專(zhuān)利名稱(chēng)：：穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明總地涉及一種通過(guò)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質(zhì)本體(bulk)和在該本體溶液(bulksolution)中加入特定輔料來(lái)制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法。
背景技術(shù)：
：干擾素是一類(lèi)細(xì)胞因子，即能在細(xì)胞之間傳遞信號(hào)的可溶性蛋白質(zhì)，通過(guò)幫助摧毀引起感染的微生物和修復(fù)所導(dǎo)致的損傷而在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。干擾素在自然情況下由受感染細(xì)胞分泌，在1957年第一次得到鑒定。它們的名字源于它們能“干擾”病毒的復(fù)制和繁殖。干擾素顯示具有抗病毒和抗增殖活性。根據(jù)其生化及免疫學(xué)性能，將天然產(chǎn)生的人干擾素分為三個(gè)主要類(lèi)型干擾素α(白細(xì)胞)，干擾素β(成纖維細(xì)胞)和干擾素γ(免疫細(xì)胞)。干擾素α目前在美國(guó)和其他國(guó)家已批準(zhǔn)用于治療毛細(xì)胞白血病、性病疣、卡波濟(jì)肉瘤(獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)病人?；嫉囊环N癌癥)，以及非甲非乙型慢性肝炎。另外，干擾素(IFNs)是機(jī)體對(duì)病毒感染應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的糖蛋白。它們能抑制病毒在受保護(hù)細(xì)胞中的繁殖。由低分子量蛋白質(zhì)組成的IFNs的作用非常顯著地沒(méi)有特異性，即一種病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN對(duì)廣泛范圍的其他病毒也有效。然而它們是物種特異性的，即一種動(dòng)物產(chǎn)生的IFN只能激發(fā)同種或密切相關(guān)種類(lèi)動(dòng)物的細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒活性。IFNs是第一類(lèi)發(fā)現(xiàn)的具有潛在抗腫瘤和抗病毒活性的細(xì)胞因子。IFNs的三種主要類(lèi)型稱(chēng)為干擾素α，干擾素β和干擾素γ。IFNs的這些主要類(lèi)型最初是根據(jù)它們的細(xì)胞來(lái)源(白細(xì)胞，成纖維細(xì)胞或T細(xì)胞)進(jìn)行分類(lèi)的。然而現(xiàn)已清楚，一種細(xì)胞可產(chǎn)生幾種類(lèi)型的IFNs。因此，白細(xì)胞IFN現(xiàn)稱(chēng)為干擾素α，成纖維IFN稱(chēng)為干擾素β，T細(xì)胞IFN稱(chēng)為干擾素γ。還有第四類(lèi)IFN，即淋巴母細(xì)胞樣干擾素，由“Namalwa”細(xì)胞系(衍生自伯基特淋巴瘤)產(chǎn)生，該細(xì)胞系似乎產(chǎn)生的是白細(xì)胞IFN和成纖維細(xì)胞IFN的混合物。干擾素單位或國(guó)際單位(U或IU，國(guó)際單位)，據(jù)報(bào)告是用作IFN活性的衡量單位，其定義為保護(hù)50％的細(xì)胞免遭病毒損害所必須的量。可用于檢測(cè)其生物活性的試驗(yàn)是如(Rubinstein，等.1981；Familletti，P.C.，等.，1981)所述的細(xì)胞病變作用抑制試驗(yàn)。在此干擾素抗病毒試驗(yàn)中，約1U/ml的干擾素是產(chǎn)生50％細(xì)胞病變(抑制)作用所必需的量。其單位可用國(guó)立衛(wèi)生研究院所提供的人IFN-β國(guó)際參考標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)測(cè)定(Pestka，S，1986)。每一類(lèi)IFN都含有幾種不同亞型。IFN-β和IFN-γ各為單一基因的產(chǎn)物。分類(lèi)為IFN-α的蛋白質(zhì)是多樣性最高的一類(lèi)，包含約15個(gè)亞型。IFN-α基因簇位于第九號(hào)染色體上，包含至少23個(gè)成員，其中15個(gè)有活性能被轉(zhuǎn)錄。成熟的IFN-α是非糖基化的。IFN-α和IFN-β長(zhǎng)度幾乎相同(165或166個(gè)氨基酸)，具有相似的生物學(xué)活性。IFN-γ長(zhǎng)146個(gè)氨基酸，與IFN-α和IFN-β相似程度較低。只有IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)T殺傷細(xì)胞成熟。這些新型治療劑有時(shí)稱(chēng)為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRM)，因?yàn)樗鼈冊(cè)跈C(jī)體抗腫瘤反應(yīng)中具有作用，可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)而影響識(shí)別。人成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性，也能激活自然殺傷細(xì)胞對(duì)抗癌細(xì)胞。它是病毒和雙鏈RNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量約20,000Da的一種多肽。用重組DNA技術(shù)克隆了成纖維細(xì)胞干擾素基因的核苷酸序列(Derynk等.1980)，并推斷出該蛋白的完整氨基酸序列。它的長(zhǎng)度為166個(gè)氨基酸。Shepard等.(1981)描述了第842位堿基的突變(第141位半胱氨酸被取代為酪氨酸)消除了干擾素的抗病毒活性，和缺失了第1119-1121位核苷酸的變體克隆。Mark等(1984)通過(guò)在堿基469位用腺嘌呤(A)取代胸腺嘧啶(T)插入一個(gè)人造突變，導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的第17位氨基酸由半胱氨酸變?yōu)榻z氨酸。據(jù)報(bào)道所產(chǎn)生的IFN-β與“天然的”IFN-β具有相同的活性并且在長(zhǎng)期儲(chǔ)存(-70℃)中穩(wěn)定。在干擾素療法中近年開(kāi)發(fā)的用于治療多發(fā)性硬化癥的Rebif(Serono公司生產(chǎn)的重組人干擾素-β)是IFN-β-1a，由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系所產(chǎn)生。其推薦的國(guó)際非專(zhuān)利藥名(InternationalNon-proprietaryNamesforPharmaceuticalSubstance，INN)是“干擾素-β-1a”。作為治療劑，和所有的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的藥物一樣，IFN-β-1a應(yīng)用中必須克服的一個(gè)主要障礙是由于藥物制劑中該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致的藥物利用度喪失。藥品制劑中危害多肽活性和藥效的物理不穩(wěn)定性包括變性和可溶及不可溶凝聚體的形成。而化學(xué)不穩(wěn)定性包括水解、亞胺生成、氧化、外消旋和脫酰胺。已知這些變化中的一些可能導(dǎo)致感興趣蛋白質(zhì)的藥物活性喪失或降低。其他方面，這些變化的精確影響尚不可知，但所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物由于具有潛在的不良副作用而認(rèn)為在藥學(xué)上是不可接受的。藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性仍然是一個(gè)主要的麻煩和易失誤問(wèn)題(Wang(1999)Int.J.Pharm.185129-188的綜述；Wang和Hanson(1988)J.ParenteralSci.Tech.42S3-S26)?？杉尤攵嚯乃幬镏苿┲刑岣咂浞€(wěn)定性的輔料包括緩沖劑、糖類(lèi)、表面活性劑、氨基酸、聚乙二醇和多聚體，但是這些化學(xué)添加劑的穩(wěn)定作用根據(jù)蛋白質(zhì)而不同。目前的蛋白質(zhì)制劑在最終蛋白質(zhì)制品中采用了輔料。然而這些制品仍然是部分不穩(wěn)定的。此外，具有單體生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，即單體蛋白，在應(yīng)力(如溫度應(yīng)力)作用下有聚合和凝聚傾向。因此，需要一種方法來(lái)改進(jìn)蛋白質(zhì)的可溶性和提高單體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以對(duì)抗凝聚和寡聚，從而提高它們的藥物利用度。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質(zhì)本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑，ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑此外，在實(shí)施本發(fā)明第一方面所述方法之前或之后，可在特定溫度下培育所述本體蛋白質(zhì)。第二方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明第一方面所述方法獲得的預(yù)配制的本體蛋白質(zhì)。第三方面，本發(fā)明提供了一種提高和/或維持單體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，包括本發(fā)明第一方面所述的預(yù)配制本體蛋白質(zhì)的方法。圖1-實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模熱解聚方法。圖1顯示實(shí)施例1a實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模熱解聚方法，涉及培育溫度和培育時(shí)間對(duì)本體干擾素穩(wěn)定性的影響。圖1與表4相對(duì)應(yīng)。4輪F/T循環(huán)后0.9ml本體樣品的SE-高效液相色譜(SE-HPLC)結(jié)果。圖2報(bào)告了在29℃經(jīng)實(shí)施例1b所述4輪F/T循環(huán)后實(shí)驗(yàn)室規(guī)模熱解聚的結(jié)果。Y軸代表面積百分比。X軸代表檢測(cè)到的重組人IFN-β-1a的形式，即凝聚體，二聚體或單體。檢測(cè)到的各形式的第一直方柱是對(duì)照，對(duì)應(yīng)于室溫2小時(shí)融化、然后-4℃貯藏的本體預(yù)制劑。檢測(cè)到的各形式的第二直方柱對(duì)應(yīng)于室溫2小時(shí)融化、然后29℃培育3小時(shí)的本體預(yù)制劑。檢測(cè)到的各形式的第三直方柱對(duì)應(yīng)于室溫2小時(shí)融化，然后29℃培育15小時(shí)的本體預(yù)制劑。檢測(cè)到的最后或第四直方柱對(duì)應(yīng)于用水浴融化，然后29℃培育15小時(shí)的預(yù)制劑。圖2與表11相對(duì)應(yīng)。圖32輪F/T循環(huán)后200ml本體樣品的SE-高效液相色譜(SE-HPLC)結(jié)果。圖3報(bào)告了在29℃經(jīng)實(shí)施例1b所述的2輪F/T循環(huán)后實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的熱解聚結(jié)果。Y軸代表面積百分比。X軸代表檢測(cè)到的重組人IFN-β1a形式，即凝聚體，二聚體或單體。檢測(cè)到的各形式的第一直方柱都是對(duì)照，對(duì)應(yīng)于室溫7小時(shí)融化，然后-4℃貯藏的本體預(yù)制劑。檢測(cè)到的各形式的第二直方柱對(duì)應(yīng)于室溫7小時(shí)融化，然后29℃培育15小時(shí)的本體預(yù)制劑。圖3與表12相對(duì)應(yīng)。圖4實(shí)驗(yàn)室規(guī)模F/TX1循環(huán)時(shí)的熱解聚動(dòng)力學(xué)。蛋白單體隨時(shí)間變化的百分比。圖4顯示在29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β1a單體隨時(shí)間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時(shí)間(小時(shí))。圖4的結(jié)果見(jiàn)表14。圖5實(shí)驗(yàn)室規(guī)模F/TX1循環(huán)時(shí)的熱解聚動(dòng)力學(xué)。二聚體隨時(shí)間變化的百分比。圖5顯示在29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β1a二聚體隨時(shí)間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時(shí)間(小時(shí))。圖5的結(jié)果見(jiàn)表14。圖6實(shí)驗(yàn)室規(guī)模F/TX1循環(huán)時(shí)的熱解聚動(dòng)力學(xué)。凝聚體隨時(shí)間變化的百分比。圖6顯示29℃培育1輪F/T循環(huán)后重組人IFN-β凝聚體隨時(shí)間變化的百分比。Y軸代表面積百分比。X軸代表時(shí)間(小時(shí))。圖6結(jié)果見(jiàn)表14。圖7實(shí)施例2的預(yù)配制研究方案。圖7代表實(shí)施例2的研究方案，該研究關(guān)注從SEC-EL分級(jí)至最終劑型(FDF)貯存之間的操作步驟中最大程度減少重組人IFN-β1a的寡聚化，以提供穩(wěn)定的本體干擾素-β。該方案在實(shí)施例2的6.2節(jié)中還有描述。圖8實(shí)施例3的預(yù)配制研究方案。圖8代表實(shí)施例3的研究方案，該研究的目的是最大程度減少重組人IFN-β1a的寡聚化。采用了兩種不同的方法速度超離心法和SE-高效液相色譜分析法(SE-HPLC)來(lái)測(cè)量穩(wěn)定本體IFN-β之后重組人IFN-β1a單體的水平。該方案在實(shí)施例3的6.1和6.2節(jié)中還有描述。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質(zhì)本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑，ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，如果在本體蛋白質(zhì)中加入本專(zhuān)利申請(qǐng)書(shū)中詳細(xì)描述的一種或多種輔料來(lái)使其穩(wěn)定，那么這種穩(wěn)定從本體蛋白質(zhì)中加入一種或者多種輔料時(shí)即開(kāi)始直至最后處理含該蛋白質(zhì)的制劑，如最終被病人服用。因此，穩(wěn)定不僅發(fā)生在貯存階段，而是貫穿蛋白質(zhì)在其生命周期直至被處理所面臨的各階段，即貯存前、貯存中及貯存后。本發(fā)明的方法能抵消蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)制劑在其生命周期內(nèi)可能遭受的各種應(yīng)力的作用。因此，不僅在制造過(guò)程中，而且在運(yùn)輸、貯藏和輸送過(guò)程中均能穩(wěn)定。本發(fā)明也包括通過(guò)本發(fā)明方法得到的穩(wěn)定的本體，也稱(chēng)為“預(yù)配制的本體(pre-formulatedbulk)”。本文中的術(shù)語(yǔ)“預(yù)制劑(preformulation)”指含有本體單體蛋白的制劑。這些預(yù)制劑的穩(wěn)定性不僅指凝聚和寡聚化較低，還包括氧化、脫酰胺等其他有害過(guò)程較輕微。例如，本發(fā)明也包括其他過(guò)程，只要這些過(guò)程影響到單體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)“貯藏過(guò)程”指制劑或組合物制備后沒(méi)有立即給予個(gè)體，而是制備后進(jìn)行包裝以液體形式或適合于給予個(gè)體的其他形式貯藏。術(shù)語(yǔ)“干燥形式”指通過(guò)凍干、噴霧干燥或空氣干燥等方法干燥的制劑或組合物。藥物制劑中單體蛋白或其他組分形成的凝聚體物或寡聚體可能會(huì)對(duì)單體蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致該藥物制劑療效喪失。而且，當(dāng)用輸液系統(tǒng)給予含單體蛋白質(zhì)的藥物組合物時(shí)，形成的凝聚體或寡聚體可能導(dǎo)致其它一些問(wèn)題，如堵塞管道、膜或泵。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”指蛋白質(zhì)的活性，如抗病毒活性和/或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等隨時(shí)間變化而保持相對(duì)恒定，根據(jù)需要，有一個(gè)功能性定義。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”也指本發(fā)明干擾素預(yù)制劑的物理、化學(xué)和構(gòu)象穩(wěn)定性(包括生物學(xué)效能的維持)。蛋白質(zhì)分子的化學(xué)降解或凝聚形成更高級(jí)聚合物、脫糖基、糖基化修飾、氧化或可能導(dǎo)致本發(fā)明單體蛋白質(zhì)至少一種生物學(xué)活性降低的其它結(jié)構(gòu)性修飾，都可能引起蛋白質(zhì)預(yù)制劑的不穩(wěn)定。一種“穩(wěn)定性的(stable)”預(yù)制劑是指本文所述蛋白質(zhì)的降解、修飾、凝聚、生物活性喪失等程度被可接受地控制、不會(huì)隨時(shí)間推移而不可接受地增加。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定的(stabilized)”指，與缺少本文所述加入到本體單體蛋白質(zhì)或含單體蛋白質(zhì)的制劑中的輔料時(shí)制備的單體蛋白質(zhì)或制劑相比，顯示穩(wěn)定性提高和/或保持的本發(fā)明的單體蛋白質(zhì)或含單體蛋白質(zhì)的制劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定化”可與“降低或/和防止蛋白質(zhì)凝聚”和/或“降低或/和防止蛋白質(zhì)寡聚”和/或“降低或/和防止凝聚體形成”和/或“降低和/或防止聚合”和/或“降低或/和防止氧化”和/或“降低和/或防止微膠束形成”和/或“降低和/或防止脫酰胺”和/或“降低和/或防止對(duì)單體蛋白質(zhì)或含單體蛋白質(zhì)制劑的任何種類(lèi)有害作用”互換使用。