專利名稱：作為雙核酶強(qiáng)效抑制劑的二芳基烷烴的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體而言涉及對由雙核酶介導(dǎo)的疾病及病癥的預(yù)防和治療。具體而言，本發(fā)明包括抑制具有雙核活性部位的酶的活性的方法。本發(fā)明包括包含一種或更多種二芳基烷烴的新型組合物。本發(fā)明的二芳基烷烴可從一種或更多種植物來源分離，或者可通過有機(jī)合成獲得。本發(fā)明還包括從天然來源分離這些化合物的方法以及合成這些化合物的方法。在一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴是通過合成修飾從植物來源分離的天然存在的化合物得到的。
背景技術(shù)：
對可抑制或預(yù)防皮膚色素過度沉著的產(chǎn)品存在很大的需求。皮膚的天然色素黑素是在黑素體內(nèi)合成的含氮聚合物，黑素體是存在于黑素細(xì)胞內(nèi)的與膜結(jié)合的細(xì)胞器。黑素產(chǎn)生的濃度因皮膚類型(遺傳傾向(genetic disposition))和環(huán)境條件而異。黑素細(xì)胞是存在于表皮基底膜內(nèi)的細(xì)胞，并且占細(xì)胞內(nèi)容物的5％至10％(每cm2約1200-1500個黑素細(xì)胞)。當(dāng)被如紫外線(UV)的因素刺激時，黑素細(xì)胞更快速地分裂，從而產(chǎn)生更大量的黑素。然后黑素在成熟的黑素體內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)至表皮內(nèi)的角質(zhì)形成細(xì)胞，于此其顯示為棕色膚色。
人類皮膚中黑素細(xì)胞的數(shù)目與膚色無關(guān)，大體上相同。膚色主要取決于產(chǎn)生的黑素的數(shù)量和類型(黑色的真黑素或黃色到紅褐色的褐黑素)。亞洲人和淺膚色人(light-skinned people)的真黑素水平相對深膚色人(dark-skinned people)較低，并且相應(yīng)地對照射作用的防護(hù)較少。具有紅發(fā)的人特征在于褐黑素沉著，并且?guī)缀鯖]有或完全沒有對光的保護(hù)。此外，黑素在皮膚中的分布也不同。在淺膚色人中，更多數(shù)的色素存在于基底層，然而在深膚色的人中，黑素則是四處擴(kuò)散，進(jìn)入角質(zhì)層。
黑素的過度生成可導(dǎo)致膚色、毛發(fā)色不同類型的異常以及其他皮膚疾病和病癥。與皮膚色素沉著病癥有關(guān)的癥狀主要有兩種。包括由UV暴露和老化導(dǎo)致的黑素異常增加的皮膚變黑；以及皮膚色素異常分布導(dǎo)致的老年斑、肝斑和藥物及傷口/疾病誘導(dǎo)的色素沉著過度(Seiberg等(2000)J.Invest.Dermatol.115162；Paine等(2001)J.Invest.Dermatol.116587)。
黑素生成(黑素的產(chǎn)生)的調(diào)節(jié)劑可被設(shè)計(jì)或選擇為以如圖1所示的各種途徑起作用。參見圖1，它們可在黑素合成之前直接起調(diào)節(jié)黑素體結(jié)構(gòu)和功能的作用、它們可通過抑制如黑素合成涉及的酪氨酸酶的酶的生成或功能起作用、它們可改變真黑素/褐黑素的比例或者它們可通過負(fù)責(zé)將黑素體從黑素細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到角質(zhì)形成細(xì)胞的制動機(jī)構(gòu)(dampingmechanism)起作用。(Briganti等(2003)Pigment Cell Research16101-110)。
酪氨酸酶是產(chǎn)生黑素的關(guān)鍵酶。它催化三個反應(yīng)使酪氨酸羥基化以生成3，4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)、氧化DOPA生成DOPA醌以及氧化DHI(5，6-二羥基吲哚生成吲哚醌(Hearing等(1991)FASEB 53515)。已經(jīng)確定酪氨酸酶的催化活性需要底物和二價金屬離子。目前旨在用于美白(lightening)皮膚的抑制黑素合成的方法主要基于能夠通過直接與酪氨酸酶本身相互作用或者如通過絡(luò)合必需的金屬離子而間接地抑制酪氨酸酶活性的物質(zhì)。
酪氨酸酶屬于3型銅蛋白家族，在它們的活性部位包含兩個銅離子。對酪氨酸酶活性部位結(jié)構(gòu)的研究揭示，如圖2所示，兩個銅離子間距接近，并且各離子通過組氨酸側(cè)鏈N-ε氮原子與三個組氨酸配位。(Pfiffner和Lerch(1981)Biochem.206029；Cuff等(1998)J.Mol.Biol.278855)。雙核銅離子可以三種主要的氧化還原形式存在Cu′-Cu′還原形式、可逆地結(jié)合O2作為過氧化物的Cu″-O2-Cu″形式以及其中Cu2+離子通常通過小配體(small ligand)橋聯(lián)的酶的休眠形式(resting form)。已確定Cu″-O2-Cu″氧化還原態(tài)是酪氨酸酶酶活性的關(guān)鍵。這種狀態(tài)下，酪氨酸酶催化將第二個羥基引入一元酚(如酪氨酸)鄰位的反應(yīng)，該反應(yīng)是黑素生物合成的關(guān)鍵。
能干擾在酪氨酸酶活性部位一元酚的接近、形成配體或氧化的任何化合物將成為酪氨酸酶的有效的抑制劑，而可能導(dǎo)致黑素生成減少和美白膚色。一般而言，酪氨酸活性部位的銅離子可易于同氧、氮、硫和鹵素的孤對電子螯合(Weder等(1999)Inorg.Chem.381736)。圖3圖解了若干已知的酪氨酸抑制劑的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制(Briganti等(2003)PigmentCell Research 16101-110；Seo等(2003)J.Agric.Food Chem.512837)。參考圖3可見，具有類似于3，4-二羥苯丙氨酸(DOPA)結(jié)構(gòu)的化合物如氫醌既可抑制酪氨酸酶還是黑素細(xì)胞溶解劑(melanocytolyticagents)。(第5,523,077號美國專利)。例如，從常見的熊果、Uvae ursi分離出的熊果苷是天然存在的氫醌的β-吡喃葡萄糖苷，其抑制酪氨酸酶并影響黑素在人類黑素細(xì)胞內(nèi)的合成。(Chakraborty等(1998)PigmentCell Res.11206；第5,980,904號美國專利)。熊果苷的作用機(jī)制包括與L-酪氨酸或L-多巴競爭結(jié)合酪氨酸酶的活性部位。其并不抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)或合成。(Maeda和Fukuda(1996)J.Pharmacol，Exp.276765)。合成的熊果苷類化合物同樣有力地抑制人的酪氨酸酶。(Sugimoto等(2003)Chem.Pharm.Bull.51798)。Kinobeon A是從紅花(Carthamus tinctoriusL.)的培養(yǎng)細(xì)胞中分離的新型二醌類化合物，其具有強(qiáng)于曲酸的酪氨酸酶抑制活性(Kanehira等(2003)Planta Med.69457)。若長時間或以高濃度施用，氫醌可能有嚴(yán)重的副作用。此外，氫醌可導(dǎo)致永久性色素脫失作用，因此當(dāng)暴露于UV光下時增加皮膚的光敏感性(photosensitivity)。
目前使用的具有較好耐受性的皮膚美白物質(zhì)是天然來源的物質(zhì)。例如，曲酸是源于包含某種細(xì)菌的糖溶液的天然羥基-γ-吡喃酮。參考圖3可見曲酸是被氧化的鄰二羥基酚。已知曲酸可與特別是Cu″的金屬離子形成強(qiáng)的螯合物。(Gerard和Hugel(1975)Bull.Soc.Chim.Fr.422404)。其是強(qiáng)競爭劑，卻是酪氨酸酶的緩慢結(jié)合抑制劑。(Cabanes等(1994)J.Pharm.Phamacol.46982)。最近研究表明，曲酸的作用為橋聯(lián)配體，牢固地與二銅(II)絡(luò)合物和二銅-二氧加合物結(jié)合，從而預(yù)防兒茶酚底物與酶結(jié)合。(Battaini等(2000)JBIC 5262)。曲酸及其酯作為皮膚美白劑的應(yīng)用已申請專利。(參見第4,369,174、4,771060、5,824,327、5,427,775以及4,990,330號美國專利)。
類黃酮是另一類已報(bào)道為酪氨酸酶抑制劑的天然產(chǎn)物(Shimizu等(2000)Planta Med.6611；Xie等(2003)Biochem.68487)?；钚岳野彼崦敢种苿┌S酮(Likhitwitayawuid等(2000)Planta Med.66275)、黃酮醇(Kubo和Kinst-Hori(1999)J.Agric.Food Chem.474121)、異戊二烯化(prenylnated)類黃酮(Kuniyoshi等(2002)Planta Med.6879；Son等(2003)Planta Med.69559；Kim等(2003)Biol.Pharm.Bull.261348)、黃烷(No等(1999)Life Sci.65PL241；Kim等(2004)Biomacromolecules5474)以及二氫查耳酮(Shoji等(1997)Biosci.Biotechnol.Biochem.611963)。
其他類的酪氨酸酶抑制劑包括酚衍生物(Sakuma等(1999)Arch.Pharm.Res.22335；Kerry和Rice Evans(1999)J.Neurochem.73247；Battaini等(2002)J.Biol.Chem.27744606)、苯甲醛(Kubo和Kinst-Hori(1999Plant Medica 6519；Chen等(2003)J.Enzyme Inhib.Med.Chem.18491；Nihei等(2004)Bioorg.Med.Chem.14681)、苯甲酸衍生物(Curto等(1999)Biochem Pharmacol.57663；Chen等(2003)J.Protein Chem.22607；Miyazawa等(2003)J.Agric.Food Chem.519653；Kubo等(2003)Z.Naturforsch[C]58713)、銅鐵試劑(Xie等(2003)Int.J.Biochem.Cell Biol.351658)、源自甘草(Glycyrrhiza uralensis)根的苯并二吡喃(Yokota等(1998)Pigment Cell Res.11335)、巰基化合物(Park等(2003)J.Protein Chem.22613)、萜類(Oh等(2002)Planta Med.68832)、以及oxazolodinethione(Seo等(1999)Planta Med 65683)。最有效的已知天然酪氨酸酶抑制劑是均二苯代乙烯類(IC50＝0.3-5μM)(Shin等(1998)Biochem Biophys.Res.Commun.243801；Ohguchi等(2003)Biosci.Biotechnol.Biochem.671587)、均二苯代乙烯苷類(Iida等(1995)PlantaMed.61425)以及4-取代的間苯二酚(Shimizu等(2000)Planta Med.6611)。
對4-取代的間苯二酚的結(jié)構(gòu)/活性研究顯示，疏水性且體積較小的取代基如-CH2C6H5和烷基即-CH2CH2CH3具有IC50小于10μM的最大效力(Shimizu等(2000)Planta Med.6611)。4-取代的間苯二酚的作用機(jī)制已被表征為緩慢結(jié)合地競爭性抑制DL-β-(3，4-二羥基苯基)丙氨酸(DL-多巴)的氧化(Jimenez和Garcia-Carmona(1997)J.Agric.Food Chem.452061)，而并沒有進(jìn)一步了解到對雙核銅離子的金屬螯合效應(yīng)。
百合科的蘆薈是包含許多生物活性物質(zhì)的復(fù)雜植物(Cohen等(1992)Wound Healing/Biochemical and Clinical Aspects，lst ed.W B Saunders，Philadelphia)。在360種已知的蘆薈物種中，大部分土生于非洲。歷史上，蘆薈產(chǎn)品已經(jīng)被用于治療灼傷、瘡及其他創(chuàng)口的皮膚學(xué)的應(yīng)用。這些應(yīng)用已經(jīng)激發(fā)許多鑒別源自蘆薈植物的具有臨床活性的化合物的研究。(參見，如Grindlay和Reynolds(1986)J.of Ethnopharmacology 16117-151；Hart等(1988)J.ofEthnopharmacology 2361-71)。
Yagi等公開一組從蘆薈中分離得到的化合物，特別是蘆薈苦素和其衍生物2″-O-阿魏酰蘆薈苦素，它們是酪氨酸酶的有效抑制劑。(Yagi等(1987)Plant Medica 515-517；Yagi等(1977)Z.Naturforsch 32c731-734)。蘆薈苦素，C-葡糖基化(glucosylated)的5-甲基色酮以劑量依賴性方式抑制人的酪氨酸酶羥化酶活性，IC50為0.92mM，并且以劑量依賴性方式抑制DOPA氧化酶活性，IC50為0.70mM，與曲酸IC50＝0.41mM和熊果苷IC50＝3.02mM相當(dāng)。使用B16F1鼠黑素瘤細(xì)胞的基于細(xì)胞的試驗(yàn)證實(shí)了蘆薈苦素對酪氨酸酶酶活性及隨后黑素形成的抑制。蘆薈苦素(IC50＝0.167mM)以劑量依賴性方式抑制黑素的生物合成。(Jones等(2002)Pigment.Cell Res.15335)。推測蘆薈色酮抑制酪氨酸酶的作用機(jī)制與銅離子的還原有關(guān)。天然的(第6,451,357號美國專利)、半合成的(第5,801256、6,083976號美國專利)以及經(jīng)蘆薈色酮制劑(第6,123,959號美國專利)均已就其美白皮膚的能力申請專利。
