專利名稱：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶而發(fā)揮降低血壓作用的肽，包含這些肽的組合物及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(在下文中被稱為ACE)是存在于動物體內(nèi)的一種羧基肽酶， 且通過消化血管緊張素I的一個肽鍵來生成血管緊張素II。血管緊張素II是具有強(qiáng)血管加壓活性的肽激素，且通過血管收縮、加速醛固酮分泌等引起高血壓。因此，抑制ACE 活性使得可以控制血管緊張素Π生成并治療高血壓。到現(xiàn)在為止，已經(jīng)將諸如卡托普利 (captopril)等的藥物投入實(shí)際使用并作為ACE抑制劑廣泛應(yīng)用。然而，因?yàn)檫@些藥物具有強(qiáng)烈的作用，因此可能引起副作用，并且在許多ACE抑制劑的情況下，必須注意諸如干咳等的副作用。另一方面，由于作為ACE底物的血管緊張素I是一種肽，已經(jīng)對提供通過天然物來源的肽競爭性抑制ACE并且沒有副作用的高血壓治療劑進(jìn)行了研究(例如參見特許文獻(xiàn) 1 幻。因?yàn)檫@些肽作用溫和，因此預(yù)期有高安全性。另一方面，問題在于肽或含有所述肽的組合物必須以比較大的量攝取方能攝取其有效量。另外，因?yàn)檫@些肽中的許多具有整體疏水性質(zhì)，并且人們認(rèn)為這類肽通常具有強(qiáng)烈的苦味(例如參見特許文獻(xiàn)6、非特許文獻(xiàn)1 和2)，所以還有一個問題是難以大量經(jīng)口攝取。特許文獻(xiàn)1 特開平4-091097號公報特許文獻(xiàn)2 特開平5462790號公報特許文獻(xiàn)3 特開平6-040944號公報特許文獻(xiàn)4 特開平7-188282號公報特許文獻(xiàn)5 特開平10-175997號公報特許文獻(xiàn)6 特開平2006-75064號公報非特許文獻(xiàn) 1 Wenyi Wang^,Comprehensive Reviews in FoodScience and Food Safety (食品科學(xué)和食品安全性的綜合報告)，2005，(4)，p. 63-78非特許文獻(xiàn)2 藤卷正生等著，《改定新版食品化學(xué)》，朝倉書店，1976年3月， P117-118。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明要解決的問題在于提供ACE抑制肽，其少量攝取就有效抑制ACE，沒有引起副作用的擔(dān)憂，并且苦味較輕，且可以由高血壓患者在日常生活期間容易地經(jīng)口攝取；包含所述肽的組合物；及它們的生產(chǎn)方法。解決問題的手段為了解決上述問題，本發(fā)明者進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了具有至今不知道存在ACE抑制作用的化學(xué)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)并且具有明顯強(qiáng)烈作用的肽，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。也就是說，根據(jù)本發(fā)明，提供了[1]由如下結(jié)構(gòu)式⑴ (9)表示的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽(I)Asp-Arg-Pro, (2) Asn-Trp, (3) Val-Gly-Leu, (4) 11 e-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) IIe-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr ^P (9) Pro-Trp 及其鹽；[2]血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其包含上項(xiàng)[1]中所述肽的至少一種；[3]組合物，其包含上項(xiàng)[1]中所述肽的至少一種且減緩高血壓癥狀；和[4]生產(chǎn)上面項(xiàng)[1]中所述肽的方法，其中將大豆在25°C以上與曲霉屬真菌培養(yǎng)物混合并攪拌。發(fā)明效果通過本發(fā)明，提供了 ACE抑制肽，其少量攝取即有效抑制ACE，沒有引起副作用的擔(dān)憂，并且苦味較輕，且可以高血壓者在日常生活期間容易地經(jīng)口攝??；包含這些肽的組合物；及它們的生產(chǎn)方法。