術(shù)語(yǔ)“單體”或“單體的”指只含有一條肽鏈的分子。術(shù)語(yǔ)“本體蛋白質(zhì)(bulkprotein)”或“蛋白質(zhì)本體”或“本體單體蛋白質(zhì)(bulkmonomericprotein)”或“單體蛋白質(zhì)本體”本文指已通過(guò)制備過(guò)程的純化步驟，但還沒(méi)有通過(guò)最終配制步驟的蛋白質(zhì)或單體蛋白質(zhì)狀態(tài)，其允許制備“最終劑型(FDF)”或“藥物組合物”以進(jìn)行最后包裝和發(fā)送銷(xiāo)售。因此本文認(rèn)為重組蛋白質(zhì)本體是在純化步驟結(jié)束時(shí)產(chǎn)生的產(chǎn)物，但該產(chǎn)物還未通過(guò)最后配制步驟。換句話(huà)說(shuō)，可認(rèn)為本發(fā)明方法包括預(yù)配制步驟，其允許獲得預(yù)配制的本體，通過(guò)加入其它輔料產(chǎn)生最終劑型或藥物組合物。通常先貯藏預(yù)配制的或未配制的本體然后制備最終制劑，但也不一定。如果冷凍貯藏，本體蛋白質(zhì)常需解凍、過(guò)濾、然后進(jìn)入最終配制步驟，但也不一定如此。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，當(dāng)所述蛋白質(zhì)是重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)時(shí)，在最終層析步驟的洗脫液中加入穩(wěn)定化輔料，所述的層析步驟例如是在進(jìn)行過(guò)濾步驟之前或者是剛好在過(guò)濾步驟之后進(jìn)行分子大小排阻層析(SEC)，本文稱(chēng)為“SEC-EL”或“SEC-EL2”，(參見(jiàn)實(shí)施例)。此時(shí)，SEC代表純化過(guò)程的最終步驟。在其他純化過(guò)程中，最后步驟可采用其他層析技術(shù)或分離方法，或者也可采用其他不依賴(lài)于分離方法作為最后純化步驟的純化方法；這不意味著限制如術(shù)語(yǔ)“本體蛋白質(zhì)”所定義的本發(fā)明范圍。只要在純化程序之后加入穩(wěn)定性輔料，無(wú)論采用哪種純化方法均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。另外，也可將本發(fā)明所述的穩(wěn)定性輔料加入到最終制劑(FDF)中。因此，F(xiàn)DF中含有的輔料可對(duì)應(yīng)于加入到本體預(yù)制劑中的那些輔料，但并不一定如此?！肮丫鄣鞍住盎颉惫丫垠w“本文用于指具有兩個(gè)或多個(gè)多肽鏈的多亞基蛋白質(zhì)。有時(shí)“寡聚蛋白”指具有兩個(gè)或多個(gè)相同的亞基多肽鏈的蛋白質(zhì)。所述寡聚體至少可區(qū)分為3種·快速可逆性非共價(jià)小寡聚體(二聚體，三聚體，四聚體等)·不可逆性非共價(jià)寡聚體·共價(jià)寡聚體(如二硫化物)“多亞基蛋白質(zhì)”是含有多個(gè)亞基的蛋白質(zhì)?！皝喕敝附M成多聚體蛋白質(zhì)的相同的或不同的蛋白質(zhì)分子之一?！肮丫刍敝赣奢^大或較小分子產(chǎn)生寡聚體的化學(xué)過(guò)程?！肮丫刍币仓竼误w或單體混合物轉(zhuǎn)變成寡聚體的過(guò)程。術(shù)語(yǔ)“寡聚化”還指單個(gè)蛋白分子通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)相互反應(yīng)形成多聚體的過(guò)程。寡聚化可以是可逆的，也可以是不可逆的。術(shù)語(yǔ)“聚合”描述單體經(jīng)反復(fù)混合而形成長(zhǎng)或大的分子聚合物的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，或單體或單體混合物轉(zhuǎn)變?yōu)榫酆衔锏倪^(guò)程。術(shù)語(yǔ)“凝聚”指主要由于較小物質(zhì)的非共價(jià)粘合而形成較高分子量物質(zhì)的過(guò)程。具體對(duì)蛋白質(zhì)而言，凝聚是一種變性形式，其中二級(jí)結(jié)構(gòu)非極性表面，例如通常形成分子內(nèi)相互作用并且包埋在蛋白內(nèi)部的α-螺旋和β-折疊的非極性表面，被允許進(jìn)行分子間相互反應(yīng)并形成有時(shí)不可溶的多聚分子形式。術(shù)語(yǔ)“不可溶的”相比較于“可溶的”有時(shí)候分別指“不可逆的”相比較于“可逆的”。凝聚體也可定義為大的寡聚蛋白結(jié)合體(如10個(gè)以上的多聚體)。非共價(jià)“凝聚體”可能是可逆的。本發(fā)明不受限于以下定義“凝聚”、“凝聚體”、“寡聚體”、“多聚物”、“寡聚”、“多聚”、“多聚的”、“寡聚的”、“聚合”，無(wú)論是那種定義。因此，本發(fā)明的范圍不限于那些術(shù)語(yǔ)或者關(guān)于這些術(shù)語(yǔ)的任何理論。重要的是“凝聚體”和“寡聚體”可通過(guò)檢測(cè)方法(如SE-HPLC)而彼此區(qū)別，通常利用不同的可鑒別信號(hào)，如分離的各個(gè)峰；各峰對(duì)應(yīng)于凝聚體或寡聚體。同樣，蛋白質(zhì)的單體形式對(duì)應(yīng)于一個(gè)精確而唯一的明確的峰。術(shù)語(yǔ)“緩沖液”或“生理學(xué)上可接受的緩沖液”指已知可安全地應(yīng)用于藥學(xué)或獸醫(yī)學(xué)制劑中、具有維持或控制該制劑的pH在所需范圍的化合物溶液。能控制pH在溫和酸性pH至溫和堿性pH范圍的可接受的緩沖液包括但不限于磷酸、乙酸、檸檬酸、精氨酸、TRIS和組氨酸這類(lèi)化合物。“TRIS”指2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇，和其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選的緩沖劑是乙酸緩沖鹽水或可接受的鹽?！暗葷B劑”指生理學(xué)上可耐受的化合物，該化合物可以賦予藥物適宜的滲透張力避免水份跨越接觸該藥物的細(xì)胞膜凈流動(dòng)。如甘油等化合物常以已知濃度用于此目的。其他合適的等滲劑包括但不限于氨基酸或蛋白質(zhì)(如甘氨酸或白蛋白)，鹽類(lèi)(如氯化鈉)以及糖類(lèi)(如葡萄糖、甘露醇、蔗糖和乳糖)。等滲劑優(yōu)選甘露醇。術(shù)語(yǔ)“抗氧化劑”指可防止氧或氧產(chǎn)生的自由基與其它物質(zhì)相互反應(yīng)的化合物?？寡趸瘎┦浅＜尤氲剿幬锵到y(tǒng)中以提高其物理和化學(xué)穩(wěn)定性的多種輔料中的一種。加入抗氧化劑是為了最大程度減小或阻滯在一些藥物或輔料接觸氧或存在自由基時(shí)所發(fā)生的氧化過(guò)程。這些氧化過(guò)程常常受到光、溫度、高濃度氫、存在的痕量金屬或過(guò)氧化物所催化。亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、硫脲、甲硫氨酸、乙二胺四乙酸鹽(EDTA)、丁基羥基甲苯(BHT)和丁基羥基茴香醚(BHA)常用作藥物中的抗氧化劑。已發(fā)現(xiàn)EDTA鈉鹽可通過(guò)與催化氧化反應(yīng)的金屬離子螯合而增強(qiáng)抗氧化劑的活性。最優(yōu)選的抗氧化劑是甲硫氨酸?？寡趸瘎┍疚囊卜Q(chēng)為穩(wěn)定劑。甲硫氨酸可以其游離堿形式或鹽形式存在。只要甲硫氨酸以其游離堿或其鹽形式存在，在本發(fā)明的方法中或本發(fā)明的制劑中可采用甲硫氨酸的任何一種立體異構(gòu)體(如L，D或DL異構(gòu)體)。優(yōu)選采用L型立體異構(gòu)體。也可在本發(fā)明的制劑中采用甲硫氨酸的類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)“甲硫氨酸類(lèi)似物”指自然產(chǎn)生的甲硫氨酸的衍生物。甲硫氨酸類(lèi)似物可以其游離堿形式或其鹽形式用于本發(fā)明制劑中。加入抗氧化劑(如甲硫氨酸)來(lái)提高或者維持穩(wěn)定性是濃度依賴(lài)性的。即在本發(fā)明含干擾素-β的制劑中不存在抗氧化劑而正常情況下發(fā)生氧化、形成凝聚體/寡聚體時(shí)，提高抗氧化劑的濃度將導(dǎo)致提高和/或維持本發(fā)明含干擾素-β制劑的穩(wěn)定性?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員通常知道的方法無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，不難確定本發(fā)明制劑中為了減少氧化或凝聚體/寡聚體形成所采用的氧化劑(如甲硫氨酸)的量。術(shù)語(yǔ)“抑菌劑”指作為抗菌劑加入到制劑中的化合物或組合物。本發(fā)明含干擾素制劑的防腐制劑宜符合為商品化多用途活性產(chǎn)品防腐效果制定的法定或管理指南的要求。抑菌劑的例子包括苯酚、間-甲酚、對(duì)-甲酚、鄰-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對(duì)羥基苯甲酸烷酯(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其類(lèi)似物)、氯化苯甲烴銨，氯化芐乙氧胺，脫氫乙酸鈉和硫柳汞。優(yōu)選的抑菌劑是苯甲醇。苯甲醇本文也稱(chēng)為穩(wěn)定劑。術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”指能降低液體表面張力或者降低兩液體間或液體與固體間界面張力的化合物，表面張力是作用于液體表面，趨向于最大程度減小表面面積的力。有時(shí)在藥物制劑中采用表面活性劑目的包括輸送低分子量藥物和多肽以改進(jìn)該藥物的吸收或?qū)⑵漭斔徒o靶組織。優(yōu)選的表面活性劑是Tween20或泊咯沙姆(poloxamer)。更優(yōu)選的表面活性劑為泊咯沙姆188。甚至更優(yōu)選的表面活性劑為T(mén)weenTM20。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指氨基酸或氨基酸混合物，任何給定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。當(dāng)采用混合氨基酸時(shí)，所有的氨基酸可以其游離堿形式存在，或可以其鹽形式存在，或一些以其游離堿形式存在而其他以其鹽形式存在。本發(fā)明方法或制劑中所用的優(yōu)選氨基酸是具有帶電荷側(cè)鏈的氨基酸，如精氨酸、賴(lài)氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。更優(yōu)選的氨基酸為賴(lài)氨酸和精氨酸。還要優(yōu)選的氨基酸為賴(lài)氨酸。只要某特定氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在，本發(fā)明方法或制劑中可采用該特定氨基酸的任何立體異構(gòu)體(如L，D，或DL異構(gòu)體)，或者這些立體異構(gòu)體的組合物。優(yōu)選采用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明方法或制劑中也可采用這些優(yōu)選氨基酸的類(lèi)似物。術(shù)語(yǔ)“氨基酸類(lèi)似物”指自然產(chǎn)生的氨基酸的衍生物。合適的精氨酸類(lèi)似物包括，例如氨基胍和N-單乙基-L-精氨酸。和優(yōu)選的氨基酸一樣，這些氨基酸類(lèi)似物以其游離堿形式或其鹽形式用于本發(fā)明方法或制劑中。本文中氨基酸也稱(chēng)為穩(wěn)定劑。本發(fā)明的方法或制劑中所用的氨基酸能保護(hù)治療性活性多肽，使其免遭各種應(yīng)力的作用，因而提高了或/和維持了單體蛋白質(zhì)或含單體蛋白質(zhì)的制劑在該單體蛋白質(zhì)生命周期(貯藏前、貯藏過(guò)程中、貯藏后)中的穩(wěn)定性。這里，術(shù)語(yǔ)“應(yīng)力”包括但不限于熱、冷凍、pH、光、攪拌、氧化、脫水、表面、剪切力、冷凍/解凍、壓力、重金屬、酚類(lèi)化合物、變性劑等。術(shù)語(yǔ)“應(yīng)力”包括任何能調(diào)節(jié)(即降低，維持或提高)(單體)蛋白質(zhì)或含(單體)蛋白質(zhì)的制劑穩(wěn)定性的因素。加入氨基酸來(lái)提高和/或維持穩(wěn)定性是濃度依賴(lài)性的。即當(dāng)本發(fā)明的單體蛋白質(zhì)或者含單體蛋白質(zhì)的制劑中不存在氨基酸通常會(huì)形成凝聚體/寡聚體時(shí)，提高氨基酸的濃度將導(dǎo)致提高和/或維持本發(fā)明單體蛋白質(zhì)或含單體蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常知道的方法無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，不難確定本發(fā)明方法或制劑中為了減少寡聚體或凝聚體形成，從而提高在該單體蛋白質(zhì)整個(gè)生命周期內(nèi)單體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，和提高所述制劑穩(wěn)定性所采用的特定氨基酸的量。“冷凍貯藏”指將預(yù)制備的單體蛋白質(zhì)水溶液制劑在0℃以下，優(yōu)選-20℃或以下，更加優(yōu)選在-70℃冷凍與保存?！袄鋬?解凍循環(huán)”或“冷凍/解凍操作“指使用凍存的蛋白質(zhì)樣品時(shí)所用的已知技術(shù)，其中將蛋白質(zhì)樣品的溫度提高到使其恢復(fù)液體狀態(tài)水平足夠時(shí)間以允許使用Rampie后，再將該樣品冷凍到0℃以下回到凍存狀態(tài)，優(yōu)選在-20℃或以下，更優(yōu)選-70℃。本發(fā)明的目的是至少抵消單體蛋白質(zhì)以及加入本發(fā)明本體蛋白質(zhì)中的其他試劑、組分或化合物的凝聚和寡聚過(guò)程(本發(fā)明不僅限于這些過(guò)程)。因此，本發(fā)明能對(duì)加入到本發(fā)明本體中和將包含在所述蛋白質(zhì)的最終劑型或藥物組合物中的所有化合物、試劑(如抑菌劑、等滲劑)、蛋白質(zhì)、表面活性劑、輔料賦予穩(wěn)定性(如減少和/或抑制寡聚體和凝聚體的形成)。換句話(huà)說(shuō)，不僅僅賦予(單體)蛋白質(zhì)，而且賦予含(單體)蛋白質(zhì)的“整個(gè)”制劑穩(wěn)定性。凝聚不僅僅損害了生物學(xué)活性，而且可產(chǎn)生中和抗體(NAb)導(dǎo)致注射部位反應(yīng)和免疫原性。本文提供的實(shí)施例清楚地表明，在本體單體蛋白制劑中加入特定輔料后，可通過(guò)防止和/或抑制凍存或/和反復(fù)凍/融循環(huán)期間多肽凝聚體或寡聚體的形成，從而顯著提高單體蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定性和溶解性。另外，本發(fā)明證明熱解聚能有效賦予(單體)蛋白質(zhì)或含該(單體)蛋白質(zhì)的制劑穩(wěn)定性。術(shù)語(yǔ)“熱解聚”本文指多聚體形式的蛋白質(zhì)在溫度作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛘呓饩鄢蔀檫€原的多聚形式或單體形式(如二聚體蛋白質(zhì)置于特定溫度下轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w)。制劑中的蛋白質(zhì)是以復(fù)合多聚體形式(二聚體，三聚體等)存在。熱解聚能有效地將所有的多聚體形式轉(zhuǎn)變或解聚成為還原的多聚體或單體形式。本發(fā)明證明溫度和多聚體解聚之間有相關(guān)性。當(dāng)進(jìn)行熱解聚時(shí)，與未經(jīng)熱解聚的制劑相比，制劑所含的多聚體形式較少、單體形式增多。優(yōu)選熱解聚將所有的多聚體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w形式。溫度可立即設(shè)定為固定溫度或呈梯度升高至特定溫度。另外，本發(fā)明證明持續(xù)熱解聚能有效穩(wěn)定(單體)蛋白質(zhì)或含(單體)蛋白質(zhì)的制劑。本發(fā)明證明熱解聚的持續(xù)時(shí)間與多聚體的解聚之間有相關(guān)性。實(shí)施例表明在熱解聚過(guò)程中前幾個(gè)小時(shí)熱解聚最有效，直至達(dá)到某時(shí)間點(diǎn)而失效。熱解聚是蛋白質(zhì)特異性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)技術(shù)，不難為某具體蛋白質(zhì)設(shè)定合適的參數(shù)，如溫度和持續(xù)時(shí)間，以獲得最佳熱解聚。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道許多分析方法可用來(lái)測(cè)定降解產(chǎn)物，如凝聚、氧化、脫酰氨、剪切、表面吸附、表面變性、環(huán)狀亞胺基形成、截短等。檢測(cè)穩(wěn)定性的方法包括但不限于高效液相色譜(HPLC)、分子大小排阻HPLC(SEC)(樣品或流動(dòng)相中含有或者不含有變性劑，如SDS、鹽酸胍、或有機(jī)溶劑)、反向(RP)HPLC、離子交換HPLC、電泳、疏水相互作用層析(HIC)、親和層析、SDS-PAGE、用還原劑還原二硫鍵、天然凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、分析型超離心、光散射、濁度試驗(yàn)和蛋白質(zhì)濃度試驗(yàn)。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性研究可采用園二色性、熒光(內(nèi)在的和疏水性探針結(jié)合的)、UV、FTIR、和/或差別性?huà)呙枇繜嵊?jì)量法。因此，某特定輔料對(duì)單體蛋白質(zhì)凝聚或寡聚的影響可通過(guò)，例如在溶液中可溶性單體蛋白隨時(shí)間的變化來(lái)測(cè)定。在分子大小排阻HPLC或SEC，也稱(chēng)為凝膠過(guò)濾層析或分子篩層析法中，設(shè)計(jì)的層析柱裝有多孔基質(zhì)，其可滯留小于孔徑的分子，較大的分子被排斥而較早洗脫下來(lái)。大多數(shù)應(yīng)用中都采用等度(isocratic)梯度。下面從不同方面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。