抗壞血酸(合成或源自如柑橘類水果的天然來源的維生素C)及其衍生物也被用于美白皮膚。大多數(shù)情況下，將維生素C同曲酸或其它的酪氨酸酶抑制劑配制(第4,919921、6,458,379和5,916,915號美國專利)。其它已報(bào)道的皮膚美白化合物包括橄欖植物提取物(第6,682,763號美國專利)、不飽和長鏈脂肪酸(第6,669,932號美國專利)、姜黃色素(第6,641,845號美國專利)、酶提取物(第6,514,506號美國專利)、擬雌內(nèi)酯(coumestrol)(第6,503,941號美國專利)、羥基羧酸(第6,417,226、6,365,137、5,609,875、5,262,153號美國專利)、β-葡聚糖(US#6,251,877)、蘆薈色酮(第6,083,976號美國專利)、苯丙氨酸化合物(第5,767,158號美國專利)、蘆丁(第5,145,782號美國專利)、escinol(第5,728,683號美國專利)、水楊酸(第5,700,784號美國專利)、血管生成素(第5,698,185號美國專利)、巰基葡聚糖(mercaptodextran)(第6,077,503號美國專利)、鞣花酸(第6,066,312號美國專利)、次膦酸(第6,280,715號美國專利)、含硼化合物(第5,993,835號美國專利)、植物提取物(源自葛根,第6,352,685號美國專利；桑屬，第6,197,304、6,066,312、和5,872,254號美國專利；acerola cherry fermentate，第5,747,006號美國專利；呋喃酮，第5,602,256號美國專利；以及其他，第5,773,014號美國專利)。
二芳基烷烴是一種稀少的天然產(chǎn)物。迄今為止，CD-ROM上的theDictionary of Natural Products(Chapman & Hall/CRC，版本122004年1月2日)所列的天然化合物超過179,000種，其中只有82種是二芳基丙烷(n＝3)。構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)是?？频穆淙~樹，已經(jīng)僅從這類植物就分離出超過20種二芳基丙烷。(Keto等(1986)Chem.Pharm.Bull.342448；Ikuta等(1986)Chem.Pharm.Bull.341968；Takasugi等(1984)Chem.Lett.689；Gonzalez等(1993)Phytochem.32433)。對構(gòu)樹提取物的在生物鑒定指導(dǎo)下的分級分離得到四種不具有芳香酶抑制活性的二芳基丙烷(Lee等(2001)J.Nat.Prod.641286)。然而，從同一植物分離的異戊二烯化二芳基丙烷卻顯示對若干癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性(Ko等(1999)J.Nat.Prod.62164)以及broussonin A顯示出抗真菌活性(Lida等(1999)Yakugaku Zasshi.119964)。
還從Iryanthera種(肉豆蔻科)分離出許多二芳基烷烴。(Alvea等(1975)Phytochem.142832；de Ahmeida等(1979)Phytochem.181015；Braz等(1980)Phytochem.191195；Diaz等(1986)Phytochem.252395)。從Iryanthera lancifolia分離的四種二氫查耳酮顯示出抗氧化活性(Silva等(1999)J.Nat.Prod.621475)。還從肉豆蔻科的Virola種分離出許多二芳基丙烷。(Braz等(1976)Phytochem.15567；Hagos等(1987)Plant Med.5357；Gonzalez等(1993)Phytochem.32433；Kijjoa等(1981)Phytochem.201385；Talukdar等(2000)Phytochem.53155)。
其他從天然來源分離的二芳基丙烷包括那些源自花櫚木(Pterocarpats marsupium)(Fabaceae)(Rao等(1984)Phytochem.23897；Maurya等(1985)J.Nat.Prod.48313)、Lindera umbellate(樟科)(Morimoto等(1985)Chem.Pharm.Bull.332281)、Helichrysum mundii(菊科)(Bohlmann等(1978)Phytochem.171935)、Viscum angulatum(桑寄生科)(Lin等(2002)J.Nat.Prod.65638)、那些源自Acacia tortilis(豆科)的具有平滑肌松弛作用的(Hagos等(1987)Planta Med.5327)、Xanthocercis zambesiaca(豆科)(Bezuidenhout等(1988)Phytochem.272329)、和源自Knema glomerata(肉豆蔻科)的細(xì)胞毒性化合物(Zeng等(1994)J.Nat.Prod.57376)。
第JP05213729A號日本專利教導(dǎo)將合成的二氫查耳酮作為黑素抑制劑應(yīng)用以治療皮膚炎癥、色斑、雀斑和陽光曬傷導(dǎo)致的色素沉著。所要求保護(hù)的化合物具有下列通式結(jié)構(gòu) 其中X選自H、OH或＝O；R是H或Me；以及R1-R5獨(dú)立地選自H、OR和NH2。因此，所公開的二氫查耳酮包含在一個苯基環(huán)上的單個羥基/甲氧基取代基以及在第二個環(huán)上的5個非特定取代基(R1-R5)。未測定任何所要求保護(hù)的組合物的酶抑制作用，而是測定了在UV刺激后經(jīng)培養(yǎng)的皮膚細(xì)胞產(chǎn)生的黑素的量以及動物皮膚的顏色變化。在本發(fā)明中，合成了JP05213729A所公開的一種化合物1-(4-羥基苯基)-3-(4′-羥基苯基)-1-丙醇并測定了其抑制酪氨酸酶的能力。該化合物僅顯示出對酪氨酸酶的中等抑制作用(IC50＝305μM，表2)。本發(fā)明教導(dǎo)了具有其中兩個芳環(huán)Ar1或Ar2中的至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R1′-R5′)取代并且其中所述R1′-R5中的至少兩個不是H)的獨(dú)特的取代模式的新型的二芳基烷烴。這些化合物顯示出出人意料的抑制酪氨酸酶活性的能力，比JP05213729所教導(dǎo)的化合物高4-600倍。據(jù)信，迄今為止沒有任何關(guān)于任意的本發(fā)明所教導(dǎo)的這些化合物的報(bào)道發(fā)表。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明包括抑制本文稱之為雙核酶的具有雙核活性部位的酶的活性的方法，所述方法包括向有需要的主體給藥有效量的一種或更多種二芳基烷烴，其中所述二芳基烷烴是合成的和/或從一種或更多種植物分離的。包括在本發(fā)明范圍內(nèi)的雙核酶的實(shí)例包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、細(xì)胞色素C氧化酶、質(zhì)子泵血紅素-銅氧化酶、雙功能的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶、核糖核苷酸還原酶、金屬-β-內(nèi)酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供選擇的氧化酶以及細(xì)菌磷酸三酯酶。在一個具體實(shí)施方案中，所述雙核酶是酪氨酸酶。
本發(fā)明還包括預(yù)防和治療與雙核酶活性有關(guān)的疾病和病癥的方法。本發(fā)明的預(yù)防和治療方法包括向有需要的主體內(nèi)部(internally)或局部給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴。根據(jù)受抑制的雙核酶，二芳基烷烴可用作為抗菌劑、抗真菌劑、抗瘧藥或抗病毒劑、作為控制男性和女性性喚起(sexual arousal)的手段的一氧化氮生成的調(diào)節(jié)劑、抗炎藥、抗氧化劑、藥物代謝的調(diào)節(jié)劑和癌及實(shí)體瘤的生長抑制劑。二芳基烷烴還可用于預(yù)防和治療牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌及其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥(sequelae)、牙髓炎、發(fā)炎(irritation)，由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的微創(chuàng)口所引起的疼痛和炎癥，牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)。
本發(fā)明還包括預(yù)防和治療與黑素過度產(chǎn)生或分布不均有關(guān)的疾病和病癥的方法，所述方法包括向有需要的主體內(nèi)部或局部給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴。與黑素過度產(chǎn)生或分布不均有關(guān)的疾病和病癥包括但不限于曬黑，由皮膚老化、肝病、熱灼傷和局部創(chuàng)口導(dǎo)致的色素沉著過度，歸因于由真菌、細(xì)菌和病毒感染引起的炎癥的皮膚色素沉著、白癜風(fēng)(vitilago)、癌、黑素瘤以及其他哺乳動物的皮膚疾病。
該方法還可用于預(yù)防和治療由于暴露于紫外線(UV)照射、化學(xué)試劑、熱、風(fēng)和干燥環(huán)境導(dǎo)致的皮膚變黑和損傷。最后，該方法可用于預(yù)防和治療皺紋、皮膚松弛、眼紋和黑眼圈、緩和敏感性皮膚以及預(yù)防和治療皮炎及其他與過敏相關(guān)的皮膚疾病。此處所述治療組分除了可用于預(yù)防和治療上述皮膚疾病和病癥外，還可提供一種有效的組合物，其具有可提供膚色改善、彈性增加、衰老減輕和延緩、年輕的外表和紋理改善以及柔韌性、緊繃度(firmness)、光滑和柔度增強(qiáng)的光滑及年輕的皮膚外觀的益處。
通過與金屬離子螯合，二芳基烷烴還可用于遞送必需的金屬離子至主體的血流、和/或攜帶金屬離子穿過皮膚或血/腦屏障以及其他膜。在該具體實(shí)施方案中，所述方法包括向有需要的主體給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴以及要被遞送的金屬離子。鑒于二芳基烷烴的這種能力，其可用于治療的疾病和病癥包括但不限于貧血及其他鐵缺乏、炎癥；肥胖和糖尿病、牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌、及其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥、牙髓炎、發(fā)炎，由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的微創(chuàng)口所引起的疼痛和炎癥，牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)、病毒感染、失眠、免疫功能抑制、骨質(zhì)疏松癥、閉經(jīng)、痛經(jīng)、癲癇癥、高血壓、膽固醇血癥(cholesterolemea)、冠狀和腦血管痙攣、腹瀉、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、男性不育癥和黃斑變性。所述金屬離子選自包括但不限于以下組中銅、鉻、鐵、鋅、硼、鋰、硒、鈣、錳、鎂、鉬及其他金屬離子。
在另一個具體實(shí)施方案中，二烷基烷烴和二烷基烷醇可用于食品工業(yè)以預(yù)防水果、蘑菇及其他食品褐變(browning)和變色。
本發(fā)明還包括包含一種或更多種二芳基烷烴的新型組合物，其中所述二芳基烷烴選自由以下通式結(jié)構(gòu)所代表的化合物的組中 其中Ar1和Ar2獨(dú)立地選自由被取代的5或6元芳環(huán)或雜芳環(huán)組成的組中，
其中各6元芳環(huán)或雜芳環(huán)獨(dú)立地被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，并且各5元芳環(huán)或雜芳環(huán)被1-4個R′基團(tuán)(R′1-R′4)取代，例外的是當(dāng)Ar1和Ar2均為6元芳環(huán)即苯基時，Ar1和Ar2中至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2個不是H，其中R′獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中n＝2-4。
在一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴選自由以下通式結(jié)構(gòu)所代表的化合物的組中 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中n＝2-4。
在一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的二芳基烷烴分離自選自包括但不限于菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、?？坪腿舛罐⒖频闹参锟浦?。本發(fā)明的二芳基烷烴還可以提取、富集和純化自包括但不限于金合歡屬、構(gòu)樹屬、蠟菊屬、山菅屬、Iryanthera、紅光樹屬、山胡椒屬、紫檀屬、槲寄生屬和Xanthocercis的高等植物屬中。二芳基烷烴可存在于植物的不同部分，包括但不限于莖、莖皮、芯材、樹干、樹干皮、椏枝、塊莖、根、根皮、嫩芽、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉子及其他氣生部分。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，二芳基烷烴分離自構(gòu)樹屬、山菅屬和Iryanthera屬的一種或更多種植物中。
在另一個具體實(shí)施方案中，通過合成的方法獲得本發(fā)明的二芳基烷烴。本發(fā)明包括合成二芳基烷烴和二芳基烷醇的方法，所述方法包括還原具有以下通式結(jié)構(gòu)的化合物 其中R1-R5和R′1-R′5及n如上所定義，并且其中R6和R7一同構(gòu)成一個或更多個羰基。還原劑可選自任何用于將酮還原為醇的已知還原劑，包括但不限于硼氫化物、催化劑存在下的H2、NaH和LiAIH4。在一個具體實(shí)施方案中，還原劑是NaBH4。
在另一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴是通過合成修飾從植物來源分離的天然存在的化合物得到的。例如，將天然存在的化合物紫鉚花素從植物來源分離、脫水并還原，由此得到相應(yīng)的二芳基烷醇。