[圖1]圖1為展示當(dāng)將Asp-Arg-Pro從組合物1中分離出時的UV峰的圖。[圖2]圖2為展示當(dāng)將組合物1長期施用于高血壓大鼠時血壓值變化的圖。
具體實(shí)施例方式以下詳細(xì)地描述本發(fā)明。本發(fā)明的肽(1)Asp-Arg-Pro、(2)Asn-Trp,(3) Val-Gly-Leu, (4) Ile-Gly-Val, (5) Gly-Val-Pro, (6) Ile-Pro-Tyr, (7) pyroGlu-Pro, (8) Tyr-Thr ^P ⑶ I^o-iTrp 是二肽或三肽，其中各氨基酸殘基由通常使用的三字母代碼表示，且pyroGlu代表焦谷氨酸殘基。這些肽可以例如通過化學(xué)合成方法生成。眾所周知的方法有，例如，液相方法，其中氨基末端側(cè)氨基酸的氨基用芐氧基羰基保護(hù)，且羧基用對硝基苯酯基活化并在三乙胺存在下與羧基末端側(cè)氨基酸縮合、接著通過催化還原或用三氟乙酸除去保護(hù)基團(tuán)；和固相方法，其中羧基末端側(cè)氨基酸結(jié)合到聚合固相載體上，且氨基酸在進(jìn)行氨基保護(hù)和羧基活化之后通過肽鍵順次結(jié)合到聚合固相載體上，接著通過使用三氟乙酸、氟化氫等從固相載體切斷而除去氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。可以通過這兩種方法進(jìn)行生產(chǎn)。在這方面，可以預(yù)期不僅可以由單純肽物質(zhì)，而且可以由其與生理學(xué)可接受離子的鹽得到類似效果。另外，本發(fā)明的肽也可以使用柱色譜等通過從用適當(dāng)?shù)鞍酌冈噭┧夂霭被嵝蛄械牡鞍踪|(zhì)而制備的組合物中分離并純化來生產(chǎn)。在那種情況下，即使以含有所述肽的組合物的形式攝取時，也可以獲得目的效果。與上述化學(xué)合成方法相比較，這更加合乎需要，因?yàn)橐子诖罅可a(chǎn)且生產(chǎn)成本低。關(guān)于在通過水解蛋白質(zhì)而獲得本發(fā)明的肽的情況下的蛋白質(zhì)源，雖然可以使用任何材料，只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的即可，但是優(yōu)選適合使用豆科植物。更優(yōu)選的是，從栽培量大、成本低、蛋白質(zhì)含量大、食用經(jīng)驗(yàn)豐富和水解后組合物的味道良好的觀點(diǎn)來看，適宜使用大豆。大豆的種類包括黃豆、紅豆、黑豆等，且黃豆特別適宜。關(guān)于大豆的形式，可以使用整粒大豆(整粒全脂大豆)、脫脂大豆、純化大豆蛋白等本身或者可以在壓碎和粉碎之后施加任選的蛋白質(zhì)變性處理來使用。關(guān)于蛋白質(zhì)變性處理，優(yōu)選工業(yè)上廣泛使用的加壓蒸煮。關(guān)于在通過水解蛋白質(zhì)而獲得本發(fā)明的肽的情況下的蛋白酶試劑，雖然可以使用任何材料，只要可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的即可，但是從蛋白酶活性高、成本低、食用經(jīng)驗(yàn)豐富、 安全性有保證和水解后組合物的味道良好的觀點(diǎn)來看，適合使用曲霉屬真菌培養(yǎng)物。關(guān)于曲霉屬真菌，特別合適的是米曲霉(Aspergillus oryzae)和/或醬油曲霉(Aspergillus sojae)。這些微生物自古已用于在發(fā)酵生產(chǎn)醬油和味增中進(jìn)行蛋白質(zhì)降解，且其安全性也已經(jīng)在GRAS(公認(rèn)為安全的，GernerallyRecognized As Safe)列表中記載并經(jīng)美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)。曲霉屬真菌培養(yǎng)物是通過使用大豆、小麥、稻米等作為培養(yǎng)基接種并培養(yǎng)曲霉屬真菌而獲得的產(chǎn)物。根據(jù)培養(yǎng)方法的不同，將其分類為液體曲霉屬真菌培養(yǎng)物和固體曲霉屬真菌培養(yǎng)物，且兩種情況都可以用于本發(fā)明。