第一方面，本發(fā)明提供一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法，該方法包括以下步驟a)提供配制在緩沖液中的單體蛋白質(zhì)本體，和b)在該本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑還可將輔料或其組合物加入到最終制劑(FDF)中，而不是只加入到單體蛋白質(zhì)本體中。換句話(huà)說(shuō)，可在單體蛋白質(zhì)本體的各個(gè)階段和制備過(guò)程的最終配制步驟中加入輔料，但至少在單體蛋白質(zhì)本體中加入一次。優(yōu)選該單體蛋白質(zhì)是干擾素。更優(yōu)選該干擾素是IFN-β。還要優(yōu)選該IFN-β是人重組IFN-β。優(yōu)選穩(wěn)定該蛋白質(zhì)避免凝聚和寡聚。優(yōu)選的抑菌劑是苯甲醇，表面活性劑是Tween20，等滲劑是甘露醇，氨基酸選自賴(lài)氨酸或精氨酸，抗氧化劑是甲硫氨酸。優(yōu)選的輔料組合為1.等滲劑是甘露醇、抗氧化劑是甲硫氨酸；2.等滲劑是甘露醇、抗氧化劑是甲硫氨酸、氨基酸是賴(lài)氨酸；3.氨基酸是賴(lài)氨酸、抗氧化劑是甲硫氨酸；4.氨基酸是賴(lài)氨酸、抗氧化劑是甲硫氨酸、表面活性劑是Tween20；5.抑菌劑是苯甲醇、抗氧化劑是甲硫氨酸；或者6.抑菌劑是苯甲醇、抗氧化劑是甲硫氨酸和表面活性劑是Tween20。另外，可在特定溫度下培育本體蛋白質(zhì)以促進(jìn)單體蛋白質(zhì)的熱解聚。優(yōu)選該溫度的范圍是27℃-31℃。最優(yōu)選該溫度設(shè)定為29℃?；蛘?，梯度升高溫度直至達(dá)到上述的特定溫度。優(yōu)選培育過(guò)程至少3小時(shí)，或6-40個(gè)小時(shí)。更優(yōu)選培育過(guò)程在15-30小時(shí)或10小時(shí)、16小時(shí)、18.5小時(shí)或24小時(shí)。甚至更優(yōu)選培育24小時(shí)?？稍诒景l(fā)明第一方面所述的預(yù)配制步驟之前或之后進(jìn)行培育，但不限于此?？稍谥苽溥^(guò)程的任何一個(gè)階段，即也可以在最終配制步驟中，培育本發(fā)明第一方面所述已經(jīng)穩(wěn)定化的單體蛋白質(zhì)。第二方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明第一方面所述方法獲得的預(yù)配制的本體蛋白質(zhì)。本發(fā)明第三方面提供了提高和/或維持單體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，該方法包括本發(fā)明第一方面所述的蛋白質(zhì)本體的預(yù)配制方法。現(xiàn)通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案來(lái)描述本發(fā)明的特定單體蛋白質(zhì)干擾素、更優(yōu)選IFN-β?！案蓴_素”或“IFN”，如本文所用包括文獻(xiàn)中如此定義的任何分子，這些分子包括，例如在上述“發(fā)明背景”中所提到的任何類(lèi)型的IFN。具體說(shuō)，在上述定義中包括IFN-α，IFN-β和IFN-γ。IFN-β是本發(fā)明的優(yōu)選IFN。根據(jù)本發(fā)明，合適的IFN-β可從市場(chǎng)上購(gòu)得，如Rebif(Serono)、Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。根據(jù)本發(fā)明，也優(yōu)選采用人源干擾素。術(shù)語(yǔ)干擾素，如本文所用，包括其鹽、功能性衍生物、變體、類(lèi)似物和活性片段。術(shù)語(yǔ)“干擾素-β(IFN-β)”，如本文所用，包括成纖維細(xì)胞干擾素，特別是來(lái)源于人的，如從生物體液分離得到的、或用DNA重組技術(shù)從原核或真核宿主細(xì)胞得到的，及其鹽、功能性衍生物、變體、類(lèi)似物和活性片段。優(yōu)選的IFN-β指干擾素β-1a。術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”本文用于指IFN的類(lèi)似物，在該類(lèi)似物中天然IFN有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換為不同的氨基酸殘基，或缺失，或在IFN的天然序列中加入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，但所得產(chǎn)物的活性與野生型IFN相比無(wú)顯著改變，得到的產(chǎn)物活性無(wú)顯著改變。這些突變蛋白可用已知的合成技術(shù)和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)，或其他已知的合適技術(shù)制備。優(yōu)選的突變蛋白包括如Shepard等.(1981)或Mark等.(1984)所述的突變蛋白。任何此類(lèi)突變蛋白優(yōu)選具有與IFN充分相同的氨基酸序列，因而具有與IFN基本上相似甚至更加優(yōu)良的活性。干擾素的生物學(xué)功能是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，而且其生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品已建立可從例如國(guó)立生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品和控制研究所購(gòu)賣(mài)到(http//immunology.org/links/NIBSC)。IFN活性測(cè)定的生物學(xué)試驗(yàn)已有描述。例如可按Rubinstein等.，1981所述進(jìn)行IFN試驗(yàn)。因此，可通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定某給定的突變蛋白是否具有與IFN基本上相似，或者甚至更優(yōu)越的活性?？捎糜诒景l(fā)明的IFN突變蛋白，或其編碼核酸，包括根據(jù)本文提供的說(shuō)明和指南無(wú)須過(guò)多實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可用常規(guī)方法獲得的有限的一組基本上相應(yīng)的序列，如取代的多肽或多聚核苷酸。本發(fā)明突變蛋白的優(yōu)選變化是稱(chēng)為“保守”取代的變化。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的保守性氨基酸取代，可包括某一組內(nèi)的同義氨基酸取代，由于同義氨基酸具有基本相似的理化性能，同組內(nèi)成員之間的取代將保存該分子的生物學(xué)功能。已清楚知道，也可在以上定義的序列中插入和缺失氨基酸而不改變其功能，特別是如果該插入或缺失只涉及少數(shù)的幾個(gè)氨基酸，如30個(gè)以下，優(yōu)選10個(gè)以下，而不去除或取代那些對(duì)功能構(gòu)象起關(guān)鍵作用的氨基酸，如半胱氨酸殘基。通過(guò)這種缺失和/或插入所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍。優(yōu)選的同義氨基酸分組是表I中所定義的那些。更優(yōu)選的同義氨基酸分組是表II中所定義的那些；最優(yōu)選的同義氨基酸分組是表III所定義的那些。表I優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表II更優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表III最優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸取代(可用于本發(fā)明中獲得IFN突變蛋白)的例子包括任何已知方法步驟，如以下專(zhuān)利中所述的方法步驟授予Mark等的美國(guó)專(zhuān)利4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的專(zhuān)利5,116,943，授予Namen等的專(zhuān)利4,965,195；授予Chong等的專(zhuān)利4,879,111；和授予Lee等的專(zhuān)利5,017,691；以及美國(guó)專(zhuān)利4,904,584(Shaw等)所述的賴(lài)氨酸取代的蛋白質(zhì)。已描述了具體的IFN-β突變蛋白，如Mark等，1984。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指包含融合于另一蛋白質(zhì)的IFN或IFN突變蛋白的多肽，例如，該融合蛋白在體液中具有延長(zhǎng)的停留時(shí)間。因此IFN可融合于另一蛋白質(zhì)、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段。本文所用“功能性衍生物”包括IFN衍生物以及它們的突變蛋白和融合蛋白，可用本領(lǐng)域已知的方法從作為殘基側(cè)鏈的官能團(tuán)、或N-或C-末端基團(tuán)來(lái)制備這些功能性衍生物，并且只要它們保持是藥學(xué)上可接受的，即它們不破壞與活性IFN基本相同的蛋白質(zhì)的活性并且不給含有該功能性衍生物的組合物帶來(lái)毒性，則這些功能性衍生物都包括在本發(fā)明中。這些衍生物可(例如)包括聚乙二醇側(cè)鏈；其可掩蔽抗原基并延長(zhǎng)IFN在體液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂族酯類(lèi)、羧基與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與?；糠?例如烷酰基或碳環(huán)芳?；?形成的N-?；苌锘蛴坞x羥基(例如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與?；糠中纬傻腛-?；苌?。本發(fā)明中的IFN“活性片段”或突變蛋白以及融合蛋白包括該蛋白分子多肽鏈的任何片段或前體，其為單獨(dú)的或者和與其相連的分子或殘基(例如糖或磷酸殘基)一起，或該蛋白分子的凝聚物以及糖殘基本身，只要與相應(yīng)的IFN相比，所述片段的活性沒(méi)有顯著降低。術(shù)語(yǔ)“鹽”在本文指上述蛋白質(zhì)或其類(lèi)似物的羧基成的鹽以及氨基的酸加成鹽?？捎帽绢I(lǐng)域已知的方法形成羧基的鹽，包括無(wú)機(jī)鹽，例如，鈉鹽、鈣鹽、銨鹽、鐵鹽或鋅鹽等，以及與有機(jī)堿形成的鹽，例如與胺(如三乙醇胺)、精氨酸或賴(lài)氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括例如，與無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或硫酸)形成的鹽，以及與有機(jī)酸(例如乙酸或草酸)形成的鹽。當(dāng)然，這些鹽必須保持與本發(fā)明相關(guān)的蛋白質(zhì)(IFN)的生物活性，即結(jié)合相應(yīng)受體并啟動(dòng)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。根據(jù)本發(fā)明，尤其優(yōu)選采用重組人INF-β以及本發(fā)明的化合物。最近描述了一種特殊種類(lèi)的干擾素變體。這種所謂的“共有序列干擾素”是非天然存在的IFN變體(美國(guó)專(zhuān)利6,013,253)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式，將本發(fā)明的化合物與共有序列干擾素聯(lián)用。如本文所用，人干擾素共有序列(IFN-con)指一種非天然存在的多肽，其主要包括在大多數(shù)天然存在的人白細(xì)胞干擾素亞型序列的IFN-α代表性亞組中共有的氨基酸殘基，在不存在所有亞型共有的氨基酸的那些位置中的一個(gè)或多個(gè)位置上，該多肽包含在該位置主要存在的氨基酸，并且決不包含任何在至少一種天然存在的亞型中都不存在于該位置的氨基酸。IFN-con包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利4,695,623、4,897,471和5,541,293中稱(chēng)為IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列?？扇缟鲜鰧?zhuān)利所述或用其它標(biāo)準(zhǔn)方法制備編碼IFN-con的DNA序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，融合蛋白包括與Ig的融合。融合可以是直接連接，或通過(guò)短的接頭肽，接頭肽的長(zhǎng)度可短至1-3個(gè)氨基酸殘基或更長(zhǎng)，例如長(zhǎng)度為13個(gè)氨基酸殘基。所述接頭可以是例如序列為E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或包含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個(gè)氨基酸的接頭序列，該接頭序列介于IFN序列和免疫球蛋白序列之間。產(chǎn)生的融合蛋白可具有改進(jìn)的性質(zhì)，如在體液中的停留時(shí)間(半衰期)延長(zhǎng)、特異活性增加、表達(dá)水平提高或有利于融合蛋白的純化。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，IFN融合于Ig分子的恒定區(qū)。優(yōu)選地，其融合于例如人IgG1的重鏈區(qū)如CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明，Ig分子的其它同工型也適于產(chǎn)生融合蛋白，所述其它同工型為例如同工型IgG2、IgG3或IgG4，或其它Ig類(lèi)別，如IgM或IgA。融合蛋白可為單體或多聚體、異多聚體或均多聚體。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，功能性衍生物包括連接于一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的至少一個(gè)部分，所述官能團(tuán)是氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈。優(yōu)選該部分是聚乙烯(PEG)部分?？捎靡阎椒ㄟM(jìn)行PEG化，如WO99/55377中所述的方法。本發(fā)明一般可應(yīng)用于所有種類(lèi)的干擾素，應(yīng)用于上述的干擾素，并且還包括天然干擾素、用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的干擾素和化學(xué)合成或修飾產(chǎn)生的干擾素。術(shù)語(yǔ)干擾素還包括來(lái)自人或任何其它合適物種的成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或任何其它含有干擾素或產(chǎn)生干擾素的組織的粗制干擾素、半純化干擾素和純化的干擾素。更優(yōu)選地，本發(fā)明可用于人成纖維細(xì)胞干擾素(干擾素-β)。預(yù)制劑中優(yōu)選IFN-β的濃度為或約為10μg/ml-2000μg/ml，更優(yōu)選為或約為100μg/ml-1000μg/ml，最優(yōu)選為或約為500-810μg/ml。優(yōu)選地，緩沖液的量足以維持所述組合物的pH值在特定pH值的上下0.5單位范圍內(nèi)，其中所述特定pH值約為3.5-5.5。更優(yōu)選，pH為3.8、4.2或4.7。更優(yōu)選，pH為4.7。優(yōu)選地，緩沖液的濃度為或約為5mM-500mM。整個(gè)溶液中的緩沖液濃度可在為或約為5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM至500mM之間變動(dòng)。優(yōu)選緩沖液濃度為或約為10mM或50mM。尤其優(yōu)選緩沖液為或約為50mM的醋酸鹽離子，pH4.7。優(yōu)選緩沖液為醋酸鹽緩沖液，優(yōu)選的抗衡離子為鈉離子或鉀離子。醋酸鹽緩沖液是本領(lǐng)域熟知的。優(yōu)選等滲劑(例如甘露醇)濃度為或約為0.5mg/m1-500mg/ml。更優(yōu)選等滲劑濃度為或約為55mg/ml。更優(yōu)選等滲劑濃度為或約為150mM，或?yàn)榛蚣s為300mM或者為或約為600mM。優(yōu)選表面活性劑(即Tween20)濃度為或約為0.01mg/ml-10mg/ml，更優(yōu)選，表面活性劑濃度為或約為0.05mg/ml。優(yōu)選抗氧化劑(例如甲硫氨酸)濃度為或約為0.01-5.0mg/ml。更優(yōu)選抗氧化劑濃度為或約為0.12mg/ml-0.24mg/ml。優(yōu)選氨基酸為賴(lài)氨酸或精氨酸。更優(yōu)選氨基酸為賴(lài)氨酸。優(yōu)選氨基酸濃度(例如賴(lài)氨酸或精氨酸)為或約為20-200mg/ml。優(yōu)選賴(lài)氨酸濃度為或約為27mg/ml、為或約為55mg/ml、為或約為82mg/ml、為或約為164mg/ml。優(yōu)選精氨酸濃度為或約為32mg/ml、或?yàn)榛蚣s為63mg/ml。優(yōu)選抑菌劑(例如苯甲醇)濃度為或約為0.01mg/ml-200mg/ml。更優(yōu)選抑菌劑濃度為或約為5mg/ml、或?yàn)榛蚣s為10mg/ml。本文引入的所有文獻(xiàn)，包括刊物文章或摘要、公開(kāi)或未公開(kāi)的美國(guó)或國(guó)外專(zhuān)利申請(qǐng)、已授權(quán)的美國(guó)或國(guó)外專(zhuān)利或任何其它參考文獻(xiàn)，均全文納入本文作為參考，包括所引用文獻(xiàn)中的所有數(shù)據(jù)、表格、圖表和文本。因此，本文參考文獻(xiàn)中引入的文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容也整體納入本文作為參考。對(duì)已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的引用并非承認(rèn)本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵤┓绞皆谙嚓P(guān)領(lǐng)域中被揭示、教導(dǎo)或暗示。以上對(duì)具體實(shí)施例方式的描述將完全揭示本發(fā)明的總體特性，通過(guò)應(yīng)用本領(lǐng)域一般常識(shí)(包括本文所引用的文獻(xiàn)的內(nèi)容)，其他人可容易地改動(dòng)這些具體實(shí)施方式和/或調(diào)整這些具體實(shí)施方式的用途，這些改動(dòng)和調(diào)整無(wú)需過(guò)多試驗(yàn)，也沒(méi)有偏離本發(fā)明的總體概念。