在另一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴是通過兩種被適當(dāng)取代的芳香化合物的反應(yīng)獲得的。從兩種被取代的芳香化合物合成這些化合物的可行化學(xué)反應(yīng)包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之間的羥醛縮合；醛和酮之間的Claisen-Schmidt反應(yīng)或交叉羥醛縮合；使用一種被取代芳環(huán)的有機(jī)鎂鹵化物通過與第二種被取代的芳環(huán)分子的羰基的加成反應(yīng)連接至所述第二種被取代的芳環(huán)的Grignard反應(yīng)；通過分子內(nèi)異構(gòu)化發(fā)生的Claisen重排，其中具有適當(dāng)?shù)娜〈孽セ姆赢悩?gòu)化而使第二種芳環(huán)連接至酚的鄰位，隨后進(jìn)行還原反應(yīng)；以及Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，其中將兩種被取代的芳環(huán)轉(zhuǎn)化成芳基硼酸，然后使用經(jīng)謹(jǐn)慎選擇的鈀催化劑通過鹵代烷連接。這些反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，并且可應(yīng)用此處公開的用于合成這些化合物的信息確定這些反應(yīng)的條件。
本發(fā)明采用將抑制試驗(yàn)和化學(xué)去重復(fù)方法(chemical dereplicationprocess)相聯(lián)合的策略以鑒別有活性的植物提取物和特異性地抑制雙核酶的那些提取物中的特定化合物。該方法包括結(jié)合天然產(chǎn)物的分離、有機(jī)合成、分子模型及酶抑制試驗(yàn)以優(yōu)化結(jié)構(gòu)并最大化藥物的效能。該方法記載于2002年6月27日提交的、名為“Method for Generating，Screeningand Dereplicating Natural Product Libraries for the Discovery of TherapeuticAgents”的第10/185,758號美國申請中，該申請全文并入本文以作參考。采用如以下實(shí)施例部分所述的酪氨酸酶抑制試驗(yàn)證實(shí)該方法的有效性。根據(jù)該發(fā)明方法評價的二芳基烷烴的純度在0.01％到100％范圍內(nèi)，取決于用于獲得化合物的方法。
在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，向有需要的主體給藥的二芳基烷烴的劑量是有效、無毒性的量，其通常選自基于最終制劑的總重量的0.001％到100％和/或基于主體體重的每千克0.01mg到200mg的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員采用常規(guī)臨床試驗(yàn)即可確定對于所治療的特定疾病的最佳劑量。本發(fā)明提供用于合成、和/或分離、純化及配制二芳基烷烴以得到具有所期望的生理學(xué)活性的組合物的商業(yè)上切實(shí)可行的選擇。本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法給藥。給藥方式包括但不限于腸道(口服)給藥、非胃腸道(靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi))給藥以及局部施用。本發(fā)明的治療方法包括向有需要的患者內(nèi)部或局部給藥治療有效量的合成和/或從單種植物或多種植物分離的純的或混和的二芳基烷烴。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，局部給藥該組合物。
應(yīng)理解的是，前述的一般說明及下文的詳細(xì)說明都只是例證和說明性的，并非是對所要求保護(hù)的本發(fā)明的限制。


圖1圖示黑素生成的過程以及各種可能調(diào)節(jié)該過程的機(jī)制。
圖2圖示酪氨酸酶活性部位的結(jié)構(gòu)。如圖中所示，兩個銅離子間距接近并且分別通過組氨酸側(cè)鏈的N-ε氮原子與三個組氨酸配位。
圖3描述已知酪氨酸酶抑制劑的結(jié)構(gòu)、名稱、作用機(jī)制及其他作用。
圖4圖示包含突出標(biāo)記的UP288(1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(1)的HTP流分(fraction)的HPLC/UV色譜圖。
圖5描述UP288(1)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和13C-NMR譜。
圖6圖示UP288和曲酸的酪氨酸酶抑制劑量反應(yīng)曲線以及IC50值。
圖7描述在生物鑒定指導(dǎo)(bioassay-guided)下自山菅(P0389)(整株)分離兩種活性化合物(UP302a和UP302b)。
圖8描繪經(jīng)多柱分離后富集的UP302流分的HPLC/UV色譜圖。
圖9圖示UP302a(2)的gHSQC譜，其圖解了質(zhì)子和碳間的連接。
圖10圖示各種抑制劑UP302a和底物L(fēng)-DOPA濃度下對酪氨酸酶活性的抑制。該動力學(xué)研究揭示UP302a是酪氨酸酶的競爭性抑制劑。
圖11圖示曲酸和UP302a(2)對小鼠B16F1細(xì)胞中內(nèi)源性黑素生成的抑制。以10種不同的濃度一式三份地測試各樣品。
圖12描繪MM2能量最小化后UP302a的三維構(gòu)象。
圖13圖示配位至Cu″-O2-Cu″氧化態(tài)下的兩個銅離子時UP302a的三維構(gòu)象。
圖14描繪如實(shí)施例17所計(jì)算的在與以過氧化物形式(Cu″-O2-Cu″)的銅離子螯合時UP302a的相鄰原子之間的距離。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明大體而言涉及對由雙核酶介導(dǎo)的疾病及病癥的預(yù)防和治療。具體而言，本發(fā)明包括抑制具有雙核活性部位的酶的活性的方法。本發(fā)明包括包含一種或更多種二芳基烷烴的新的組合物。本發(fā)明的二芳基烷烴可從一種或更多種植物來源分離，或者可通過有機(jī)合成獲得。本發(fā)明還包括從植物來源分離這些化合物的方法以及合成這些化合物的方法。在一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴是通過合成修飾從植物來源分離的天然存在的化合物得到的。
本文使用各種術(shù)語提及本發(fā)明的各方面。提供以下定義以幫助闡明對本發(fā)明各部分的說明。除非另有定義，否則本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的意思。
應(yīng)注意的是，此處所使用的術(shù)語“a”或者“an”實(shí)體是指一種或更多種該實(shí)體；例如，“a diarylalkane”是指一種或更多種二芳基烷烴。以此類推，術(shù)語“a”或“an”、“一種或更多種”以及“至少一種”在本文中可交換使用。
本文所使用的“二芳基烷烴”是具有以下通式結(jié)構(gòu)的特定類型的芳香化合物。本發(fā)明還包括包含一種或更多種二芳基烷烴的新組合物，其中所述二芳基烷烴選自由以下通式結(jié)構(gòu)所代表的化合物的組中 其中Ar1和Ar2獨(dú)立地選自由被取代的5或6元芳環(huán)或雜芳環(huán)組成的組中，其中各6元芳環(huán)或雜芳環(huán)獨(dú)立地被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，并且各5元芳環(huán)或雜芳環(huán)被1-4個R′基團(tuán)(R′1-R′4)取代，例外的是當(dāng)Ar1和Ar2均為6元芳環(huán)即苯基時，Ar1和Ar2中至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2個不是H，其中R′獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、和X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中n＝2-4。
在一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴和二芳基烷醇選自由以下通式結(jié)構(gòu)所代表的化合物的組中 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且
n＝1至10。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中n＝2-4。
本文所使用的“二芳基烷醇”是指在兩個芳環(huán)間的烷基碳上具有至少一個羥基(R6和/或R7＝-OH)的特定類型的“二芳基烷烴”。
本文所使用的“雙核酶”是指具有雙核活性部位的酶，其實(shí)例是如上所述在其活性部位具有兩個銅離子的酪氨酸酶。雙核酶包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、細(xì)胞色素C氧化酶、質(zhì)子泵血紅素-銅氧化酶、雙功能的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶、核糖核苷酸還原酶、金屬-β-內(nèi)酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供選擇的氧化酶以及細(xì)菌磷酸三酯酶。
本文所使用的“治療”包括阻止、治療和/或預(yù)防。在使用時，治療是指人類以及其他動物。
“藥物或治療有效劑量或量”是指足夠引起所期望的生物學(xué)結(jié)果的劑量水平。該結(jié)果可能是減輕病征、癥狀或疾病的本因或者所期望的生物系統(tǒng)其他變化。精確劑量將根據(jù)各種因素而變化，包括但不限于對象的年齡和大小、疾病和所實(shí)施的治療。
“安慰劑”是指使用無活性物質(zhì)替換足以引起所期望的可減輕病征、癥狀或疾病本因的生物學(xué)結(jié)果的藥物學(xué)有效和治療有效的劑量。
“主體”或“患者”或“對象”是需要治療的有生命的哺乳動物、人或動物。所述“主體”、“患者”或“對象”通常是指根據(jù)本發(fā)明方法要實(shí)施的治療的接受者。應(yīng)注意的是，此處所述的發(fā)明可用于獸醫(yī)以及應(yīng)用于人，并且不應(yīng)以受限的方式解釋術(shù)語“主體”。就獸醫(yī)應(yīng)用而言，應(yīng)如下文所述在考慮動物體重的情況下決定劑量范圍。
本文所使用的“藥物學(xué)可接受的載體”是指任何不會干擾活性成分生物活性的有效性且對接受給藥的主體無毒性的載體。“藥物學(xué)可接受的載體”的實(shí)例包括但不限于任何如鹽溶液即林格氏溶液、緩沖鹽溶液、水、葡萄糖溶液、血清白蛋白以及其他用于片劑和膠囊劑型的輔料和防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)藥物載體。
本發(fā)明包括抑制本文稱之為雙核酶的具有雙核活性部位的酶的活性的方法，所述方法包括向有需要的主體給藥有效量的一種或更多種二芳基烷烴，其中所述二芳基烷烴是合成和/或從一種或更多種植物分離的。本發(fā)明范圍內(nèi)的雙核酶的實(shí)例包括但不限于酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、細(xì)胞色素C氧化酶、質(zhì)子泵血紅素-銅氧化酶、雙功能的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶、核糖核苷酸還原酶、金屬-β-內(nèi)酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供選擇的氧化酶以及細(xì)菌磷酸三酯酶。在一個具體實(shí)施方案中，所述雙核酶是酪氨酸酶。
本發(fā)明還包括預(yù)防和治療與雙核酶活性有關(guān)的疾病和病癥。本發(fā)明的預(yù)防和治療方法包括向有需要的主體內(nèi)部或局部給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴。根據(jù)受抑制的雙核酶，所述二芳基烷烴可用作為抗菌劑、抗真菌劑、抗瘧藥或抗病毒劑、作為控制男性和女性性喚起的手段的氧化氮生成的調(diào)節(jié)劑、抗炎藥、抗氧化劑、藥物代謝的調(diào)節(jié)劑，用于預(yù)防和治療牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌及其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥、牙髓炎、發(fā)炎，由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的微創(chuàng)口所引起的疼痛和炎癥，牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)、和癌及實(shí)體瘤的生長抑制劑。
本發(fā)明還包括預(yù)防和治療與黑素過度產(chǎn)生或分布不均有關(guān)的疾病和病癥的方法，所述方法包括向有需要的主體內(nèi)部或局部給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴。與黑素過度產(chǎn)生或分布不均有關(guān)的疾病和病癥包括但不限于曬黑，由皮膚老化、肝病、熱灼傷和局部創(chuàng)口導(dǎo)致的色素沉著過度，歸因于由真菌、細(xì)菌和病毒感染引起的炎癥的皮膚色素沉著，白癜風(fēng)、癌、黑素瘤以及其他哺乳動物的皮膚疾病。
該方法還可用于預(yù)防和治療由于暴露于紫外線(UV)照射、化學(xué)試劑、熱、風(fēng)和干燥環(huán)境導(dǎo)致的皮膚變黑和損傷。最后，該方法可用于預(yù)防和治療皺紋、皮膚松弛、眼紋和黑眼圈、緩和敏感性皮膚以及預(yù)防和治療皮炎及其他與過敏相關(guān)的皮膚疾病。此處所述治療組分除了可用于預(yù)防和治療上述皮膚疾病和病癥外，還可提供一種有效的組合物，其具有可提供膚色改善、彈性增加、衰老減輕和延緩、年輕的外表和紋理改善以及柔韌性、緊繃度、光滑和柔度增強(qiáng)的光滑及年輕的皮膚外觀的益處。