例如，液體曲霉屬真菌培養(yǎng)物可以通過將曲霉屬真菌接種到含有 5%的大豆、小麥、麥麩等的液體培養(yǎng)基中并在 25°C 40°C下將其培養(yǎng)M小時 120小時來獲得。同樣，固體曲霉屬真菌培養(yǎng)物混合物可以通過將曲霉屬真菌接種在含有大豆、小麥等的固體培養(yǎng)基上并在25 V 40°C下將其培養(yǎng)M小時 120小時來獲得。關(guān)于上述水解反應(yīng)的條件，將最終濃度為10% 70%、優(yōu)選30% 50%的曲霉屬真菌培養(yǎng)物與最終濃度為5 % 40 %、優(yōu)選15 % 30 %的大豆、最終濃度為0 % 25 %、優(yōu)選6 % 18 %的鹽，還有最終濃度為0 % 85 %的水混合，且將大豆和鹽的最終濃度調(diào)整到上述范圍，接著在25°C 60°C、優(yōu)選30°C 55°C下，在IOrpm 150rpm的攪拌速率下反應(yīng) 12小時 240小時、優(yōu)選M小時 168小時。為了任選地改善香味，可以加入屬于接合酵母屬的酵母菌株等，同時進(jìn)行發(fā)酵。不管是否含有本發(fā)明的肽，通過上述生產(chǎn)方法制備的組合物都可作為食物美味地攝取，因?yàn)閹缀醪荒芨杏X到苦味且其具有甘美、醇厚穩(wěn)定優(yōu)良的香味，這明顯不同于通常已知的含ACE抑制肽的組合物。用于從上述組合物中分離并純化本發(fā)明的肽的方法包括可以列舉的超濾、滲析、 各種類型的色譜法等。這些是一般廣泛使用的方法。特別地講，從樣品處理量和純化效率的觀點(diǎn)來看，陽離子交換色譜法和反相色譜法是有效的。以此方式獲得的本發(fā)明的肽可通過經(jīng)口或腸胃外施用作為ACE抑制劑、即血壓上升抑制/降低劑使用。根據(jù)常用方式，在經(jīng)口施用的情況下，可將其制成諸如片劑、顆粒劑、 粉末、膠囊等形式，且在腸胃外施用的情況下，可將其制成諸如注射制劑、經(jīng)皮制劑、栓劑等形式。另外，為了預(yù)防和/或治療高血壓，可將其用于食品和飲料(例如健康食品、注重健康的食品、功能性食品、特定健康用途的食品等)中。本發(fā)明的肽可以通過將其加入各種類型的食品和飲料中來生產(chǎn)，且因?yàn)榧词故窃谏鲜龊慕M合物的形式下，其味道也良好，所以可以容易地將其加入各種類型的食品和飲料中。此外，也容易攝取組合物本身。以此方式獲得的食品和飲料的實(shí)例包括醬油、含醬油產(chǎn)品、醬油粉、味增、面汁和湯類、肉湯、豆?jié){、 發(fā)酵乳、清涼飲料、飲料濃縮原液和調(diào)整用粉末、酒、含油脂食品、面條、水產(chǎn)加工食品、肉類加工食品、半固體食品、糊狀食品、固體食品等。
雖然這些肽的劑量根據(jù)預(yù)防或治療用途和方法而異，但是每天適宜在0. Olmg IOOmg范圍內(nèi)的肽。另外，在其作為各種類型的食品和飲料攝取的情況下，IC5tl表示的ACE 抑制活性總體上成為lmg/ml以下是相宜的。下文參考實(shí)施例說明性地描述本發(fā)明，本發(fā)明的技術(shù)范圍不受這些實(shí)施例限制。實(shí)施例1<通過化學(xué)合成方法生產(chǎn)肽>在下文中舉例說明Asn-Trp的生產(chǎn)。在這方面，關(guān)于試劑，除了特別提到的試劑以外，使用由和光純藥生產(chǎn)的試劑。首先，將120mg L-色氨酸鹽酸鹽溶解于2ml 二甲基甲酰胺中，并加入150μ 1三乙胺和300mg Z-Asn-Onp (由國產(chǎn)化學(xué)社制造)，且在室溫下攪拌M小時。接著，加入20ml 氨水并使其在-10°C下靜置1小時。形成的沉淀物通過過濾收集并用冷水洗滌沉淀物。將沉淀物溶解于20ml甲醇中；向其中加入20mg活性碳鈀；且在氮?dú)饷芊庵?，進(jìn)行催化還原反應(yīng)。反應(yīng)在室溫、大氣壓下與氫氣接觸下進(jìn)行3天。反應(yīng)之后，過濾除去不溶物質(zhì)且使甲醇蒸發(fā)，隨后溶解在蒸餾水中。接著，通過連接HPLC(LC-8A，由島津制作所制造)的ODS柱(Cosmosil 5C18-ARII 20X250mm，由Nakalai Tesque制造)進(jìn)行分級純化。通過使用超純水+0. 三氟乙酸(TFA)作為洗脫劑A，和乙腈+0. 1%TFA作為洗脫劑 B，根據(jù)常用方式進(jìn)行梯度洗脫。各級分通過薄層色譜(TLC)分析，且從用茚三酮試劑顯示斑點(diǎn)的級分獲得87mg Asn-Trp。