因此，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)和指引，這些調(diào)整和改動(dòng)包括在所公開(kāi)的實(shí)施方式的等同范圍內(nèi)。應(yīng)理解，本文所用措詞和術(shù)語(yǔ)是用于描述而并非限制，因此，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)和指引并結(jié)合本領(lǐng)域一般技術(shù)人員的知識(shí)來(lái)解釋本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)或措詞。實(shí)施例以下實(shí)施例中使用的分析方法在實(shí)施例6中進(jìn)行描述。實(shí)施例1培育溫度和培育時(shí)間對(duì)本體干擾素穩(wěn)定性的影響(熱解聚)。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以評(píng)估解凍溫度、培育溫度和培育時(shí)間(持續(xù)時(shí)間)對(duì)本體干擾素-β穩(wěn)定性的影響。目的是有效和恒定地降低制備過(guò)程中干擾素寡聚體和/或干擾素凝聚體的形成。以下實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用于凍藏的本體干擾素制品(0℃以下，如-20℃或-70℃下貯藏的制品)，將該制品先融化，然后最終在給定的溫度、給定的時(shí)間內(nèi)培育或貯藏以進(jìn)行進(jìn)一步的制備處理。這些實(shí)驗(yàn)中的考慮也可應(yīng)用于0℃以上(例如2-8℃)貯藏因此不經(jīng)過(guò)解凍過(guò)程(或溫度變化)但可能經(jīng)受其它應(yīng)力作用的制品。術(shù)語(yǔ)“靜置的”指凍存制品的融化(如在培育箱，水浴或其他地方)，然后在給定溫度下，在給定的時(shí)間內(nèi)貯藏(如在培育箱，水浴或其他地方)；術(shù)語(yǔ)“靜置溫度”指解凍溫度和培育溫度；如果將冷凍制劑直接置于培育箱中，術(shù)語(yǔ)“培育溫度”或“靜置溫度”可互換使用?！办o置時(shí)間”指在特定溫度下貯存的時(shí)間(如培育的時(shí)間)和解凍時(shí)間之和；如果將冷凍制劑直接置于培育箱中，術(shù)語(yǔ)“培育時(shí)間”或“靜置時(shí)間”可互換使用。1.a各種溫度實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模熱解聚實(shí)驗(yàn)在第一次實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了解凍溫度為室溫(RT)、或25℃、27℃或29℃，然后在25℃、27℃或29℃培育的效果，共16小時(shí)或24小時(shí)。該實(shí)驗(yàn)是在不干擾溫度設(shè)置的情況下進(jìn)行的，因此在整個(gè)過(guò)程中保持穩(wěn)定。表4與圖1總結(jié)了此過(guò)程。干擾素寡聚體和干擾素凝聚體用新型SEC-HPLC方法，本文稱(chēng)為NEWSEC來(lái)測(cè)定。該NEWSEC方法能定量和定性檢測(cè)非共價(jià)和共價(jià)寡聚體。目的是優(yōu)化本體干擾素的熱解聚(TD)，在制備藥物產(chǎn)品(損傷修復(fù))之前，用下面的參數(shù)或變量將寡聚和/或凝聚降到最低。1)培育溫度(25℃、27℃和29℃)對(duì)熱解聚效率的影響；2)培育持續(xù)時(shí)間對(duì)熱解聚效率的影響；3)通過(guò)在培育箱中解凍來(lái)縮短解凍持續(xù)時(shí)間。表4*解凍和培育時(shí)間共16小時(shí)或24小時(shí)。室溫對(duì)照進(jìn)行一次，實(shí)驗(yàn)設(shè)置1進(jìn)行了2次，實(shí)驗(yàn)設(shè)置2進(jìn)行了3次。各條件都使用了裝有小規(guī)模模式(里面裝有1.8ml“新鮮”的本體干擾素的2mlNUNC試管，“插入的試管模式”)的250ml試管。培育箱用水保溫夾套或用氣體循環(huán)保溫。詞匯表/縮寫(xiě)Agg凝聚體COA分析驗(yàn)證.Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp.溫度1.新型SEC-HPLC方法的設(shè)備和材料HPLC系統(tǒng)WatersAlliancesUV檢測(cè)器波長(zhǎng)214nm的Waters996PDA自動(dòng)取樣溫度設(shè)定4℃層析柱TosoHaasTSKG2000SWXL層析柱溫度室溫流動(dòng)相pH3.8、含50mMNaCl的50mM醋酸鈉制備將5.84gNaCl溶解于2升pH3.8的50mM醋酸鈉緩沖液中。在滅菌溶液?jiǎn)卧袑⒋姿峒尤氲絎FI中并用10M的NaOH溶液滴定至pH-3.8來(lái)制備醋酸緩沖液。流速0.5mL/min注射體積0.34-0.36mg/mL重組人IFN-β1a本體200μL試劑醋酸，Merck編號(hào)K31358056NaOH，MerckB19758210MNaOH溶液WFINaCl，JTBAKER產(chǎn)品編號(hào)3627-072.步驟—步驟如圖1所述1)將1.8ml新鮮重組人IFN-β1a本體插入(加入)到2mlNUNC試管中，-70℃在含有200ml水的250ml試管中冷凍。2)3個(gè)試管在室溫下解凍，分別在25℃、27℃和29℃確證的(validated)培育箱(固定溫度隨時(shí)間變化保持恒定)中培育，共16小時(shí)。解凍后和16個(gè)小時(shí)(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測(cè)定。3)3個(gè)試管在室溫下解凍，分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中培育，共24小時(shí)。解凍后和24小時(shí)(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測(cè)定。4)3個(gè)試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共16小時(shí)。解凍后和16個(gè)小時(shí)(解凍+培育)后，從試管中取樣用NEWSEC測(cè)定。5)3個(gè)試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共16小時(shí)。16個(gè)小時(shí)(解凍+培育)后從試管中取樣用NEWSEC測(cè)定，-此培育箱中解凍后沒(méi)有取樣。6)3個(gè)試管分別在25℃、27℃和29℃確證的培育箱中解凍和培育，共24小時(shí)。24個(gè)小時(shí)(解凍+培育)后從試管中取樣用NEWSEC測(cè)定-此培育箱中解凍后沒(méi)有取樣。7)1個(gè)試管在室溫下解凍16個(gè)小時(shí)，在2-8℃下貯藏至多72小時(shí)，-此試管取樣作NEW-SEC測(cè)定，作為此實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。8)為了評(píng)價(jià)對(duì)分子的影響，本試驗(yàn)在選定的條件下進(jìn)行重復(fù)。用NEWSEC，IEF，QUANT-HPLC，ES-MS，BIOASSAY，DEG/OXHPLC，CZE檢測(cè)培育的樣品。試驗(yàn)結(jié)果與室溫解凍16小時(shí)并在2-8℃貯藏的對(duì)照樣品作比較。3.結(jié)果％Mon或％單體＝％重組人干擾素-β1a單體％Agg＝％重組人干擾素-β1a凝聚體·室溫解凍和培育共16小時(shí)將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍和室溫解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣并立即轉(zhuǎn)移到3個(gè)培育箱(25℃、27℃以及29℃)中，解凍和培育時(shí)間共16個(gè)小時(shí)。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結(jié)果如表5所示。表5**培育持續(xù)時(shí)間-10個(gè)小時(shí)·室溫解凍和培育共24小時(shí)將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍和室溫解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣并立即轉(zhuǎn)移到3個(gè)培育箱(25℃、27℃和29℃)中，解凍和培育共24個(gè)小時(shí)。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結(jié)果如表6所示。表6**培育持續(xù)時(shí)間-18.5個(gè)小時(shí)·培育箱中解凍和培育共16小時(shí)將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍后，分別在3個(gè)培育箱(25℃、27℃和29℃)中解凍，解凍和培育共16小時(shí)后，將這些試管溫和地顛倒20次。樣品在2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。結(jié)果如表7所示。表7**培育持續(xù)時(shí)間-16個(gè)小時(shí)·培育箱中解凍和培育共24小時(shí)將3×250ml含有插入物的試管-70℃冷凍后，分別在3個(gè)培育箱(25℃、27℃和29℃)中解凍，將這些試管溫和地顛倒20次，取樣用NEWSEC-HPLC分析，培育共24小時(shí)(解凍+培育)。樣品2-8℃貯藏直至用NEWSEC-HPLC分析。本試驗(yàn)在另一天重復(fù)進(jìn)行，-這些試管解凍之后沒(méi)有取樣。結(jié)果如表8a和8b所示。表8a**培育持續(xù)時(shí)間24個(gè)小時(shí)表8b4.結(jié)論從以上的實(shí)驗(yàn)可以得出以下幾點(diǎn)·提高培育溫度和持續(xù)時(shí)間可以提高熱解聚效率?！づc室溫解凍相比，當(dāng)樣品在培育箱中解凍時(shí)，解凍持續(xù)時(shí)間減少，因此可提高單體的水平?！じ鶕?jù)常規(guī)SECHPLC、Deg/OxHPLC、Quant-HPLC、ES-MS，生物學(xué)試驗(yàn)和CZE的結(jié)果，25℃、27℃和29℃解凍和培育多至24小時(shí)對(duì)重組人干擾素-β1a分子沒(méi)有負(fù)面影響。上述實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)調(diào)節(jié)前述凍存的本體干擾素的靜置溫度和靜置時(shí)間而降低寡聚獲得了顯著的結(jié)果。與制劑如何解凍(如室溫解凍或在培育箱中解凍)無(wú)關(guān)，提高靜置溫度至一特定溫度對(duì)干擾素單體水平具有有益效果。因此，靜置溫度和蛋白質(zhì)單體水平之間有相關(guān)性；將靜置溫度從25℃提高到29℃導(dǎo)致蛋白質(zhì)單體水平提高。當(dāng)本體溶液溫度設(shè)定在29℃時(shí)獲得最好結(jié)果。優(yōu)選將本體溶液置于培育箱中29℃培育。比較培育溫度，觀(guān)察到從25℃到29℃單體水平增加～5-6％。優(yōu)選將冷凍制劑直接置于培育箱中，在培育之前不在室溫下解凍(而在培育箱中解凍)。結(jié)果也顯示培育解凍的本體干擾素10小時(shí)已產(chǎn)生了超過(guò)95％的單體百分比。如果在室溫下解凍，測(cè)定的培育持續(xù)時(shí)間為10小時(shí)或18.5小時(shí)。如果在培育箱中解凍，測(cè)定的培育持續(xù)時(shí)間為16小時(shí)或24小時(shí)。同樣的，靜置時(shí)間也是一個(gè)影響寡聚的因素。與靜置條件(如室溫下解凍后培育或者直接培育)無(wú)關(guān)，在靜置時(shí)間和單體水平之間有相關(guān)性；較長(zhǎng)的靜置時(shí)間提高了蛋白質(zhì)單體水平。靜置時(shí)間24小時(shí)可得到最好的結(jié)果。比較靜置時(shí)間，靜置時(shí)間從16小時(shí)到24小時(shí)可得到～3％的單體增加。優(yōu)選冷凍制劑的靜置時(shí)間為24小時(shí)。更優(yōu)選將冷凍制劑直接置于培育箱(在培育箱中解凍)中培育時(shí)間(靜置時(shí)間)為24小時(shí)。組合兩個(gè)變量(靜置時(shí)間和靜置溫度)，可達(dá)到～9％的單體增加。當(dāng)比較培育的制劑與那些沒(méi)有培育的制劑時(shí)，結(jié)果甚至更加顯著。如果在解凍后直接分析制劑(沒(méi)有進(jìn)行培育)，得到77.48％的單體，而當(dāng)冷凍制劑在29℃培育溫度下直接培育24小時(shí)得到97.9％的單體。因此，通過(guò)優(yōu)化這兩個(gè)變量得到20％的單體水平差異。優(yōu)選將本體干擾素靜置溫度設(shè)定為29℃，靜置時(shí)間24小時(shí)。更優(yōu)選將本體干擾素直接在29℃培育(在培育箱中解凍)，培育時(shí)間24小時(shí)(最好的結(jié)果是產(chǎn)生97.9％的單體)。結(jié)論是靜置時(shí)間和靜置溫度，和優(yōu)選培育溫度和培育時(shí)間是對(duì)維持和/或提高本體干擾素預(yù)制劑或制劑穩(wěn)定性具有重要影響的重要因素。1.b經(jīng)不同輪次F/T循環(huán)29℃實(shí)驗(yàn)室規(guī)模熱解聚實(shí)驗(yàn)此報(bào)告評(píng)價(jià)了29℃培育對(duì)重組人干擾素-β1a藥物中二聚體和凝聚體水平的影響。1.步驟a采用NEW-SEC法分析如表9中所示經(jīng)不同輪次F/T循環(huán)解凍后29℃培育15小時(shí)或3小時(shí)的重組人干擾素-β1a本體樣品。將重組人干擾素-β1a本體轉(zhuǎn)移到7個(gè)15mlcorning試管中(每管0.9ml)。將試管-70℃冷凍。還將干擾素-β-1a本體(事先冷凍并解凍的)轉(zhuǎn)移到2個(gè)250mlcorning試管中(每管200ml)，將試管-70℃冷凍。表9實(shí)驗(yàn)室規(guī)模熱解聚實(shí)驗(yàn)的樣品處理b為了評(píng)價(jià)培育干擾素-β-1a本體對(duì)該分子的影響，采用Deg/Ox-HPLC，IEF，ES-MS，Quant-HPLC，CZE檢測(cè)了培育的本體(在1輪F/T循環(huán)后)。c另外，還進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的1輪F/T循環(huán)熱解聚的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。一輪F/T循環(huán)后，從250ml試管中取出等份重組人干擾素-β1a本體放入15ml試管中在29℃培育箱中培育。2結(jié)果1)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(1F/T)，使單體水平從82.8％上升到97.57％，凝聚體水平從0.7％降到0.2％(見(jiàn)表10)。29℃培育(培育箱中)15小時(shí)使二聚體有效解聚；2)水浴解凍后培育重組人干擾素-β1a本體，使單體水平從82.8％上升到96.7％，但凝聚體水平從0.7％升高至1.97％(見(jiàn)表10)。表10一輪F/T循環(huán)后，0.9ml本體樣品的SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果3)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(4F/T)3小時(shí)，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％上升到89.5％(見(jiàn)表11和圖2)。4)室溫解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體(4F/T)15小時(shí)，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％進(jìn)一步上升到93.7％(與培育3小時(shí)相比較)(見(jiàn)表11和圖2)。5)水浴解凍后，培育重組人干擾素-β1a本體，由于二聚體水平降低，單體水平從82.3％上升到94.7％(見(jiàn)表11和圖2)。表114輪F/T循環(huán)后，0.9ml本體樣品的SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果6)室溫解凍后，培育200ml重組人干擾素-β1a本體樣品使單體水平從73％上升到91.2％，凝聚體水平從3.9％下降到2.9％(見(jiàn)表12和圖3)。表122輪F/T循環(huán)后，200ml本體樣品的SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果7)用以下試驗(yàn)分析培育的重組人干擾素-β1a本體樣品(0.9ml，1F/T)以及室溫解凍4℃保存的對(duì)照樣品(見(jiàn)表13)Deg/Ox-HPLC-與對(duì)照樣品(4℃貯藏)相比，培育的樣品中未見(jiàn)氧化水平提高ES-MS-與對(duì)照樣品相比，培育樣品中未見(jiàn)糖類(lèi)水平有差異Quant-HPLC-未見(jiàn)濃度有顯著差異CZE-得到了相同的電泳圖譜IEF-在循環(huán)水浴中解凍的重組人干擾素-β1aF本體樣品顯示在p1-7附近有一條額外條帶。對(duì)照樣品和室溫解凍培育15小時(shí)的樣品符合規(guī)定要求。表13熱解聚對(duì)干擾素的影響如Deg/oxHPLC、ES-MS、Quant-HPLCCZE和IEF所測(cè)定的那樣，室溫解凍后培育15小時(shí)，不影響IFN-β1a分子的參數(shù)。8)1輪F/T熱解聚動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表14和圖4-6中所示。表14實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的F/TX1熱解聚動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)3.結(jié)論1)室溫解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時(shí)顯著降低了寡聚化水平(主要為二聚體)2)29℃水浴解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時(shí)顯著降低了寡聚化水平。