通過與金屬離子螯合，二芳基烷烴還可用于遞送必需的金屬離子至主體的血流、和/或攜帶金屬離子穿過皮膚或血/腦屏障以及其他膜。在該具體實(shí)施方案中，所述方法包括向有需要的主體給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴以及要被遞送的金屬離子。鑒于二芳基烷烴的這種能力，其可用于治療的疾病和病癥包括但不限于貧血及其他鐵缺乏、炎癥；肥胖和糖尿病、牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌、及其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥、牙髓炎、發(fā)炎，由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的微創(chuàng)口所引起的疼痛和炎癥，牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)、病毒感染。該金屬離子選自包括但不限于以下組中銅、鐵、鋅、硒、鎂及其他金屬離子。
在另一個具體實(shí)施方案中，所述二烷基烷烴可用于食品工業(yè)以預(yù)防水果、蘑菇及其他食品褐變和變色。
可根據(jù)下文所述應(yīng)用的二芳基烷烴包括上述通式結(jié)構(gòu)所示的化合物。本發(fā)明的二芳基烷烴可通過合成方法獲得或分離自一種或更多種選自包括但不限于菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、?？坪腿舛罐⒖频闹参锟浦?。本發(fā)明的二芳基烷烴可提取、富集和純化自包括但不限于金合歡屬、構(gòu)樹屬、山菅屬、蠟菊屬、Iryanthera、紅光樹屬、山胡椒屬、紫檀屬、槲寄生屬和Xanthocercis的高等植物屬中。所述二芳基烷烴可存在于植物的不同部分中，包括但不限于莖、莖皮、芯材、樹干、樹干皮、椏枝、塊莖、根、根皮、嫩芽、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉子及其他氣生部分。在一個優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴分離自構(gòu)樹屬、山菅屬和Iryanthera屬的一種或更多種植物。
在另一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的二芳基烷烴是通過化學(xué)合成的方法獲得的。本發(fā)明包括合成二芳基烷烴和二芳基烷醇的方法，所述方法包括還原具有以下通式結(jié)構(gòu)的化合物 其中R1-R5和R′1-R′5及n如上所定義，并且其中R6和R7一同構(gòu)成一個或更多個羰基。還原劑可選自任何用于將酮還原為醇的已知還原劑，包括但不限于硼氫化物、催化劑存在下的H2、NaH和LiAlH4。在一個具體實(shí)施方案中，該還原劑是NaBH4。
在另一個具體實(shí)施方案中，二芳基烷烴是通過合成修飾從植物來源分離的天然存在的化合物得到的。例如，將天然存在的化合物紫鉚花素從植物來源分離、脫水并還原產(chǎn)生相應(yīng)的二芳基烷醇。
在另一個具體實(shí)施方案中，所述二芳基烷烴是通過兩種被適當(dāng)取代的芳香化合物的反應(yīng)獲得的。從兩種被取代的芳香化合物合成這些化合物的可行化學(xué)反應(yīng)包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之間的羥醛縮合；醛和酮之間的Claisen-Schmidt反應(yīng)或交叉羥醛縮合；使用一種被取代芳環(huán)的有機(jī)鎂鹵化物通過與第二種被取代的芳環(huán)分子的羰基的加成反應(yīng)連接至所述第二種被取代的芳環(huán)的Grignard反應(yīng)；通過分子內(nèi)異構(gòu)化發(fā)生的Claisen重排，其中具有適當(dāng)?shù)娜〈孽セ姆赢悩?gòu)化而使第二種芳環(huán)連接至酚的鄰位，隨后進(jìn)行還原反應(yīng)；以及Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，其中將兩種被取代的芳環(huán)轉(zhuǎn)化成芳基硼酸，然后使用經(jīng)謹(jǐn)慎選擇的鈀催化劑通過鹵代烷連接。這些反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，并且可應(yīng)用此處公開的用于合成這些化合物的信息確定這些反應(yīng)的條件。
應(yīng)注意的是本申請全文中提供了各種引用。所有這些引用分別全文具體地并入此文以做參考。
本發(fā)明采用將酪氨酸酶抑制試驗(yàn)與化學(xué)去重復(fù)方法聯(lián)合的策略以鑒別有活性的植物提取物和特異性地抑制雙核酶酪氨酸酶的那些提取物中的特定化合物。如上所述，抑制酪氨酸酶的酶可導(dǎo)致黑素生成減少，從而有效地美白皮膚。如實(shí)施例1所述，通過用有機(jī)溶劑提取干燥植物粉末形成植物提取物庫。如實(shí)施例2所述，按照J(rèn)ones等(2002)Pigment.CellRes.15335所報(bào)道的方法進(jìn)行酪氨酸酶抑制試驗(yàn)。應(yīng)用該試驗(yàn)，總共對1144種植物提取物的抑制蘑菇酪氨酸酶活性的能力進(jìn)行了篩選。該初步的篩選鑒別出20種具有強(qiáng)效酪氨酸酶強(qiáng)抑制活性的植物提取物(1.75％命中率(hit rate))。表1描繪自4種不同屬的植物分離的這些提取物中的4種提取物的酪氨酸酶抑制百分比。
如實(shí)施例3所述，為了從活性植物提取物中有效地鑒別活性化合物，采用了高通量分級分離方法(high throughput fractionation process)。簡而言之，采用了高通量純化(HTP)系統(tǒng)分級分離活性提取物。然后按照如實(shí)施例2所述的初步試驗(yàn)測試各流分的抑制酪氨酸酶活性的能力。在應(yīng)用HPLC與PDA及MS檢測器的組合，并結(jié)合結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫搜索并排除含已知酪氨酸酶抑制劑如多酚以及色酮的流分，從而去重復(fù)后，總共選出七種活性提取物進(jìn)行如實(shí)施例4-6所述的在生物鑒定指導(dǎo)下的大規(guī)模分離和純化，小構(gòu)樹(Broussonetia kazinoki Sieb.Et Zucc)(?？?以及山菅(Dianella ensifolia(L.)DC.)(百合科)用于舉例說明。
實(shí)施例4描述采用實(shí)施例1所述通法自小構(gòu)樹(桑科)(整株)提取、分離和純化新型的二芳基丙烷1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)(1)。圖4所示含UP288的HTP流分的HPLC/UV色譜圖。采用如實(shí)施例4所述的聯(lián)合光譜法闡明活性化合物UP288的結(jié)構(gòu)。圖5描述UP288的化學(xué)結(jié)構(gòu)和13C-NMR譜。圖6圖示UP288相對于曲酸的酪氨酸酶抑制劑量反應(yīng)曲線以及IC50值。該圖說明UP288(1)是和曲酸一樣強(qiáng)效的IC50＝24M的酪氨酸酶抑制劑。
如實(shí)施例5所述，出人意料地從全然不同的植物科——山菅(百合科)中分離及鑒別出兩種相似的二芳基烷烴。圖7圖示在生物鑒定指導(dǎo)下自山菅(P0389)(整株)中分離這兩種活性化合物(UP302a(2)和UP302b(3))。參考圖7可見，在收集的共264份樣品中僅15份柱流分顯示出對酪氨酸酶的強(qiáng)效抑制。對合并的活性流分的HPLC分析(圖8)顯示，活性化合物是在經(jīng)高度富集后的最佳集合(pool)中的微量成分。經(jīng)艱辛的分離及純化的努力，得到兩種新型的活性化合物，如實(shí)施例5及圖9所示通過NMR及其他光譜方法，該化合物已被充分表征為1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a，IC50＝0.24μM)(2)和1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷(UP302b，IC50＝1.2μM)(3)。
實(shí)施例6描述自山菅(DE)(整株)中大規(guī)模分離最有效的酪氨酸酶抑制劑UP302a(2)。參考實(shí)施例6可知，自4.3kg干燥生物物料(biomass)經(jīng)硅膠、CG-161以及C-18樹脂多柱分級分離后總共獲得30mg純的UP302a(2)。所分離的化合物的結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能已經(jīng)確認(rèn)。
由于二芳基烷烴/二芳基烷醇的天然豐度低，研發(fā)了合成這些生物學(xué)活性化合物的方法以作為這類化合物可選擇的商業(yè)來源。實(shí)施例7描述一種通過還原被取代的查耳酮合成二芳基烷烴的通法。以說明為目的，描述了采用硼氫化鈉將2，4-二羥基苯基)-3′，4′-二甲氧基苯基查耳酮(4)還原為1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)的方法。然而，如實(shí)施例7中所述，已應(yīng)用該通法合成許多其他二芳基烷烴。所有這些經(jīng)合成的化合物均顯示高至中等的酪氨酸酶抑制活性。就實(shí)施例7所述的通法而言，可用于實(shí)施該還原反應(yīng)的任意已知的還原劑包括但不限于其他硼氫化物、催化劑存在下的H2、NaH及LiAlH4。
實(shí)施例8、9及10中表明，應(yīng)用如實(shí)施例7所述的通用反應(yīng)已經(jīng)將若干其他被取代的二芳基丙酮轉(zhuǎn)變?yōu)槎蓟楹?或二芳基丙醇。實(shí)施例11表明了采用分離自天然來源的黃酮苷(flavonoid glycoside)作為原材料合成二芳基丙醇的方法。
在另一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明包括通過兩種被適當(dāng)取代的芳香化合物的反應(yīng)合成這類化合物的方法。實(shí)施例12中采用間苯二酚與3-甲氧基-4-羥基肉桂酸的反應(yīng)舉例說明了該具體實(shí)施方案。從兩個被取代的芳香化合物合成這些化合物的可行化學(xué)反應(yīng)包括但不限于被取代的苯甲醛和被取代的苯乙酮之間的羥醛縮合；醛和酮之間的Claisen-Schmidt反應(yīng)或交叉羥醛縮合；使用一種被取代芳環(huán)的有機(jī)鎂鹵化物通過與第二種被取代的芳環(huán)分子的羰基的加成反應(yīng)連接至所述第二種被取代的芳環(huán)的Grignard反應(yīng)；通過分子內(nèi)異構(gòu)化發(fā)生的Claisen重排，其中具有適當(dāng)?shù)娜〈孽セ姆赢悩?gòu)化而使第二種芳環(huán)連接至酚的鄰位，隨后進(jìn)行還原反應(yīng)；以及Suzuki偶聯(lián)反應(yīng)，其中將兩種被取代的芳環(huán)轉(zhuǎn)化成芳基硼酸，然后使用經(jīng)謹(jǐn)慎選擇的鈀催化劑通過鹵代烷連接。這些反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，并且可應(yīng)用此處公開的用于合成這些化合物的信息確定這些反應(yīng)的條件。
實(shí)施例13列出若干根據(jù)本發(fā)明方法合成的二芳基烷烴和二芳基烷醇的IC50值。采用實(shí)施例2所述的通法評價這些化合物。采用動力學(xué)軟件計(jì)算各樣品的IC50值以驗(yàn)證所述反應(yīng)在特定時間和濃度呈線性。應(yīng)用實(shí)施例7-12中所述的方法，總共合成24種化合物，并評價了它們抑制酪氨酸酶的能力。結(jié)果如表2所示。根據(jù)表2可見，合成二芳基烷醇的IC50與天然存在的二芳基丙烷相近。因此，這兩類化合物可以大致相同的程度抑制酪氨酸酶。最具活性的二芳基烷烴和/或二芳基烷醇在兩個芳環(huán)間有三個碳。采用如實(shí)施例17中所述的計(jì)算方法，證明該結(jié)構(gòu)特征對于產(chǎn)生平行及重疊(superimposed)的分子內(nèi)構(gòu)象而言是必需的。然而，在兩個芳環(huán)間含二個以及四個碳的二芳基烷醇如1-(2，4-二羥基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇(IC50＝77μM)以及1，4-雙-3，4-二羥基苯基)-2，3-二甲基-丁烷(buthane)(IC50＝700μM)也可顯著抑制酪氨酸酶活性。
如實(shí)施例14所示，應(yīng)用如實(shí)施例2所述方法，采用L-DOPA作為底物評價UP302a(2)對酪氨酸酶的抑制。結(jié)果如圖10所示。這項(xiàng)研究顯示UP302a(2)是具有長效作用的強(qiáng)競爭性抑制劑。有趣地，酪氨酸酶活性在與UP302a溫育后幾天不會恢復(fù)。相反，酪氨酸酶活性在與曲酸溫育后僅1小時就完全恢復(fù)。由于UP302a芳環(huán)上的兩個取代基是甲氧基，所以該抑制劑并不易被羥基化和/或氧化。這也許可以同時解釋UP302a抑制活性的效力和持續(xù)時間。因此，可推斷這些化合物將具有長效的作用。
如實(shí)施例15所述，通過在體外試驗(yàn)中測定對B-16細(xì)胞系生成黑素的抑制也證實(shí)了所要求保護(hù)的組合物的效能。結(jié)果如圖11所示。UP302a(2)對內(nèi)源性黑素的減少作用比曲酸幾乎高6倍。此外，UP302a對MSH誘導(dǎo)的黑素生成的抑制也顯著高于曲酸。如所期待的，UP288(1)在B-16細(xì)胞系模型中與曲酸相當(dāng)。
實(shí)施例16描述了評定兩種二芳基丙烷UP288(1)和UP302a(2)相對于曲酸的細(xì)胞毒性的試驗(yàn)。在高于所有3種受試化合物IC50的濃度——250μM下，證實(shí)二芳基丙烷具有與曲酸類似的安全特性。