使用蛋白質(zhì)測序儀(Procise 492，由Applied Biosystems 制造)、NMR(ADVANCE 500，由 Bruker 制造)和 LC-MS(1100,由 Agilent Technologies 制造；和 QSTAR Elite,由 Applied Biosystems 制造，柱為 Develosil RPAQUE0US-AR，由野村化學(xué)社制造)，根據(jù)常用方式證實(shí)其化學(xué)結(jié)構(gòu)。測量通過上述合成方法獲得的肽的ACE抑制活性。關(guān)于測量方法，通過將 Yamamoto等的方法(山本節(jié)子等，日胸疾會志，1980，18，p.四7 30 加以部分改變的方法來實(shí)行。也就是說，將140μ1樣品溶液、ΙΟμΙ酶溶液(0.3U/ml的ACE(得自兔肺，由SIGMA制造)和50mM硼酸鹽緩沖液(pH 8. 3)加到100 μ 1底物溶液(12. 5mM HippuryI-His-Leu (由SIGMA制造)、IOOmM硼酸鹽緩沖液pH 8. 3、IM NaCl)中，且使反應(yīng)在 37°C下進(jìn)行30分鐘。隨后，通過加入250 μ 1 IN鹽酸且攪拌后加入1. 5ml乙酸乙酯使反應(yīng)停止，隨后離心，將Iml乙酸乙酯層通過離心濃縮進(jìn)行濃縮和干燥，隨后將其溶解于Iml超純水中以測量在228nm下的吸光度。ACE抑制比由下式表示。ACE 抑制比(% ) = {1-(ODs-ODsb)/(ODc-ODcb)} XlOO在這方面，ODs是當(dāng)向如上所述的樣品中加入酶溶液而進(jìn)行反應(yīng)時的吸光度； ODsb是當(dāng)超純水代替酶溶液加入時的吸光度；ODc是當(dāng)超純水代替樣品溶液加入時的吸光度；且ODcb是當(dāng)超純水代替酶溶液和樣品溶液加入時的吸光度。另外，將在該反應(yīng)系統(tǒng)中提供50%的酶活性抑制比的樣品濃度視為IC5tl值。本發(fā)明的肽的ACE抑制活性見表1。在這方面，至今所記錄的約400種主要ACE 抑制肽的IC5tl值為約1 μ M 1000 μ M(山田耕路編著，《食品科學(xué)叢書-3》“食品成分的作用”，朝倉書店，2004年3月，p. 63 67)。因?yàn)榕c常規(guī)已知的肽相比，本發(fā)明的肽具有充分強(qiáng)的活性，所以認(rèn)為它們在產(chǎn)業(yè)上有用。表 權(quán)利要求
1.由如下結(jié)構(gòu)式(1) (9)表示的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽及其鹽 (I)Asp-Arg-Pro, (2)Asn-Trp, (3)Val-Gly-Leu, (4)Ile-Gly-Val, (5)Gly-Val-Pro,(6)Ile-Pro-Tyr, (7)pyroGlu-Pro, (8)Tyr-Thr ^P 0)Pro_Trp。
2.—種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其包含如權(quán)利要求1所述的肽中的至少一種。
3.一種組合物，其包含如權(quán)利要求1所述的肽中的至少一種，并且減緩高血壓的癥狀。
4.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的肽的方法，其中在25°C以上將大豆與曲霉屬真菌培養(yǎng)物混合并攪拌。
全文摘要
本發(fā)明公開了ACE抑制肽，其可以在小劑量下有效抑制ACE，且沒有副作用，高血壓患者在日常生活期間容易經(jīng)口攝取該ACE抑制肽。本發(fā)明還公開了包含所述肽的組合物。本發(fā)明特別公開了由如下結(jié)構(gòu)式(1)～(9)中的任一個結(jié)構(gòu)式表示的肽或其鹽(1)Asp-Arg-Pro，(2)Asn-Trp，(3)Val-Gly-Leu，(4)Ile-Gly-Val，(5)Gly-Val-Pro，(6)Ile-Pro-Tyr，(7)pyroGlu-Pro，(8)Tyr-Thr和(9)Pro-Trp。
文檔編號C07K5/083GK102164946SQ20098013746
公開日2011年8月24日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月19日
發(fā)明者仲原丈晴, 佐藤拓也, 內(nèi)田理一郎, 杉本騰俊, 青田仁美 申請人:龜甲萬株式會社