3)根據(jù)所用的分析方法，如Deg/oxHPLC、ES-MS、Quant-HPLCCZE和IEF所測(cè)定的那樣，室溫解凍后，29℃培育重組人干擾素-β1a樣品15小時(shí)對(duì)IFN-β-1a分子參數(shù)沒(méi)有負(fù)面影響。解聚非共價(jià)寡聚體有效，但并非所有的非共價(jià)寡聚體都解聚(在250ml試管中有4％的非共價(jià)寡聚體沒(méi)有解聚)。250ml試管中單體百分比達(dá)到94％(29℃培育9小時(shí))而小試管中達(dá)到97.57％(29℃培育15個(gè)小時(shí))。在熱解聚后寡聚體立即達(dá)到平衡(見(jiàn)表和圖)。15ml試管中29℃15小時(shí)后熱解聚完成。總之，本實(shí)驗(yàn)(1.a和1.b)證明，熱解聚(體現(xiàn)為具體溫度和持續(xù)時(shí)間(即靜置溫度和靜置時(shí)間或培育時(shí)間和培育溫度))對(duì)維持和/或提高(單體)蛋白質(zhì)或含(單體)蛋白質(zhì)的制劑的穩(wěn)定性非常重要。干擾素-β的熱解聚動(dòng)力學(xué)結(jié)果還顯示，經(jīng)1輪F/T循環(huán)的樣品熱解聚僅在3個(gè)小時(shí)后就產(chǎn)生了90％的單體，6個(gè)小時(shí)后幾乎完成，然后在15小時(shí)達(dá)到“平臺(tái)”。優(yōu)選進(jìn)行熱解聚至少3小時(shí)。更優(yōu)選將干擾素-β的熱解聚持續(xù)時(shí)間(靜置時(shí)間或培育時(shí)間)設(shè)定在6-40小時(shí)。甚至還要優(yōu)選將干擾素-β的熱解聚持續(xù)時(shí)間設(shè)定在15-30小時(shí)，或10小時(shí)、16小時(shí)、18.5小時(shí)或24小時(shí)。甚至更優(yōu)選干擾素-β的熱解聚持續(xù)時(shí)間為24小時(shí)。培育或靜置溫度優(yōu)選設(shè)定為27℃-31℃。更優(yōu)選該溫度為29℃。雖然熱解聚動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在1輪F/T循環(huán)后得到的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員不難用常規(guī)技術(shù)測(cè)定經(jīng)多輪F/T循環(huán)后(如2F/T，4F/T或11F/T；或在其他種類(lèi)的應(yīng)力后)熱解聚的動(dòng)力學(xué)，或者甚至測(cè)定任何干擾素-β(如重組人干擾素-β1a)或任何單體蛋白質(zhì)整個(gè)制備過(guò)程或一部分制備過(guò)程中的熱解聚動(dòng)力學(xué)。因此本發(fā)明不限于某具體的培育時(shí)間或持續(xù)時(shí)間(或靜置時(shí)間)。同樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難用常規(guī)技術(shù)測(cè)定在一輪或多輪F/T循環(huán)后(或在其他種類(lèi)的應(yīng)力后)最適宜的培育溫度(或靜置溫度)，或者甚至測(cè)定任何干擾素-β(如重組人干擾素-β1a)或任何單體蛋白質(zhì)整個(gè)制備過(guò)程或一部分制備過(guò)程中的最適宜培育溫度。因此本發(fā)明不限于某具體的培育溫度(或靜置溫度)。實(shí)施例2在本體干擾素中加入輔料來(lái)穩(wěn)定干擾素-β進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證一些輔料如氨基酸、抑菌劑、表面活性劑和等滲劑對(duì)保護(hù)本體重組人干擾素-β1a減少寡聚和凝聚的效果。進(jìn)行以下研究時(shí)在本體重組人干擾素-β1a預(yù)制劑中沒(méi)有加入人血清白蛋白(HSA)。1.0詞匯表/縮寫(xiě)Agg凝聚體COA分析驗(yàn)證Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp溫度2.0介紹此研究關(guān)注從SEC-EL分級(jí)到FDF貯藏的制備步驟中最大程度降低r-hIFN-β1a的寡聚化，以提供穩(wěn)定的本體干擾素-β。通過(guò)以下步驟最大程度降低應(yīng)力(如F/T)產(chǎn)生的寡聚1.用輔料和/或其他穩(wěn)定劑但不存在HSA的情況下預(yù)配制本體。2.評(píng)價(jià)貯藏溫度(-20℃、-70℃和2-8℃)對(duì)預(yù)配制的本體寡聚化的影響。用SE-HPLC分析預(yù)配制的本體樣品。3.0目的/范圍最大程度降低本體處理過(guò)程中r-hIFN-β1a的寡聚化。4.0設(shè)備和材料4.1設(shè)備0.2μ過(guò)濾裝置P/NMPGL025MilliporeMillex0.2μ針頭式微孔過(guò)濾器-P/NSLGV025LSMillipore250ml錐形離心管-Corning1.8ml冷凍管-Nunc4.2材料a.SECel2組分b.D-甘露醇DAB，歐洲藥典(PhEur)，英國(guó)藥典(BP)，美國(guó)藥典(USP)，美國(guó)《食品化學(xué)藥典》(FCC)，美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)E421(編號(hào)1.05980，Merck)c.100％冰醋酸(編號(hào)1.00063，Merck)d.10M氫氧化鈉e.泊咯沙姆188(Poloxamer188，LutrolF68DAC，美國(guó)藥典USP/美國(guó)國(guó)家處方集NF，Basf)，5163315f.L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)g.苯甲醇PhEur，BP，NF(編號(hào)1.00987，Merck)h.L-精氨酸單鹽酸鹽(編號(hào)1.01544，Merck)i.TweenTM20歐洲藥典(Ph.Eur)，美國(guó)國(guó)家處方集(NF)，(編號(hào)8.17072，Merck)j.賴(lài)氨酸(編號(hào)1.05701，Merck)k.0.48-0.5mg/ml或0.088mg/ml的重組人干擾素-β1al.pH3.8、50mM或10mM醋酸鹽緩沖液。穩(wěn)定劑氨基酸1.31.6mg/ml精氨酸2.27.4mg/ml賴(lài)氨酸3.0.12mg/ml甲硫氨酸(抗氧化劑)表面活性劑1.0.05mg/mlTween202.0.5mg/ml泊咯沙姆188(Pluronicacid)抑菌劑1.5mg/ml苯甲醇等滲劑1.54.6mg/ml甘露醇5.0步驟進(jìn)行SEC-EL2組分研究。研究的總體方案見(jiàn)圖7所示。不同的預(yù)配制條件見(jiàn)15和16所示。表15實(shí)驗(yàn)方案穩(wěn)定劑苯甲醇/L-精氨酸/甘露醇/賴(lài)氨酸表16測(cè)試的預(yù)配制條件6.1溶液制備6.1.11升50mM、pH-3.8醋酸鈉溶液(SAB)的制備將3.003g冰醋酸加入到1000mlWFI中混合5分鐘。加入約0.56ml10M氫氧化鈉調(diào)pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測(cè)電導(dǎo)率，用0.2μ濾器過(guò)濾。在預(yù)制劑中泊咯沙姆188(或PluronicF-68)的水平為0.1％(重要的微膠束濃度(CriticalMicellarConcentration))，以防制備過(guò)程中容器表面吸附藥物；較高的濃度可能對(duì)產(chǎn)物穩(wěn)定性有負(fù)面影響(氧化較高)；較低的濃度可能抑制吸附的效果較差。6.1.2制備1升的以下溶液1.50mM醋酸鹽、pH-3.8，10mg/ml苯甲醇如6.1.1加入10g苯甲醇后加入氫氧化鈉2.50mM醋酸鹽、pH-3.8，5mg/ml苯甲醇如6.1.1加入5g苯甲醇后加入氫氧化鈉3.50mM醋酸鹽、pH-3.8，63.2mg/ml精氨酸如6.1.1加入63.2g精氨酸后加入氫氧化鈉4.50mM醋酸鹽、pH-3.8，31.6mg/ml精氨酸如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氫氧化鈉5.50mM醋酸鹽、pH-3.8，54.8mg/ml賴(lài)氨酸如6.1.1加入54.8g賴(lài)氨酸后加入氫氧化鈉6.50mM醋酸鹽、pH-3.8，27.4mg/ml賴(lài)氨酸如6.1.1加入31.6g精氨酸后加入氫氧化鈉7.50mM醋酸鹽、pH-3.8，600mM甘露醇將3.003g冰醋酸加入到0.926kgWFI中混合溶液5分鐘。在該溶液中加入100.3g甘露醇混合5分鐘。加入約0.56ml10M氫氧化鈉調(diào)pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測(cè)電導(dǎo)率，用0.2μ膜過(guò)濾。8.50mM醋酸鹽、pH-3.8，600mM甘露醇將3.003g冰醋酸加入到0.966kgWFI中混合溶液5分鐘。在該溶液中加入55.1g甘露醇混合5分鐘。加入約0.56ml10M的氫氧化鈉調(diào)pH至3.8，混合溶液5分鐘，取樣測(cè)電導(dǎo)率，用0.2μ膜過(guò)濾。6.1.3制備1升以下溶液1.50mM醋酸鹽、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸。如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。2.50mM醋酸鹽pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。3.50mM醋酸鹽、pH-3.8、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5grTween204.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸5.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和50g泊咯沙姆188。6.50mM醋酸鹽、pH-3.8、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。7.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。8.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188(Poloxamer188)如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆188。9.50mM醋酸鹽、pH-3.8、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。10.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸。11.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/ml泊咯沙姆188如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5g泊咯沙姆18812.50mM醋酸鹽、pH-3.8、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20如6.1.2中所述加入12g甲硫氨酸和5gTween。6.2本體預(yù)制劑本體制備和組成的總體方案見(jiàn)圖7和表15所示。第一階段6.2.1將197g的SEC-EL用SAB、10mg/ml苯甲醇以1∶1w/w稀釋6.2.2將197g的SEC-EL用SAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1w/w稀釋6.2.3將197g的SEC-EL用SAB、600mM甘露醇以1∶1w/w稀釋6.2.4將197g的SEC-EL用SAB、54.8mg/ml賴(lài)氨酸以1∶1w/w稀釋6.2.592gSEC-EL用208gSAB稀釋以制備含0.5mg/ml重組人干擾素-β1a的溶液。過(guò)濾后，將溶液分入兩個(gè)250ml試管(含有130g本體)和6個(gè)2ml的試管(含有0.5ml本體)中。一個(gè)250ml試管和兩個(gè)2ml試管-70℃凍存。一個(gè)250ml試管和兩個(gè)2ml試管-70℃冷凍，然后轉(zhuǎn)移到第二個(gè)冷凍罐中-20℃貯存。兩個(gè)2ml試管2-8℃貯存。用水稀釋SEC-EL以制備6ml含有0.088mg/ml重組人干擾素-β1a的10mM醋酸鹽溶液，pH-3.8。第二階段制備重組人干擾素-β1a濃度為0.5mg/ml的以下溶液。6.2.6將6.2.1中制備的溶液用SAB，5mg/ml苯甲醇稀釋6.2.7將6.2.2中制備的溶液用SAB，31.6mg/ml精氨酸稀釋6.2.8將6.2.3中制備的溶液用SAB，300mM甘露醇稀釋6.2.9將6.2.4中制備的溶液用SAB，27.4mg/ml賴(lài)氨酸稀釋6.2.10過(guò)濾后，將這4種溶液(6.2.6到6.2.9)分入4個(gè)250ml試管(含有130g本體)和6個(gè)2ml試管(含有2ml本體)中?？偣?4個(gè)250ml試管和18個(gè)2ml試管。將這3種溶液的剩余部分進(jìn)一步加工(第三階段)6.2.11每種溶液2個(gè)250ml試管和2個(gè)2ml試管-70℃凍存。每種溶液2個(gè)250ml試管和2個(gè)2ml試管-70℃冷凍，然后轉(zhuǎn)移到第二個(gè)冷凍罐中-20℃貯存。每種溶液2個(gè)2ml試管2-8℃貯存。第三階段(1∶100稀釋)6.2.12將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB，5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.13將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物(Pluronic)稀釋。6.2.14將6.2.6中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、5mg/ml苯甲醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.15將6.2.7中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.16將6.2.7中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.17將6.2.7中制備29.7ml的溶液用0.3mlSAB、31.6mg/ml精氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.18將6.2.8中制備的29.7m溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.19將6.2.8中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.20將6.2.8中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、300mM甘露醇、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.21將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸稀釋。6.2.22將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、50mg/ml普流尼克聚合物稀釋。6.2.23將6.2.9中制備的29.7ml溶液用0.3mlSAB、27.4mg/ml賴(lài)氨酸、12mg/ml甲硫氨酸、5mg/mlTween20稀釋。6.2.24所有的溶液(6.2.12到6.2.23)分別用Millex0.2μ針頭式過(guò)濾器過(guò)濾。6.2.25將溶液分入2ml試管中(每種溶液至少6個(gè)試管)6.2.26每種溶液2個(gè)2ml試管-70℃凍存。每種溶液2個(gè)2ml試管-70℃冷凍，然后轉(zhuǎn)移到第二個(gè)冷凍罐中-20℃貯存。每種溶液2個(gè)2ml試管2-8℃貯存。6.3本體分析室溫解凍2小時(shí)后，用SE-HPLC分析在2-8℃、-70℃和-20℃貯存的每種預(yù)配制條件的一個(gè)2ml試管。將-20℃貯存的樣品在解凍前移回-70℃貯存4小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表17所示。室溫解凍6小時(shí)后，用SE-HPLC分析在條件1、5、9、13和15(見(jiàn)表1)預(yù)配制的-70℃貯存的一個(gè)250ml試管。結(jié)果見(jiàn)表18所示。另外，取1輪F/T循環(huán)后29℃培育8小時(shí)的15ml試管中的樣品進(jìn)行熱解聚研究(F/Tx1后從250ml試管中取出1ml樣品)并用SE-HPLC分析(結(jié)果見(jiàn)表19)。7.0結(jié)果表17貯存在-70℃、-20℃和2-8℃的Nunc試管(0.5ml)的預(yù)配制結(jié)果*2-8℃貯存3周。**-70℃冷凍，-20℃貯存16天，移回-70℃貯存4小時(shí)。結(jié)果為一式二份的平均值。本體緩沖液含50mM醋酸鈉pH-3.8+輔料(BA-苯甲醇、MET-甲硫氨酸、MAN-甘露醇、TW-Tween20、POL-泊咯沙姆)的不同組合。表18在-70℃貯存、29℃培育8個(gè)小時(shí)(+INC)或不經(jīng)29℃培育的250ml試管的預(yù)配制結(jié)果結(jié)果為一式二份的平均值。表19經(jīng)1輪F/T循環(huán)后15ml試管的熱解聚8.0觀(guān)察在本體重組人干擾素-β1a中加入輔料一致地降低了二聚體和凝聚體的百分比(因而一致地提高了單體的百分比)。比較熱解聚和所選輔料對(duì)重組人干擾素-β的作用，加入輔料可使單體水平輕度升高(降低二聚體和凝聚體水平)。另外，加入輔料而穩(wěn)定的預(yù)制劑再經(jīng)熱解聚(如29℃培育)后甚至顯示出更高的單體水平。1.2ml試管·4℃下不同條件下單體％差異較小(最大的Δ為1.3％)，而含甘露醇的樣品單體水平最高(100％)。·-70℃下甘露醇+Tween20+甲硫氨酸的組合比賴(lài)氨酸略好。不同組合中的所有穩(wěn)定劑都能產(chǎn)生≥99％的單體％?！?70℃下并在-20℃貯存賴(lài)氨酸+Tween20+甲硫氨酸組合獲得了最高的單體百分比。2.250ml試管·-70℃與其他測(cè)試的輔料相比，賴(lài)氨酸降低寡聚化水平具有明顯的優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例3用速度超離心、SEC和Deg/OxHPLC分析在本體干擾素中添加輔料后干擾素-β的穩(wěn)定性1.0詞匯表/縮寫(xiě)Agg凝聚體Dim二聚體Deg降解物FDF最終劑型F/T冷凍和解凍r-hIFN-β1aCHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜SAB50mM醋酸鈉，pH-3.8Temp溫度1.0介紹此研究關(guān)注從SEC-EL分級(jí)到FDF貯存的制備步驟中最大程度降低r-hIFN-β1a寡聚化以提供穩(wěn)定的本體干擾素。