實(shí)施例17描述了所進(jìn)行的用以確定活性二芳基烷烴及二芳基烷醇最穩(wěn)定的3-D構(gòu)象的分子模型分析。使用Chem3D軟件進(jìn)行分子力學(xué)計(jì)算。這些計(jì)算揭示，最有效的酪氨酸酶抑制劑1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a(2)，IC50＝0.24μM)具有如實(shí)施例12所示的兩個芳環(huán)彼此重疊的非常獨(dú)特的三維構(gòu)象。該構(gòu)象的最低總能量是-4.7034KJ/Mol，且兩個芳環(huán)的間距是3.28。分別如圖14所示，第一個芳環(huán)上的酚羥基正好在第二個芳環(huán)上的兩個甲氧基的上方，與兩個氧原子的間距是2.99和3.16。雙核酶酪氨酸酶的活性部位具有螯合至過氧化物氧化態(tài)[Cu″-O2-Cu″]的氧分子的兩個銅離子，這是酪氨酸酶催化向單酚(如酪氨酸)芳環(huán)鄰位引入羥基機(jī)制的關(guān)鍵。(Decker等(2000)Angew.Chem.Int.Ed.391591)。據(jù)報(bào)道的原子間距是Cu-Cu3.56、Cu-O 1.90以及O-O 1.41(Kitajima等(1989)Am.Chem.Soc.1118975)。如圖13和圖14所示，1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)丙烷(UP302a，IC50＝0.24μM)的平行構(gòu)象可從頂端及底端完美地螯合[Cu″-O2-Cu″]絡(luò)合物的兩個銅離子。抑制劑在活性部位與兩個銅離子的雙螯合可完全阻斷如L-Dopa的底物接近酶，因而有效地抑制蛋白質(zhì)的功能。使用相同的方法，分析了表2所列的經(jīng)分離及合成所得的二芳基烷烴和二芳基烷醇。分析結(jié)果顯示具有扭曲(twisted)或非平行構(gòu)象的化合物不具有或者僅有弱的抑制酪氨酸酶活性的能力。
從這些研究中可以確定，最有效的二芳基烷烴抑制劑在第一個芳環(huán)上有兩個至三個取代基并且在第二個芳環(huán)上有零至多個取代基。最有利的結(jié)構(gòu)是那些至少有一個芳環(huán)在2及4位被取代。通過兩個經(jīng)分離的化合物1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫化-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙醇，IC50＝72μM及3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇，IC50＝225μM證實(shí)，優(yōu)選的環(huán)是6元芳環(huán)和/或雜芳環(huán)。
本發(fā)明的組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法給藥。給藥方式包括但不限于胃腸道(口服)給藥、非胃腸道(靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi))給藥以及局部施用。本發(fā)明的治療方法包括向有需要的患者內(nèi)部或局部給藥治療有效量的二芳基烷烴或者包含一種或更多種二芳基烷烴的混和物。
本發(fā)明組合物可被配制成藥物組合物，其包含如藥物學(xué)和/或美容學(xué)(cosmetically)可接受的賦形劑、佐劑和/或載體的組分。例如，本發(fā)明的組合物可在所治療的主體能耐受的賦形劑內(nèi)配制。賦形劑是用作如二芳基烷烴或二芳基烷烴混和物的治療藥物的稀釋劑或載體(vehicle)的惰性物質(zhì)。這種賦形劑的實(shí)例包括但不限于水、緩沖劑、鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、甘露醇、Hank溶液、防腐劑及其他含水的生理學(xué)平衡鹽溶液。還可以使用如不揮發(fā)性油類、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯的非水載體。其他可用的劑型包括包含粘度增強(qiáng)劑如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖的混懸劑。賦形劑還可包含微量的添加劑，如提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)。緩沖劑的實(shí)例包括磷酸鹽緩沖劑、碳酸氫鹽緩沖劑、三羥甲基氨基甲烷緩沖劑、組氨酸、檸檬酸鹽及甘氨酸或其混和物，而防腐劑的實(shí)例包括但不限于EDTA、乙二胺四乙酸二鈉、BHA、BHT、維生素C、維生素E、亞硫酸氫鈉、SnCl2、硫柳汞、m-或o-甲酚、福爾馬林和苯甲醇。標(biāo)準(zhǔn)劑型可為液體或固體，其可被適當(dāng)液體吸收(taken up)，成為用于給藥的混懸劑或溶液。因此，在非液體劑型中，賦形劑可包括葡萄糖、人血清白蛋白、防腐劑等等，在給藥前可向其中加入無菌水或者鹽水。
在本發(fā)明一個具體實(shí)施方案中，所述組合物還可包含佐劑或載體。佐劑通常是一般可提高主體對特定生物活性劑的生物反應(yīng)的物質(zhì)。適宜的佐劑包括但不限于弗氏(Freund)佐劑、其他細(xì)菌細(xì)胞壁成分，鋁、鎂、銅、鋅、鐵、鈣及其他金屬離子基鹽，硅石、多核苷酸、類毒素、血清蛋白、病毒外殼蛋白、其它的細(xì)菌衍生制劑、γ干擾素；嵌段共聚物佐劑；如Hunter′s Titermax佐劑(Vaxcel.TM.，Inc.Norcross，Ga.)、Ribi佐劑(可從Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.獲得)；以及皂苷和其衍生物，如Quil A(可從Superfos Biosector A/S，丹麥獲得)。載體通常是可提高治療組合物在所治療的主體內(nèi)的半衰期的混和物。適宜的載體包括但不限于聚合控釋劑型、可生物降解的植入劑、脂質(zhì)體、細(xì)菌、病毒、油、酯和二醇類。
在一個具體實(shí)施方案中，所述組合物被制備成將本發(fā)明組合物緩慢釋放到主體內(nèi)的控釋劑型。本文所使用的控釋劑型包含在控釋載體內(nèi)的本發(fā)明組合物。適宜的控釋載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知。優(yōu)選的控釋劑型是可生物降解的(即可生物侵蝕的(bioerodible))。
本發(fā)明的治療劑優(yōu)選通過任意適宜的方法局部給藥，本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的局部給藥治療組合物的方法包括但不限于軟膏劑、凝膠劑、洗液、或者乳膏基質(zhì)、或者作為牙膏、漱口液或牙線上涂敷的物質(zhì)、或者作為乳劑、作為貼劑、敷料(dressing)或面膜、無粘性紗布、繃帶、藥簽(swab)或布拭子(cloth wipe)。實(shí)施例18描述活性含量為配方總重量的0.01％及0.1％的純二芳基烷烴和/或二芳基烷烴混和物的兩種乳膏劑型的制劑。這種局部施用可采用局部給藥已知的任意標(biāo)準(zhǔn)手段向任何患病區(qū)域局部給藥。根據(jù)給藥的方法，治療組合物可以各種單位劑量形式給藥。對于特定的遞送模式而言，本發(fā)明的治療組合物可在本發(fā)明賦形劑內(nèi)配制。本發(fā)明的治療試劑可給藥于任何主體，優(yōu)選哺乳動物，以及更優(yōu)選人類。特定的給藥方式將取決于要治療的病癥。
在一個具體實(shí)施方案中，適宜的軟膏劑包含所需濃度——即通常選自基于局部給藥制劑總重量的0.001％到100％的范圍內(nèi)的有效、非毒性的量——的單種二芳基烷烴或者兩種或更多種二芳基烷烴的混和物，從65到100％(優(yōu)選75到96％)的白色軟石蠟、從0到15％的液體石蠟、以及從0到7％(優(yōu)選3到7％)的羊毛脂或其衍生物或合成等效物。在另一個具體實(shí)施方案中，該軟膏劑可包含聚乙烯液體石蠟基質(zhì)。
在一個具體實(shí)施方案中，適宜的乳膏劑包含乳化系統(tǒng)以及所需濃度的如上所提供的單種二芳基烷烴或者兩種或更多種二芳基烷烴的混和物。所述乳化系統(tǒng)優(yōu)選包含2到10％的聚氧乙烯醇(如可以商品名CetomacrogolTM1000獲得的混和物)、從10到25％的十八烷醇、從20到60％的液體石蠟和從10到65％的水；以及一種或更多種防腐劑，如從0.1到1％的N，N″-亞甲基二[N′-[3-(羥基甲基)-2，5-二氧代-4-咪唑烷基]脲](可以商品名Imidurea USNF獲得)、從0.1到1％的4-羥基苯甲酸烷基酯(如可從Nipa Laboratories獲得的商品名為Nipastat的混和物)、從0.01到0.1％的4-羥基苯甲酸丁酯鈉(可從Nipa Laboratories獲得，商品名為Nipabutyl sodium)、以及從0.1到2％的苯氧乙醇。
在一個具體實(shí)施方案中，適宜的凝膠劑包含半固體系統(tǒng)，其中液相被束縛至高度交聯(lián)的三維聚合基質(zhì)內(nèi)。該液相可包含水、以及所需量的單利二芳基烷烴或者兩種或更多種二芳基烷烴的混和物，從0到20％的可與水混溶的添加劑如甘油、聚乙二醇或丙二醇，以及從0.1到10％、優(yōu)選從0.5到2％的增稠劑，其可為選自包括但不限于黃蓍膠、果膠、角叉菜膠、瓊脂和藻酸組中的天然產(chǎn)物或者選自包括但不限于甲基纖維素和羧聚乙烯(卡波普(carbopol))組中的合成或半合成化合物，以及一種或更多種選自包括但不限于如從0.1到2％的4-羥基苯甲酸甲酯(對羥基苯甲酸甲酯)或苯氧乙醇-differential(phenoxyethanol-differential)組中的防腐劑。另一適宜的基質(zhì)(base)包含所需量的單種二芳基烷烴或二芳基烷烴的混和物、以及70到90％的聚乙二醇(例如含40％聚乙二醇3350及60％聚乙二醇400、依照美國National Formulary(USNF)配制的聚乙二醇軟膏劑)、從5到20％的水、從0.02到0.25％的抗氧化劑(例如丁羥甲苯)以及從0.005到0.1％的螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))。
如上所應(yīng)用的術(shù)語軟石蠟涵蓋乳膏劑或軟膏劑基質(zhì)白色軟石蠟和黃色軟石蠟。術(shù)語羊毛脂涵蓋原生羊毛脂(native wool fat)和精制羊毛脂。羊毛脂的衍生物特別包括被化學(xué)修飾以改變它們的物理或化學(xué)性質(zhì)的羊毛脂，以及羊毛脂的合成等價物，特別包括藥物學(xué)和美容學(xué)領(lǐng)域已知的用作羊毛脂的替代物并且可被稱作羊毛脂替代物的合成或半合成的化合物和混和物。
一種可使用的適當(dāng)?shù)难蛎铣傻葍r物是可以SoftisanTM的商品名獲得的物質(zhì)，其稱為Softisan 649TM?？蓮腄ynamit Nobel Aktiengesellschaft獲得的Softisan 649是天然植物脂肪酸、異硬脂酸以及己二酸的甘油酯；其性質(zhì)已由H.Hermsdorf在Fette，Seifen，Anstrichmittel，Issue No.84，No.3(1982)，pp.3-6中論述。
上文提及的作為適宜的軟膏劑或乳膏劑基質(zhì)成分的其他物質(zhì)和它們的性質(zhì)在標(biāo)準(zhǔn)參考資料如藥典中論述。Cetomacrogol 1000的化學(xué)式為CH3(CH2)m(OCH2CH2)nOH，其中m可為15或17且n可為20到24。丁羥甲苯是2，6-二叔丁基-對甲酚。Nipastat是4-羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的混和物。
可通過常規(guī)制藥技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的組合物。因此，例如上述組合物可通過在優(yōu)選60-70℃的高溫下混合軟石蠟、若存在的話液體石蠟、以及羊毛脂或其衍生物或合成等價物方便地制備。然后可將該混和物冷卻至室溫，并且在添加莫匹羅星水合晶體鈣鹽(hydrated crystalline calcium saltof mupirocin)以及皮質(zhì)甾類(corticosteroid)和任何其它成分后攪拌以確保充分分散。
與給藥方式無關(guān)，特定劑量根據(jù)主體的大概體重計(jì)算。涉及上述各種劑型時，確定適宜的治療劑量所必需的對計(jì)算結(jié)果的進(jìn)一步改進(jìn)由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)地進(jìn)行，并且在他們不需過度試驗(yàn)即可執(zhí)行的任務(wù)的范圍內(nèi)，特別是在考慮此處所公開的劑量信息以及試驗(yàn)的情況下。這些劑量可通過應(yīng)用已建立的確定使用劑量的試驗(yàn)，并結(jié)合適當(dāng)?shù)膭┝?反應(yīng)數(shù)據(jù)確定。
以下實(shí)施例僅提供用于說明性目的，而非用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1.從干的植物制備有機(jī)提取物將干的植物材料磨碎至粒徑不超過2mm，并轉(zhuǎn)移一部分(60g)至錐形瓶中用600ml的甲醇∶二氯甲烷(1∶1)萃取。將該混和物振搖1小時，過濾，并且再次用甲醇∶二氯甲烷(1∶1)(600ml)萃取該生物物料。合并有機(jī)提取物，并在真空下蒸發(fā)以提供源自各植物材料的有機(jī)提取物。然后將各提取物(約75mg)溶解于1.5ml DMSO中，至濃度為50mg/ml，接著將其置于-70℃冷凍裝置中貯存。將該萃取液的等分試樣用于如實(shí)施例2所述的酪氨酸酶試驗(yàn)。
實(shí)施例2.酪氨酸酶抑制試驗(yàn)采用Jones等(2002)Pigment.Cell Res.15335所報(bào)道的方法進(jìn)行酪氨酸酶抑制試驗(yàn)。使用該方法，在酪氨酸酶的底物L(fēng)-Dopa轉(zhuǎn)化成多巴色素后在450nm監(jiān)測吸收。將酪氨酸酶在50mM磷酸鉀緩沖液、pH 6.8(試驗(yàn)緩沖液)中配制成2000U/ml，并在使用前以1ml等分試樣于-20℃貯存。在試驗(yàn)中使用時，將儲備酶溶液解凍并用試驗(yàn)緩沖液稀釋至200U/ml。每次試驗(yàn)制備在試驗(yàn)緩沖液中的2mM底物L(fēng)-DOPA的工作溶液(working solution)。將樣品溶于10％的DMSO(0.5ml)，并用試驗(yàn)緩沖液稀釋至5ml。該反應(yīng)混和物由0.050ml 2mM L-DOPA、0.050ml200U/ml蘑菇酪氨酸酶和0.050ml抑制劑組成。用試驗(yàn)緩沖液將反應(yīng)體積調(diào)整至200μl。試驗(yàn)在96孔Falcon 3097平底微量滴定板(BecktonDickinson，NJ)上進(jìn)行。用WALLAC 1420 Multilable Counter(土爾庫，芬蘭)測定出現(xiàn)的多巴色素。平均速度由測定450nm處每分鐘吸光度(ΔA450)的變化的線性酶速率確定。通過利用公式(1)比較樣品相對于對照的吸光度確定試樣對酪氨酸酶的抑制百分比(陰性對照吸收-樣品吸收)/陰性對照吸收×100(1)結(jié)果如表1所示表1.四種植物提取物的酪氨酸酶抑制活性

