌或酵母細胞。
12.如權利要求10到11中的一項或多項所述的宿主細胞，其還共表達PAM酶。
13.體外表達系統(tǒng)，其包含如權利要求2-3中的一項或多項所述的核酸分子。
14.如權利要求13所述的體外表達系統(tǒng)，其還共表達PAM酶。
15.用于產生通式II的C端酰胺化肽的方法(AS)n-Xm-NH2(式II)其中AS為基因可編碼的一個或多個氨基酸；n為5-2000，優(yōu)選地為10-1000，特別地為15-500，十分特別優(yōu)選地為20-400；且(AS)n和/或(AS)n-Xm優(yōu)選地是生物學活性肽或蛋白質，X為一個或多個堿性氨基酸或其衍生物，優(yōu)選地為賴氨酸、組氨酸和/或精氨酸，特別地為賴氨酸；m為1-15，優(yōu)選地為3-10，特別地為6-8；且n和m是整數且其中a)在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)如權利要求10-12中所定義的宿主細胞或如權利要求13-14中所定義的表達系統(tǒng)，b)表達權利要求1中定義的化合物，c)任選地通過酶或化學切割從適宜的前體肽釋放權利要求1中所定義的化合物；d)來自步驟b)的表達產物或來自步驟c)的中間體產物任選地在純化步驟后與α-酰胺化酶反應；和e)以適宜的方式純化通式II的C端酰胺化的肽，優(yōu)選地通過制備色譜法。
16.如權利要求15所述的方法，用于產生如權利要求2中定義的化合物，優(yōu)選地為根據Seq ID No.2的化合物。
17.如權利要求15-16中的一項或多項所述的方法，其中通過酶切割從適宜的前體肽釋放根據權利要求1所定義的化合物。
18.如權利要求17所述的方法，其中通過酶腸激酶從適宜的前體肽釋放根據權利要求1所定義的化合物。
19.根據權利要求15-18中的一項或多項得到的C端酰胺化肽的用途，用于產生藥品或藥物制劑。
20.如權利要求1-2中的一項或多項所述的化合物的用途，用于產生藥品或藥物制劑。
21.如權利要求20-21中的一項或多項所述的用途，用于產生治療糖代謝紊亂的藥物。
22.如權利要求21所述的用途，用于產生治療糖尿病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及羧基端(C端)酰胺化肽的產生，所述羧基端(C端)酰胺化肽具有C端酰胺化了的賴氨酸，特別是具有GLP－1的生物學活性，涉及其化學和/或生物技術學前體和中間體產物。本發(fā)明還涉及其產生方法以及其用于產生藥品的用途。
文檔編號A61K38/26GK101068833SQ200580041283
公開日2007年11月7日 申請日期2005年11月18日 優(yōu)先權日2004年12月1日
發(fā)明者P·哈伯曼, H·德克爾, C·拉特曼, O·馬內戈, C·薩拉格納德, F·措赫爾 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司