通過(guò)以下步驟將寡聚化降到最低1)在-70℃冷凍前，用輔料和/或其他穩(wěn)定劑預(yù)配制本體2)用輔料和/或其他穩(wěn)定劑預(yù)配制本體，不冷凍，2-8℃運(yùn)送3)在2-8℃運(yùn)送未經(jīng)冷凍的r-hIFN-β1a本體，不進(jìn)行預(yù)配制。用SE-HPLC、Deg/OxHPLC和速度超離心方法分析預(yù)配制的本體樣品。SE-HPLC可能只檢測(cè)共價(jià)寡聚體，而速度超離心還能夠定性和定量檢測(cè)非共價(jià)寡聚體。3.0目的/范圍最大程度降低在本體處理過(guò)程中r-hIFN-β1a的寡聚化。4.0設(shè)備和材料4.1設(shè)備0.2μ過(guò)濾裝置P/NMPGL025Millipore-70℃Revco冰箱蠕動(dòng)泵250ml錐形離心試管-Corning1.8ml冷凍管-Nunc4.2材料SECel2組分D-甘露醇DAB，歐洲藥典(PhEur)，英國(guó)藥典(BP)，美國(guó)藥典(USP)，F(xiàn)CC，E421(編號(hào)1.05980，Merck)100％冰醋酸(編號(hào)1.00063，Merck)10M氫氧化鈉L-甲硫氨酸(1.05707，Merck)L-精氨酸單鹽酸鹽(編號(hào)1.01544，Merck)賴(lài)氨酸(編號(hào)1.05701，Merck)5.0步驟進(jìn)行SEC-EL2組分研究。研究總體方案見(jiàn)圖8所示。不同的預(yù)配制條件見(jiàn)表20所示。表20預(yù)配制條件*用quant-HPLC測(cè)得。6.4溶液制備按實(shí)施例2制備溶液。1.50mM，pH-3.8醋酸鈉溶液(SAB)制備見(jiàn)實(shí)施例2。2.0.5升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、63.2mg/ml精氨酸制備a.稱(chēng)重0.483kgWFIb.加入31.6g精氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入1.5g醋酸e.混合溶液5分鐘f.測(cè)pH值時(shí)，加入約0.28ml10MNaOH使pH達(dá)到3.8g.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定h.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液3.1升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、31.6mg/ml精氨酸制備a.稱(chēng)重0.986kgWFIb.加入31.6g精氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.測(cè)pH值時(shí)，加入約0.56ml10MNaOH溶液使pH達(dá)到3.8g.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定h.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液4.1升50mM、pH-4.1醋酸鹽溶液、164.4mg/ml賴(lài)氨酸制備a.稱(chēng)重0.835kgWFIb.加入164.4g賴(lài)氨酸c.混合溶液5分鐘使精氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.56ml10MNaOH溶液使pH達(dá)到約4.1g.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定h.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液5.1升50mM、pH-4.0的醋酸鹽溶液、82.2mg/ml賴(lài)氨酸制備a.稱(chēng)重0.92kgWFIb.加入82.2g賴(lài)氨酸c.混合溶液5分鐘使賴(lài)氨酸溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.56ml10MNaOH溶液使pH達(dá)到約4.0g.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定h.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液6.1升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸制備a.稱(chēng)重0.92kgWFIb.加入110.28g甘露醇c.混合溶液5分鐘使甘露醇溶解d.加入3.002g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.24g甲硫氨酸g.混合溶液5分鐘h.測(cè)pH值時(shí)，加入約0.56ml10MNaOH溶液使pH達(dá)到3.8i.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定j.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液7.2升50mM、pH-3.8醋酸鹽溶液、300mM甘露醇、0.12mg/ml甲硫氨酸制備a.稱(chēng)重1.93kgWFIb.加入110.28r甘露醇c.混合溶液5分鐘使甘露醇溶解d.加入6.006g醋酸e.混合溶液5分鐘f.加入0.24g甲硫氨酸g.混合溶液5分鐘h.測(cè)pH值時(shí)，加入約1.12ml10MNaOH溶液使pH達(dá)到3.8i.溶液取樣作電導(dǎo)率和pH測(cè)定j.通過(guò)0.2微米過(guò)濾器過(guò)濾溶液6.1本體預(yù)配制本體預(yù)配制和組成的總體方案見(jiàn)圖8和表20所示。以下詳述該預(yù)配制過(guò)程。SEC-EL經(jīng)OD280定量測(cè)定濃度為1.31mg/ml。第一階段(用不同緩沖液以1∶1w/w稀釋SEC-EL2)6.2.1用155gSAB、164.4mg/ml賴(lài)氨酸以1∶1(w/w)稀釋155gSEC-EL6.2.2用78gSAB、63.2mg/ml精氨酸以1∶1(w/w)稀釋78gSEC-EL6.2.3用220gSAB、600mM甘露醇、0.24mg/ml甲硫氨酸以1∶1(w/w)稀釋220gSEC-EL6.2.4用306gSAB稀釋189gSEC-EL以制備含有0.50-mg/mlr-hIFN-β1a的溶液。過(guò)濾后將該溶液分入250ml試管和2mlnunc試管中，-70℃或2-8℃貯存，用于2-8℃運(yùn)送的250ml試管裝滿(mǎn)至蓋。第二階段(最終的本體稀釋至0.50-0.58mg/mlr-hIFN-β1a)制備以下溶液(目的濃度為0.5mg/mlr-hIFN-β1a)6.2.5用90gSAB、82.4mg/ml賴(lài)氨酸稀釋310g6.2.1中制備的溶液。6.2.6用48gSAB、31.6mg/ml精氨酸稀釋156g6.2.2中制備的溶液。6.2.7用132gSAB、300mM甘露醇，0.12mg/ml甲硫氨酸稀釋440g6.2.3中制備的溶液。6.2.8過(guò)濾后，將這3種溶液(6.2.5-6.2.7)分入250ml試管和2ml試管(含有2ml本體)。6.2.9將含有賴(lài)氨酸和精氨酸溶液的250ml試管和2ml試管-70℃凍存，含甘露醇和甲硫氨酸的溶液2-8℃貯存(250ml試管裝滿(mǎn)至蓋)6.3預(yù)配制的本體的處理用速度超速離心、Deg/OxHPLC和SE-HPLC測(cè)定-70℃和2-8℃貯存的樣品。7.0結(jié)果表218.0觀(guān)察本研究中用速度超離心和SEC方法證實(shí)了實(shí)施例2獲得的結(jié)果(單體水平％的差異可能是由于SEC只能檢測(cè)到共價(jià)寡聚體而致)。另外，DEG/OXHPLC顯示在本體r-hIFN-β1a中加入輔料后，氧化形式的水平保持穩(wěn)定。實(shí)施例4在過(guò)濾步驟前后在本體干擾素中加入輔料穩(wěn)定干擾素-β1.0詞匯表/縮寫(xiě)Agg凝聚體COA分析驗(yàn)證.Dim二聚體Deg降解物Deg/Ox-HPLC測(cè)定降解物和氧化形式的反相高效液相色譜F/T冷凍和解凍Quant-HPLC定量測(cè)定r-hIFN-β1a本體中r-IFNβ量的反相高效液相色譜r-hIFN-β1aCHO細(xì)胞產(chǎn)生的重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a)r-hIFN-βFDF重組人IFN-β1a的最終劑型(r-hIFN-βFDF)SE-HPLC分子大小排阻高效液相色譜Temp溫度2.0小結(jié)采用SE-HPLC和速度超離心方法顯示在本體過(guò)濾之前或之后加入300mM甘露醇(冷凍前)預(yù)配制IFN-β-1a本體，經(jīng)1輪F/T和4輪F/T循環(huán)，共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體減到最少。過(guò)濾前加入300mM甘露醇更顯著地降低了寡聚化水平，尤其是在250ml試管(盛放r-hIFN-β1a本體的常規(guī)容器)中的非共價(jià)寡聚體和凝聚體。采用SE-HPLC和速度超離心方法顯示2-8℃貯存的未冷凍的r-hIFN-β1a本體中不形成寡聚體，但在r-hIFN-β1a本體冷凍和解凍過(guò)程中形成寡聚體。3.0介紹最大程度程度減少冷凍解凍循環(huán)中r-hIFN-β1a的寡聚和凝聚是所需的目標(biāo)，因?yàn)檎J(rèn)為蛋白質(zhì)凝聚可引起免疫反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生中和抗體。目前用于測(cè)定本體中單體水平的分析方法是SE-HPLC。采用速度超離心得到的初步結(jié)果似乎表明，SE-HPLC只能檢測(cè)到共價(jià)寡聚體而速度超速離心還可定性和定量檢測(cè)非共價(jià)寡聚體(見(jiàn)實(shí)施例2)。此項(xiàng)研究采用SE-HPLC和速度超離心作為分析方法，來(lái)測(cè)定以生產(chǎn)規(guī)模用甘露醇預(yù)配制本體對(duì)r-hIFN-β1a寡聚和凝聚的影響。4.1目的/范圍4.1.1測(cè)定SEC組分中(過(guò)濾前和冷凍前)是否有非共價(jià)凝聚體。4.1.2測(cè)定在本體過(guò)濾前或后、冷凍前加入300mM甘露醇，經(jīng)1輪或4輪F/T循環(huán)后是否能將共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體減至最少。4.1.3測(cè)定在本體過(guò)濾前、冷凍前加入150mM甘露醇，經(jīng)1輪或4輪F/T循環(huán)后是否能將共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體減至最少。4.1.4測(cè)定在F/T循環(huán)后，1.8ml測(cè)試試管中的非共價(jià)凝聚體水平是否與250ml試管的水平相似。5.0設(shè)備和材料5.1設(shè)備0.2μl50-500ml過(guò)濾裝置Nalgene5.2材料SECel2組分-800ml甘露醇-MerckP/N1.05980.905050mM、pH3.8醋酸鹽緩沖液-IPL編號(hào)S88RD60050mM、pH3.8、含300mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(54.6g甘露醇/升)50mM、pH3.8、含600mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(109.3g甘露醇/升)50mM、pH3.8、含150mM甘露醇的醋酸鹽緩沖液(27.3g甘露醇/升)250ml錐形離心管-CorningP/N4307761.8ml冷凍管-Nunc試管P/N3754186.0步驟進(jìn)行SECel2組分的研究。(濃度為1.81mg/ml，根據(jù)OD280)6.1本體制備如下制備本體(1)SECel2組分將裝滿(mǎn)的1.8ml試管速度超離心，在2-8℃運(yùn)送。(2)對(duì)照將180mlSECel2組分通過(guò)0.2μm過(guò)濾裝置過(guò)濾，然后用720ml50mM、pH-3.8的醋酸鹽溶液洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個(gè)250ml試管(每個(gè)200ml)和10個(gè)1.8ml冷凍管中。其中兩個(gè)1.8ml試管不冷凍。將這兩個(gè)裝滿(mǎn)的試管的其中一個(gè)在速度超離心分析前保存在2-8℃。本體濃度為350μg/ml(根據(jù)quant-HPLC)。(3)過(guò)濾后加入300mM的甘露醇將180mlSECel2組分通過(guò)0.2μm濾器過(guò)濾，然后用180ml的50mM醋酸鹽、600mM甘露醇pH-3.8和540ml的50mM醋酸鹽、300mM甘露醇、pH-3.8洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個(gè)250ml試管(每個(gè)200ml)和10個(gè)1.8ml冷凍管中。其中兩個(gè)1.8ml試管不冷凍。將這兩個(gè)裝滿(mǎn)的試管的其中一個(gè)在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為300mM。該本體的濃度為344μg/ml(根據(jù)quant-HPLC)。(4)過(guò)濾前加入150mM的甘露醇將200mlSECel2與200ml50mM醋酸鹽、300mM甘露醇溶液混合。將380ml此混合液通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾，然后用570ml50mM醋酸鹽、150mM甘露醇、pH-3.8洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個(gè)250ml試管(每個(gè)200ml)和10個(gè)1.8ml冷凍管中。其中兩個(gè)1.8ml試管不冷凍。將這兩個(gè)裝滿(mǎn)的試管的其中一個(gè)在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為150mM。該本體的濃度為342μg/ml(根據(jù)quant-HPLC)。(5)過(guò)濾前加入300mM甘露醇將200mlSECel2與200ml50mM醋酸鹽、600mM甘露醇溶液混合。將380ml此混合液通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾，然后用400ml50mM醋酸鹽、300mM甘露醇洗滌濾器。-70℃冷凍前，將該本體分入4個(gè)250ml試管(每個(gè)200ml)和10個(gè)1.8ml冷凍管中。其中兩個(gè)1.8ml試管不冷凍。將這兩個(gè)裝滿(mǎn)的試管的其中一個(gè)在速度超離心分析前保存在2-8℃。甘露醇最終濃度為300mM。該本體的濃度為342μg/ml(根據(jù)quant-HPLC)。注意通過(guò)有4個(gè)電控制的閥門(mén)的系統(tǒng)，將SEC柱洗脫液平行收集在4個(gè)1升玻璃瓶中，該電控制閥門(mén)每隔5分鐘交替打開(kāi)(由LCC500控制器控制)。在SEC-EL2組分過(guò)濾前加入甘露醇時(shí)，從SEC柱上洗脫時(shí)，在在線(xiàn)玻璃瓶中(glassbottleonline)輕輕混合SEC組分和甘露醇溶液(4)或(5)。在SEC過(guò)濾后加入甘露醇時(shí)(3)，加入甘露醇并通過(guò)同一過(guò)濾裝置過(guò)濾，但在SECEL-2組分之后。6.2冷凍和解凍將250ml試管冷凍至少8個(gè)小時(shí)、室溫解凍7小時(shí)，進(jìn)行4輪F/T循環(huán)，。然后每輪解凍循環(huán)后25次顛倒混合試管內(nèi)容物。將1.8ml試管冷凍至少8小時(shí)和解凍2個(gè)小時(shí)，進(jìn)行4輪F/T循環(huán)。在下輪冷凍循環(huán)前20次顛倒混合試管內(nèi)容物。對(duì)每種本體條件(2-5)，保存經(jīng)1輪F/T循環(huán)和4輪F/T循環(huán)的2個(gè)冷凍250ml試管和2個(gè)1.8ml試管作速度超離心分析。每種本體條件的其他兩個(gè)250ml試管和1.8ml試管解凍，用SEC-HPLC測(cè)試。對(duì)解凍24±2小時(shí)的樣品進(jìn)行SE-HPLC試驗(yàn)和速度超離心。先使甘露醇溶解。表22各批SEC/本體批次測(cè)試樣品列表注括號(hào)中的數(shù)字指總體方案。7.0結(jié)果7.1采用SE-HPLC方法，經(jīng)1輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件(3、4和5)下用甘露醇預(yù)配制對(duì)降低1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平有輕度影響。(與對(duì)照樣品相比純度高～0.4％)。采用超離心方法，經(jīng)1輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件(3、4和5)下甘露醇對(duì)1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平都有顯著作用。在250ml試管中(表25)，與過(guò)濾后加入300mM甘露醇(條件3)相比，過(guò)濾前加入300mM甘露醇(條件5)對(duì)降低寡聚化有更積極(positive)的作用。7.2采用SE-HPLC方法，經(jīng)4輪F/T循環(huán)后(表26)，在所有3種條件下(3、4和5)甘露醇對(duì)1.8ml試管中的寡聚化水平都有顯著作用(與對(duì)照樣品相比，當(dāng)用300mM甘露醇預(yù)配制時(shí)純度提高～2.6％)采用超離心，經(jīng)4輪F/T循環(huán)后，在所有3種條件下(3、4和5)甘露醇對(duì)1.8ml試管和250ml試管中的寡聚化水平具有顯著作用。然而，在1.8ml試管中這種積極作用更顯著。7.3用SE-HPLC和超離心二方法(表23)測(cè)定，2-8℃貯存樣品(未冷凍)中未測(cè)到寡聚化。7.4根據(jù)SE-HPLC和超離心結(jié)果，250ml試管的寡聚化水平顯著高于1.8ml試管。注意表23-27的括號(hào)中結(jié)果是指凝聚體％。