實(shí)施例3.活性植物提取物的HTP分級分離將活性有機(jī)提取物(400mg)裝至預(yù)先填充、正相的快速柱中。(2cmID×8.2cm，10g硅膠)。用Hitachi高通量純化(HTP)系統(tǒng)采用5mL/min流速下30分鐘內(nèi)(A)50∶50的乙酸乙酯∶己烷及(B)甲醇從100％A到100％B的梯度流動相洗脫該柱。應(yīng)用寬波段波長UV檢測器監(jiān)測分離，并使用Gilson流分收集器將流分以1.9mL/孔收集至96-深-孔板中。低真空下干燥樣品板并離心。使用DMSO(1.5mL)溶解各孔的樣品，取一部分(100μL)一式兩份用于酪氨酸酶抑制試驗(yàn)。
實(shí)施例4.自小構(gòu)樹(BK)(整株)中提取、分離及純化1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(1) 將小構(gòu)樹(100g整株)磨碎并用800ml的MeOH∶DCM(1∶2)萃取3次。使用硅膠柱，以己烷/乙酸乙酯(50/50)到MeOH的梯度溶劑分級分離干提取物(6g)。收集2套88試管的流分。應(yīng)用LC/MS/PDA檢驗(yàn)各流分，然后基于其組分的相似性將各流分合并。蒸發(fā)該合并的流分以除去溶劑、干燥并且如實(shí)施例2所述方法測定他們對酪氨酸酶的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流分(P0346-HTP-F2-P0346-HTP-F4)最具活性，并將這些流分合并且標(biāo)記為BK-F2--4。蒸發(fā)溶劑后，采用水/MeOH梯度以預(yù)填充的反相柱(C-18柱)進(jìn)一步分離BK-F2--4。分離后觀察到18個化合物峰。進(jìn)行14個反相柱并且在每次運(yùn)行中合并相似的流分。在合并及富集的流分中，被稱作UP288的化合物峰顯示出強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性(圖4)。用制備HPLC分離和純化后，獲得6mg的1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)(1)。使用MS和NMR譜(1H、13C、HMQC和HMBC)闡明該化合物的結(jié)構(gòu)。圖5描述UP288的化學(xué)結(jié)構(gòu)和13C-NMR譜。IC50值為24μM的UP288是活性與曲酸相當(dāng)?shù)睦野彼崦敢种苿D6圖示UP288和曲酸的酪氨酸酶抑制劑量反應(yīng)曲線以及IC50值。
1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷(UP288)。收率0.006％(純度＞96％，HPLC)；UVλMax281.0nm；MS(超聲電離(Super Sound Ionization)、陽離子檢測)m/z 289(M+1，100％)；1H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ1.70(2H，m，CH2)，2.46(4H，m，2CH2)，3.68(3H，s，OCH3)，3.73(3H，s，OCH3)，6.26(1H，q，H-5)，6.35(1H，d，H-3)，6.55(1H，q，H-14)，6.65(1H，d，H-13)，6.72(1H，d，H-16)，6.86(1H，d，H-6)，8.69(1H，s，OH)，9.20(1H，s，OH)；13C-NMR(100MHz，(CD3)2SO)δ28.5(C-8)，31.6(C-9)，34.5(C-10)，55.0(C-7)，55.6(C-17)，98.9(C-3)，106.4(C-5)，112.4(C-16)，115.2(C-13)，119.7(C-1)，119.8(C-14)，120.3(C-11)，120.4(C-6)，132.9(C-12)，144.6(C-4)，147.2(C-17)& 158.3(C-7)。
實(shí)施例5.自山菅(P0389)(整株)提取、分離和純化1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a)(2)及1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷(UP302b)(3) 將山菅(P0389，300g整株)磨碎并用800ml的MeOH∶DCM(1∶2)萃取3次。使用硅膠柱，以己烷/乙酸乙酯(50/50)到MeOH的梯度溶劑分級分離干提取物(5g)。收集2套264試管的流分。應(yīng)用LC/MS/PDA檢驗(yàn)每份流分，然后基于其組分的相似性將流分合并成22流分。(圖7)。蒸發(fā)該合并的流分以除去溶劑、干燥并且如實(shí)施例2所述測定它們的酪氨酸酶抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流分P0389-HTP-F12、P0389-HTP-F13及P0389-HTP-F14最具活性，并將這些流分合并且重新標(biāo)記為DE-F12-14。蒸發(fā)溶劑后，采用水/MeOH梯度在預(yù)填充反相柱(C-18柱)進(jìn)一步分離DE-F12--14。分離后觀察到兩個較大的及十一個較小的化合物峰。由7次額外的RP-柱分離，分離出分別對應(yīng)于這些峰的化合物。將所有收集的化合物干燥并測試?yán)野彼崦敢种苹钚?。十一個較小峰中被分別稱為UP302a和UP302b的兩個顯示出強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性(圖8)。分離和純化后獲得兩種活性化合物1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a，10mg)(2)及1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷(UP302b，6mg)(3)。使用MS和NMR譜(1H、13C、gHSQC和HMBC)闡明這兩種化合物的結(jié)構(gòu)。圖9所示為UP302a的gHSQC譜。酪氨酸酶抑制試驗(yàn)顯示，UP302a是最有效的抑制劑，其IC50是0.24μM，而UP302b的IC50是12μM。
1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a)(2)。收率0.02％(純度＞98％，HPLC)；UVλMax279.8nm；MS(超聲電離、陽離子檢測)m/z 303(M+1，100％)；1H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ1.70(2H，m，CH2)，2.03(3H，s，CH3)，2.43(2H，m，CH2)，2.49(2H，m，CH2)，3.58(3H，s，OCH3)，3.73(3H，s，OCH3)，6.11(1H，q，H-16)，6.25(1H，d，H-14)，6.65(1H，d，H-5)，6.76(1H，d，H-17)，6.97(1H，d，H-6)，8.93(1H，s，OH)，9.03(1H，s，OH)；13C-NMR(100MHz，(CD3)2SO)δ28.8(C-9)，29.3(C-11)，31.1(C-10)，55.3(C-7)，55.9(C-8)，102.4(C-14)，105.8(C-16)，106.1(C-5)，118.4(C-1)，118.6(C-12)，126.9(C-3)，127.0(C-6)，130.1(C-17)，155.7(C-13)，156.2(C-15)，156.3(C-4)以及156.8(C-2)。
1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷(UP302b)(3)。收率0.01％(純度＞95％，HPLC)；UVλMax279.8nm；MS(超聲電離、陽離子檢測)m/z 303(M+1，100％)；1H-NMR(400MHz，(CD3COCD3)δ1.82(2H，m，CH2)，2.07(3H，s，CH3)，2.52(2H，m，CH2)，2.56(2H，m，CH2)，3.63(3H，s，OCH3)，3.77(3H，s，OCH3)，6.64(1H，q，H-15)，6.72(1H，d，H-14)，6.64(1H，d，H-5)，6.70(1H，d，H-17)，7.00(1H，d，H-6)，7.65(1H，s，OH)以及7.69(1H，s，OH)。
實(shí)施例6.從山菅(DE)(整株)大規(guī)模分離1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷(UP302a)(2)收集、磨碎山菅(4.3kg整株)并使用滲濾式浸出器(percolationextractor)以甲醇為溶劑萃取3次。合并萃取液并蒸發(fā)以除去甲醇。然后將粗提物懸浮于水中并用DCM分配。分離各層并蒸干DCM層以提供60g的物質(zhì)。對兩層的LC-MS/PDA分析顯示，大部分UP302a存在于DCM層，僅少量存在于水層。用己烷-ETOAC梯度在3個單獨(dú)的硅膠柱上洗脫分級分離該DCM萃取液?？偣搏@得15個亞流分(sub-fractions)并用HPLC-MS/PDA分析。在流分6到9中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物(UP302a)，將它們合并共得到3g富集的UP302a。用水-MeOH梯度在填充CG-161樹脂的空心柱(open column)中洗脫對富集的UP302a作進(jìn)一步分離。對流分15到21的洗脫中共收集到23份含有UP302a的流分。然后合并流分15-21并蒸發(fā)溶劑得到700mg的固體，通過C-18柱以制備HPLC進(jìn)一步純化得到30mg的UP302a。經(jīng)NMR、酶抑制試驗(yàn)和LC-MS/PDA證實(shí)該經(jīng)純化的產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)、酪氨酸酶抑制活性和純度。
實(shí)施例7.通過硼氫化鈉還原被取代的查耳酮合成二芳基烷烴以下利用2，4-二羥基)-3′，4′-二甲氧基查耳酮(4)舉例說明通過用硼氫化鈉還原被取代的查耳酮合成二芳基烷烴的通法。
將2，4-二羥基-3′，4′-二甲氧基查耳酮(4)(40mg)溶于1-丙醇(5ml)，然后加入硼氫化鈉(15mg)，使該混和物在室溫下反應(yīng)2小時。反應(yīng)完成時，加入20％乙酸(0.2ml)，將該混和物于80℃加熱5分鐘并冷卻。然后在預(yù)填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脫分離該混和物以提供1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)。通過MS、UV光譜、1D和2D1H-NMR證實(shí)化合物(5)的結(jié)構(gòu)。
1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(5)。收率60％(純度＞98％，HPLC)；UVλMax278.5nm；MS(超聲電離，陽離子檢測)m/z305(M+1，100％)；1H-NMR(400MHz，(CD3)2SO)δ1.93(2H，m，CH2)，2.60(2H，m，CH2)，4.49(1H，m，CH-OH)，3.78(3H，s，OCH3)，3.80(3H，s，OCH3)，6.28(1H，q，H-5)，6.31(1H，d，H-3)，6.98(1H，d，H-6)，6.71(1H，q，H-5′)，6.77(1H，d，H-2′)，6.83(1H，d，H-6′)。
利用上述通法可將下列化合物還原成其相應(yīng)的醇2，4-二羥基-2′-羥基查耳酮、2′-羥基-4′-甲氧基-2，4-二甲氧基-查耳酮、4′-羥基-4-羥基-查耳酮、2′，4′-二羥基-2-羥基-查耳酮、2′，4′-二羥基-3，4-二甲氧基-查耳酮、2′，4′，6′-三甲氧基-3，4-二甲氧基-查耳酮和2′-羥基-4′-甲氧基-3，4，5-三甲氧基-查耳酮以提供1-(2，4二羥基苯基)-3-(2′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(4-羥基苯基)-3-(4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇和1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇。
實(shí)施例8.通過硼氫化鈉還原被取代的二芳基丙酮合成被取代的二苯基丙醇以下利用1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙酮(6)舉例說明通過用硼氫化鈉還原被取代的二芳基丙酮合成被取代的二苯基丙醇的通法。

將1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙酮(6)(5mg)溶于1-丙醇(1ml)，然后加入硼氫化鈉(2mg)，使該混和物在室溫下反應(yīng)5小時。反應(yīng)完成時，加入20％乙酸(0.2ml)中和過量的硼氫化鈉。然后在預(yù)填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脫分離該反應(yīng)混和物以提供1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇(7)。
按照上述的合成通法還原下列二芳基烷烴化合物1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙酮、3-(5′-芐氧基-4′-甲氧基-2′-甲基苯基)-1-(2-羥基-4，5-二甲氧基苯基)-1-丙酮、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫-bezo(b)dioxocin-8′-基)-1-丙酮以及3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-1-丙烯酮以分別提供1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、3-(5′-芐氧基-4′-甲氧基-2′-甲基苯基)-1-(2-羥基-4，5-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基-苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫-bezo(b)dioxocin-8-基)-1-丙烯醇以及3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基-苯基)-1-丙烯醇。