表232-8℃貯藏的1.8ml試管中本體純度％表241輪F/T循環(huán)后1.8ml試管中本體純度％表251輪F/T循環(huán)后250ml試管中的本體純度％樣品取自同一250ml試管表264輪F/T循環(huán)后1.8ml試管中的本體純度％*樣品取自不同的1.8ml試管。表274輪F/T循環(huán)后250ml試管中的本體純度％*樣品取自一個(gè)試管。8.0結(jié)論8.1采用SE-HPLC和速度超離心兩種方法，當(dāng)在本體過(guò)濾之前或之后加入300mM甘露醇(冷凍前)預(yù)配制r-hIFN-β1a本體時(shí)，經(jīng)1輪F/T和4輪F/T循環(huán)后，共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體減至最少。然而，過(guò)濾前加入300mM甘露醇更顯著地降低了寡聚化水平，特別是250ml試管(IFN-β-1a本體的常規(guī)容器)中的非共價(jià)寡聚體和凝聚體。用甘露醇預(yù)配制本體，經(jīng)F/T循環(huán)后，對(duì)r-hIFN-β1a寡聚和凝聚的影響在1.8ml試管中與250ml試管中相似(與對(duì)照樣品相比，用SE-HPLC測(cè)定純度提高約0.4％，而用速度超離心測(cè)定提高約13％)。8.2在本體過(guò)濾前，冷凍前加入150mM濃度的甘露醇，經(jīng)1輪F/T循環(huán)和4輪F/T循環(huán)后，減少了共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體，但是這種作用不如300mM那樣顯著。8.3SE-HPLC和速度超離心二種方法顯示，在2-8℃貯藏的、未冷凍的r-hIFN-β1a本體和SEC-EL無(wú)寡聚體形成，但在r-hIFN-β1a本體冷凍和解凍過(guò)程中形成寡聚體。8.4速度超離心得到的初步結(jié)果似乎表明，SE-HPLC(與NEWSEC相反)只能檢測(cè)出共價(jià)寡聚體而速度超離心還可定性和定量檢測(cè)非共價(jià)寡聚體。未經(jīng)F/T循環(huán)的4℃(或2-8℃)貯藏的樣品非常穩(wěn)定(根據(jù)％單體含量)。不希望受理論的束縛，據(jù)信應(yīng)力，如冷凍/解凍循環(huán)對(duì)于分子的作用，均會(huì)增加干擾素-β寡聚體的形成。4℃貯存的樣品中，最好的結(jié)果是聯(lián)用甘露醇和甲硫氨酸和最后補(bǔ)加苯甲醇或Tween20時(shí)獲得的，顯示樣品2-8℃貯存沒(méi)有寡聚化。優(yōu)選本發(fā)明方法聯(lián)用甘露醇和甲硫氨酸作為穩(wěn)定劑，還可加入苯甲醇或Tween20。單單賴(lài)氨酸或其任何組合也是可采用的優(yōu)選輔料。一些輔料顯示具有穩(wěn)定活性可對(duì)抗F/T循環(huán)所產(chǎn)生的應(yīng)力，即Tween20、苯甲醇或賴(lài)氨酸(即，已證明這些輔料能抵消冷凍/解凍應(yīng)力)。如果制備過(guò)程包括冷凍/解凍循環(huán)，宜將優(yōu)選的輔料，如Tween20、苯甲醇或賴(lài)氨酸加入到本體溶液中。因此，當(dāng)制備過(guò)程包括F/T循環(huán)時(shí)，也鑒定了優(yōu)選的輔料及其組合。本發(fā)明-20℃貯存的樣品經(jīng)多輪F/T循環(huán)(試管先-70℃冷凍然后再轉(zhuǎn)移到第二個(gè)冷凍罐中-20℃貯存16天。然后樣品在解凍前移回-70℃貯存4小時(shí)。)。根據(jù)以上所述，當(dāng)經(jīng)歷應(yīng)力如F/T循環(huán)時(shí)，優(yōu)選采用Tween20、苯甲醇和賴(lài)氨酸作穩(wěn)定劑。因此，在任何貯存溫度(-70℃，-20℃或4℃)和存在F/T循環(huán)應(yīng)力時(shí)，Tween20、賴(lài)氨酸和苯甲醇單獨(dú)或聯(lián)用是本體干擾素溶液中的優(yōu)選輔料。以下組合尤其優(yōu)選1.賴(lài)氨酸和苯甲醇2.賴(lài)氨酸和Tween203.賴(lài)氨酸和苯甲醇和Tween20，和4.苯甲醇和Tween20以下實(shí)施方案是在任何貯存溫度(-70℃、-20℃或4℃)下和在F/T循環(huán)應(yīng)力存在時(shí)最優(yōu)選的實(shí)施方案。就單體％和凝聚體％而言，在-20℃以及4℃和-70℃時(shí)賴(lài)氨酸產(chǎn)生了很好的結(jié)果。賴(lài)氨酸是經(jīng)測(cè)試的唯一能夠抵抗冷凍/解凍應(yīng)力而穩(wěn)定干擾素-β的氨基酸。因此，賴(lài)氨酸是最優(yōu)選的抗F/T循環(huán)應(yīng)力的輔料，避免了對(duì)抗菌劑(如苯甲醇)或表面活性劑(如Tween20)的需要，它們是顯示了抗F/T應(yīng)力的穩(wěn)定活性的另外兩種輔料。因此，可考慮預(yù)制劑中只包含賴(lài)氨酸或賴(lài)氨酸與抗氧化劑(如甲硫氨酸)的組合。-20℃時(shí)的最好結(jié)果事實(shí)上是由賴(lài)氨酸和甲硫氨酸組合而獲得的。更優(yōu)選本發(fā)明采用賴(lài)氨酸和甲硫氨酸的組合。甘露醇、甲硫氨酸和Tween20的組合獲得了高水平的單體百分比(98.12％單體)。苯甲醇和甲硫氨酸的組合產(chǎn)生了很高的單體百分比(～98％單體)。因此，苯甲醇和甲硫氨酸的組合是優(yōu)選的。也可將Tween20加入到這種組合中，產(chǎn)生更高的單體百分比(～99％)。因此，更優(yōu)選苯甲醇、甲硫氨酸和Tween20的組合。在整個(gè)制備過(guò)程中的兩個(gè)特定步驟中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。在過(guò)濾前或后加入某種輔料(如甘露醇)能降低和/或減少寡聚體和凝聚體的形成。采用SE-HPLC和速度超離心法，在本體過(guò)濾前或后加入300mM甘露醇(冷凍前)預(yù)配制r-hIFN-β1a本體，經(jīng)1輪F/T循環(huán)或4輪F/T循環(huán)后，共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體降至最低。本發(fā)明因此不應(yīng)只限于本體蛋白質(zhì)制備過(guò)程中某一特定步驟，而可包括預(yù)配制的本體蛋白質(zhì)的制備和/或貯存所需要的所有步驟(即，可在本體處理的多個(gè)不同步驟中加入穩(wěn)定性輔料)。結(jié)果顯示就寡聚和凝聚而言沒(méi)有很大的不同，但在過(guò)濾前加入甘露醇會(huì)產(chǎn)生更好的結(jié)果，特別是對(duì)于250ml試管中的非共價(jià)寡聚體和凝聚體。因此優(yōu)選在過(guò)濾步驟前加入甘露醇。最后，上述實(shí)驗(yàn)顯示與分別使用時(shí)獲得的水平相比，某些輔料與熱解聚相組合可產(chǎn)生更高水平的單體百分比。通過(guò)此方法，二聚體和凝聚體的水平顯著減少。因此，本發(fā)明優(yōu)選將通過(guò)加入輔料而穩(wěn)定的本體溶液與熱解聚相結(jié)合。熱解聚步驟可在生產(chǎn)過(guò)程的任何階段實(shí)施，不應(yīng)限于本體處理過(guò)程的某一特定步驟。實(shí)施例5pH4.7的預(yù)制劑研究為評(píng)價(jià)pH對(duì)寡聚體和凝聚體形成的影響，在pH4.7進(jìn)行了預(yù)配制研究。(1)步驟1.通過(guò)1∶1混合(1體積的SECE12組分與1體積的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)的醋酸鹽溶液混合)，預(yù)配制pH為4.7的約0.5mg/ml的第一種本體。2.通過(guò)1∶1混合(1體積的SECE12組分與1體積的50mM、pH7.2(用NaOH滴定)、含164.4mg/ml賴(lài)氨酸的醋酸鹽溶液混合)，預(yù)配制pH為4.7的含82.2mg/ml賴(lài)氨酸的第二種本體。3.將這些制劑與用50mM、pH3.8醋酸鹽配的0.5mg/ml對(duì)照和用50mM、pH3.9、含82.2mg/ml賴(lài)氨酸的醋酸鹽預(yù)配制的對(duì)照作比較。4.在1.8ml試管中經(jīng)一輪冷凍解凍循環(huán)后，用新型SEC-HPLC方法檢測(cè)樣品。結(jié)果表28(2)結(jié)論·與pH3.8時(shí)相比，pH4.7的預(yù)制劑降低了寡聚體和凝聚體的形成(分別為～99％單體比～81％單體，0％凝聚體比0.67％凝聚體)。因此，本發(fā)明的方法宜在pH4.7實(shí)施?！ず?lài)氨酸的pH3.9或pH4.7的預(yù)制劑寡聚化減少。在pH4.7時(shí)，加入賴(lài)氨酸產(chǎn)生了99.6％的單體，而不加入賴(lài)氨酸產(chǎn)生99.1％的單體。在pH3.8時(shí)，加入賴(lài)氨酸對(duì)減少寡聚有顯著作用，產(chǎn)生99.7％的單體，與之相比不加賴(lài)氨酸的單體為81.41％。因此，在本發(fā)明中方法中賴(lài)氨酸是優(yōu)選加入的氨基酸?！げ捎胮H4.7預(yù)配制和賴(lài)氨酸相組合產(chǎn)生了最好的結(jié)果。因此，本發(fā)明的方法最優(yōu)選采用pH4.7和加入賴(lài)氨酸作為輔料。因此在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可在pH4.7的本體干擾素中加入優(yōu)選輔料，并結(jié)合熱解聚。實(shí)施例6-分析方法本實(shí)施例描述采用的不同分析方法。采用分子大小排阻(SE)-HPLC、新SE-HPLC本文也稱(chēng)為“新型SE-HPLC”或“NEWSEC”，和速度超離心(AUC)檢測(cè)重組人干擾素-β1a(r-hIFN-β1a或r-hβIFN-1a)中的凝聚體和寡聚體水平。所述NEWSE-HPLC和AUC方法能定性和定量檢測(cè)共價(jià)和非共價(jià)寡聚體和凝聚體。a.SE-HPLC-純度測(cè)試用SE-HPLC測(cè)定IFN-β-1a本體中凝聚體的數(shù)量。步驟分析100μl待測(cè)IFN-β-1a本體樣品和對(duì)照樣品(PRB)。制備以下溶液30％ACN(乙腈)/0.2％TFA(三氟乙酸)/H2O。層析柱(Progel-TSKG2000或等同物)用洗脫液平衡，流速為0.5ml/min，至少1小時(shí)。一旦獲得穩(wěn)定的基線(xiàn)，注入100μl樣品液，以0.5ml/min流速用等梯度液洗脫。用214nmUV檢測(cè)記錄柱洗脫圖。本體樣品中IFN-β-1a單體的百分比由蛋白質(zhì)峰整合面積來(lái)測(cè)定。說(shuō)明IFN-β-1a本體樣品的主峰面積(對(duì)應(yīng)完整分子)占總峰面積的比例不少于95％，含有不多于1％的凝聚體。冷凍/解凍循環(huán)(F/T)對(duì)照樣品的SE-HPLC測(cè)試步驟1.從-70℃的冰箱中取出需要量的重組人干擾素-β1a本體/批(batch)。2.大試管(～200ml)室溫解凍6-9小時(shí)，小試管/安瓿(1-15ml)2-4小時(shí)。(第一輪冷凍/解凍循環(huán))3.按以上本體所需量分成1ml等份(大試管)。4.-70℃冷凍各等份至少2個(gè)小時(shí)。5.再重復(fù)步驟2和步驟4三次。6.在第四輪解凍循環(huán)后，將少量對(duì)照樣品用稀釋緩沖液稀釋到0.25mg/ml作檢查。7.各等份應(yīng)-70℃貯存。8.在進(jìn)行SE-HPLC試驗(yàn)之前，將對(duì)照F/T各等份試管室溫解凍2小時(shí)。b.NEWSE-HPLC在TSKG2000SWXL柱(TosoHaas)或BioSuite柱(Waters)中檢測(cè)凝聚體的總含量；用50mM醋酸鹽緩沖液、50mM、pH3.8NaCl，以0.5mL/min流速進(jìn)行等梯度模式洗脫；波長(zhǎng)設(shè)定在215nm。運(yùn)行時(shí)間30分鐘。將重組人干擾素-β1a本體(0.35mg/ml)注入到處于飽和相的柱子中(每次注入0.2ml)。·NewSE-HPLC方法的儀器和材料HPLC系統(tǒng)WatersAllianceUV檢測(cè)儀Waters996PDA波長(zhǎng)214nm自動(dòng)取樣器溫度設(shè)定4℃·TosoHaasTSKG2000SWXL色譜柱柱溫室溫流動(dòng)相含50mMNaCl的50mM、pH3.8醋酸鹽溶液制備方法取5.84gNaCl溶于2升50mM、pH3.8醋酸鹽緩沖液中。在無(wú)菌溶液操作單元中將醋酸加入到WFI中，用10MNaOH滴定至pH-3.8制備該醋酸鹽緩沖液。流速0.5ml/min洗脫液50mMCH3COONa-50mMNaCl、pH3.8激活液50mMHCl-50mMNaCl·試劑醋酸鹽，Merck編號(hào)K31358056NaOH，MerckB19758210MNaOH溶液WFINaCl，JTBAKER編號(hào)3627-07C.沉降速度分析-AUC1.方法描述將樣品液加載到含2通道-木炭環(huán)氧樹(shù)脂中間體(2-channelcharcoal-eponcentrepieces)帶有12mm光通路的加樣小室中。用洗滌劑清洗該中間體和蘭寶石窗口，然后在水中浸泡以盡可能得到最清潔的表面。將對(duì)應(yīng)的安慰劑加載到參比通道中(該儀器的功能類(lèi)似于雙光束分光光度計(jì))。然后將那些已加樣的小室放入AN-50Ti分析型轉(zhuǎn)頭中，裝入BeckmanOptimaXL-I分析離心機(jī)中，20℃。轉(zhuǎn)頭加速到3000rpm時(shí)，掃描樣品(280nm吸收峰)，以證實(shí)加樣小室載量合適。然后將轉(zhuǎn)頭加速至最終轉(zhuǎn)速50000rpm。記錄各樣品在此轉(zhuǎn)速時(shí)的50次掃描結(jié)果。用PeterSchuck在N.I.H(國(guó)立衛(wèi)生研究院)開(kāi)發(fā)的和在他的分析程序SEDFIT中實(shí)施的c(s)方法(8.7版；Schuck，P.(2000).用沉降速度超離心和Lamm方程模型進(jìn)行大分子的大小分布分析(Size-distributionanalysisofmacromoleculesbysedimentationvelocityultracentrifugationandLammequationmodelling).Biophys.J.78，1606-1619)分析數(shù)據(jù)。在此方法中，直接擬合許多原始數(shù)據(jù)產(chǎn)生沉降系數(shù)分布曲線(xiàn)，同時(shí)模擬擴(kuò)散對(duì)數(shù)據(jù)的影響以增強(qiáng)解析?；谒械奈镔|(zhì)具有相同的總體流體動(dòng)力學(xué)形狀(overallhydrodynamicshape)(由相對(duì)于球體摩擦系數(shù)的摩擦系數(shù)比值f/f0定義所述形狀)的假設(shè)，該方法通過(guò)為各沉降系數(shù)值賦予一個(gè)擴(kuò)散系數(shù)來(lái)發(fā)揮作用。然后改變f/f0值以發(fā)現(xiàn)各樣品數(shù)據(jù)的最佳總體擬合值。用0.51最大熵校平法(maximum-entropysmoothing)計(jì)算分布。2.分析參數(shù)—轉(zhuǎn)頭類(lèi)型8孔轉(zhuǎn)子—轉(zhuǎn)速50krpm—中間體木炭環(huán)氧樹(shù)脂—通道長(zhǎng)度12mm—AUC運(yùn)行溫度20℃—檢測(cè)波長(zhǎng)280nm—樣品體積432mcl—參比體積442mcl3.設(shè)備和軟件分析型超速離心機(jī)XL-I型(BeckmanCoulter)SEDFITver8.70b軟件(PeterSchuck-國(guó)立衛(wèi)生研究院)Originver6.03軟件(BeckmanCoulter)ProteomeLabXL-A/XL-Iver5.0軟件(BeckmanCoulter)d.用RP-HPLC-QUANT-HPLC定量測(cè)定IFN-β-1a下述反相色譜法可用來(lái)定量測(cè)定本體樣品中的IFN-β-1a。在C4，5μm大孔丁基柱(Wide-PoreButyl)(Baker)中進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測(cè)定；波長(zhǎng)設(shè)定為214nm，用以下流動(dòng)相和梯度液以1mL/min流速進(jìn)行洗脫。步驟用50mM、pH3.8醋酸鈉緩沖液稀釋待測(cè)的IFN-β-1a樣品至濃度50-150μg/ml之間。制備以下溶液洗脫液A0.1％TFA水溶液(水/三氟乙酸0.1％)洗脫液B0.1％TFA乙腈溶液(乙腈/三氟乙酸0.1％)洗脫液CACN(乙腈)先用洗脫液C以1.0ml/min流速洗滌C4RP-HPLC柱30分鐘，然后用50％水和50％ACN洗滌15分鐘。用70％洗脫液A和30％的洗脫液B以約1.0ml/min流速平衡此柱15分鐘。一旦得到穩(wěn)定的基線(xiàn)，將IFN-β-1a本體樣品、對(duì)照樣品和校準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品(PRB，1.24-19.8μg)依次注入。每種注入100μl，除了1.24μg校準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品注入20μl外。流速保持在1.0ml/min。采用以下梯度液表29運(yùn)行時(shí)間＝65分鐘由校準(zhǔn)曲線(xiàn)面積的對(duì)數(shù)回歸曲線(xiàn)計(jì)算得到所測(cè)樣品中IFN-β-1a的量。說(shuō)明IFN-β-1a本體含有0.280-0.500mg/ml的IFN-β-1a。e.用反相(RP)-HPLC-DEG/OX測(cè)定純度下述反相方法能檢測(cè)IFN-β-1a的氧化形式，所述氧化形式在洗脫時(shí)與完整分子不同。該氧化形式的定量測(cè)定在40℃恒溫C4，SupelcosilLC-304柱(Supelco)中進(jìn)行；波長(zhǎng)被設(shè)定為208nm，用以下流動(dòng)相和梯度液洗脫，流速1mL/min制備以下溶液洗脫液A60％水/40％ACN/0.14％HFBA(水60％/乙腈40％/七氟丁酸酐(Heptafluorobutirricacid)0.14％)洗脫液B20％水/80％ACN/0.14％HFBA(水20％/乙腈80％/七氟丁酸酐0.14％)洗脫液C20％水/80％ACN/0.1％TFA(水20％/乙腈80％/三氟乙酸0.1％)用70％洗脫液A和30％洗脫液B以1ml/min流速平衡C4RP-HPLC柱至少15分鐘(直至獲得穩(wěn)定基線(xiàn))。注入120μl樣品。用50mM、pH3.8醋酸鈉溶液稀釋待測(cè)樣品至濃度0.250-0.280mg/ml。采用以下梯度液表30利用蛋白質(zhì)峰整合面積計(jì)算IFN-β-1a本體樣品的純度百分比。說(shuō)明IFN-β-1a的主峰面積(對(duì)應(yīng)于完整分子)不低于總峰面積的95％。