實(shí)施例9.1，3-雙(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇(9)的合成 將1，3-雙(2，4-甲氧基苯基)-丙-1，3-二酮(8)(5mg)溶于1-丙醇(1ml)，然后加入硼氫化鈉(3mg)，并使該混和物在室溫下反應(yīng)3小時。反應(yīng)完成時，加入20％乙酸(0.2ml)中和過量的硼氫化鈉。然后在預(yù)填充的C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脫分離該混和物以提供1，3-雙(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇(9)。
實(shí)施例10.從新橙皮苷合成1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇(11) 新橙皮苷是二氫查耳酮的糖苷。將總重100mg的新橙皮苷懸浮于1NHCl 10ml中并于80℃加熱2小時。冷卻水解產(chǎn)物(10)并用乙酸乙酯(3×10ml)萃取。合并乙酸乙酯層，蒸發(fā)除去乙酸乙酯并溶解于1-丙醇(5ml)中。向丙醇溶液中加入硼氫化鈉(25mg)并在室溫下攪拌2小時。反應(yīng)完成后，在預(yù)填充C18柱上以MeOH/H2O梯度洗脫分離該混和物以提供1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇(11)。
實(shí)施例11.提取、純化及結(jié)構(gòu)修飾紫鉚苷(Butrin)以合成1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二羥基苯基)-1-丙醇(14) 紫鉚苷是從紫鉚(Butea frondosa)干花中用甲醇萃取并經(jīng)多次反相柱色譜分離純化的高含量黃烷酮糖苷。在用HCl水解除去糖后生成紫鉚黃酮(12)，并通過RP-HTP純化(整株收率1.5％)。于80℃用10％氫氧化鈉處理紫鉚黃酮以獲得紫鉚花素(13)，將其用硼氫化鈉還原得到1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二羥基苯基)-1-丙醇(14)(IC50＝250nM)。
實(shí)施例12.1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′羥基苯基)-1-丙醇(19)的合成 將間苯二酚(15)、3-甲氧基-4-羥基-肉桂酸(16)及H2SO4(5％)在THF中回流4小時得到7，4′-二羥基-3′-甲氧基黃烷酮(17)(90％收率)。然后將產(chǎn)物7，4′-二羥基-3′-甲氧基黃烷酮(17)用10％氫氧化鈉在80℃處理1小時，隨后在丙醇中用硼氫化鈉還原以提供如LC-MS/PDA檢測證實(shí)的1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇(19)。該粗產(chǎn)物顯示出相當(dāng)強(qiáng)的酪氨酸酶抑制活性。通過HTP對混和物作進(jìn)一步純化。
實(shí)施例13.測定合成二芳基烷烴抑制酪氨酸酶的IC50使用實(shí)施例2所述方法測定合成二芳基烷烴對酪氨酸酶的抑制。采用動力學(xué)軟件計(jì)算各樣品的IC50值以驗(yàn)證反應(yīng)在特定時間和濃度呈線性。應(yīng)用實(shí)施例7-12所述方法，總共合成24種化合物，并評價它們抑制酪氨酸酶的能力。結(jié)果如表2所示。
表2.合成二芳基烷烴和/或二芳基烷醇的IC50值

實(shí)施例14.酶抑制動力學(xué)應(yīng)用如實(shí)施例2所述方法，以0.75、1.25及2.5mM濃度的L-DOPA為底物評價不同濃度(0、261、522、1044nM)的抑制劑(UP302a)對酪氨酸酶的抑制。如圖10所示，發(fā)現(xiàn)UP302a是具有強(qiáng)效及長效抑制作用的競爭性抑制劑。酪氨酸酶活性在與UP302a溫育后幾天不會恢復(fù)。相反，酪氨酸酶活性在與曲酸溫育后僅1小時就完全恢復(fù)。
實(shí)施例15.對B-16細(xì)胞系黑素生成的抑制采用兩個不同的試驗(yàn)評價對黑素生成的抑制。在第一個試驗(yàn)中，評價未經(jīng)β-MSH誘導(dǎo)的黑素生成的抑制；而在第二個試驗(yàn)中，測定對在細(xì)胞培養(yǎng)基中經(jīng)β-MSH誘導(dǎo)的黑素生成的抑制。簡而言之，使B16 F1細(xì)胞(ATCC#_CRL-622)生長至融合，然后每孔接種40,000個細(xì)胞。允許細(xì)胞在含5％CO2的濕潤環(huán)境、37℃下貼壁(attach)整夜。第二天，將抑制劑以0-1000μM濃度范圍一式三份加至細(xì)胞中并允許溫育4天。通過加入在0-1000nM濃度范圍內(nèi)、以10倍增加的濃度的激素確定誘導(dǎo)黑素形成要求的β-MSH的量。一旦適當(dāng)?shù)摩?MSH濃度確定，將細(xì)胞如上述所述接種，允許其貼壁整夜，然后與0-1000μM濃度范圍內(nèi)的酪氨酸酶抑制劑共同溫育。每個早上目視監(jiān)測顏色變化。顯色后，從各孔中取出200μl細(xì)胞上清液并于450nm測定吸光度。結(jié)果讀數(shù)用于測定有和無β-MSH誘導(dǎo)下的細(xì)胞試驗(yàn)中黑素形成的IC50。為了對細(xì)胞毒性進(jìn)行初步比較，用250μM經(jīng)處理的孔進(jìn)行乳酸脫氫酶試驗(yàn)(LDH)。LDH是自受損或死亡細(xì)胞中泄漏出的代謝酶。該酶在NAD+存在下轉(zhuǎn)化發(fā)色團(tuán)而產(chǎn)生可被分光光度計(jì)監(jiān)測的變色。
該試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有經(jīng)測試的天然抑制劑(UP288、UP302a和UP302b)若不是優(yōu)于曲酸的話至少也與曲酸相當(dāng)。在兩組條件下的IC50值存在某些差異。曲酸的抑制從內(nèi)源性試驗(yàn)的1C50170μM到誘導(dǎo)試驗(yàn)中的IC5067μM有所改善。相對于曲酸，在經(jīng)測試的抑制劑中化合物UP302b是唯一顯示在兩組條件下IC50增加的，從IC505.2μM增加至IC5034μM。所有經(jīng)測試的化合物所測定的對酪氨酸酶抑制的IC50相對相同，UP302和UP302b兩種化合物例外，相對于內(nèi)源性試驗(yàn)的28μM和5.2μM以及誘導(dǎo)試驗(yàn)中的40μM和34μM，它們分別具有0.2μM和0.3μM的低IC50。這些差異可能是由于UP302a(2)和UP302b(3)相對于其它的抑制劑降低了對細(xì)胞的穿透性。然而，這通過它們對酶的抑制強(qiáng)度得以克服。
表3提供了UP288和UP302a抑制劑相對于曲酸的兩個試驗(yàn)的結(jié)果。
實(shí)施例16.細(xì)胞毒性試驗(yàn)將經(jīng)化合物處理的孔用于進(jìn)行乳酸脫氫酶試驗(yàn)(LDH)。LDH是自受損或死亡的細(xì)胞泄露出的代謝酶。該酶在NAD+存在下轉(zhuǎn)化發(fā)色團(tuán)而產(chǎn)生可被分光光度計(jì)監(jiān)測的變色。在250μM濃度下檢驗(yàn)細(xì)胞毒性。在此濃度下，這些化合物中沒有比曲酸顯著得多的細(xì)胞毒性。然而，應(yīng)當(dāng)指出的是僅檢測了一個濃度(250μM)的細(xì)胞毒性。如表3所示，UP288(1)和UP302a(2)顯示出與曲酸相當(dāng)?shù)闹械鹊募?xì)胞毒性。
表3.分離獲得的化合物在小鼠B16F1細(xì)胞中對蘑菇酪氨酸酶和黑素形成的抑制以及細(xì)胞毒性的比較

實(shí)施例17.分子力學(xué)(MM2)計(jì)算利用Chem3D軟件進(jìn)行分子力學(xué)計(jì)算，以使能量最低化并確定最穩(wěn)定的3-D構(gòu)象。使用以下參數(shù)步距(Step interval)＝2.0fs、構(gòu)造間隔(frame interval)＝10fs、10,000步后停止、加熱/冷卻速率＝1.000Kcal/原子/PS、目標(biāo)溫度＝3000K。性質(zhì)π鍵序及空間能量總結(jié)。分析了所有天然及合成化合物以及其他二芳基烷烴和二芳基烷醇的結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)分離自山菅(L.)整株的最有效的酪氨酸酶抑制劑1-(3-甲基-2,4-二甲氧基苯基)-3-2,4-二羥基苯基)-丙烷(UP302a(2)，IC50＝0.24μM)具有兩個芳環(huán)彼此重疊的非常獨(dú)特的3維構(gòu)象。此構(gòu)象的最小總能量是-4.7034KJ/Mol。兩個芳環(huán)的間距是3.28。分別如圖12-14所示，第一個芳環(huán)的酚羥基正好在第二個芳環(huán)兩個甲氧基的上方，與兩個氧原子的間距是2.99和3.16。該分子內(nèi)平行構(gòu)象允許該化合物從頂端及底端完美地螯合處于過氧化物形式[Cu″-O2-CuII]時的雙核酶的兩個銅離子。
實(shí)施例18.將二芳基烷烴組合物配制成乳膏劑UP302a包含被取代的二芳基丙烷作為主要的活性成分。這些化合物可溶于高極性溶劑，包括但不限于乙醇、丙二醇和乙二醇。它們可與藥物學(xué)可接受和/或美容學(xué)可接受的賦形劑、佐劑和/或載體共同配制。這種賦形劑的實(shí)例包括但不限于水、緩沖劑、鹽水、Ringer溶液、葡萄糖溶液、甘露醇、Hank溶液、防腐劑及其他含水的生理學(xué)平衡鹽溶液。還可以使用包括但不限于不揮發(fā)性油類、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯的非水載體。其他可用的劑型包括但不限于包含粘度增強(qiáng)劑的混懸劑，所述粘度增強(qiáng)劑包括但不限于羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。賦形劑還可包含微量的添加劑或者防腐劑，如改善顏色和化學(xué)穩(wěn)定性的抗氧化劑。UP302還可制備成脂質(zhì)體劑型以增加其皮膚穿透性或者制備成將活性成分的組合物緩慢釋放至主體的控釋劑型。
優(yōu)選將UP302a作為軟膏劑、凝膠劑、洗液或乳膏基質(zhì)或者作為乳劑、貼劑、敷料或面膜、無粘性紗布、繃帶、藥簽或布拭子局部給藥。這種局部施用可采用局部給藥已知的任意標(biāo)準(zhǔn)方法局部地給藥于任何患病區(qū)域。可向人類和動物給藥UP302。
根據(jù)給藥方法及目示適應(yīng)癥，UP302a治療組合物可以各種單位劑量形式給藥。通常建議有效、非毒性的量在基于局部制劑總重量的0.01％到5％的范圍內(nèi)。將兩種不同濃度的UP302a(按重量計(jì)，0.01％和0.5％)如表4及表5所述配制為乳膏劑。為了制備這些乳膏劑，在室溫下將二芳基烷烴溶于水，并在攪拌器中勻化，直至其完全分散在溶液中(大約5分鐘)以產(chǎn)生組合物A。室溫下且不經(jīng)攪動或攪拌，通過撒于溶液表面將Ultrez-21卡波姆(carbomer)加入該勻化的溶液中，并允許其完全濕潤(不見白色區(qū)域)并沉入該溶液中。然后在輕微攪拌下，加熱該溶液至40℃，加入甘油并混合該組合物另外的5分鐘以提供組合物B。40℃下，將組合物A加至組合物B中并充分混合該組合物直至均質(zhì)(約5分鐘)。將所得的乳液冷卻至30℃并在用攪拌棒和/或刮勺攪拌下滴定中和劑調(diào)節(jié)pH約為5.5(5.3到5.7)。由于中和誘導(dǎo)卡波姆的構(gòu)象發(fā)生變化，該乳狀液變得非常粘稠。攪拌時，該乳狀液將達(dá)到乳膏劑適當(dāng)?shù)恼吵矶取；旌显摻M合物至均勻，將其倒入貯存容器中并于2℃到8℃貯存。
表4.0.01％二芳基烷烴乳膏劑組分

表5.0.1％UP302乳膏劑組分

權(quán)利要求
1.一種抑制雙核酶活性的方法，所述方法包括給藥有效量的包含一種或更多種二芳基烷烴的組合物。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中所述二芳基烷烴選自具有以下結(jié)構(gòu)的化合物的組中 其中Ar1和Ar2獨(dú)立地選自由被取代的5或6元芳環(huán)或雜芳環(huán)組成的組中，其中各6元芳環(huán)或雜芳環(huán)獨(dú)立地被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，并且各5元芳環(huán)或雜芳環(huán)被1-4個R′基團(tuán)(R′1-R′4)取代，例外的是當(dāng)Ar1和Ar2均為6元芳環(huán)即苯基時，Ar1和Ar2中至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2個不是H，其中R′獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
3.如權(quán)利要求2的方法，其中n＝2-4。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中所述二芳基烷烴選自由以下結(jié)構(gòu)通式所代表的化合物的組中 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中n＝2-4。
6.如權(quán)利要求1的方法，其中所述二芳基烷烴選自以下組中1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-內(nèi)醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羥基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
7.如權(quán)利要求1的方法，其中所述二芳基烷烴通過有機(jī)合成獲得或自一種或更多種植物分離獲得。
8.如權(quán)利要求7的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物部分莖、莖皮、樹干、樹皮、椏枝、塊莖、根、根皮、嫩芽、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉子及其他氣生部分。
9.如權(quán)利要求7的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物科中菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、?？坪腿舛罐⒖?。
10.如權(quán)利要求7的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物屬中金合歡屬、構(gòu)樹屬、山菅屬、蠟菊屬、Iryanthera、紅光樹屬、山胡椒屬、紫檀屬、槲寄生屬和Xanthocercis。
11.如權(quán)利要求1的方法，其中所述雙核酶選自以下組中酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、細(xì)胞色素C氧化酶、質(zhì)子泵血紅素-銅氧化酶、雙功能一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶、核糖核苷酸還原酶、金屬-β-內(nèi)酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供選擇的氧化酶以及細(xì)菌磷酸三酯酶。
12.如權(quán)利要求11的方法，其中所述雙核酶是酪氨酸酶。
13.一種預(yù)防和治療與雙核酶有關(guān)的疾病和病癥的方法，所述方法包括向有需要的主體給藥有效量的包含一種或更多種二芳基烷烴的組合物。
14.如權(quán)利要求13的方法，其中所述二芳基烷烴選自具有以下結(jié)構(gòu)的化合物的組中 其中Ar1和Ar2獨(dú)立地選自由被取代的5或6元芳環(huán)或雜芳環(huán)組成的組中，其中各6元芳環(huán)或雜芳環(huán)獨(dú)立地被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，并且各5元芳環(huán)或雜芳環(huán)被1-4個R′基團(tuán)(R′1-R′4)取代，例外的是當(dāng)Ar1和Ar2均為6元芳環(huán)即苯基時，Ar1和Ar2中至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2個不是H，其中R′獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
15.如權(quán)利要求14的方法，其中n＝2-4。
16.如權(quán)利要求13的方法，其中所述二芳基烷烴選自由以下結(jié)構(gòu)通式所代表的化合物的組中 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
17.如權(quán)利要求14的方法，其中n＝2-4。
18.如權(quán)利要求13的方法，其中所述二芳基烷烴選自以下組中1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羥基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
19.如權(quán)利要求13的方法，其中所述二芳基烷烴通過有機(jī)合成獲得或自一種或更多種植物分離獲得。
20.如權(quán)利要求19的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物部分莖、莖皮、樹干、樹皮、椏枝、塊莖、根、根皮、嫩芽、種子、根莖、花及其他生殖器官、葉子及其他氣生部分。
21.如權(quán)利要求19的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物科中菊科、Fabaceae、樟科、豆科、百合科、桑寄生科、?？坪腿舛罐⒖?。
22.如權(quán)利要求19的方法，其中所述二芳基烷烴分離自選自以下組中的植物屬中金合歡屬、構(gòu)樹屬、山菅屬、蠟菊屬、Iryanthera、紅光樹屬、山胡椒屬、紫檀屬、槲寄生屬和Xanthocercis。
23.如權(quán)利要求13的方法，其中所述雙核酶選自以下組中酪氨酸酶、精氨酸酶、脲酶、細(xì)胞色素C氧化酶、質(zhì)子泵血紅素-銅氧化酶、、雙功能的一氧化碳脫氫酶/乙酰輔酶A合酶、核糖核苷酸還原酶、金屬-β-內(nèi)酰胺酶、H(+)-腺苷三磷酸酶和可供選擇的氧化酶以及細(xì)菌磷酸三酯酶。
24.如權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物以選自0.01到200mg/kg主體體重的劑量給藥。
25.如權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物以選自基于治療制劑總重量的0.001％到100％的劑量給藥。
26.如權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物以包含0.001重量百分比(wt％)到99.9wt％的二芳基烷烴或二芳基烷烴在藥物學(xué)、皮膚學(xué)或美容學(xué)可接受的載體內(nèi)的混和物的藥物學(xué)、皮膚學(xué)或美容學(xué)制劑給藥。
27.如權(quán)利要求13的方法，其中所述給藥途徑選自以下組中局部、氣霧劑、栓劑、皮內(nèi)、肌內(nèi)和靜脈內(nèi)給藥。
28.如權(quán)利要求27的方法，其中使用無粘性紗布、繃帶、藥簽、布拭子、貼劑、面膜、防護(hù)劑、清潔劑、牙線材料(dental flossing material)、防腐劑、溶液、乳膏、洗液、軟膏劑、凝膠劑或乳劑、液體、牙膏、漱口液、美容糊劑(cosmetic paste)、肥皂或散劑給藥所述組合物。
29.如權(quán)利要求13的方法，其中所述組合物還包括藥物學(xué)、皮膚學(xué)和美容學(xué)適宜局部施用的常規(guī)賦形劑和任選的佐劑、和/或載體、和/或常規(guī)(regular)或控釋載體。
30.如權(quán)利要求13的方法，其中所述由雙核酶介導(dǎo)的疾病或病癥選自以下組中細(xì)菌感染、真菌感染、瘧疾傳染、病毒感染、一氧化氮生成減少、男性及女性性喚起異常、炎癥、氧化應(yīng)激、藥物代謝異常、癌和實(shí)體瘤。
31.如權(quán)利要求13的方法，其中所述由雙核酶介導(dǎo)的疾病或病癥選自以下組中牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌、和其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥、牙髓炎、發(fā)炎，由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的輕傷所引起的疼痛和炎癥，牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)。
32.一種預(yù)防和治療與黑素過度產(chǎn)生或分布不均有關(guān)的疾病和病癥的方法，所述方法包括向有需要的主體內(nèi)部或局部給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴。
33.如權(quán)利要求32的方法，其中所述與黑素過度產(chǎn)生分布不均有關(guān)的疾病和病癥選自以下組中暴露于紫外線導(dǎo)致的皮膚變黑和損傷，曬黑，由皮膚老化、肝病、熱灼傷和局部創(chuàng)口導(dǎo)致的色素沉著過度，歸因于由真菌、細(xì)菌和病毒感染導(dǎo)致的炎癥的皮膚色素沉著，白癜風(fēng)、癌和黑素瘤。
34.一種遞送金屬離子的方法，所述方法包括向有需要的主體給藥治療有效量的一種或更多種二芳基烷烴以及要被遞送的金屬離子。
35.如權(quán)利要求34的方法，其中所述金屬離子選自以下組中銅、鐵、鋅、硼、鋰、硒、鈣、鉻、鉬、鎂、以及錳。
36.如權(quán)利要求34的方法，其中所述金屬離子穿過膜或通過皮膚被遞送至血流。
37.如權(quán)利要求34的方法，其中所述膜是血/腦屏障。
38.如權(quán)利要求34的方法，其中給藥所述金屬以治療選自以下組中的疾病或病癥貧血及其他鐵缺乏、炎癥；肥胖和糖尿病、病毒感染、失眠、免疫功能抑制、骨質(zhì)疏松癥、閉經(jīng)、痛經(jīng)、癲癇癥、高血壓、膽固醇血癥、冠狀和腦血管痙攣、腹瀉、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、癌、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牙周病、口腔癌前期癥狀、口腔癌、及其他口腔惡性腫瘤、牙齦和牙齒過敏、后遺癥、牙髓炎、發(fā)炎、由口部假牙物理植入、創(chuàng)傷、損傷、夜磨牙癥及其他口內(nèi)、牙齦或舌上的微創(chuàng)口所引起的疼痛和炎癥、牙菌斑和牙垢、牙齒脫鈣、蛋白酶解作用和齲齒(腐蝕)、男性不育癥和黃斑變性。
39.選自具有以下通式的化合物組中的二芳基烷烴 其中Ar1和Ar2獨(dú)立地選自由被取代的5或6元芳環(huán)或雜芳環(huán)組成的組中，其中各6元芳環(huán)或雜芳環(huán)獨(dú)立地被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，并且各5元芳環(huán)或雜芳環(huán)被1-4個R′基團(tuán)(R′1-R′4)取代，例外的是當(dāng)Ar1和Ar2均為6元芳環(huán)即苯基時，Ar1和Ar2中至少一個被1-5個R′基團(tuán)(R′1-R′5)取代，其中所述R′1-R′5中的至少2個不是H，其中R′獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
40.如權(quán)利要求39的二芳基烷烴，其中n＝2-4。
41.選自具有以下通式結(jié)構(gòu)的化合物組中的二芳基烷烴 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
42.如權(quán)利要求41的二芳基烷烴，其中n＝2-4。
43.如權(quán)利要求41的二芳基烷烴，其中R6和/或R7中至少一個為OH基團(tuán)。
44.選自以下組中的二芳基烷烴1-(2-甲氧基-4-羥基苯基)-3-(2′-羥基-5′-甲氧基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二羥基苯基)-丙烷、1-(3-甲基-2，4-二甲氧基苯基)-3-(2′，5′-二羥基苯基)-丙烷、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(2′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(4′-氨基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-苯基-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(3′，4′，5′-三甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(4′-甲氧基苯基)-1-乙醇、1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-3-(2′，3′，4′，5′-四氫-苯并(b)二oxocin-8′-基)-1-丙醇、3-(5′-氯-1′-甲基-1′-氫-咪唑-2′-基)-1-(2-羥基-4-甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-3-(3′-甲氧基-4′-羥基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-乙醇、1，4-二-(3，4-二羥基苯基)-2，3-二甲基-丁烷、1-(2-羥基-5-甲氧基苯基)-3-(2′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇、1-(2，4-二羥基苯基)-2-(2′，4′-二氯苯基)-1-乙醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇、1，3-二(2，4-二甲氧基苯基)-丙-1，3-二醇、1-(2，4，6-三羥基苯基)-3-(3′-羥基-4′-甲氧基苯基)-1-丙醇以及1-(2，4，6-三甲氧基苯基)-3-(3′，4′-二甲氧基苯基)-1-丙醇。
45.一種合成二芳基烷烴的方法，所述方法包括還原具有以下通式結(jié)構(gòu)的化合物 其中R1、R2、R3、R4、R5、R′1、R′2、R′3、R′4及R′5獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-SH、-OR、-CN、-SR、-NH2、-NHR、-NR2、X、以及單糖或包含2-6個單糖的寡糖的糖苷，其中所述單糖獨(dú)立地選自以下組中戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛糖、己酮糖及其化學(xué)衍生物；其中R是具有1-20個碳原子的烷基且X是選自Cl、Br、F、I的鹵素，并且其中R1-R5中的至少2個或R′1-R′5中的至少2個不是H；R6和R7獨(dú)立地選自以下組中-H、-OH、-OR、-CN、-NHR、-NH2和-X，其中一個或更多個R6和R7一同形成＝O，R是具有1-20個碳原子的烷基且其中X是選自Cl、Br、F、I的鹵素；并且n＝1至10。
46.如權(quán)利要求41的方法，其中所述二芳基烷烴通過有機(jī)合成獲得或自一種或更多種植物分離獲得。
47.如權(quán)利要求41的方法，其中用選自硼氫化物、催化劑存在下的H2、NaH和LiAlH4的還原劑還原被取代的二芳基烷酮獲得所述二芳基烷烴。
全文摘要
本發(fā)明采用將酶抑制試驗(yàn)與化學(xué)去重復(fù)方法聯(lián)合的策略以鑒別有活性的植物提取物和那些提取物中特異性地抑制雙核酶功能的特定化合物——二芳基烷烴和/或二芳基烷醇。本發(fā)明包括包含一種或更多種抑制特別是酪氨酸酶的雙核酶并預(yù)防黑素過度生成的二芳基烷烴和/或二芳基烷醇的組合物。本發(fā)明還提供抑制特別是酪氨酸酶的雙核酶活性的方法和預(yù)防及治療與雙核酶功能相關(guān)的疾病和病癥。本發(fā)明還包括預(yù)防和治療黑素過度生成和與之相關(guān)的皮膚疾病和病癥的方法。預(yù)防和治療與雙核酶功能及黑素過度生成相關(guān)的疾病和病癥的方法包括向有需要的主體給藥有效量的包含一種或更多種合成或自一種或更多種植物分離的二芳基烷烴和/或二芳基烷醇以及藥物學(xué)可接受的載體的組合物。
文檔編號A61K31/704GK1993114SQ200580025681
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者賈琦, 趙吉福 申請人:尤尼根制藥公司