f.細(xì)胞病變效應(yīng)抑制生物學(xué)試驗(yàn)-CPE生物效能(抗病毒活性)用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)抑制生物學(xué)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定IFN-β-1a本體的抗病毒活性。用基于IFN-β誘導(dǎo)的保護(hù)細(xì)胞(WISH細(xì)胞-人羊膜組織)對(duì)抗病毒(水皰性口炎病毒)的細(xì)胞病變作用的抗病毒試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)生物學(xué)活性。干擾素的生物學(xué)試驗(yàn)的原理在于，一些病毒如水皰性口炎病毒(VSV)引起的細(xì)胞死亡可用活細(xì)胞染色方法觀(guān)測(cè)。繼而，細(xì)胞病變效應(yīng)可用于定量測(cè)定干擾素的細(xì)胞保護(hù)效果。該試驗(yàn)通過(guò)用活細(xì)胞攝取染料四唑鹽MTT(硫代二甲基四唑)的量進(jìn)行評(píng)估來(lái)間接測(cè)定細(xì)胞的死亡。該方法采用自動(dòng)化分光光度儀測(cè)定受保護(hù)細(xì)胞的百分比和三點(diǎn)平行線(xiàn)試驗(yàn)對(duì)滴度作統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。步驟在微量滴定板中進(jìn)行該試驗(yàn)。a.將50μl細(xì)胞培養(yǎng)液(MEM/5％FBS)加入到各孔中。b.將100μlIFN-β-1a樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液(60-100IUhIFN-β/ml)加入到各孔中，在板中逐行進(jìn)行3次1∶1.5分步稀釋。c.將50μlWISH細(xì)胞懸浮液(0.78-0.82×106細(xì)胞/ml)加入各孔中，在5％CO2濕度培育箱中37℃培育微孔板18-20小時(shí)。d.將VSV懸液加入各孔中，除細(xì)胞對(duì)照孔加入MEM/2.5％FBS外。e.在5％CO2濕度培育箱中37℃培育微孔板24個(gè)小時(shí)。f.用倒置顯微鏡驗(yàn)證以下情況(1)VSV對(duì)照行中至少80％細(xì)胞損傷，和(2)在IFN-β標(biāo)準(zhǔn)品存在時(shí)，未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品保護(hù)百分比平均值為84％；1∶1.5稀釋時(shí)為45％，而1∶3稀釋時(shí)為27％。然后用特異性染料MTT染色培養(yǎng)的細(xì)胞。g.用自動(dòng)化分光光度儀測(cè)定染色強(qiáng)度，讀取592nm值。h.用計(jì)算機(jī)程序(Colombo軟件)分析OD讀取值，定量測(cè)定IFN-β-1a的活性。說(shuō)明IFN-β-1a本體含量不少于50×106IU/ml。g.用電噴霧電離質(zhì)譜(ES-MS)法繪制糖圖譜(Carbohydratemapping)用四極質(zhì)譜儀對(duì)IFN-β-1a的糖部分(N-連接于Asn-80殘基)作完整分子的ES-MS分析。步驟該試驗(yàn)方法包括以下步驟(1)IFN-β-1a本體樣品脫鹽，(2)用四極質(zhì)譜儀作IFN-β-1a完整糖型類(lèi)別的ES-MS半定量分析。按照它們的預(yù)期分子量(21-24kDa，蛋白鏈分子量20kDa)，用ES-MS譜鑒定完整的糖型。然后，根據(jù)其唾液酸化水平(非唾液酸化、單唾液酸化、雙唾液酸化、三唾液酸化)將糖型分組，并根據(jù)它們的相對(duì)峰高度確定它們的相對(duì)豐度％。樣品脫鹽用乙腈/水/醋酸(40/60/1，v/v)室溫透析((Microcon10裝置，Amicon，或等同裝置)給約35μgIFN-β-1a樣品(對(duì)照IFN-β-1a樣品和本體測(cè)試樣品)脫鹽(最終濃度為每毫升約150μgIFN-β-1a)ES-MS分析在MicromassPlatformLCZ單一四極質(zhì)譜儀(或等同儀器)中進(jìn)行陽(yáng)離子ES-MS分析，用一套灌注泵使脫鹽的樣品直接流入電噴射源，流速約6-10μl/min。用m/z600-2400Da范圍的肌紅蛋白校準(zhǔn)該質(zhì)譜儀，用以下設(shè)定運(yùn)行質(zhì)譜儀毛細(xì)管電壓2.5-4.0KV錐電壓36V電噴源溫度70-100℃以約10秒/掃描的典型掃描速度，掃描600Da-2400Da(肌紅蛋白)和1100-2400Da(IFN-β-1a)獲得質(zhì)譜結(jié)果。多電荷離子的質(zhì)譜處理和去卷積用MassLynx軟件(或等同軟件)完成。ES-MS結(jié)果的解釋代表性去卷積的ES-MS譜顯示MS峰(A-F)代表不同糖型，可根據(jù)其唾液酸化程度將這些糖型分為4個(gè)主要的糖型組，見(jiàn)下表34所示。表31在IFNβ1a的ES-MS譜中觀(guān)察到的糖型*2A＝雙觸(Biantennary)復(fù)合型低聚糖；3A＝三觸(Triantennary)復(fù)合型低聚糖；4A＝四觸(Tetrantennary)復(fù)合型低聚糖；0S＝非唾液酸化；2S＝雙唾液酸化，3S＝三唾液酸化，1F＝巖藻糖基化的(Fucosylated)。如下進(jìn)行4種主要糖型每種的半定量評(píng)估·非唾液酸化糖型百分比F峰高度/總峰高度×100·單唾液酸化糖型百分比B峰高度/總峰高度×100·雙唾液酸化糖型百分比(A+C)峰高度/總峰高度×100·三唾液酸化糖型百分比(D+E)峰度/總峰高度×100總峰高度為A-F所有峰高之和。請(qǐng)注意對(duì)應(yīng)于缺失末端甲硫氨酸的N-末端截短的(2-166aa)2A2S1FIFN-β-1a的約22244Da處未標(biāo)記的MS峰(圖SPA-1)，在IFN-β-1a雙唾液酸化糖型百分比計(jì)算中沒(méi)有考慮，通過(guò)獨(dú)立的本體純度釋放試驗(yàn)(N-末端截短，N-1NMT6％)來(lái)控制這種雜質(zhì)的水平。說(shuō)明質(zhì)譜與預(yù)期的IFN-β-1a分布圖(峰高百分比)相一致非唾液酸化糖型不多于5％單唾液酸化糖型6-30％雙唾液酸化糖型56-81％三唾液酸化糖型8-16％h.等電聚焦-IEF用等電聚焦分離IFN-β-1a的同工型，考馬斯亮藍(lán)染色觀(guān)察。然后將同工型的pl值與PRB的pl值作比較。用密度法(densitometry)測(cè)定糖型的面積和pl值。步驟樣品制備將IFN-β-1a樣品用微量離心裝置濃縮至0.7-1.0mg/ml。凝膠制備和等電聚焦制備5％IEF丙烯酰胺凝膠，澆鑄后洗滌除去所有未聚合的丙烯酰胺。然后用兩性電解質(zhì)(最終2％，pH3-10)、10mM谷氨酸、10mM賴(lài)氨酸和3％甘油重建，置入水平電泳裝置中冷卻至15℃。在存在CO2捕獲劑(0.1MNaOH)的氮?dú)饬飨拢?W功率將凝膠預(yù)先聚焦60分鐘。將約3.5μg本體IFN-β-1a、6μg細(xì)胞色素C和合適的pI標(biāo)準(zhǔn)液逐滴(5μl)滴加到凝膠表面。10℃，8000V-小時(shí)聚焦IEF凝膠。用20％(w/v)TCA固定凝膠30-35分鐘，然后用Neuhoff等人所述的膠凝程序以考馬斯亮藍(lán)染色(Neuhoff，V.，Arold，N.，Taube，D.，Ehrhardt，W.，采用考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250改進(jìn)聚丙烯酰凝膠蛋白質(zhì)的染色，包括等電聚焦產(chǎn)生具有清晰背景的凝膠，納克級(jí)靈敏度(ImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueG-250andR-250)，Electrophoresis，19889255-262)。用自動(dòng)化密度計(jì)(ComputingDensitometer，MolecularDynamics，USA，配備ImageQuant3.3程序和其它整合/計(jì)算結(jié)果所需要的專(zhuān)門(mén)化軟件；或等同裝備)定量測(cè)定IFN-β-1a同工型和pl值。說(shuō)明測(cè)試樣品獲得的電泳圖與參比標(biāo)準(zhǔn)品(referencehousestandard)獲得的類(lèi)似1.所得到的電泳圖由3組主要條帶組成，共含有5-10條電泳帶(不包括進(jìn)樣點(diǎn)處的條帶)，與用參比標(biāo)準(zhǔn)品得到的帶型一致。2.用密度法測(cè)定的5條主要條帶，應(yīng)屬于表32所示的組中。表32-等電聚焦，同工型的說(shuō)明參考文獻(xiàn)1.DerynkR.等，Nature1980；285，542-547。2.Familletti，P.C.，Rubinstein，S.，和Pestka，S.1981“一種干擾素的方便快速細(xì)胞病變作用抑制試驗(yàn)”，MethodsinEnzymology，Vol.78(S.Pestka，編寫(xiě).)，AcademicPress，NewYork，387-394；3.MarkD.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81(18)5662-5666(1984)。4.Pestka，S.(1986)“干擾素的標(biāo)準(zhǔn)品和通用縮寫(xiě)”，MethodsinEnzymology(S.Pestka，編寫(xiě).)，AcademicPress，NewYork119，14-23。5.Rubinstein，S.，F(xiàn)amilletti，P.C.，和Pestka，S.方便的干擾素試驗(yàn)，J.Virol1981；37，755-758。6.ShepardH.M.等，Nature1981；294，563-565。權(quán)利要求1.一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法，所述方法包括如下步驟a)提供配制在緩沖溶液中的單體蛋白質(zhì)本體，和b)在所述本體中加入輔料，所述輔料選自i)抑菌劑ii)表面活性劑iii)等滲劑iv)氨基酸v)抗氧化劑vi)等滲劑和抗氧化劑vii)等滲劑、抗氧化劑和氨基酸viii)氨基酸和抗氧化劑ix)氨基酸、抗氧化劑和表面活性劑x)抑菌劑和抗氧化劑，和xi)抑菌劑、抗氧化劑和表面活性劑。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述單體蛋白質(zhì)為干擾素。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述干擾素為IFN-β。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述IFN-β是重組人IFN-β。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)相對(duì)于凝聚具有穩(wěn)定性。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)定相對(duì)于寡聚化具有穩(wěn)定性。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是Tween20。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇。10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴(lài)氨酸或精氨酸。11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑為甲硫氨酸。12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇、抗氧化劑為甲硫氨酸。13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述等滲劑為甘露醇、抗氧化劑為甲硫氨酸、氨基酸為賴(lài)氨酸。14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴(lài)氨酸、抗氧化劑為甲硫氨酸。15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸為賴(lài)氨酸、抗氧化劑為甲硫氨酸、表面活性劑為T(mén)ween20。16.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇、抗氧化劑為甲硫氨酸。17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑為苯甲醇、抗氧化劑為甲硫氨酸、表面活性劑為T(mén)ween20。18.如權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括在27℃-31℃溫度范圍內(nèi)培育所述本體蛋白質(zhì)的步驟。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述溫度為29℃。20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其特征在于，在權(quán)利要求1預(yù)配制步驟之前或之后進(jìn)行所述培育。21.如權(quán)利要求18、19或20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培育過(guò)程至少進(jìn)行3個(gè)小時(shí)。22.如權(quán)利要求18、19或20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培育過(guò)程進(jìn)行6-40個(gè)小時(shí)。23.如權(quán)利要求18、19或20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培育過(guò)程進(jìn)行15-30個(gè)小時(shí)。24.如權(quán)利要求18、19或20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培育過(guò)程進(jìn)行10、16、18.5或24小時(shí)。25.如權(quán)利要求18、19或20任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述培育過(guò)程進(jìn)行24小時(shí)。26.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述IFN的pH值保持在3.0-6.0范圍內(nèi)。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述pH值為4.7。28.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述IFN的濃度約為10μg/ml-2000μg/ml。29.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述IFN的濃度約為500μg/ml或約810μg/ml。30.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的濃度約為5mM-500mM。31.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述緩沖液的濃度約為10mM或約50mM。32.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述等滲劑的濃度約為0.5mg/ml-500mg/ml。33.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述等滲劑的濃度約為55mg/ml或約150mM、或約300mM、或約600mM。34.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Tween20的濃度約為0.01mg/ml-10mg/ml。35.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述Tween20的濃度約0.5mg/ml。36.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑的濃度約為0.01mg/ml-5.0mg/ml。37.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抗氧化劑的濃度約為0.12mg/ml或約0.24mg/ml。38.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的濃度約為20mg/ml-200mg/ml。39.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述賴(lài)氨酸的濃度約為27mg/ml，或約55mg/ml、或約82mg/ml、或約164mg/ml。40.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述精氨酸的濃度約為32mg/ml或約63mg/ml。41.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑的濃度約為0.01mg/ml-200mg/ml。42.如以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述抑菌劑的濃度約為5mg/ml或約10mg/ml。43.通過(guò)以上權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法獲得的預(yù)配制的本體蛋白質(zhì)。44.一種提高和/或保持單體蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，其特征在于，該方法包括權(quán)利要求1-42任何一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)本體預(yù)配制方法。全文摘要本發(fā)明描述了一種制備穩(wěn)定的單體蛋白質(zhì)本體溶液的方法，該方法包括提供配制在緩沖液中的單體蛋白質(zhì)本體和在該本體中加入輔料，所述輔料選自抑菌劑、表面活性劑、等滲劑、氨基酸、抗氧化劑及其組合。該單體蛋白質(zhì)優(yōu)選是IFN－β。文檔編號(hào)A61K47/00GK1993138SQ200580025660公開(kāi)日2007年7月4日申請(qǐng)日期2005年5月27日優(yōu)先權(quán)日2004年6月1日發(fā)明者A·賈比爾申請(qǐng)人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司